KR101385867B1 - 단백질분해효소 측정용 자성나노구조체, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

단백질분해효소 측정용 자성나노구조체, 이의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질분해효소 측정용 자성나노구조체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단백질분해효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이 자성나노입자에 결합되어 소광상태로 존재하는 자성나노구조체가 펩타이드 기질이 분해되면서 강한 형광을 나타내어 암, 염증성 질환 등의 진단, 치료 등에 사용할 수 있다.

Description

단백질분해효소 측정용 자성나노구조체, 이의 제조방법 및 이의 용도{Proteinase targetable opto-magnetic nanoprobes, method for preparing the probes and use thereof}
본 발명은 단백질분해효소에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이 결합되어 있어 단백질분해효소의 유무 및 활성도를 평가할 수 있고, T2-MR 조영제로 사용할 수 있어 암, 염증성 질환 등 질환 진단이 가능한 자성나노구조체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
주변 조직을 침습하고 원거리 기관으로 전이할 수 있는 능력이 인간 암 세포의 특징이기는 하나, 비침습성 암 세포를 검출하기 위한 분자 이미징 진단 양상은 이들 암세포의 표적과 관련하여 한계가 있어 어려운 문제이다.
효소적 활성에 따라 세포외 기질을 분해하고 변형할 수 있어 분자 이미징을 위한 매력적인 표적 중 하나인 기질 금속단백분해효소(metrix metalloproeinases, MMPs)는 비침습성 과정에 관여한다. 더욱 많은 증거가 막에 결합된 단백질분해효소의 서브클래스인 것으로 제시하고 있는 MMPs의 큰 패밀리 가운데 멤브레인 타입 기질 단백분해효소(membrane-type MMP)는 비침습성 암 세포 거동을 조절하는데 있어 중요한 역할을 담당하고 있다. 특히, MT1-MMP는 종양세포가 연결조직으로 침습하는데 직접적이고 필수적인 역할을 담당할 뿐만 아니라 분비되는 용해성 MMP에 비해 비침습성 암 세포를 측정하기 위한 분자 이미징을 위한 직접적인 세포 표적으로 제공된다.
최근 분자영상기법을 이용하여 단백질분해효소를 측정하는 방법이 개발되었다. 가장 대표적인 기술은 2001년 하버드 의과대학에서 개발된 단백질분해효소 영상화를 위한 자가소광물질(Self-quenching)이다. 상기 자가소광물질은 단백질분해효소에 의해 분해가 가능한 형광체-펩타이드 기질-생체 적합성 고분자와 화학적 결합으로 이루어져 있다. 근적외선 형광체가 서로 가까운 거리(수십 나노미터)에 있을 때 형광체의 발광(emission)과 여기 스펙트럼(excitation spectra)이 공유되어 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 원리에 의하여 형광체의 형광이 소광된다. 이에 상기 근적외선 형광체에 형광체-펩타이드가 결합되어 있을 시에는 형광체-형광체의 물리적 결합으로 형광이 소광되어 있다가 단백질분해효소에 의하여 펩타이드가 분해되고 이에 형광체-형광체의 거리가 멀어지면 형광이 복원되어 단백질분해효소의 발현 정도를 영상화할 수 있다. 광학 영상기법에서 가장 중요한 것은 신호 대 노이즈(signal-to-noise (S/N)) 비율이다. 배경(Backgound)의 형광이 높으면 표적으로 하는 생체분자 또는 조직에서의 영상 해상도(resolution)가 낮아질 수밖에 없다. 이에 형광체의 소광은 매우 중요하며 형광체가 소광상태에 있어 형광을 전혀 나타내지 않다가 원하는 생체 분자 또는 질환 부위에서 형광이 발광하면 높은 S/N 비율을 나타낼 수 있으며 결과적으로 선명한 영상을 얻을 수 있다. 상기 연구에서는 근적외선 형광체가 가까운 거리에 있을 때 형광이 소광되는 자가소광원리(self-quenching)를 이용하여 소광을 이루었다. 하지만 FRET에 기인한 자가소광은 형광체가 매우 가까운 거리에 있을 시 이루어지며 형광 소광율도 뛰어나지 못한 단점이 있다. 