KR101896145B1 - 암 림프절 전이의 조기 진단용 펩타이드-기반된 이중-형광 고분자 나노프로브 및 이의 용도 - Google Patents

암 림프절 전이의 조기 진단용 펩타이드-기반된 이중-형광 고분자 나노프로브 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이중-형광 나노프로브, 그리고 이를 포함하는 암 전이 조기 진단 방법 및 조영제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 나노프로브 복합체는 (i) 1차 형광 모이어티-펩타이드-퀀처; 및 (ii) 생체적합성 폴리머 계면활성제로 구성되며, 35 nm 이하의 유체역학적 크기를 가지면서 수용성 환경에서 콜로이드 형태로 균일하게 분포한다. 본 발명의 방법에 따르면, 상기 나노프로브 복합체로부터 유래되는 형광 및 생체적합성 계면활성제로부터 유래하는 형광을 검출하여 이들 간의 비율값을 산출하여 목적 세포/조직에서 암 전이의 유무를 결정하였다. 따라서, 본 발명의 나노프로브 복합체 및 이를 포함하는 조성물 및 방법/시스템은 목적 세포/조직에 도달한 활성 성분(예컨대, 펩타이드 또는 포집된 일가양이온성 약물)으로부터 유래된 형광을 통해 다양한 질환(구체적으로, 암 전이 상태)의 검출에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

암 림프절 전이의 조기 진단용 펩타이드-기반된 이중-형광 고분자 나노프로브 및 이의 용도{Peptide-Based Dual-Fluorescence Nanoprobe for Early Diagnosis of Cancer Lymphnode Metastasis and Uses Thereof}
본 발명은 이중-형광 나노프로브, 그리고 이를 포함하는 암 전이 조기 진단 방법 및 조영제 조성물에 관한 것이다.
세포 및 생체 내에서의 생명현상을 분자 영상기법 중 하나인 형광신호로 영상화하는 기술은 세계를 변화시킬 10대 신흥기술로 선정되었으며(10 Emerging Technologies That Will Change the World, MIT technology review, 2003), 암과 같은 난치성 질환에 대한 분자 활성 수준에서의 조기 진단을 비침습적으로 실현시킬 수 있는 첨단 융합기술로 인정받고 있다. 상기의 분자영상/분자진단이 구현되기 위해서는 특정 질환에 대한 분자표식자와 광학 신호를 발생시키는 형광표지자(fluorescence label)가 결합된 형광프로브(fluorescence probe)의 개발이 필수적이며, 현재까지 해결되지 못한 여러 가지 문제점(형광신호 파장, 강도, 정확성, 독성, 안정성, 생체조직 간섭, 등)으로 인해 형광 응용기술은 임상적으로 체외 진단에만 주로 사용되고 있다. 하지만, 생체환경은 표적 부위에 대한 영상프로브의 전달량을 정확하게 제어하기 어려우므로, 단일신호 강도만으로는 반응 정도의 차이인지 농도 차이인지를 구별하기 용이하지 않다.
PET, CT, MRI 등의 영상의학적 기법을 이용한 림프절 검사는 잠재전이 진단능력이 높지 않으며, 현재 암의 잠재전이를 발견하는 가장 정확한 방법 중의 하나는 감시림프절 조직검사(sentinel lymph node biopsy, SLNB)이다. 감시림프절 조직검사는 림프절 전이 암세포를 발견하는 방법이 아니라, 단지 종양 근처의 일차 유입되는 림프절 만을 찾는 방법으로 암세포 자체에 대한 정보는 병리 검사를 통하여 얻어야 한다. 하지만 약 5% 정도 동결절편 검사에서 발견하지 못한 암세포가 최종 조직검사에서 발견된다. 또한 감시림프절 조직검사는 단지 해부학적(암세포 전이 유무)인 정보를 주며, 종양세포 또는 종양주변 미세환경의 활성도를 반영하지 못한다. 이러한 한계점으로 인하여 암 주변의 잠재전이에만 사용가능하며 이미 림프절 전이가 있거나 다발성 림프절 전이가 있는 환자에서는 진단 정확도가 낮아서 사용하지 못하는 한계가 있다. 또한, 현실적으로도 조직검사 자체가 어느 정도의 외과적 수술이기 때문에 이에 따른 환자의 외과적 수술부담이 남아있다는 한계가 있다. 이에 따라, 감시림프절 조직검사는 상당히 진단 정확도가 높은 검사임에도 불구하고 임상적인 한계점을 가지고 있다.
따라서, 상술한 영상의학적 진단방법의 한계점을 극복하기 위해, 보다 간편하고 효율적인 형광 프로브를 이용하여 임상적으로 적용가능한 감시림프절 비침습 조직 진단 방법이 당업계에서 시급히 요구되고 있다.
