KR101452775B1 - 단백질 분해 효소 활성 측정용 인 비트로 키트 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질 분해 효소 활성의 정량적 측정용 시험관내 키트 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 형광체 및 소광체가 결합되고, 단백질 분해효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이 고분자에 결합된 복합체를 포함하는 시험관내 단백질 분해효소 활성의 정량적 측정용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 복합체는 소광체의 형광물질에 대한 높은 소광 능력으로 형광이 발광하지 않은 상태로 있다가 특정 단백질 분해효소에 의하여 펩타이드 기질이 분해가 되어야만 강한 형광을 특이적으로 발광함으로써, 특히 단백질 분해효소 과다 발현을 억제하는 억제제와 같은 신약을 스크리닝하는 방법, 암, 골 관절염, 류마티스 관절염, 치매 등 자가면역질환 등의 다양한 질병 및 난치병의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 복합체는 소광체의 형광물질에 대한 높은 소광 능력으로 형광이 발광하지 않은 상태로 있다가 특정 단백질 분해효소에 의하여 펩타이드 기질이 분해가 되어야만 강한 형광을 특이적으로 발광함으로써, 특히 단백질 분해효소 과다 발현을 억제하는 억제제와 같은 신약을 스크리닝하는 방법, 암, 골 관절염, 류마티스 관절염, 치매 등 자가면역질환 등의 다양한 질병 및 난치병의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 단백질 분해 효소의 활성을 정량적으로 측정하기 위한 단백질 분해 효소 활성 측정용 인 비트로 키트 및 그 제조방법에 관한 것이다.
최근 단백질 분해 효소는 암과 치매와 같은 다양한 인간 질병에 중추적인 역할을 하며 원인 제공을 하고 있음이 새로이 밝혀지고 있다. 예를 들어, 기질 금속단백분해효소 (matrix metalloprotease, MMP)는 과거 세포 및 체내에서 세포외 기질 (extracellular matrix)을 분해하는 인자로 인식되었지만, 다양한 연구를 통해 이들이 인테그린 (integrin) 신호전달과 세포주위 기질 (pericellular matrix)의 분해에 따른 세포 운동에 관련돼 있음이 밝혀졌다. 또한 MMP는 신규 혈관형성 현상, 암세포의 침윤, 전이 등 암 성장에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있음이 밝혀져 있다.
상기 기질 금속단백분해효소 MMP 등과 같은 단백질 분해 효소의 활성을 정량적으로 분석하는 방법으로 현재 이용되고 있는 방법으로는, 비변성 (nondenaturing) 조건 하에서 폴리아크릴아미드 젤 (polyacrylamide gel)을 이용하는 전기영동 기술인 zymography, 효소를 붙인 해당 항체를 이용해 항원을 검출하는 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), 항원의 에피토프와 반응하는 항체를 이용하여 단백질 혼합물 중에서 원하는 단백질 (antigen)만을 찾아내는 웨스턴 블랏 (western blot), 항원항체반응의 예민성과 특이성을 이용해 특정 단백질에 대한 생성물질을 검출하는 방법으로 현미경에서 직접 눈으로 관찰할 수 있는 일종의 분석검사인 면역조직 화학법 (immunohistochemistry) 등의 방법이 있다. 그러나 zymography 방법은 처리과정이 번거롭고 특이성이 떨어지는 단점이 있고 ELISA 방법은 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 또한 웨스턴 블랏은 비용이 비싸다는 단점이 있고 역시 시간이 오래 걸린다는 단점이 있으며, 면역조직 화학법(immunohistochemistry)은 많은 양의 샘플과 시약을 필요로 하고 역시 시간이 오래 걸리는 단점을 가지고 있다. 또한 이러한 방법들은 여러 샘플을 한꺼번에 처리하는데 비용 및 처리 시간이 늘어나기 때문에 효율적인 방법이라고 할 수 없다.
상기와 같은 단점을 해결하기 위하여 최근 분자영상기법을 이용하여 단백질 분해 효소를 측정하는 방법이 개발되었다.
가장 대표적인 기술은 2001년 하버드 의과대학에서 개발된 단백질 분해 효소 영상화를 위한 고분자 센서이다. 상기의 센서는 단백질 분해 효소에 의해 분해가 가능한 형광체-펩타이드 기질-생체 적합성 고분자의 화학적 결합으로 이루어져 있다. 근적외선 형광체가 서로 가까운 거리 (수십 nm)에 있을 때 형광체의 발광 (emission)과 여기 스펙트럼 (excitation spectra)이 공유되어 FRET (fluorescence resonance energy transfer) 원리에 의하여 형광체의 형광은 소광된다. 이에 상기의 센서는 형광체-펩타이드가 고분자에 결합되어 있을 시에는 형광체-형광체의 물리적 결합으로 형광이 소광되어 있다가 단백질 분해 효소에 의하여 펩타이드가 분해되고 이에 형광체-형광체의 거리가 멀어지면 형광이 복원되어 단백질 분해 효소 발현정도를 영상화할 수 있다. 그러나 상기 연구에서는 근적외선 형광체가 가까운 거리에 있을 때 형광이 소광되는 자가소광원리 (self-quenching)를 이용하여 센서의 소광을 이루었다. 하지만 FRET에 기인한 자가소광은 형광체가 매우 가까운 거리에 있을 시 이루어지며 형광 소광율도 뛰어나지 못한 단점이 있다.