이를 해결하고자 다양하게 사용되고 있는 것이 소광체(quencher)이며, 다양한 소광체 중 완전 흡광체인 블랙홀 소광체(black hole quencher) 등은 다양한 흡수 파장을 가지고 있다. 일 예로, BHQ-1은 480 ∼ 580 nm, BHQ-2는 550 ∼ 650 nm, BHQ-3는 620 ∼ 730 nm 파장대의 형광을 매우 효율적으로 흡수한다. 형광체-펩타이드 기질-소광체의 단일 분자는 단백질분해효소에 의해 펩타이드 기질이 분해되면 형광이 복원되어 단백질분해효소 양을 측정할 수 있으며, 형광체-형광체 결합의 자가소광보다 높은 형광 소광율을 나타낸다. 그러나, 형광체-펩타이드 기질-소광체는 펩타이드 고유 특성인 낮은 생체 내 안정성 및 세포 비 투과성으로 반응액 내에서의 단백질분해효소 양을 정량적으로 분석하는 시험관내 키트(in vitro kit)에만 응용이 될 수 있다. 또한 형광체-펩타이드 기질-소광체의 단일 분자는 생체 내에서 영상화가 가능한 높은 형광 방출이 어렵기 때문에 생체 내에서의 단백질 발현을 실시간으로 측정하기에는 어려움이 있다.
1. 대한민국 공개특허 제2010-0026477호, 2010.03.10 2. 대한민국 공개특허 제2011-0038215호, 2011.04.14 3. 미국 공개특허 제2005/0181989호, 2005.08.18
본 발명의 목적은 세포 및 체내의 조직에서 발현되는 단백질분해효소의 유무 판별 및 활성화를 영상화할 수 있는 자성나노구조체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 자성나노구조체의 단백질분해효소의 활성 또는 정량 분석, 질병 진단 등의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 구조식 1로 표현되는 자성나노구조체를 제공한다:
[구조식 1]
Figure 112012013958463-pat00001

상기 식에서,
A는 형광체이고,
B는 단백질분해효소에 의해 분해되는 펩타이드 기질로서, 서열목록 서열번호 1 내지 13에 기재된 아미노산 서열 중 적어도 하나이며,
C는 상기 형광체의 발광을 흡수하여 소광 효과를 나타낼 수 있는 소광체이고,
D는 자성나노입자를 나타낸다.
본 발명은 또한
단백질분해효소에 의해 분해되는 서열번호 1 내지 13에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는 펩타이드 기질과 형광체 및 소광체를 반응시켜 형광체-펩타이드 기질-소광체 복합체를 제조하는 단계; 및
상기 복합체와 자성나노입자를 결합시켜 자성나노구조체를 제조하는 단계를 포함하는 자성나노구조체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 멤브레인 타입 1 기질 금속단백분해효소(membrane-type 1 matrix metalloproteinase)에 의해 분해되는 펩타이드 기질을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 자성나노구조체를 포함하는 단백질분해효소의 활성 또는 정량 분석용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 자성나노구조체를 포함하는 단백질분해효소의 과다발현을 억제하는 약물 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 자성나노구조체; 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 자성나노구조체; 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 자성나노구조체; 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 자성나노구조체; 및
진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브를 제공한다.
본 발명은 비침습성 암 세포에 고정된 MT1-MMP의 발현을 인지할 뿐만 아니라 이의 단백질분해 활성도를 측정할 수 있는 새로운 이미징 프로브를 제공하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 나노구조체를 이용한 표적 단백질분해효소의 활성도 측정 원리에 관한 모식도이다.