한편, 기질금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)-2 또는 MMP-9는 암 환경에서 많이 발현되는 효소로 암 환경 뿐 아니라 전이가 일어나는 조직이나 림프절(lymphnode, LN)에서도 높은 농도로 측정되는 요인 중 하나이다. 따라서 MMPs는 암 전이 조기 진단을 위한 적절한 타겟이다. 이 효소는 특정 펩타이드 서열을 가수분해할 수 있어서 특정 펩타이드 서열을 이용한 MMP 농도 측정 및 영상진단을 위한 연구가 많이 진행되고 있지만(Cancer Res, 2013, 73(2), 855; PNAS, 2010, 107, 4311), 상술한 바와 같이 종래의 방법으로는 영상의학적 진단방법에 적용시키기에 여러 가지 난점들이 존재한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 펩타이드 기반의 형광 물질을 포함하는 나노프로브를 이용하여 암 전이를 조기에 보다 효율적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 생체 내 암 전이 위치(예컨대, 림프절)에서 과다발현되는 프로테아제(예컨대, MMP-2, MMP-9, 등)에 의해 절단가능한 펩타이드를 1차 형광 모이어티 및 퀀처(quencher)와 결합시켜 제조된 다수의 단일복합체(monocomplex; 즉, 1차 형광 모이어티-펩타이드-퀀처)를 2차 형광 모이어티 결합된 생체적합성 폴리머 계면활성제(예를 들어, Cy7-플루로닉 F-127)로 포집(encapsulation)시켜 이중-형광 나노프로브 복합체(dual-fluorescent nanoprobe complexes)를 제형화시켰으며, 상기 이중-형광 나노프로브 복합체를 통해 1차 형광 모이어티와 2차 형광 모이어티-유래된 형광 간의 비율값을 측정하여 목적 세포/조직(예컨대, 감시림프절)에서 암 전이 상태를 이른 시기에 보다 간편하고 정확하게 영상 검출 또는 정량(pseudo-quantification)할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 이중-형광 나노프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암 전이를 조기에 진단하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 조영제(contrast agent) 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 프로테아제 절단가능한 펩타이드로서, 상기 펩타이드의 말단 각각에 1차 형광 모이어티 및 퀀쳐가 결합된 펩타이드; 및 (ii) 상기 펩타이드를 포집하는 2차 형광 모이어티가 결합된 생체적합성 폴리머 계면활성제를 포함하는 이중-형광 나노프로브를 제공한다.
본 발명자들은 펩타이드 기반의 형광 물질을 포함하는 나노프로브를 이용하여 암 전이를 조기에 보다 효율적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 생체 내 암 전이 위치(예컨대, 림프절)에서 과다발현되는 프로테아제(예컨대, MMP-2, MMP-9, 등)에 의해 절단가능한 펩타이드를 1차 형광 모이어티 및 퀀쳐와 결합시켜 제조된 다수의 단일복합체(즉, 1차 형광 모이어티-펩타이드-퀀쳐)를 2차 형광 모이어티 결합된 생체적합성 폴리머 계면활성제(예를 들어, Cy7-플루로닉 F-127)로 포집시켜 이중-형광 나노프로브 복합체를 제형화시켰으며, 상기 이중-형광 나노프로브 복합체를 통해 1차 형광 모이어티와 2차 형광 모이어티-유래된 형광 간의 비율값을 측정하여 목적 세포/조직(예컨대, 감시림프절)에서 암 전이 상태를 보다 간편하고 정확하게 영상 검출 또는 정량할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명은 특이적으로 암 전이 상태를 조기에 진단할 수 있는 신규한 이중-형광 나노프로브를 제공하며, 이를 이용하여 생체 내 목적 조직(예컨대, 림프절)에서 암 전이를 검출하는 방법 및 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명의 이중-형광 나노프로브는 다음과 같이 구성된다: (i) 1차 형광 모이어티-프로테아제 절단가능한 펩타이드-퀀쳐; 및 (ii) 상기 펩타이드를 포집하는 2차 형광 모이어티가 결합된 생체적합성 폴리머 계면활성제.
본 발명에서 이용할 수 있는 펩타이드는 암이 존재하거나 또는 암 전이가 진행 중인 목적 조직(예컨대, 림프절)에서 과다발현되는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드라면 어떠한 것도 가능하며(예컨대, PLGVRG 서열, IPVSLRS 서열, PLGLAG 서열, 등), 상기 프로테아제는 종양 또는 종양 전이가 일어나는 조직에서 과다발현되는 프로테아제로서, 예를 들어 MMP-2 및 MMP-9 같은 MMPs, 카뎁신 B, 카뎁신 D, 카뎁신 K, 전립선-특이적 항원, 헤르페스 심플렉스 바이러스 프로테아제, HIV 프로테아제, 시토메갈로바이러스 프로테아제, 트롬빈, 인터류킨 1β 변환 효소, 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 프로테아제는 MMP-2이고, 상기 프로테아제 절단가능한 펩타이드는 PLGVRG이다(참고: 실시예 1).
이후, 생체 내 전달 및 안정성 문제를 고려하여 본 발명자들은 상기 1차 형광 모이어티-프로테아제 절단가능한 펩타이드-퀀쳐 구조체를 생체적합성 폴리머 계면활성제에 포집시켰다(참고: 도 3 내 a). 따라서, 상기 제형은 보다 작은 크기의 균일한 콜로이드 제형을 형성하며(참고: 도 3 내 b), 이는 상기 구성성분들이 친수성/소수성 상호작용에 의해 나노구조를 형성한다는 것을 의미한다. 더욱이, 상기 나노복합체는 마이셀성 구조를 가져 보다 작은 크기로 응집됨으로써 림프관 뿐 아니라 세포 내로 용이하게 침투할 수 있다. 또한, 상기 생체적합성 폴리머 계면활성제로 포집된 형광-펩타이드-퀀처는 MMP-2 농도에 따른 형광증가를 보임에 따라 나노물질화된 후에도 상기 펩타이드 구조체는 MMP-2의 영향을 받을 수 있음을 보여준다(참고: 도 3 내 c).
