CN113892457A - 一种原位脑胶质瘤的pdxc模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种原位脑胶质瘤的PDXC模型构建方法，包括如下步骤，步骤A：获取病人脑肿瘤标本，并培养脑肿瘤单个细胞：步骤B：向小鼠脑部内注射若干脑肿瘤单细胞；步骤C：收获小鼠颅内扩增后PDX肿瘤；步骤D：将小鼠PDX肿瘤加入培养液，收集所有颗粒以及培养液；步骤E：将步骤D所得肿瘤细胞颗粒离心、去上清、培养；步骤F：将步骤E培养后肿瘤细胞加入培养液，再次离心，去上清，吹打再加入培养液，并转移到另一离心管；步骤G：细胞计数，完成PDXC模型构建。本发明基于PDX技术，能扩增构建干细胞库，可保留患者肿瘤特性，能提高患者来源模型的成功率，能快速且大量用于高通量药物的筛选、放疗敏感性或者其它治疗的筛选，为有效治疗脑肿瘤起到了有技术支撑。
Description
背景技术
恶性脑肿瘤，如胶质母细胞瘤、脑转移癌等存在复发率高、致残致死率高的问题，因此临床医疗及研究中，弄清楚其肿瘤的生物学行为和治疗抵抗(比如应用于治疗该疾病大量药物的筛选确定)的机制是治疗这类疾病的重要技术手段。目前，现有的技术中，主要是依靠构建模型方式用于研究该肿瘤生物学行为，其中，主要包括细胞系(脑肿瘤传统的细胞系)以及细胞系注射的老鼠模型两种方式来构建，这些模型最大的缺点是不能完全覆盖患者肿瘤的生物学信息。随着精准医学时代的到来及个体化治疗的发展，临床前研究迫切需要能够模拟患者肿瘤信息的体内外模型。
目前，脑肿瘤传统的细胞系有U87、U251、LN-229、A-172等，它们经过数十代甚至数百代的培养，在生物学行为上已经有了变化，不能有效模拟患者的信息。因此，基于患者来源的细胞PDC(Patient-derived cell,PDC)以及PDX模型是国际上公认的最能代表肿瘤患者信息的模型。PDC模型因为培养周期较快、细胞扩增后数量大，最适合做大规模的药物筛查，但目前国内外的研究表明原带肿瘤标本培养成功率不太高，约为30-50％，特别是肿瘤标本比较少的组织，成功率更加低，因此该技术还未得到有效推广及应用。患者来源脑肿瘤异体种植模型(Patient-derived xenograft,PDX)是保存患者信息最全面、最能重复患者脑肿瘤生物学行为的模型，尤其是原位脑部移植的PDX模型，因为提供能肿瘤生长所需的脑部微环境，最接近患者的肿瘤，但因为脑部原位PDX生长周期较长、大量构建照护成本和经费大，不太适宜作为大范围药物筛选的基准，因而其应用也还存在较大的局限性。
发明内容
为了克服现有技术中，细胞系以及细胞系注射的老鼠构建的模型，不能完全覆盖患者肿瘤的生物学信息，PDC模型样本培养成功率不高，PDX模型生长周期较长、大量构建照护成本和经费大，不适宜作为大范围药物筛选，应用存在较大局限性的弊端，本发明提供了基于PDX技术，经相关技术步骤制得的成品，能扩增构建细胞库，一方面可以保留患者的肿瘤特性，另外一方面，尤其对于肿瘤样本小的组织，可以提高患者来源模型的成功率，并由于量级大，可以快速用于脑肿瘤高通量药物的筛选、放疗敏感性或者其它治疗的筛选，为有效治疗脑肿瘤等起到了有技术支撑的一种原位脑胶质瘤的PDXC模型构建方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种原位脑胶质瘤的PDXC模型构建方法