이에, 본 발명자는 광학 영상기법에서 가장 중요하게 여겨지는 신호대노이즈 (signal-to-noise (S/N)) 비율을 높이기 위하여 소광체 (quencher)를 도입하였다. 다양한 소광체 중 완전 흡광체인 블랙홀 소광체 (black hole quencher) 등은 다양한 흡수 파장을 가지고 있다. 일 예로, BHQ-1은 480 내지 580 nm, BHQ-2는 550 내지 650 nm, BHQ-3는 620 내지 730 nm 파장대의 형광을 매우 효율적으로 흡수한다. 형광체-펩타이드 기질-소광체의 단일 분자는 단백질 분해 효소에 의해 펩타이드 기질이 분해되면 형광이 복원되므로 단백질 분해 효소의 양을 측정할 수 있으며, 형광체-형광체 결합의 자가소광보다 높은 형광 소광율을 나타낸다.
한편, 2008년 특허출원 제0085497호에는 형광체 및 소광체가 결합되고, 단백질 분해 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이 생체 적합성 나노입자에 결합된 단백질 분해 효소 활성 측정용 나노입자 센서가 기재되어 있다. 그러나, 상기 나노입자 센서는 단백질 분해 효소 활성 측정을 위해 생체 내에 주입되어야 하기 때문에 생체 거부 반응과 같은 부작용을 수반할 수 있다는 문제점을 갖고 있다. 이에 생체 내 직접 주입없이도 단백질 분해 효소의 정량 및 활성 측정이 가능한 인 비트로 키트를 개발하여야 할 필요성이 대두되었다.
이러한 문제를 해결하기 위하여 2009년 특허출원 제0096373호는 형광체와 소광체가 결합되고 단백질 분해 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이 고분자에 결합된 복합체를 웰-플레이트에 결합시킨 단백질 분해 효소 활성 정량적 측정용 인 비트로 키트에 관하여 기재하고 있으나, 단백질 분해 효소 처리 초기에 명암 대비 효과가 미흡하여 진단 또는 효소 활성의 정량적 측정까지 상당 시간이 소요되어야 하는 문제점이 있다. 따라서, 보다 짧은 분석 시간 내에 고감도로 효소 활성의 정량적 측정이 가능한 인 비트로 키트의 개발 필요성이 대두되었다.
본 발명의 목적은 단백질 분해 효소의 활성을 정량적으로 측정하기 위한 형광체, 단백질 분해 효소에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질 및 상기 형광체의 발광을 흡수하는 소광체가 고분자 나노입자에 결합된 단백질 분해 효소 활성 측정용 인 비트로 키트 (in vitro kit) 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
하기 구조식 1을 가지는 나노입자 복합체가 표면에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 분해 효소 활성의 정량적 측정용 인 비트로 키트를 제공한다.
[구조식 1]
여기서, 상기 A는 형광체이고, 상기 B는 단백질 분해 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이고, 상기 C는 소광체이며, 상기 D는 고분자 나노입자이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 고분자 나노입자는 키토산, 글라이콜 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 폴리아미노산 및 헤파린으로 이루어진 군에서 선택된 고분자와 담즙산, 지방산 및 콜레스테롤로 구성된 군에서 선택된 소수성 물질이 결합된 고분자 나노입자일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 단백질 분해 효소는 기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinases; MMP), 트롬빈, FXIIIa(Human coagulation factor XIIIA), 카스파제(caspase), 우로키나아제 플라스미노겐 활성제(urokinase plasminogen activator, uPA), HIV 프로테아제, DPP-IV(Dipeptidyl peptidase-4) 및 프로테아좀(proteasome)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 형광체는 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 알렉사, 보디피 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 소광체는 형광을 소광시킬 수 있는 블랙홀 소광체(blackhole quencher), 블랙베리(blackberry quencher) 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 단백질 분해 효소는 기질 금속단백분해효소(MMP)이고, A는 Cy5.5이고, B는 MMP에 특이적 분해되는 펩타이드 기질이고, C는 BHQ-3 (black hole quencher-3)이고, D는 글라이콜 키토산이 소수성 물질과 결합된 나노입자일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 인 비트로 키트는 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암 진단에 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 인 비트로 키트는 자가면역질환 진단에 사용되는 것이고, 자가면역질환은 골관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 인 비트로 키트는 단백질 분해 효소의 과다발현을 억제하는 약물 스크리닝 또는 약물의 효능 측정에 사용되는 것일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 단백질 분해 효소 활성의 정량적 측정용 인 비트로 키트의 제조방법을 제공한다.
(1) 하기 구조식 1을 가지는 나노입자 복합체를 수득하는 단계; 및
(2) 상기 나노입자 복합체를 키트의 표면 상에 고정시키는 단계.