도 2는 MR에 의한 비침습성 암 세포에 고정된 MT1-MMP의 분자적 검출(i)과 형광 이미징에 의한 MR1-MMP의 단백질분해 활성도의 민감한 감지(ii)를 위한 본 발명의 자성나노구조체의 이중 이미징 과정의 모식도를 도시한 것이다.
도 3은 MT1-MMP에 특이적인 펩타이드 기질(서열번호 1 및 14) 별 MT1-MMP 반응에 따른 신호 회복 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 자성나노구조체에 따른 형광체-펩타이드 기질-소광체 결합 공정을 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 자성나노구조체(서열번호 1의 펩타이드 기질 포함, MNC-ActP), 서열번호 15의 펩타이드 기질을 포함하는 자성나노구조체(MNC-ScrP) 및 단백질분해효소 억제제(GM6001)의 병용 처리에 따른 단백질분해효소의 종류별 특이성 평가 결과를 나타낸 MR 이미지(상단), 형광 이미지(중간) 및 신호 회복 그래프(하단)이다.
도 6은 본 발명의 자성나노구조체의 농도별 형광 강도(그래프 내 사진) 및 이의 신호 회복 세기 그래프(a)와 결합된 형광 펩타이드(ActP)의 증가에 따른 표적화 효과 증대에 대한 그래프(b)를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 자성나노구조체의 단백질분해효소 활성도 평가 결과를 나타낸 것으로, a)는 본 발명의 자성나노구조체(MNC-ActP), 서열번호 15의 펩타이드 기질을 포함하는 자성나노구조체(MNC-ScrP) 및 상기 자성나노구조체(MNC-ActP)와 억제제를 도입한 마우스 종양 모델의 생체 내 광학 영상 사진이고, b)는 상기 a)의 광학 신호 그래프이다.
도 8은 본 발명의 자성나노구조체의 단백질분해효소 유무 평가 결과를 나타낸 것으로, a)는 본 발명의 자성나노구조체(MNC-ActP), 서열번호 15의 펩타이드 기질을 포함하는 자성나노구조체(MNC-ScrP) 및 상기 자성나노구조체(MNC-ActP)와 억제제를 도입한 마우스 종양 모델의 생체 내 자기공명 영상 사진이고, b)는 상기 a)의 자기공명 신호 그래프이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 질환과 관련하여 발현되는 단백질분해효소의 존재 및 그것의 효소적 활성에 대해 민감하고 매우 공간적 해상도를 갖는 이미징을 위해, 활성적인 형광 펩타이드를 디자인하고, 단백질분해효소에 대한 표적 모이어티와 단백질분해 리간드를 결합시키고 자성나노결정을 결합시켜 자기공명(MR) 이미징 조영제로서 합성하였다(MNC-ActFP). 콜로이드 MNC-ActFP의 자성 특징과 형광능은 다중양식 이미징 프로브로서의 능력을 평가하여 조사하였고, 세포 또는 체내에서 발현되는 질환 관련 단백질분해효소에 대한 MNC-ActFP의 실험관 내 및 생체 내 표적 가능성과 단백질분해 활성도는 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer, FRET) 효과에 기반을 두고 평가함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 하기 구조식 1로 표현되는 자성나노구조체를 제공한다:
[구조식 1]
Figure 112012013958463-pat00002

상기 식에서,
A는 형광체이고,
B는 단백질분해효소에 의해 분해되는 펩타이드 기질로서, 서열목록 서열번호 1 내지 13에 기재된 아미노산 서열 중 적어도 하나이며,
C는 상기 형광체의 발광을 흡수하여 소광 효과를 나타낼 수 있는 소광체이고,
D는 자성나노입자를 나타낸다.
본 발명의 자성나노구조체는 세포 및 체내에서 발현되는 단백질분해효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질에 형광체와 소광체를 결합하여 형광의 소광율을 극대화하고, 이를 생체적합성 자성나노입자에 결합하여 다양한 단백질분해효소에 특이적으로 반응하고 표적으로 하는 단백질분해효소에만 형광이 발생하도록 하여 단백질분해효소의 활성 및 정량 분석이 가능한 특징이 있다.