본 명세서에서 사용되는 용어 "1차 형광 모이어티(first fluorescence moiety)"는 본 발명의 펩타이드에 연결 또는 컨쥬게이션되어 형광 시그널을 창출하는 형광 분자 또는 이의 유도체 또는 컨쥬게이트로서, 상기 프로테아제 절단가능한 펩타이드에 결합되어 퀀처에 의해 퀀칭된 상태로 존재하다가 목적 조직에서 발현된 프로테아제에 의해 절단됨에 따라 형광을 방출하는 모이어티이다. 예를 들어, 본 발명의 이중-형광 나노프로브 내 펩타이드가 암 전이와 관련된 조직(예컨대, 림프절)에서 과다발현되는 프로테아제에 의해 절단됨에 따라 퀀칭되어 있던 1차 형광 모이어티로부터 형광을 방출함에 따라 목적 조직을 효과적으로 형광 검출할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "연결(link)" 또는 "화학적 결합(컨쥬게이션)"은 최소 하나의 화학적 결합을 통해 두 개의 구성요소들을 연결하는 것을 의미하며, 상기 화학적 결합은 공유결합, 수소 결합, 이온 결합, 배위 결합, 등과 같이 당업계에 알려진 어떠한 결합을 포함할 수 있고, 구체적으로는 공유 결합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 1차 형광 모이어티-프로테아제 절단가능한 펩타이드-퀀쳐 구조체를 제조함에 있어서, 상기 펩타이드의 양 말단과 1차 형광 모이어티 또는 퀀쳐 간의 결합은 스페이서를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "스페이서(spacer)"는 하나의 물질(예컨대, 펩타이드)을 다른 물질(예컨대, 1차 형광 모이어티 또는 퀀처)에 연결하는 물질로서 퀀처에 의한 형광 퀀칭을 방지하지 않는다면 어떠한 물질도 이용가능하며, 예를 들어 하나 이상의 아미노알킬 카르복실산(예컨대, 아미노카프론산), 아미노산의 측쇄(예컨대, 리신 또는 오르니틴의 측쇄), 중성 아미노산(예컨대, 글라이신), 아미노옥시알킬산(예컨대, 8-아미노-3,6-디옥사옥타노익산), 이산성 알킬(예컨대, 숙신산), 이산성 알킬옥시(예컨대, 디글리콜산) 및 알킬디아민(예컨대, 8-디아미노-3,6-디옥사옥탄)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명에서 이용되는 스페이서는 아미노카프론산이다.
또한, 본 발명의 이중-형광 나노프로브 복합체에서 상기 생체적합성 폴리머 계면활성제는 다른 형광 모이어티(즉, 2차 형광 모이어티)와 결합된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "2차 형광 모이어티(second fluorescence moiety)"는 상기 1차 형광 모이어티와 방출 형광이 다르며, 본 발명에 이용될 수 있는 생체적합성 폴리머 계면활성제에 연결 또는 컨쥬게이션되어 형광 시그널을 창출하는 형광 분자 또는 이의 유도체 또는 컨쥬게이트를 의미한다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 나노프로브 복합체에 이용되는 생체적합성 폴리머 계면활성제는 본 발명의 단일복합체들을 포집(구체적으로는, 마이셀성 포집)시킬 수 있는 물질이라면 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 보다 구체적으로는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블락 공중합체(polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer), 폴리비닐 알코올 및 젤라틴을 포함하며, 보다 더 구체적으로는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블락 공중합체를 포함한다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명에서 이용되는 생체적합성 폴리머 계면활성제는 다음의 화학식 1로 표시되는 비-이온성 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블락 공중합체(폴록사머)이다:
화학식 1
(PE)x-(PPO)y-(PE)z
상기 화학식에서, PE는 에틸렌옥사이드, PPO는 프로필렌옥사이드, x, y 및 z는 각각 독립적으로 1-10,000의 정수이다.
상기 폴록사머는 폴리프로필렌 옥사이드의 소수성 센터 및 폴리에틸렌 옥사이드의 양 끝의 친수성 폴리 택(tag)으로 구성된 양친매성 삼중블럭(tri-block) 구조로, 소수성 오일 물질의 물 용해도를 증가시키거나 서로 다른 성질을 지니는 두 물질의 혼화성(miscibility)를 증가시키는 데 이용될 수 있으며, 상기 x, y 및 z의 구성에 따라 다양한 플루로닉스(pluronics) 상표명(BASF Corporation)으로 구입이 가능하고, 예를 들어 플루로닉 F-38, F-68, F-77, F-98, F-108 및 F-127을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 폴록사머는 양친매성 구조를 가지기 때문에, 소수성 오일 물질의 물 용해도를 증가시키거나 서로 다른 성질을 지니는 두 물질의 혼화성(miscibility)을 증가시키는 데 이용된다. 폴록사머는 공업, 화장품 또는 의학 분야에 응용되며, 특히 약물 운반 시스템의 모델 시스템으로 유용하게 이용된다. 또한, 폴록사머의 첨가는 세포 완충 효능(cell cushioning effects)으로 인해 세포를 낮은 스트레스 조건에 놓이게 하기 때문에 세포 배양 배지에 매우 유용하다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 생체적합성 폴리머 계면활성제는 플루로닉 F-127이다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 또는 생체적합성 폴리머 계면활성제는 말단 부위에 로다민, 쿠마린, 시아닌, EvoBlue, 옥사진, 카르보피로닌(carbopyronin), 나프탈렌, 바이페닐, 안트라센(anthracene), 페난트렌, 파이렌, 카르바졸 등을 기본 백본으로 가지는 형광 색소 또는 이의 유도체 같은 형광 모이어티가 선택적으로 연결 또는 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 1차 또는 2차 형광 모이어티는 Cy5.5 (694), Cy7 (773), ATTO 390™ (479), ATTO　425™ (484), ATTO　465™ (508), ATTO　488™ (523), ATTO　495™ (527), ATTO　520™ (538), ATTO　532™ (553), ATTO　Rho6G™ (570), ATTO　550™ (576), ATTO　565™ (592), ATTO　Rho3B™ (565), ATTO　Rho11™ (608), ATTO　Rho12™ (532), ATTO　Thio12™ (579), ATTO　610™ (634), ATTO　611 X™ (681), ATTO　620™ (643), ATTO　Rho14™ (625), ATTO 