[구조식 1]
여기서, 상기 A는 형광체이고, 상기 B는 단백질 분해 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이고, 상기 C는 소광체이며, 상기 D는 고분자 나노입자이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 단백질 분해 효소에 특이적으로 분해되는 임의의 펩타이드 기질에 형광체와 소광체를 결합하여 형광의 소광율을 극대화하고, 이를 고분자 나노입자에 결합하여 제조되는 복합체를 포함하는 단백질 분해 효소 활성 측정용 인 비트로 키트에 관한 것으로, 상기 복합체의 펩타이드 기질은 표적으로 하는 특정 단백질 분해 효소에만 특이적으로 반응하여 형광이 발생하여 빠르고 간편한 방법으로 단백질 분해 효소 활성의 측정을 가능하게 하는 인 비트로 키트다.
보다 구체적으로, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 단백질 분해 효소 활성 측정용 인 비트로 키트에 포함되는 복합체는 다음의 구조식 1을 가진다:
[구조식 1]
여기서, 상기 A는 형광체이고, 상기 B는 상기 단백질 분해 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이며, 상기 C는 상기 형광체의 발광을 흡수하여 소광 효과를 나타낼 수 있는 소광체이고, 상기 D는 고분자 나노입자로 이루어진다.
여기서, 상기 형광체 및 상기 소광체는 상기 펩타이드 기질의 아미노 말단, 라이신, 시스테인, 또는 카르복실산에 결합 될 수 있고, 고분자 나노입자는 상기 펩타이드 기질의 C 말단의 카르복실산 또는 시스테인의 -SH기와 결합될 수 있다.
상기 단백질 분해 효소는 기질 금속단백분해효소 (matrix metalloproteinases; MMP), 트롬빈, FXIIIa, 카스파제 (caspase), 우로키나아제 플라스미노겐 활성제 (urokinase plasminogen activator, uPA), HIV 프로테아제, DPP-IV 또는 프로테아좀 (proteasome) 등 일 수 있다.
상기 펩타이드 기질(B)은 단백질 분해 효소에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질로, 예컨대 MMP (matrix metalloprotenase), 트롬빈, 세포사멸시 활성화되는 카스파제 (caspase), 프로테아좀 (proteasome) 등의 표적이 되는 펩타이드일 수 있다. 특정 단백질 분해 효소에 따라 사용되는 상기 펩타이드 기질은 다르다.
하기 표 1에서 다양한 단백질 분해 효소에 대한 펩타이드 기질 서열을 예시적으로 나타낸다. 그러나, 본 발명에 따른 인 비트로 키트에 사용되는 펩타이드 기질이 이들 특정 서열의 펩타이드로 한정되는 것은 아니다.
상기의 표 1과 같이, 다양한 질환에 중추적 역할을 하는 단백질 분해 효소가 이미 종래에 보고되어 있고, 이에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질 또한 많이 보고되어 있다. 상기 표 1에 개시된 바와 같은 펩타이드 기질들 외에도, 시그마-알드치리 회사 홈페이지에는 효소에 의해 다양하게 분해되는 펩타이드 기질이 개시되어 있다 ( http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/TablePage/14573356 참고) 다양하게 사용될 수 있고, 이를 이용하여 다양한 단백질 분해 효소를 검출할 수 있다.
상기 형광체(A)는 가시광선 영역 또는 근적외선의 형광을 발광하는 형광체일 수 있고, 일 예로써, 플루오레신 (fluorescein), 보디피 (BODYPY), 테트라메틸로드아민 (Trtramethylrhodamine), 알렉사 (Alexa), 시아닌 (Cyanine), 알로피코시아닌 (allopicocyanine), 기타의 형광을 발생시키는 형광체 또는 이들의 유도체가 사용될 수 있다. 또한, 양자 수득량 (quantaum yield)이 높은 형광체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 형광체 중 특히 시아닌계, 알렉사계는 근적외선 빛을 방출 및 흡수하므로 세포, 혈액 및 생체 조직 등과 간섭 또는 흡수가 최소화되므로 더욱 바람직하다.
상기 소광체(C)는 형광체가 결합된 펩타이드 기질에 화학적으로 결합된 소광체는 형광체가 발산하는 파장의 빛을 흡수하여 강한 소광효과 (quenching effect)를 이룸으로써, 펩타이드가 특정 단백질 분해 효소에 의해 분해되지 않으면 형광이 발광되지 않으며, 이러한 소광효과는 형광체와 소광체의 거리가 수십 nm 이내에 있을 경우에 나타난다. 다시 말해, 특정 단백질 분해 효소와 반응하여 펩타이드 기질이 분해되면 펩타이드에 결합된 형광체와 소광체가 서로 분리되어 멀어지면서 소광효과가 없어지고, 이에 따라 형광체 고유의 형광을 발광하여 단백질 분해 효소의 정성 및 정량적 분석이 가능하게 된다.
본 발명에서 소광체는, 형광체에서 나오는 빛의 파장을 흡수하여 소광효과를 최대화할 수 있는 것으로, 형광체의 발광파장과 같거나 거의 유사한 파장대의 소광체를 사용하여야 소광효과를 극대화할 수 있기 때문에, 형광체의 발광 파장의 범위에 따라 사용되는 소광체의 종류가 달라진다.
본 발명에 있어서 소광체는, 여기된 (excited) 형광체의 에너지를 흡수하지만 형광 에너지를 밖으로 방출하지 않으므로 형광체의 형광을 소광시킬 수 있는 물질인 'dark quencher'로서, 상업적으로 널리 상용화되어 있는 블랙홀 소광체 (black hole quenchers) (BHQ, WO01/86001, Biosearch Technologies, Inc. Novato, CA, USA) 및 블랙베리 소광체 (blackberry quencher) (Berry & Associates Inc. Dexter, MI, USA) 등을 사용할 수 있다.