상기 자성나노구조체는 상기 구조식 1과 같이 형광체, 소광체 및 자성나노입자가 펩타이드 기질에 의해 서로 결합되어 있는 구조를 가질 수 있다.
상기 형광체 및 소광체는 펩타이드 기질과 각각 펩타이드 결합을 통해 결합될 수 있다. 따라서, 펩타이드 결합이 일어날 수 있는 펩타이드 기질의 아민기, 티올기 또는 카르복실기 등에 결합될 수 있다.
상기 자성나노입자는 펩타이드 기질의 아민기, 티올기, 또는 카르복실기 등과의 결합, 예컨대, 카보디이미드 결합 등을 통해 연결될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 자성나노구조체는 펩타이드 기질로 암 및 염증성 질환 부위에서 과다 발현되는 멤브레인 타입 1 기질 금속단백분해효소(membrane-type 1 matrix metalloproteinase)에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질, 즉 서열번호 1에 기재된 펩타이드를 사용하고, 형광체는 상기 펩타이드의 아민기에 결합되어 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5이며, 소광체는 상기 펩타이드의 카르복실기, 티올기, 아민기 등과 결합되어 상기 형광체의 형광을 흡수하여 소광효과를 극대화시킬 수 있는 BHQ-3(black hole quencher-3)일 수 있다. 또한, 자성나노입자는 상기 펩타이드의 N-말단의 아민기와 화학적으로 결합하여 소광형태의 형광체 A-B-C를 암 및 염증 부위에 특이적으로 전달할 수 있는 전달체 역할을 할 수 있다.
아울러, 이러한 자성나노입자는 나노입자를 기반으로 이루어져 있기 때문에, 세포 침투성을 가지고 있고, EPR(enhanced permeability retention) 효과에 의하여 생체 내 암 조직을 포함한 염증성 질환 부위에 특이적으로 축적이 가능하므로, 세포 및 생체 내 질환부위에서 특정적으로 발현되는 단백질분해효소의 발현 정도를 비침습적으로 측정 및 영상화 할 수 있다.
상기 펩타이드 기질은 단백질분해효소에 의해 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질을 사용할 수 있으며, 예컨대, MMP-2/9, MMP-7, MMP-13, MT1-MMP(멤브레인 타입 1 기질 금속단백분해효소, membrane-type 1 matrix metalloproteinase) 등을 포함하는 기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinases; MMP), 트롬빈, FXIIIa(factor Xiiia), 카스파제(caspase), 우로키나아제 플라스미노겐 활성제(urokinase plasminogen activator, uPA), 피지안(Fijian), 카텝신(cathepsins), HIV 프로테아제, DPP-IV(dipeptidyl peptidase) 또는 프로테아좀(proteasome) 등에 의해 특이적으로 분해되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드 기질은 서열목록 서열번호 1 내지 13에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나를 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 펩타이드 기질은 멤브레인 타입 1 기질 금속단백분해효소(membrane-type 1 matrix metalloproteinase)에 의해 특이적으로 분해되는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 펩타이드 기질의 표적 단백질분해효소 관련 질환은 하기 표 1에 도시한 바와 같다.
Figure 112012013958463-pat00003
상기 형광체는 가시광선 영역 또는 근적외선의 형광을 발광하는 형광체일 수 있고, 일 예로써, 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODYPY), 테트라메틸로드아민(Trtramethylrhodamine), 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine) 또는 기타의 형광을 발생시키는 형광체가 사용될 수 있다. 또한, 양자 수득량(quantaum yield)이 높은 형광체를 사용하는 것이 좋다. 상기 형광체 중 특히 시아닌계, 알렉사계는 근적외선 빛을 방출 및 흡수하므로 세포, 혈액 및 생체 조직 등과 간섭 또는 흡수가 최소화되므로 더욱 좋다.