633™ (657), ATTO　647™ (669), ATTO　647 N™ (669), ATTO　655™ (684), ATTO　Oxa12™ (663), ATTO　700™ (719), ATTO 725™ (752), ATTO　740™ (764), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), EvoBlue10™, EvoBlue30™, MR121, Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), 로다민(Rhodamine) 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), 피코에리트린 R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), 피로닌 Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-피코시아닌 (642), C-피코시아닌 (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), 티아디카르보시아닌 (671), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705), Quasar 705 (610) 및 이의 유도체 또는 컨쥬게이트와 연결될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 또한, 상기 형광 모이어티 유도체는 본 발명의 나노복합체 형성을 방해하지 않는 한 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 말단 부위에 형광 빛을 흡수하여 퀀칭시킬 수 있는 퀀처가 선택적으로 연결 또는 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 퀀처는 답실(Dabsyl), BHQ(Black Hole Quencher)-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, Iowa Black® FQ, Iowa Black® RQ, QXLTM 490, QXLTM 570, QXLTM 610, QXLTM 670, QXLTM 680, IRDye QC-1, Deep Dark Quencher II, Deep Dark Quencher I, Eclipse® Dark Quencher, ATTO 540Q, ATTO 580Q, ATTO 612Q 및 이의 유도체 또는 컨쥬게이트와 연결될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 퀀처 유도체는 본 발명의 나노물질 형성을 방해하지 않는 한 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 이중-형광 나노프로브 내 펩타이드는 pH 4 내지 pH 10 및 인간 혈청에서 분해되지 않는다(참고: 도 2c).
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 이중-형광 나노프로브는 35 nm 이하의 유체역학적 크기를 가진다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 나노프로브는 수용성 환경에서 콜로이드 형태를 이룬다.
본 발명의 이중-형광 나노프로브 복합체는 특정 조직(예컨대, 감시림프절 또는 종양)에서 세포 또는 인 비보에서 특이적으로 영상화되었다(참고: 도 4a). 본 발명의 나노프로브가 증가된 세포 및 조직 투과성 효과와 충분히 작은 크기로 인하여 국부 주사 후 림프관을 따라 림프절로 이동하여 영상화 및 MMP-2 또는 MMP-9에 의하여 형광 활성이 나타남으로써 이는 조직학적 결과와 자이모그래피의 결과와 비슷한 양상을 보임에 따라 암 전이의 진단에 매우 효과적으로 이용/적용될 수 있다(참고: 도 4a 및 도 5b).
본 발명의 어떤 구현예에 있어서, 본 발명의 나노프로브의 1차 형광 모이어티의 형광은 림프절(특히, 감시림프절)에서 보다 특이적으로 분포되며, 상기 용어 “분포(distribution)”는 나노프로브 입자를 조직내 국소 주입한 경우 나노프로브 입자가 림프관을 통하여 이동하여 1차 형광이 회복되어 생체 내 여러 기관에 존재하는(localization) 정도를 의미한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "진단"은 한 대상자가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 또는 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것을 포함한다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 나노프로브 복합체에 의해 진단/검출될 수 있는 암/종양은 뇌암, 신경 내분비 암, 골수종, 림프종, 백혈병, 림프관 혈관내피세포육종(lymphangioendotheliosarcoma), 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 회돌기세포교종, 수막종, 신경모세포종, EMC(extraskeletal myxoid chondrosarcoma), 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 자궁경부암, 고환 종양, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피 암종, 신경교종, 대장선암, 전립선암종, 대장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평상피세포암, 기저세포암, 선암종, 신세포암종, 간세포암, 담도암, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피세포육종, 림프관 육종, 윤활막종, 중피종, 유윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 횡문근종, 땀샘암종, 피지샘 암종, 유두상암종, 유두상 선암, 낭선암종, 연수갑상선암종, 기관지암종, 융모상피암, 고환종, 배아성암종, 윌름 종양, 카포시육종 또는 망막모세포종을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 목적 조직에서 암 전이를 조기에 진단하는 방법을 제공한다: (a) 상술한 이중-형광 나노프로브 복합체를 대상자에 투여하는 단계; 및 (b) 상기 대상자의 목적 조직에서 1차 형광 모이어티 및 2차 형광 모이어티로부터 유래되는 형광을 각각 측정하여 얻어진 형광 값 간의 비율값을 정량화시키는 단계로서, 상기 비율값은 1차 형광 모이어티-유래된 형광 값을 2차 형광 모이어티-유래된 형광 값으로 나누어서 얻어지며 상기 비율값이 1 이상 및 p값이 0.05 이하이면 암 전이가 상기 목적 조직에 존재하는 것으로 판단하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 이중-형광 나노프로브를 포함하는 암 전이 검출용 조영제(contrast agent) 조성물을 제공한다.