상기 고분자 나노입자 (D)는 상기 형광체-펩타이드 기질-소광체-고분자로 이루어지는 복합체를 96-well 플레이트에 많은 양으로 고정화시킬 수 있는 것이 좋다. 좋기로는 상기 나노입자는 수용액 상태에서 50-500nm의 균일한 크기를 가지는 키토산, 폴리(에틸렌이민) (poly(ethylene imine)), 폴리(아미노산) (poly(amino acid)) 등의 분자량 1,000 - 1,000,000 Da 사이의 고분자에 소수성 화합물을 결합하여 이루어진 나노입자일 수 있다.
고분자에 소수성 화합물을 결합시켜 나노입자를 제조하는 경우, 비개질된 선형의 고분자와 비교하여 제한된 공간에 형광체가 보다 조밀하게 존재할 수 있다. 따라서, 선형 고분자를 이용하여 제조한 인 비트로 키트에서보다 소광 효과가 높아지게 되므로 이로부터 복원되는 형광의 콘트라스트가 강하게 관찰될 수 있어 단시간 내의 고감도 정량이 가능하게 된다. 이것은 나노 구조의 표면적이 선형 구조의 경우보다 넓기 때문에 단백질의 흡착이 보다 잘 이루어지기 때문일 수 있다.
본원에서 사용되는 고분자로는 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 폴리아미노산, 헤파린 등이 있으며, 바람직하게는, 친수성 키토산일 수 있으며, 분자량 103 내지 106 인 모든 종류의 키토산, 특히, 천연 고분자인 수용성 키토산 (chitosan), 보다 바람직하게는 글리콜 (glycol)기가 도입되어 수용성이 증대된 글리콜 키토산을 사용할 수 있다.
상기 고분자에 결합하는 소수성 물질로는, 담즙산, 지방산, 콜레스테롤 등이 있다.
본 발명의 구체적인 일 예로써, 본 발명의 단백질 분해 효소 활성 측정용 인 비트로 키트에서, 상기 펩타이드(B)는 암 및 염증질환 부위에서 과다 발현되는 다양한 분해 효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이고, 형광체 (A)는 상기 펩타이드의 아미노 말단에 결합되어 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5이며, 소광체 (C)는 상기 펩타이드의 라이신, 시스테인 등과 결합되어 상기 형광체의 형광을 흡수하여 소광효과를 극대화시킬 수 있는 BHQ-3 (black hole quencher-3)일 수 있다. 또한, 나노입자 (D)는 상기 펩타이드 (B)의 C터미널 말단부분의 카르복실산 또는 시스테인의 -SH 부분과 화학적으로 결합 할 수 있다. 일반적으로, 펩타이드의 C 터미널 (카르복실산), N 터미널 (아민), 라이신의 아민, 시스테인의 -SH 등의 부분과 화학적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 단백질 분해 효소 활성 측정용 시험관 키트는, 특정 단백질 분해 효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질에 형광체와 소광체를 결합시키고, 이를 고분자 나노입자에 결합한 복합체를 96-well 플레이트에 결합시켜서 제조할 수 있다.
보다 구체적으로는, (1) 나노입자 복합체를 수득하는 단계; (2) 상기 나노입자 복합체를 키트의 표면 상에 고정시키는 단계를 포함하는 단백질 분해효소 활성의 정량적 측정용 인 비트로 키트를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 필요에 따라, 상기 방법은 형광체-펩타이드-소광체-고분자 나노입자 복합체를 정제 또는 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 펩타이드 기질은 적절하게 합성될 수 있고, 이러한 합성은 다양한 펩타이드 합성 방법, 예컨대, 고체상 합성법(solid phase synthesis)에 따른 에프목 방법(Fmoc strategy)을 이용할 수 있다.
또한, 상기 합성된 펩타이드 기질의 N 말단 또는 펩타이드 중간부분에 있는 보호기를 제거하고, 펩타이드의 말단 작용기와 결합할 수 있는 형광체 또는 그 유도체를 반응시켜 결합시키고, 펩타이드의 한쪽 말단에 형광체가 결합된 펩타이드 유도체의 나머지 말단에 있는 보호기를 제거하고, 이 말단 작용기와 결합할 수 있는 소광체 또는 그 유도체를 반응시켜 결합시킬 수 있다.
또한, 상기 결합된 형광체-펩타이드 기질-소광체를 고분자 나노입자에 결합시키는 경우에 있어서, 상기 고분자는 친수성 및 소수성 물질을 이용하여 화학적으로 결합시킴으로써 수용액 상태에서 균일한 나노크기의 입자를 형성시켜 수득한다.
상기 형광체 (A)와 소광체 (C)사이의 거리는 형광체와 소광체 사이에서 발생하는 소광효과를 최대화하여, 형광체의 형광이 최소화될 수 있게 조절한다. 형광체와 소광체 사이의 거리를 수십 나노미터 이내로 유지시킴으로써 발생하는 소광효과에 의해서 형광체의 형광 세기가 최소가 되게 합성하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 제조된 단백질 분해 효소 활성 검출용 형광체-펩타이드-소광체-나노입자 유도체는, 형광체, 소광체, 및 펩타이드 기질을 쉽게 변경하고 제어 할 수 있기 때문에, 다양한 특정 단백질 분해 효소 측정용 키트를 설계할 수 있다.