상기 형광체가 결합된 펩타이드 기질에 화학적으로 결합된 소광체는 형광체가 발산하는 파장의 빛을 흡수하여 강한 소광효과(quenching effect)를 이룸으로써 펩타이드 기질이 특정 단백질분해효소에 의해 분해되지 않으면 형광이 발광되지 않으며, 이러한 소광효과는 형광체와 소광체의 거리가 수십 nm 이내에 있을 경우에 나타난다. 다시 말해, 특정 단백질분해효소와 반응하여 펩타이드 기질이 분해되면 펩타이드 기질에 결합된 형광체와 소광체가 서로 분리되어 멀어지면서 소광효과가 없어지고 이에 따라 형광체 고유의 형광을 발광하여 단백질분해효소의 정성 및 정량적 분석이 가능하게 된다.
본 발명에서 소광체는 형광체에서 나오는 빛의 파장을 흡수하여 소광효과를 최대화할 수 있는 소광체로 형광체의 발광파장과 같거나 거의 유사한 파장대의 소광체를 사용하여야 소광효과를 극대화할 수 있기 때문에 형광체의 발광 파장의 범위에 따라 사용되는 소광체의 종류가 달라질 수 있다.
본 발명에 있어서 소광체는 여기된(excited) 형광체의 에너지를 흡수하지만 형광 에너지를 밖으로 방출하지 않으므로 형광체의 형광을 소광시킬 수 있는 물질인 'dark quencher'로서, 상업적으로 널리 상용화되어 있는 블랙홀 소광체(black hole quenchers) (BHQ, WO01/86001, Biosearch Technologies, Inc. Novato, CA, USA) 또는 블랙베리 소광체(blackberry quencher) (Berry & Associates Inc. Dexter, MI, USA) 등을 사용할 수 있다.
상기 자성나노입자는 수용액 상태에서 나노입자들이 모여있는 자성나노클러스터(magnetic nanocluster, 또는 "MNC"라 함) 형태일 수 있고, 자성물질을 포함하는 코어부 및 상기 코어부를 둘러싸고 있으며, 외주면에는 관능기가 도입되어 있는 쉘부로 이루어진 구조를 가질 수 있다.
상기 자성나노입자는 직경이 1 내지 1,000 nm, 구체적으로 50 내지 500 nm일 수 있으며, 상기 직경이 1 nm 미만이면, 자성 민감도가 떨어져 영상화 효율이 저하될 우려가 있고, 1,000 nm를 초과하면, 생체로 투입된 자성나노입자가 혈관을 막는 등 생체로의 적용성이 저하될 우려가 있다. 상기와 같은 입자라면 그 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않으나, 금속물질, 자성물질 또는 자성합금으로 제조된 입자일 수 있다.
상기 금속물질의 예로는 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다.
자성물질의 예로는 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4 및 MxOy로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, 여기서 M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd 또는 Cr을 나타내고, x 및 y는 각각 0 < x ≤ 3, 및 0 < y ≤ 5를 만족하나 이에 특별히 제한하지는 않는다.
자성합금의 예로는 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다.
상기 자성나노입자는 유기 기능성 분자와 결합되어 있을 수 있다. 상기 유기 기능성 분자는 자성나노입자의 상태와 크기를 안정화시킬 수 있는 유기성 표면안정제 또는 계면활성제 등일 수 있다.
자성나노입자와 표면안정제의 결합은 자성나노입자의 전구물질에 표면안정제가 배위하여 착화합물을 형성하여 이루어질 수 있다.