본 발명의 진단 방법 및 조영제 조성물은 상술한 본 발명의 이중-형광 나노프로브 복합체를 유효성분으로 포함하기 때문, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 방법에 따르면, 본 발명의 나노프로브 복합체를 대상자에게 투여한 후, 목적 세포/조직에서 상기 나노프로브 복합체로부터 유래되는 형광(즉, 목적 형광 시그널; 구체적으로는 Cy5.5-유래된 형광 시그널) 및 생체적합성 계면활성제로부터 유래하는 형광(즉, 기준 형광 시그널; 구체적으로는 Cy7-유래된 형광 시그널)을 검출한다. 구체적으로는, 본 발명의 나노프로브 복합체의 펩타이드 구조체의 퀀칭된 형광이 목적 조직에서 펩타이드가 분해됨에 따라 유래되는 1차 형광 모이어티-유래된 형광 시그널을 측정하고, 생체적합성 폴리머 계면활성제의 2차 형광 모이어티로부터 유래되는 기준 형광 시그널을 측정하였다. 이후, 상기 1차 형광 모이어티-유래된 형광 시그널과 2차 형광 모이어티-유래된 형광 시그널의 값 간의 비율을 산출하여 목적 조직에서의 암 전이의 유무를 결정하였다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 비율값은 1차 형광 모이어티-유래된 형광 값을 2차 형광 모이어티-유래된 형광 값으로 나누어서 얻어진다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 비율값이 1 이상, 보다 구체적으로는 1.2 이상, 및 보다 더 구체적으로는 1.6 이상이면 암 전이가 상기 목적 조직에 존재하는 것으로 판단한다. 흥미롭게도, 전이가 진행된 초기 상태보다 종양 조직 또는 전이가 많이 진행된 상태에서 상기 비율값이 비례적으로 증가하였는데(참고: 도 5a), 이것은 본 발명의 방법이 종양 조직 또는 전이가 많이 진행된 상태의 검출에 매우 효과적이라는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 이중-형광 나노프로브 복합체를 이용하는 경우, 기준 형광 시그널과 대비하여 MMP-2 또는 MMP-9 활성에 대한 검출 형광 시그널(즉, 1차 형광 모이어티-유래된 형광 시그널)이 정량적으로 검출할 수 있어서, 종래의 단일 형광 시그널의 검출 방법의 부정확성을 개선시킬 수 있는 정확한 진단 결과를 정량적으로 제시할 수 있다. 또한, 이러한 결과는 조직학적 결과와 자이모그래피의 결과는 비슷한 경향을 나타냈다(참고: 도 5b).
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 방법은 150분 이내, 보다 구체적으로는 120분 이내, 보다 더 구체적으로는 90분 이내, 보다 더 구체적으로는 60분 이내, 보다 더욱 더 구체적으로는 45분 이내 및 가장 구체적으로는 30분 이내에 암 전이를 형광 진단할 수 있다(참고: 도 4a).
본 발명의 조영제 조성물은 다양한 조영 기술에 적용될 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 나노프로브 복합체는 방출 형광에 따라 광학 이미징 및 분광(Optical Imaging and Spectroscopy) 또는 BL(bioluminescence) 이미징에 사용될 수 있다. BL 이미징의 일반적인 내용은 미국 특허 제5,650,135호에 개시되어 있다.
또한, 본 발명의 나노프로브의 합성에서 방사선 동위 원소 또는 양전자방출동위원소가 결합되어 합성되는 경우, 이로부터 얻어진 나노프로브 입자는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT, Single Photon Emission Computed Tomography) 또는 양전자 방출 단층촬영(PET, Positron Emission Tomography)에도 사용될 수 있다. 본 발명의 조영제 조성물을 이용하여 PET 또는 SPECT 이미지를 얻는 경우, 양전자방출동위원소의 예는 10C, 11C, 13O, 14O, 15O, 12N, 13N, 15F, 17F, 18F, 32Cl, 33Cl, 34Cl, 43Sc, 44Sc, 45Ti, 51Mn, 52Mn, 52Fe, 53Fe, 55Co, 56Co, 58Co, 61Cu, 62Cu, 62Zn, 63Zn, 64Cu,65Zn, 66Ga, 66Ge, 67Ge, 68Ga, 69Ge, 69As, 70As, 70Se, 71Se, 71As, 72As 73Se, 74Kr, 74Br, 75Br, 76Br, 77Br, 77Kr, 78Br, 78Rb, 79Rb, 79Kr ,81Rb, 82Rb, 84Rb, 84Zr, 85Y, 86Y, 87Y, 87Zr, 88Y, 89Zr, 92Tc, 93Tc, 94Tc, 95Tc, 95Ru, 95Rh, 96Rh, 97Rh, 98Rh, 99Rh, 100Rh, 101Ag, 102Ag, 102Rh, 103Ag, 104Ag, 105Ag, 106Ag, 108In, 109In, 110In, 115Sb, 116Sb, 117Sb, 115Te, 116Te, 117Te, 117I, 118I, 118Xe, 119Xe, 119I, 119Te, 120I, 120Xe, 121Xe, 121I, 122I, 123Xe, 124I, 126I, 128I, 129La, 130La, 131La, 132La, 133La, 135La, 136La, 140Sm, 141Sm, 142Sm, 144Gd, 145Gd, 145Eu, 146Gd, 146Eu, 147Eu, 147Gd, 148Eu, 150Eu, 190Au, 191Au, 192Au, 193Au, 193Tl, 194Tl, 194Au, 195Tl, 196Tl, 197Tl, 198Tl, 200Tl, 200Bi, 202Bi, 203Bi, 205Bi, 206Bi 또는 그의 유도체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. PET 이미징 방법 및 장치는, 미국 특허 제6,151,377호, 제6,072,177호 제5,900,636호, 제5,608,221호, 제5,532,489호 제5,272,343호 및 제5,103,098호에 기재되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. SPECT 이미징 방법 및 장치는, 미국 특허 제6,115,446호, 제6,072,177호, 제5,608,221호, 제5,600,145호, 제5,210,421호 및 제5,103,098호에 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 조영제 조성물은 인체의 특정 부위, 특히 감시림프절 또는 종양 조직에 대한 이미징에 매우 유용하다. 이미징 과정은 인간에게 조영제의 진단학적 유효량을 투여한 다음 감시림프절의 가시적 이미지를 얻기 위하여 이미징을 실시하여 인체를 스캐닝함으로써 이루어진다.