，其特征在于包括如下步骤，步骤A：获取病人脑肿瘤标本，并培养获得脑肿瘤的单个细胞：步骤B：向选取的小鼠脑部内注射若干脑肿瘤单细胞；步骤C：间隔一定时间，肿瘤细胞在老鼠的脑内增殖后，收获小鼠颅内的扩增后PDX肿瘤；步骤D：将小鼠PDX肿瘤加入无血清培养液，并带入无菌操作台，使用无菌刀片将PDX肿瘤切割成小颗粒，收集所有颗粒以及培养液；步骤E：将步骤D所得肿瘤细胞颗粒离心、去上清，加入细胞分离溶液，放入培养箱培养一段时间；步骤F：将步骤E培养后肿瘤细胞加入培养液，再次离心，去上清，然后加入培养液，吹打离心后的细胞团多次，再加入培养液，使用过滤器过滤上述混悬液至另一新离心管；步骤G：细胞计数，将步骤F所得细胞均匀接种于多个培养瓶中，每个培养瓶能获得二百万个肿瘤细胞培养液，完成PDXC模型构建。
进一步地，所述步骤A中，获取病人脑肿瘤标本后需要切成小片，通过细胞消化液培养后，然后吹打3-5次，离心后获得单个脑肿瘤细胞。
进一步地，所述步骤B中，选用的小鼠为雄性免疫缺陷小鼠、8～12周龄，体质量12～14g，通过立体定向仪固定小鼠后，注射脑肿瘤单细胞，注射的量为10万个，具体定位方法为：小鼠前囟后2mm，中线外侧2mm，进针深度为2.5mm。
进一步地，所述步骤C中，间隔的时间为1-3个月后，当小鼠出现体重明显下降，食欲差、或者神经系统症状，如一侧肢体偏瘫、精神差时，再收获小鼠颅内的扩增后PDX肿瘤。
进一步地，所述步骤D中，将小鼠PDX肿瘤先保存在无菌的15ml离心管中，然后再加入无血清DMEM培养液，加入的量5ml；先将收集所有颗粒以及培养液离心管中肿瘤及培养液倒入一个中号培养皿内，再通过无菌刀片将PDX肿瘤切割成2mm左右小颗粒。
进一步地，所述步骤E：离心时间为5分钟，加入的细胞分离溶液量为2ml，培养箱温度为37度、培养时间为5分钟。
进一步地，所述步骤F中，加入的培养液为5ml NSA培养液，第二次加入的培养液为1ml NSA培养液，吹打离心后的细胞团次数是3-5次，第三次加入的培养液为9ml NSA培养液，使用的过滤器过滤型号是70um，混悬液量为10ml左右。
进一步地，所述步骤G中，培养瓶个数是3-5个，培养瓶为低吸附T75培养瓶。
本发明有益效果是：本发明基于PDX技术，经过七个步骤构建起PDXC，能扩增构建患者来源脑胶质瘤细胞库，一方面可以保留患者的肿瘤特性，另外一方面，尤其对于肿瘤样本小的组织，可以提高患者来源模型的成功率，并由于量级大，可以快速且大量用于脑肿瘤高通量药物的筛选、放疗敏感性或者其它治疗的筛选，为有效治疗脑肿瘤等起到了有技术支撑。克服了现有细胞系以及细胞系注射的老鼠构建的模型，不能完全覆盖患者肿瘤的生物学信息，PDC模型本培养成功率不高，PDX模型生长周期较长、大量构建照护成本和经费大，不适宜作为大范围药物筛选，应用存在较大局限性的弊端。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
图1是本发明操作流程及应用流程示意图。
图2是本发明PDX向PDXC转化成神经球样生长示意图。
图3是本发明PDX向PDXC生长曲线示意图。
图4是本发明采用加用替莫唑胺测试PDXC细胞对化疗药物敏感性示意图。
图5是本发明荧光标记PDXC细胞快速筛选药物示意图。
图6是本发明Cell Titer Glo三色试剂标记PDXC筛选药物示意图。
具体实施方式