상기 표면안정제로 양친매성 화합물을 들 수 있고, 상기 양친매성 화합물의 예로는 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌글리콜 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, 소듐 도데실 설파이트 및 폴리에틸렌 글라이콜 솔비탄 모노리트 계열 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 계면활성제는 알킬 트라이메틸암모늄 할라이드(alkyl trimethylammonium halide)를 포함하는 양이온 계면활성제; 올레산(oleic acid), 라우르산(lauric acid), 또는 도데실산(dodecylic acid)과 같은 포화 또는 불포화 지방산; 트리옥틸포스핀 옥사이드(trioctylphosphine oxide: TOPO), 트리옥틸포스핀(trioctylphosphine: TOP) 또는 트리부틸포스핀(tributylphosphine)과 같은 트리알킬포스핀; 트리알킬포스핀옥사이드, 올레익아민(oleic amine), 트리옥틸아민(trioctylamine) 또는 옥틸아민(octylamine)과 같은 알킬아민(alkyl amine); 알킬티올(alkyl thiol)을 포함하는 중성 계면활성제; 또는, 소디움 알킬 설페이트(sodium alkyl sulfate) 또는 소디움 알킬 포스페이트(sodium alkyl phosphate)을 포함하는 음이온 계면활성제를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 나노입자의 안정화 및 균일한 크기 분포를 고려할 때, 포화 또는 불포화 지방산 및/또는 알킬아민을 사용하는 것이 좋다.
본 발명은 또한
단백질분해효소에 의해 분해되는 서열번호 1 내지 13에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는 펩타이드 기질과 형광체 및 소광체를 반응시켜 형광체-펩타이드 기질-소광체 복합체를 제조하는 단계; 및
상기 복합체와 자성나노입자를 결합시켜 자성나노구조체를 제조하는 단계를 포함하는 자성나노구조체의 제조방법에 관한 것이다.
상기 제조방법에 있어서, 필요에 따라, 상기 방법으로 제조된 자성나노구조체를 정제 또는 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 펩타이드 기질은 적절하게 합성될 수 있고, 이러한 합성은 당업자에게 공지인 다양한 펩타이드 합성 방법, 예컨대, 고체상 합성법(solid phase synthesis)에 따른 에프목방법(Fmoc strategy)을 이용할 수 있다.
상기 펩타이드 기질과 형광체 및 소광체의 결합은 상기 펩타이드 기질의 N-말단 또는 펩타이드 중간부분에 있는 보호기를 제거하고, 펩타이드 기질의 말단 작용기와 결합할 수 있는 형광체를 반응시켜 펩타이드 결합시키고, 펩타이드의 한쪽 말단에 형광체가 결합된 펩타이드 기질의 나머지 말단에 있는 보호기를 제거하고, 이 말단 작용기와 펩타이드 결합할 수 있는 소광체를 반응시켜 얻을 수 있다. 또는 펩타이드 기질과 소광체의 결합 후 형광체와의 결합을 실시할 수도 있다.
상기 형광체와 소광체 사이의 거리는 형광체와 소광체 사이에서 발생하는 소광효과를 최대화하여, 형광체의 형광이 최소화될 수 있게 조절한다. 형광체와 소광체 사이의 거리를 수십 나노미터 이내로 유지시킴으로써 발생하는 소광효과에 의해서 형광체의 형광 세기가 최소가 되게 합성하는 것이 좋다.
상기 자성나노입자는 통상의 공지된 방법을 통해 제조할 수 있으며, 예컨대,
용매 하에서 금속 전구체와 계면활성제를 반응시키는 단계; 및
상기로부터 얻은 반응물을 열분해하는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.
상기 용매는 자성나노입자의 표면에 계면활성제가 배위된 착화합물의 열분해 온도보다 높은 끓는점을 가지는 화합물이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 옥틸 에테르(octyl ether), 부틸 에테르(butyl ether), 헥실 에테르(hexyl ether) 또는 데실 에테르(decyl ether)와 같은 에테르계 화합물; 피리딘 또는 테트라하이드로퓨란(THF)과 같은 헤테로고리화합물; 톨루엔, 자일렌, 메시틸렌 또는 벤젠과 같은 방향족화합물; 디메틸술폭사이드(DMSO)와 같은 술폭사이드화합물; 디메틸포름아마이드(DMF)와 같은 아마이드화합물; 옥틸알코올 또는 데칸올과 같은 알코올; 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 데칸, 도데칸, 테트라데칸 또는 헥사데칸과 같은 탄화수소, 또는 물을 사용할 수 있다.