또한, 상기 형광체-펩타이드 기질-소광체-고분자 복합체는 96-well 플레이트에 고정되는데, 상기 고분자를 96-well plate에 고정시켜 본 발명에 따른 단백질 분해 효소 활성의 정량적 측정용 인 비트로 키트를 제조할 수 있다.
한편, 상기 단백질 분해 효소 활성 측정용 인 비트로 키트는 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암 등을 포함하는 암 및 류마티스 관절염, 골관절염과 같은 염증성 질환에서의 단백질 분해 효소를 정량화하는 방법에 이용될 수 있으며, 일 구체예로써, 상기 단백질 분해 효소 활성 측정용 인 비트로 키트는 치매, 뇌졸중 등을 포함하는 난치성 질환에서의 단백질 분해 효소를 정량화하는 방법에 이용될 수 있다.
본 발명은, 일 예로써, 상기 단백질 분해 효소 활성 측정용 인 비트로 키트를 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암 진단용으로, 또는 치매 또는 뇌졸증 진단용 조성물 또는 자가면역질환, 구체적으로 골관절염 또는 류마티스 관절염을 비롯한 염증성 질환을 진단하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 단백질 분해 효소 활성 측정용 인 비트로 키트를 사용하여 상기 단백질 분해 효소의 과다발현을 억제하는 약물 또는 약물의 효능을 스크리닝하거나, 신약 개발에 필요한 고성능 스크리닝 (high-throughput screening) 또는 조기 질병 진단을 할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 형광체와, 상기 형광체의 발광을 흡수하는 소광체가 결합되고, 단백질 분해효소에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이 고분자 나노입자에 결합된 복합체를 포함하는 단백질 분해효소 활성 측정용 시험관내 키트는, 소광체의 형광물질에 대한 높은 소광 능력으로 형광이 발광하지 않은 상태로 있다가 특정 단백질 분해효소에 의하여 펩타이드 기질이 분해가 되면 강한 형광을 특이적으로 발광한다. 따라서 세포 및 조직에서 발현되는 다양한 단백질 분해효소를 빠른 시간 내에 정량분석할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 특성은 단백질 분해효소 과다 발현을 억제하는 억제제와 같은 신약을 스크리닝하는 방법, 암, 골 관절염, 류마티스 관절염, 치매 등 자가면역질환 등의 다양한 질병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 형광 소광 상태에 있다가 단백질 분해 효소에 특이적으로 분해되면 강한 형광이 복원되어 영상화가 가능한 펩타이드, 근적외선 형광체, 소광체 및 고분자 나노입자로 이루어진 본 발명의 단백질분해효소 활성 측정 복합체의 모식도이다.
도 2는 펩타이드, 근적외선 형광체, 소광체 및 선형 고분자로 이루어진 단백질 분해효소 활성 측정 복합체의 모식도이다.
도 3은 형광체-펩타이드-소광체로 이루어진 프로브의 합성 예를 나타낸것이다.
도 4a는 균일한 나노입자를 이룰 수 있는 글라이콜 키토산-담즙산 유도체의 합성 모식도이다.
도 4b는 글라이콜 키토산-담즙산 유도체가 균일한 나노입자를 이루고 있음을 나타내는 입자 크기 분포도 및 TEM 사진이다.
도 5는 실시예 1 및 비교실시예 1에서 제조한 인 비트로 키트에 고정된 프로브의 정량을 위한 UV 흡광도 분석 결과이다.
도 6은 실시예 1 및 비교실시예 1에서 제조한 인 비트로 키트의 형광 복원률 측정 결과이다.
도 2는 펩타이드, 근적외선 형광체, 소광체 및 선형 고분자로 이루어진 단백질 분해효소 활성 측정 복합체의 모식도이다.
도 3은 형광체-펩타이드-소광체로 이루어진 프로브의 합성 예를 나타낸것이다.
도 4a는 균일한 나노입자를 이룰 수 있는 글라이콜 키토산-담즙산 유도체의 합성 모식도이다.
도 4b는 글라이콜 키토산-담즙산 유도체가 균일한 나노입자를 이루고 있음을 나타내는 입자 크기 분포도 및 TEM 사진이다.
도 5는 실시예 1 및 비교실시예 1에서 제조한 인 비트로 키트에 고정된 프로브의 정량을 위한 UV 흡광도 분석 결과이다.
도 6은 실시예 1 및 비교실시예 1에서 제조한 인 비트로 키트의 형광 복원률 측정 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명의 범위가 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 형광체-
펩타이드
-
소광체
-고분자 나노입자 복합체가 표면에
결합되어
있는 인 비트로
키트의
제조
1-1. 형광체-
펩타이드
-
소광체
유도체의 제조
형광체와 소광체가 결합된 펩타이드를 제조하기 위해, 펩타이드는 고체상 합성법 (solid phase synthesis)을 따라 에프목 방법 (Fmoc strategy)으로 제조하고, 상기 제조된 펩타이드 서열에 형광체와 소광체를 화학적으로 결합하였다.