본 발명의 조영제는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 조영제는 비경구 방식으로 투여되는 것이 선호된다. 비경구 투여를 하는 경우, 국소 주입(예컨대, 종양 주변(peritumoral) 주입), 정맥내 주입, 복강내 주입, 피내 주입, 병변내 (intralesional) 주입, 근육내 주입, 두개강내(intracranial) 주입, 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조영제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "진단학적 유효량"은 인체의 이미지를 얻는데 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.0001-100 mg/kg이다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 이중-형광 나노프로브는 국소 투여시 림프절(보다 구체적으로는, 감시림프절)에 잘 도달하기 때문에 림프절 영상 성능 향상에 효과적으로 적용될 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 포유동물, 보다 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 이중-형광 나노프로브, 그리고 이를 포함하는 암 전이 조기 진단 방법 및 조영제 조성물에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 나노프로브 복합체는 (i) 1차 형광 모이어티-펩타이드-퀀처; 및 (ii) 생체적합성 폴리머 계면활성제로 구성되며, 35 nm 이하의 유체역학적 크기를 가지면서 수용성 환경에서 콜로이드 형태로 균일하게 분포한다.
(c) 본 발명의 방법에 따르면, 상기 나노프로브 복합체로부터 유래되는 형광 및 생체적합성 계면활성제로부터 유래하는 형광을 검출하여 이들 간의 비율값을 산출하여 목적 세포/조직에서 암 전이의 유무를 결정하였다.
(d) 따라서, 본 발명의 나노프로브 및 이를 포함하는 조성물 및 방법/시스템은 목적 세포/조직에 도달한 활성 성분(예컨대, 펩타이드)으로부터 유래된 형광을 통해 다양한 질환(구체적으로, 암 전이 상태)의 검출에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1a는 프로테아제 절단가능한 펩타이드와 1차 형광 모이어티 및 퀀처를 결합시키는 나노프로브 활성 성분의 제조 반응을 예시하고, 도 1b는 상기 활성 성분을 정제한 후 질량분석기로 측정한 결과이며, 도 1c는 이의 구조식을 보여주는 도면이다.
도 2a는 Cy5.5-PLGVRG-BK01에 MMP-2 처리 농도에 따른 형광 강도의 변화를 보여주는 결과이며, 도 2b는 MMP-2 저해제를 처리하는 농도에 따라 감소하는 형광 강도를 보여주는 결과이고, 도 2c는 생리학적 조건(예컨대, 다양한 pH, 인간 혈청 또는 반응 완충액) 하에서 본 발명의 Cy5.5-PLGVRG-BK01 구조체의 안정성을 확인시켜 주는 도면이다.
도 3은 생체적합성 폴리머 계면활성제로 Cy5.5-PLGVRG-BK01를 포집하여 나노프로브 제조 반응(a)을 예시하고, Zetasisernano ZS를 사용하여 측정된 나노입자들의 유체역학적 크기(b) 및 프로테아제 MMP-2 처리 시 검출되는 형광 패턴(c)을 보여주는 결과이다.
도 4는 본 발명의 이중-형광 나노프로브 복합체를 국소 투여한 후, Cy5.5(4a) 및 Cy7(4b)-유래된 형광을 추적한 검출 결과이다.
도 5a는 본 발명의 이중-형광 나노프로브 복합체를 국소 투여 후, 검출된 형광 값들(Cy5.5 및 Cy7-유래된 형광)의 비율을 산출한 결과로서, 측정값은 평균값±표준오차(* P < 0.05 및 ** P < 0.01)로 제시되어 있다.
도 5b는 해당하는 림프절의 조직학적 결과와 자이모그래피(zymography) 결과로 암으로부터 유래된 형광 검출과 MMP-2 또는 MMP-9의 분포 레벨을 검출한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 형광- 퀀처 결합된 펩타이드가 결합된 고분자 나노물질 제조
(1) 형광- 퀀처 결합된 펩타이드 합성
기질금속단백질분해효소-2에 의하여 가수분해될 수 있는 펩타이드(PLGVRG, 3.0 mg; (주)펩트론, 대한민국)와 말레이미드가 결합된 퀀처(BK01-maleimide, 3.3 mg; qFlamma Black-I Maleimide, Cat. No. QWM1001; Bioacts, 대한민국)를 각각 디메틸포름아미드(DMF, 1 mL; Sigma-Aldrich, 미국)에 녹여 상온(20-25℃)에서 2시간 동안 반응시켰다. 합성된 퀀처-펩타이드는 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)로 확인 후 에테르 침전으로 회수하였다. 상기 펩타이드를 다시 DMF(1 mL)에 녹이고 시아닌5.5-N-히드록시숙신이미드 에스테르(Cy5.5-NHS, 2.3 mg; Lumiproble, 독일)와 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine, DIPEA, 2.8 μL; Sigma-Aldrich, 미국)을 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응진행 여부를 HPLC로 확인한 다음, 에테르 침전을 이용하여 형광-펩타이드-퀀처(Cy5.5-PLGVRG-BK01)를 회수하였다. 상기 펩타이드를 다시 준조제용 HPLC로 정제한 후 이를 고분해능 질량분석기로 확인하고 그 결과는 각각 도 1a 내지 도 1c에 나타냈다.