상기 금속 전구체는 금속과 리간드가 결합된 금속 화합물, 금속과 음이온이 결합된 금속이온을 포함한 금속염, 또는 이들의 혼합염일 수 있다. 예컨대, 금속과 -CO, -NO, -C5H5, 알콕사이드(alkoxide) 또는 기타 공지의 리간드가 결합된 금속 화합물을 사용할 수 있으며, 구체적으로 아이언펜타카르보닐 (iron pentacarbonyl, Fe(CO)5), 페로센(ferrocene), 또는 망간카르보닐(Mn2(CO)10) 등의 금속 카르보닐 계열의 화합물; 또는, 철 아세틸아세토네이트(Fe(acac)3) 등의 금속 아세틸아세토네이트 계열의 화합물 등의 다양한 유기금속화합물들을 사용할 수 있다.
상기 금속과 Cl- 또는 NO3- 등의 공지된 음이온과 결합된 금속이온을 포함한 금속염은 삼클로로화철(FeCl3), 이클로로화철(FeCl2), 또는 철 나이트레이트(Fe(NO3)3)등을 사용할 수 있다.
상기 혼합염은 상기에서 언급한 2종 이상의 금속 전구체의 혼합물을 사용할 수 있다.
반응 조건은 특별히 제한되지 않으며, 금속 전구체 및 계면활성제의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 반응은 실온 또는 그 이하의 온도에서도 형성될 수 있으나, 통상적으로는 약 30 내지 200℃의 범위로 가열 및 유지시키는 것이 좋다.
자성나노입자 표면에 계면활성제가 배위된 착화합물을 열분해하여 자성나노입자를 성장시킬 수 있다. 이때 반응조건에 따라 균일한 크기 및 형상의 자성나노입자를 형성할 수 있으며, 열분해 온도 역시 금속 전구체 및 계면활성제의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 구체적으로, 약 50 내지 500℃에 반응시키는 것이 좋다.
상기 과정에서 제조된 자성나노입자는 공지의 수단을 통하여 분리 및 정제할 수 있다.
상기에서 수득한 자성나노입자는 유기용매에 용해시켜 오일상을 제조하고, 친수성 화합물을 수성용매에 용해시켜 수용상을 제조하며, 상기 오일상과 수용상을 혼합하여 에멀젼을 형성하고, 상기 에멀젼으로부터 오일상을 분리하여 나노입자들의 모임인 자성나노클러스터를 제조하는데 사용될 수 있다.
자성나노클러스터를 제조하는 방법에 관한 구체적인 방법 및 조건은 당업계에 잘 알려져 있으므로, 당업자는 공지의 방법을 반복 실험함으로써 이들을 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
예컨대, 상기 유기용매는 클로로포름, 헥산, 헵탄,메틸렌클로라이드, 벤젠, 톨루엔, 테트라하이드로퓨란, 아세톤 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 친수성 화합물은 상기 양친매성 화합물을 의미하며, 이의 종류는 전술한 바와 같다.
상기 오일상을 분리하는 과정은 통상의 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예컨대 교반하여 수행될 수 있다.
상기 과정을 거쳐 수득한 자성나노클러스터는 원심분리 및 겔 여과 컬럼에 적용하여 불순물을 제거하여 사용할 수 있다.
상기 형광체-펩타이드 기질-소광체 복합체와 자성나노입자의 결합은 특별히 제한하지는 않으나, 펩타이드 기질과 자성나노입자의 화학적 결합을 유도하여 제조할 수 있다. 예컨대, 본 발명에서는 생체 내 환경에서의 보다 높은 안정성을 위해 반응활성기를 자성나노입자 표면에 만들기 위해 표면 개질시키고, 본 발명의 펩타이드 기질은 말단에 자유 아민기를 가지고 있어 이들의 결합을 통해 자성나노구조체의 형성이 가능하다.