형광체로는 Cy5.5 (ex/em, 670/690), TRITC (ex/em, 547/572), FITC (ex/em, 490/520)을 사용하였고, 각각의 Cy5.5, TRITC, FITC 형광체의 형광을 소광시킬 수 있는 소광체로는 BHQ-3 (abs. 620 nm - 730 nm), BHQ-2 (abs. 550 nm - 650 nm) 및 BHQ-1 (abs. 480 nm - 580 nm) (Biosearch Technologies Inc.)를 각각 사용하였다.
MMPs 단백질 효소에 선택적으로 분해되는 펩타이드 기질인 NH2-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Gly-COOH을 에프목 (Fmoc) 펩타이드 합성방법으로 제조하고, 펩타이드 기질 5 mg에 근적외선 형광체인 Cy5.5-HNS 에스터 8.5 ㎎, N-메틸모르폴린 8 μl, 4-디메틸아미노피리딘 0.3 mg을 200 μl의 디메틸포름아미드에 녹인 후 12 시간 상온에서 반응시켰다. 반응이 종료한 용액을 차가운 에틸 에테르 4 ml로 침전시키고 원심분리하여 상등액은 제거한 후 차가운 에틸 에테르 2 ml로 다시 세척하였다. 표면의 에틸 에테르를 제거한 후 스피드 베큠 (speed vacuum) 또는 진공 오븐 (vacuum oven)으로 건조시켜 Cy5.5-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Gly-COOH 전구체를 제조하였다.
건조된 상기의 펩타이드 전구체의 보호기를 탈보호하기 위하여, 상기의 물질을 트리플로오로아세트산 1 ml, 증류수 25 μl, 아니솔 (Anisole) 25 μl를 넣어서 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 로터리 펌프 (Rotary pump)를 이용하여 용액을 모두 제거한 후, 이를 HPLC 용리액 (eluent) (0.1% TFA이 있는 식염수:0.1% TFA가 있는 아세토니트릴 =1:1) 1 ml에 녹인 후, 필터 (0.45 μM, 유기용매 사용 가능한 필터)하였다. HPLC 용리액 (eluent) (0.1% TFA이 있는 식염수: 0.1% TFA이 있는 아세토니트릴 =1:1), 애질런트 (Agilent) ZORBAX SB-C18 컬럼 (9.4 x 150 mm)을 이용하여, 0.1% TFA이 있는 5% 아세토니트릴, 0.1% TFA이 있는 95% 식염수로 HPLC를 안정화시켰다. 20 분 동안 기울기 용리 (gradient elution) (0 분에 5%, 5 분에 22%, 20 분에 40% 아세토니트릴 (0.1% TFA이 있는) vs DW (0.1% TFA가 있는))을 통하여 물질을 분리시켰다. 이때, UV 220 nm, FLD ex: 675 nm em: 690 nm에서 측정한 후 Cy5.5-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys-Gly-Gly-COOH 물질을 분리하였다. 분리한 물질을 분자량을 매스 (mass)를 사용하여 찍어 확인한 후 동결건조시켰다. 상기의 물질 2 ㎎에 BHQ3-NHS 에스터 (Biosearch Technologies Inc., 0.71 ㎎), NMM 1.5 μl, DMAP 0.2 mg를 30 μl DMSO에 녹여 상온에서 12 시간 반응시켰다. HPLC 용리액 (0.1% TFA이 있는 식염수 : 0.1% TFA가 있는 아세토니트릴 =1:1), 애질런트 (Agilent) ZORBAX SB-C18 컬럼 (9.4 x 150 mm)을 이용하여, 0.1% TFA가 있는 5% 아세토니트릴, 0.1% TFA가 있는 95% 식염수로 HPLC를 안정화시켰다. 25분 동안 기울기 용리 (gradient elution) (0분에 5%, 5분에 30%, 25분에 70% 아세토니트릴 (0.1% TFA 있는)vs 0.1% TFA가 있는 식염수)을 통하여 물질을 분리시켰다. 이때, UV 220 nm, FLD ex: 675 nm em: 690 nm에서 측정한 후 Cy5.5-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys(BHQ3)-Gly-Gly-COOH 물질 (MMP 펩타이드 프로브)을 분리하였다. 분리한 물질을 분자량을 매스 (mass)를 사용하여 찍어 확인한 후 동결건조 시켰다.
1-2. 고분자 나노입자 유도체의 제조
고분자 나노입자를 제조하기 위해, 고분자로 글라이콜 키토산 (GC, 분자량 250,000 Da)을 사용하였고, 소수성 물질로는 담즙산의 일종인 콜란산 (cholanic acid)을 사용하였으며, 최종 합성된 물질은 글라이콜 키토산-담즙산 (이하, HGC)(도 4a)이었다.
도 4a의 반응식에 나타난 과정에 따라, 글라이콜 키토산 500 mg을 60 ml 증류수에 녹인 후 90 ml의 MeOH을 부어 희석시켰다. 상기의 용액에 MeOH에 녹인 콜란산, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 (EDC)와 N-히드록시 숙신이미드 (NHS)를 첨가 한 후 상온에서 12 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 증류수/MeOH (1:3) 용액에서 24시간, 증류수/MeOH (1:1) 용액에서 24 시간 및 증류수 용액에서 24 시간 투석 (dialysis) 한 후 동결건조시켰다. 그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 수용액 상태에서 250 nm의 크기를 가지는 고분자 나노입자가 제조되었다.