(2) 형광- 펩타이드 - 퀀처 및 양친성 고분자를 포함하는 나노 입자의 제조
상기 (1)에서 얻은 Cy5.5-PLGVRG-BK01 3 mg을 DMSO(dimethyl sulfoxide) 1 mL에 녹여 Cy5.5-PLGVRG-BK01 용액(3 mg/mL)을 제조하였다. Cy7이 결합된 고양친성 고분자 플루로닉(Pluronic®) F-127 20 mg을 물 1 mL에 녹여 플루로닉 F-127 용액(20 mg/mL)을 제조하였는데(이중 1%는 Cy7이 결합된 F127을 사용함), 이때 플루로닉 F-127 용액 1 mL를 초음파 분산기로 분산시키는 동안, Cy5.5-PLGVRG-BK01 용액 30 μL를 상기 용액에 첨가하여 물에 고르게 분산된 형광-펩타이드-퀀처 나노 입자(FPQ NPs)를 제조하였다.
상기 나노 입자는 크기는 Zetasisernano ZS(Malvern Instruments, UK)를 사용하여 측정하였고, 이를 도 3b에 나타내었다. 도 3b로부터 상기 나노 입자는 직경이 약 30 nm의 입자임을 확인할 수 있었다.
실시예 2: Cy5.5-M-BK01 및 이를 포함한 나노물질의 기질금속단백질분해효소(MMP)-2에 의한 형광 활성화 및 생리학적 조건하에서의 안정성 평가
(1) 기질금속단백질분해효소 -2에 의한 형광 활성화 평가
상기 실시예 1의 (1)에서 합성한 Cy5.5-PLGVRG-BK01과 나노물질이 MMP-2에 의하여 가수분해되어 형광 회복이 일어나는 것을 확인하기 위해, 100 μL Cy5.5-PLGVRG-BK01 용액(0.1 mg/mL in TCNB 완충액/5% DMSO)을 활성화된 100 μL MMP-2 용액(0-5 μg/mL)과 혼합시킨 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 나노물질의 경우 실시예 1의 (2)에서 만들어진 용액의 100 μL를 사용하여 동일한 조건으로 반응시켰다(TCNB 완충액 조성: 50 mM 트리신 완충액, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.05% Brij35, pH 7.5).
도 2a 및 도 3(c)에서 볼 수 있듯이, Cy5.5-PLGVRG-BK01과 이를 포함한 나노물질(FPQ NPs)의 형광은 MMP-2의 농도가 증가함에 따라 비례하여 형광 세기가 증가하였는데, 이는 펩타이드가 MMP-2에 의하여 가수분해되어 형광이 회복되었다는 것을 의미한다.
또한, 상기 반응 조건 중 고-농도의 100 μL MMP-2(5 μg/mL) 조건에서 여러 농도의 MMP-2 저해제(EDTA, 0-1 mg)를 100 μL Cy5.5-PLGVRG-BK01 용액(0.1 mg/mL in TCNB 완충액/5% DMSO)에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 형광의 변화를 관찰하였다. 도 2b에서 볼 수 있듯이, 저해제의 농도가 증가함에 따라 형광의 세기가 감소하였으며, Cy5.5-PLGVRG-BK01의 형광이 MMP-2의 농도에 따라 가수분해되어 형광에 영향을 주는 것을 확인하였다.
(2) Cy5 .5- PLGVRG - BK01 의 생리학적 조건하에서의 안정성 평가
다양한 생리학적 조건 하에서 Cy5.5-PLGVRG-BK01의 안정성을 평가하기 위하여, Cy5.5-PLGVRG-BK01 용액(0.1 mg/mL in TCNB 버퍼/5% DMSO) 100 μL에 다양한 pH(4-9.5)를 가진 인산완충식염수, TCNB(pH 7.5) 및 인간 혈청 900 μL와 각각 혼합하여 37℃에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 형광의 세기를 측정하고, 이를 퀀처의 소광 효율로 도출하여 도 2c에 나타내었다. 또한, 상기 실험으로 MMP-2 외의 생리학적 조건이 Cy5.5-PLGVRG-BK01의 가수분해에 영향이 적음을 확인하였다.
실시예 3: 암 전이모델에서 FPQ NPs 의 생체 국소 주입 후 림프절 축적 및 특성 평가
암 전이모델을 만들기 위하여 수컷 쥐(Balb/c-nu, 5.5 주령; 오리엔트 바이오, 대한민국)의 왼쪽엉덩이 근육 부위에 각각 세포 배양액 60 μL에 분산된 1 X 106개의 SCC(Squamous Cell Carcinoma)7-GFP 세포를 피하 주사하였다. 이후 14일차에 Cy5.5-PLGVRG-BK01이 봉입된 나노입자(FPQ NPs) 20 μL를 쥐의 왼손바닥에 국소 주사하고 형광 영상 장비(IVIS-Spectrum; Perkin-Elmer, 미국)의 Cy5.5 채널과 Cy7 채널을 이용하여 나노입자를 추적하고 암 전이의 가능성이 큰 림프절에서 Cy5.5-PLGVRG-BK01의 형광 재생현상 및 Cy7 형광을 관찰하였고 이를 각각 도 4a 및 도 4b에 나타내었다. 또한, 대조군으로 암 모델을 만들지 않은 정상 쥐에 같은 조건으로 FPQ NPs를 왼손바닥에 20 uL 주입하고 cy5.5 채널과 Cy7 채널로 관측하였다.