图1、2、3、4、5、6中所示，一种原位脑胶质瘤的PDXC模型构建方法，包括如下步骤，步骤A：获取病人脑肿瘤标本，并培养获得脑肿瘤的单个细胞：实际操作中，获取病人脑肿瘤标本后需要切成小片，通过accutase(细胞消化液)培养后，然后吹打3-5次，离心后获得单个脑肿瘤细胞。步骤B：向选取的小鼠脑部内注射若干脑肿瘤单细胞；实际操作中，选用的小鼠为雄性、8～12周龄，体质量12～14g，通过立体定向仪固定小鼠后，注射脑肿瘤单细胞，注射的量为10万个，具体定位方法为：小鼠前囟后2mm，中线外侧2mm，进针深度为2.5mm。步骤C：间隔一定时间后，肿瘤细胞在老鼠的脑内增殖后，收获小鼠颅内的扩增后PDX肿瘤；实际操作中，间隔的时间为1-3个月后，当小鼠出现体重明显下降，食欲差、或者神经系统症状，如一侧肢体偏瘫、精神差时，再收获小鼠颅内的扩增后PDX肿瘤。步骤D：将小鼠PDX肿瘤加入无血清DMEM培养液，并带入无菌操作台，使用无菌刀片将PDX肿瘤切割成小颗粒，收集所有颗粒以及培养液；实际操作中，将小鼠PDX肿瘤先保存在无菌的15ml离心管中，然后再加入无血清DMEM培养液，加入的量为5ml；先将收集所有颗粒以及培养液离心管中肿瘤及培养液倒入一个中号培养皿内，再通过无菌刀片将PDX肿瘤切割成2mm左右小颗粒。
图1、2、3、4、5、6中所示，步骤E：将步骤D所得肿瘤细胞颗粒离心、去上清，加入细胞分离溶液，放入培养箱培养一段时间；实际操作中，离心时间为5分钟，加入的细胞分离溶液量为2ml，培养箱温度为37度、培养时间为5分钟。步骤F：将步骤E培养后肿瘤细胞加入培养液，再次离心，去上清，然后加入培养液，吹打离心后的细胞团多次，再加入培养液，使用过滤器过滤上述混悬液至另一新离心管；实际操作中，加入的培养液为5ml NSA培养液，第二次加入的培养液为1ml NSA培养液，吹打离心后的细胞团次数是3-5次，第三次加入的培养液为9ml NSA培养液，使用的过滤器过滤型号是70um，混悬液量为10ml左右。步骤G：细胞计数，将步骤F所得细胞均匀接种于多个培养瓶中，每个培养瓶能获得二百万个肿瘤细胞/10ml NSA培养液，完成PDXC(PDX-derived cells，PDX转化细胞库)模型构建；实际操作中，培养瓶个数是3-5个，培养瓶为低吸附T75培养瓶。
图1、2、3、4、5、6中所示，，本发明基于PDX技术，经过七个步骤构建起PDXC，能扩增构建干细胞细胞库，比现有PDX应用技术提高了几何倍数增加的量级，一方面可以保留患者的肿瘤特性，另外一方面，尤其对于肿瘤样本小的组织，可以提高患者来源模型的成功率，并由于量级大，可以快速且大量用于脑肿瘤高通量药物的筛选、放疗敏感性或者其它治疗的筛选，为有效治疗脑肿瘤等起到了有技术支撑。本发明直接采用本PDXC库内的相应量肿瘤细胞就可实现脑肿瘤高通量药物的筛选、放疗敏感性或者其它治疗的筛选(量级大，那么提供的脑肿瘤样本也就更多)，克服了现有细胞系以及细胞系注射的老鼠构建的模型，不能完全覆盖患者肿瘤的生物学信息，PDC模型本培养成功率不高，PDX模型生长周期较长、大量构建照护成本和经费大，不适宜作为大范围药物筛选，应用存在较大局限性的弊端。