1-3. 형광체-
펩타이드
-
소광체
-고분자 나노입자 복합체의 제조
상기 1-1에서 제조된 MMP 펩타이드 프로브 (형광체-펩타이드-소광체)를 고분자 나노입자에 화학적으로 결합시켜 고분자 나노입자 기반 단백질 분해 효소 활성 측정용 복합체를 제조하였다.
구체적으로, 상기 1-1에서 제조된 MMP 펩타이드 프로브를 글라이콜 키토산 기반의 나노입자에 결합하였다.
상기 1-2에서 합성된 HGC 10 mg를 튜브에 담고 100 μl DMSO로 녹인 후 14 ml PBS (pH 7.4) 에 첨가한 후 소니케이터를 이용하여 완전히 분산시켰다. MMP 펩타이드 프로브를 100 μl DMSO로 녹인 후 100μl PBS (pH 6.0)를 첨가한 후 EDC (1 mg) 및 Sulfo-NHS (1 mg)를 첨가하여 상온에서 15 분 반응시켰다. 반응 종료 후 상기 용액을 HGC 나노입자 용액에 첨가한 후 상온에서 12 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 증류수/MeOH (1:3) 용액에서 24 시간, 증류수/MeOH (1:1) 용액에서 24 시간 및 증류수 용액에서 24 시간 투석 (dialysis)한 후 동결건조시켰다.
1-4. 인 비트로
키트의
제조
상기 1-3에서 제조된 MMP 펩타이드 프로브-HGC 나노입자 복합체를 maleic anhydride가 코팅되어 있는 96-well에 넣고 상온에서 12 시간동안 교반하여, 복합체가 maleic anhydride와 함께 화학적 결합을 하도록 하였다. 복합체를 제거한 후, 반응하지 않은 maleic anhydride를 quenching시키기 위해 0.5% BSA가 함유된 PBS 2 ml을 넣고 1 시간 동안 교반 하였다. 0.5% BSA가 함유된 PBS를 제거한 후, TCNB buffer를 이용하여 2번 세척하였다.
비교실시예
1. 형광체-
펩타이드
-
소광체
-선형 고분자 복합체가 표면에
결합되어
있는 인 비트로
키트의
제조
상기 실시예 1의 1-1에서 제조한 MMP 펩타이드 프로브를 HGC 나노입자 대신에 선형의 GC 고분자에 결합시킨 것을 제외하고는 상기 실시예 1-3에 기재한 것과 동일한 방법을 사용하여 MMP 펩타이드 프로브-GC 선형 고분자 복합체를 제조하였다.
이를 상기 실시예 1-4와 동일한 방법에 의해 96-well 플레이트 상에 고정시켜 MMP 펩타이드 프로브-GC 선형 고분자 복합체가 표면에 결합되어 있는 인 비트로 키트를 제조하였다.
실험예
1.
실시예
1 및
비교실시예
1에서 제조한 인 비트로
키트에
고정된 형광체-
펩타이드
-
소광체
-고분자 복합체의 양 비교
실시예 1 및 비교 실시예 1에서 제조한 각각의 인비트로 키트에 동일한 양의 복합체가 고정되었는지 여부를 확인하기 위하여 UV 흡광도 분석을 수행하였다. GC 선형 고분자 또는 HGC 나노입자에 결합된 MMP 펩타이드 프로브 정량을 위한 표준 곡선을 얻기 위하여, 키트상의 MMP 펩타이드 프로브-GC 복합체 (1.10 μM) 또는 MMP 펩타이드 프로브-HGC 복합체 (1.10 μM)의 UV 흡광도를 UV/VIS 분광 광도기 (Optizen 2120, Mecasys)를 이용하여 450 내지 800 nm에 걸쳐 측정하였다. 다양한 농도 (각각, 1.5, 2.6, 5.5, 11.0, 22.0 μM)의 MMP 펩타이드 프로브가 표준 측정되었다. 표준 곡선을 690 nm에서의 UV 흡광 스펙트럼을 이용하여 작성하였다. 이렇게 얻어진 UV 흡광도 분석 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이 동일한 양의 MMP 펩타이드 프로브가 각각의 인 비트로 키트의 표면상에 고정되었음을 확인할 수 있었다.