상기 실험으로 암 전이 모델에서 Cy7 신호가 왼쪽 팔의(brachial) 림프절에서 관측되었고 시간에 따라 신호가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, Cy5.5 신호 또한 왼쪽 팔의 림프절에서 관측되었고 시간에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 생체 내 암 전이 림프절에서 FPQ NPs의 형광 회복의 정확한 정량을 위하여 쥐에 암을 배양한 지 4, 7, 11, 14 또는 21일차에 FPQ NPs 주입 후 30분에 쥐를 희생하여 팔의 림프절을 적출하였다. tkdrl 적출된 림프절들에서 나오는 Cy5.5와 Cy7 신호를 형광 영상 장비로 정량화하여 전이가 진행된 시간에 따른 두 신호의 비율로 도시화하여 도 5a에 나타냈다. 또한, 쥐에 암을 배양한 지 7ldf 후 암과 림프절을 적출하여 조직학적 분석 및 자이모그래피 분석을 실시아형 도 5b에 나타냈다.
상기 실험으로 Cy5.5와 Cy7의 신호 비율이 암 전이 모델 쥐에서 정상 쥐보다 대체로 더 높고, 암 전이가 진행될수록 그 비율이 증가함을 확인하였으며, 그 결과 상기 나노입자는 생체 내 암 전이를 진단할 수 있는 가능성이 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (19)

  1. 나노프로브에 있어서,
    (i) 프로테아제 절단 가능한 펩타이드로서, 상기 펩타이드의 말단 각각에 1차 형광 모이어티 및 퀀쳐가 결합된 펩타이드; 및 (ii) 2차 형광 모이어티가 말단에 결합된 생체적합성 폴리머 계면활성제를 포함하며, 상기 1차 형광 모이어티와 2차 형광 모이어티는 서로 다른 파장에서 형광 시그널을 방출하고, 상기 계면활성제는 상기 1차 형광 모이어티 및 퀀쳐가 결합된 펩타이드를 포집하고, 상기 1차 형광 모이어티와 퀀쳐는 소수성 스페이서로 상기 계면활성제와 결합되어 계면활성제 내부는 소수성 공간이 형성되고 상기 2차 형광 모이어티는 상기 계면활성제 말단에 결합하며 상기 나노프로브 입자 표면에 존재하므로써 1차 형광 모이어티 및 퀀쳐가 2차 형광 모이어티와 공간적으로 이격되는 것을 특징으로 하는 이중-형광 나노프로브.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 pH 4 내지 pH 10 및 인간 혈청에서 분해되지 않는 것인 이중-형광 나노프로브.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드의 양 말단과 1차 형광 모이어티 또는 퀀쳐 간의 결합은 소수성 스페이서를 추가적으로 포함하는 것인 이중-형광 나노프로브.
  4. 제1항에 있어서, 상기 나노프로브는 35 nm 이하의 유체역학적 크기를 가지는 것인 이중-형광 나노프로브.
  5. 제1항에 있어서, 상기 나노프로브는 수용성 환경에서 콜로이드 형태를 이루는 것인 이중-형광 나노프로브.
  6. 제1항에 있어서, 상기 나노프로브는 1차 형광성 모이어티 및 상기 1차 형광성 모이어티의 생체 내 분포를 제공하는 기준 신호인 2차 형광성 모이어티로부터 유래되는 형광을 제공하고, 상기 1차 형광성 모이어티의 형광값을 2차 형광성 모이어티의 형광 값으로 보정하기 위해 1차 형광 모이어티-유래된 형광 값을 2차 형광 모이어티-유래된 형광 값으로 나누어서 조직 내 프로테아제 발현량에 대한 정량적인 정보로서 이들 형광 값 간의 비율값을 제공하여, 상기 비율값이 1 이상이면 목적 조직에 암 전이가 존재함을 나타내는 목적 조직에서 암 전이 진단에 이용될 수 있는 것인 이중-형광 나노프로브.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 프로테아제는 기질금속단백질분해효소(matrix metalloprotease, MMP)-2 또는 MMP-9인 것인 이중-형광 나노프로브.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블락 공중합체, 폴리비닐 알코올 또는 젤라틴인 것인 이중-형광 나노프로브.
  13. 제12항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블락 공중합체는 플루로닉 F-127인 것인 이중-형광 나노프로브.
  14. 삭제
  15. 제1항 내지 제6항, 제8항, 제12항 및 제13항 중 어느 하나의 항의 이중-형광 나노프로브를 포함하는 암 전이 검출용 조영제 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조영제 조성물은 대상자에게 비경구로 투여되는 것인 조영제 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 비경구 투여는 국소 투여, 정맥내 투여 또는 복강내 투여인 것인 조영제 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 조성물은 150분 이내에 암 전이를 형광 진단할 수 있는 것인 조영제 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 암은 뇌암, 신경 내분비 암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 포함하는 것인 조영제 조성물.
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