图2可见，采用本发明PDX向PDXC转化成神经球样生长中，生长速度较快。图3中可见，PDX向PDXC生长曲线呈现连续向上高位生长，显示了采用本发明PDXC细胞生长旺盛。图4是可见，采用加用替莫唑胺(TMZ)测试PDXC细胞对化疗药物的敏感性较强。图5可见，荧光标记PDXC细胞快速筛选药物速度快、效果好；图6可见，Cell Titer Glo三色试剂标记PDXC筛选药物，检测细胞活性、细胞毒性、细胞凋亡，充分表明PDXC的有效性。综上，本发明能大量用于脑肿瘤高通量药物的筛选、放疗敏感性或者其它治疗的筛选。
以上显示和描述了本发明的主要特征及本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (8)
1.一种原位脑胶质瘤的PDXC模型构建方法，其特征在于包括如下步骤，步骤A：获取病人脑肿瘤标本，并培养获得脑肿瘤的单个细胞：步骤B：向选取的小鼠脑部内注射若干脑肿瘤单细胞；步骤C：间隔一定时间，肿瘤细胞在老鼠的脑内增殖后，收获小鼠颅内的扩增后PDX肿瘤；步骤D：将小鼠PDX肿瘤加入无血清培养液，并带入无菌操作台，使用无菌刀片将PDX肿瘤切割成小颗粒，收集所有颗粒以及培养液；步骤E：将步骤D所得肿瘤细胞颗粒离心、去上清，加入细胞分离溶液，放入培养箱培养一段时间；步骤F：将步骤E培养后肿瘤细胞加入培养液，再次离心，去上清，然后加入培养液，吹打离心后的细胞团多次，再加入培养液，使用过滤器过滤上述混悬液至另一新离心管；步骤G：细胞计数，将步骤F所得细胞均匀接种于多个培养瓶中，每个培养瓶能获得二百万个肿瘤细胞培养液，完成PDXC模型构建。
2.根据权利要求1所述的一种原位脑胶质瘤的PDXC模型构建方法，其特征在于，步骤A中，获取病人脑肿瘤标本后需要切成小片，通过细胞消化液培养后，然后吹打3-5次，离心后获得单个脑肿瘤细胞。
3.根据权利要求1所述的一种原位脑胶质瘤的PDXC模型构建方法，其特征在于，步骤B中，选用的小鼠为雄性免疫缺陷小鼠、8～12周龄，体质量12～14g，通过立体定向仪固定小鼠后，注射脑肿瘤单细胞，注射的量为10万个，具体定位方法为：小鼠前囟后2mm，中线外侧2mm，进针深度为2.5mm。
4.根据权利要求1所述的一种原位脑胶质瘤的PDXC模型构建方法，其特征在于，步骤C中，间隔的时间为1-3个月后，当小鼠出现体重明显下降，食欲差、或者神经系统症状，如一侧肢体偏瘫、精神差时，再收获小鼠颅内的扩增后PDX肿瘤。
5.根据权利要求1所述的一种原位脑胶质瘤的PDXC模型构建方法，其特征在于，步骤D中，将小鼠PDX肿瘤先保存在无菌的15ml离心管中，然后再加入无血清DMEM培养液，加入的量5ml；先将收集所有颗粒以及培养液离心管中肿瘤及培养液倒入一个中号培养皿内，再通过无菌刀片将PDX肿瘤切割成2mm左右小颗粒。
6.根据权利要求1所述的一种原位脑胶质瘤的PDXC模型构建方法，其特征在于，步骤E：离心时间为5分钟，加入的细胞分离溶液量为2ml，培养箱温度为37度、培养时间为5分钟。
7.根据权利要求1所述的一种原位脑胶质瘤的PDXC模型构建方法，其特征在于，步骤F中，加入的培养液为5ml NSA培养液，第二次加入的培养液为1ml NSA培养液，吹打离心后的细胞团次数是3-5次，第三次加入的培养液为9ml NSA培养液，使用的过滤器过滤型号是70um，混悬液量为10ml左右。
8.根据权利要求1所述的一种原位脑胶质瘤的PDXC模型构建方法，其特征在于，步骤G中，培养瓶个数是3-5个，培养瓶为低吸附T75培养瓶。
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