실험예
2. 형광체-
펩타이드
-
소광체
-
GC
복합체 또는 형광체-
펩타이드
-
소광체
-HGC 복합체가 고정된 인 비트로
키트의
형광
복원률
비교
실시예 1 및 비교 실시예 1에서 제조한 인 비트로 키트 각각에 동일한 양의 MMP-13 분해효소를 처리하고 시간에 따라 복원되는 형광 (fluoroscent intensity)을 측정하였다. 구체적으로 MMP-13 분해 효소를 활성화하기 위하여 MMP-13 분해 효소를 p-아미노페닐 머큐릭산 (p-aminophenyl mercuric acid)이 첨가된 TCNB 반응액 (0.1 M Tris, 5 mM 염화칼슘, 200 mM NaCl, 0.1% 브리즈(Brij))에 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 활성화된 MMP-13 분해 효소 (각각 150 nM)를 각각의 인 비트로 키트에 첨가하여 37℃에서 5 분간 반응시켰다. 형광 발현은 형광분석기로 ex: 675 nm, em: 676~800 nm에서 측정하였다. 동일한 방법으로 활성화된 MMP-13 분해 효소 (각각 150 nM)를 각각의 인 비트로 키트에 첨가하여 37℃에서 60 분간 반응시키고 형광을 측정하였다. 그 후 실험 결과를 도 6에 나타내었다. 5 분간 반응시, MMP 펩타이드 프로브-HGC 복합체를 고정화시킨 키트의 형광 복원 효과는 형광 콘트라스트가 170배로 관찰된 반면, MMP 펩타이드 프로브-GC 복합체를 고정화시킨 키트의 형광 복원 효과는 형광 콘트라스트가 81배로 관찰되어 실시예 1에서 제조된 키트의 형광 복원 효과가 비교 실시예 1에서 제조된 키트보다 2배 이상 매우 우수함이 관찰되었다. 각각의 복합체에 결합된 형광체의 양이 동일하다면 최종적으로 복원되는 형광의 양은 동일하지만, 단백질 분해 효소의 작용 시간이 불충분한 초기 5 분 내에 복원되는 형광의 세기가 강할수록 단백질 분해 효소의 정량 분석, 단시간 내 시각화, 신약 스크리닝, 다양한 질병의 진단에 유용하다는 장점이 있다. 이러한 형광체-펩타이드-소광체-GC 복합체와 형광체-펩타이드-소광체-HGC 복합체 간의 형광 복원력의 차이는 선형인 GC에 비하여 소수성 나노 구조의 HGC의 경우 제한된 공간에 형광체가 보다 조밀하게 존재하게 되어 이로부터 소광 효과가 높아지게 되므로 이로부터 복원되는 형광의 콘트라스트가 강하게 관찰되며, 동시에 나노 구조의 표면적이 넓기 때문에 단백질의 흡착이 보다 잘 이루어진 결과에서 비롯된 것이라고 보여진다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (11)
- 하기 구조식 1을 가지는 나노입자 복합체가 표면에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 분해 효소 활성의 정량적 측정용 인 비트로 키트:
[구조식 1]
여기서, 상기 A는 형광체이고, 상기 B는 단백질 분해 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이고, 상기 C는 소광체이며, 상기 D는 고분자 나노입자로서, 키토산 및 글라이콜 키토산으로 이루어진 군에서 선택된 고분자와 담즙산, 지방산 및 콜레스테롤로 구성된 군에서 선택된 소수성 물질이 결합된 고분자 나노입자이다. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 기질 금속단백분해효소 (matrix metalloproteinases; MMP), 트롬빈, FXIIIa (Human coagulation factor XIIIA), 카스파제 (caspase), 우로키나아제 플라스미노겐 활성제 (urokinase plasminogen activator, uPA), HIV 프로테아제, DPP-IV (Dipeptidyl peptidase-4) 및 프로테아좀 (proteasome)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 인 비트로 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 형광체는 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 알렉사 및 보디피로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 인 비트로 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 소광체는 형광을 소광시킬 수 있는 블랙홀 소광체 (blackhole quencher) 및 블랙베리 (blackberry quencher)로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 인 비트로 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 기질 금속단백분해효소 (MMP)이고, 상기 A는 Cy5.5이고, 상기 B는 MMP에 특이적 분해되는 펩타이드 기질이고, 상기 C는 BHQ-3 (black hole quencher-3)이고, 상기 D는 글라이콜 키토산이 소수성 물질과 결합된 나노입자인 것인 인 비트로 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 인 비트로 키트는 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암 진단에 사용되는 것인 인 비트로 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 인 비트로 키트는 자가면역질환 진단에 사용되는 것인 인 비트로 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 자가면역질환은 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것인 인 비트로 키트.
- 제1항에 있어서, 인 비트로 키트는 상기 단백질 분해 효소의 과다발현을 억제하는 약물 스크리닝 또는 약물의 효능 측정에 사용되는 것인 인 비트로 키트.
- 하기 구조식 1을 가지는 나노입자 복합체를 수득하는 단계; 및
상기 나노입자 복합체를 키트의 표면 상에 고정시키는 단계
를 포함하는 단백질 분해 효소 활성의 정량적 측정용 인 비트로 키트의 제조방법:
[구조식 1]
여기서, 상기 A는 형광체이고, 상기 B는 단백질 분해 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이고, 상기 C는 소광체이며, 상기 D는 고분자 나노입자로서, 키토산 및 글라이콜 키토산으로 이루어진 군에서 선택된 고분자와 담즙산, 지방산 및 콜레스테롤로 구성된 군에서 선택된 소수성 물질이 결합된 고분자 나노입자이다.
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| KR1020120090911A KR101452775B1 (ko) | 2012-08-20 | 2012-08-20 | 단백질 분해 효소 활성 측정용 인 비트로 키트 및 그 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020120090911A KR101452775B1 (ko) | 2012-08-20 | 2012-08-20 | 단백질 분해 효소 활성 측정용 인 비트로 키트 및 그 제조방법 |
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