일 구체예에 따르면, 자성나노입자를 N-(3-디메틸프로필)-N-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-dimethylpropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC) 및 N-하이드록시술포숙신이미드(Nhydroxysulfosuccinimide, sulfo-NHS)로 표면 개질시켜 아민기를 가지는 자성나노입자를 제조한 다음, 상기 아민기를 가지는 자성나노입자를 복합체와 반응시켜 자성나노입자의 아민기와 펩타이드 기질의 카르복실기, 아민기 또는 티올기 등과 결합함으로써 나노구조체를 형성할 수 있다.
상기 자성나노입자의 표면을 아민기로 개질시키는 것은 암모늄 하이드록사이드(ammonium hydroxide), 에탄올(ethanol), 아미노프로필 트리메틸실란(aminopropyl trimethylsilane, APTMS), N-(3-디메틸프로필)-N-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-dimethylpropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC), N-하이드록시술포숙신이미드(Nhydroxysulfosuccinimide, sulfo-NHS) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 이루어진 군에서 선택되는 것으로 수행할 수 있다.
상기에서 제조된 나노구조체는 형광체, 소광체 및 펩타이드 기질을 쉽게 변경하고 제어 가능하기 때문에, 원하는 특정 단백질분해효소 및 원하는 파장대를 쉽게 제어할 수 있으므로, 다양한 단백질분해효소에 대해 설계할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 멤브레인 타입 1 기질 금속단백분해효소(membrane-type 1 matrix metalloproteinase)에 의해 분해되는 펩타이드 기질에 관한 것이다.
상기 펩타이드 기질은 공지된 MT1-MMP에 의해 특이적으로 분해되는 기질, 예컨대 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열(GPLPSRSW)에 대해 벌키 구조의 형광체 및 소광체의 결합이 가능하도록 3개의 아미노산 서열 스페이서가 추가된 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열(GPLPLRSWGLK)을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 자성나노구조체를 포함하는 단백질분해효소의 활성 또는 정량 분석용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 나노구조체는 펩타이드 기질을 쉽게 변경하고 제어 가능하기 때문에, 원하는 특정 단백질분해효소 및 원하는 파장대를 쉽게 제어할 수 있으므로, 다양한 단백질분해효소에 대해 설계할 수 있어, 전술한 종류의 단백질분해효소의 활성 또는 정량 분석이 가능하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 자성나노구조체를 포함하는 단백질분해효소의 과다발현을 억제하는 약물 스크리닝용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 자성나노구조체는 단백질분해효소의 활성 및 억제를 영상화를 통하여 빠르게 스크리닝할 수 있으므로 약물 스크리닝에 응용할 수 있고, 세포 및 조직에서 실시간 세포 영상화 및 비침습적 조직 영상화를 할 수 있다. 구체적으로, 상기 자성나노구조체는 생체 내 특정 조직 또는 세포에 존재하는 단백질분해효소의 존재 여부, 활성도, 및 활성 억제 등을 쉽게 판별해 낼 수 있어서 세포 영상, 특정 조직 영상, 약물전달체 등의 다양한 목적으로 사용될 수 있다.
아울러, 상기 조성물들은 생체 내(in vivo) 및 시험관 내(in vitro) 모두 적용이 가능하여, 신약 개발에 필요한 고성능 스크리닝(high-throughput screening) 방법 및 조기 질병 진단 등의 다양한 용도로 사용이 가능하다.
본 발명은 또한 상기 자성나노구조체; 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 자성나노구조체는 특정 단백질분해효소의 활성 또는 정량 분석이 가능하여 상기 단백질분해효소가 존재하는 세포 및 조직에서 실시간 세포 영상화 및 비침습적 조직 영상화가 가능하여 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 표적 부위의 이미징이 가능한 조영제로 사용할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 조영제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조영제 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조영제 조성물의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다.
또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.
본 발명의 조영제 조성물은 진단 대상에서 분리한 조직 또는 세포에 투여하여 자성나노구조체가 발산하는 신호를 감지하여 영상을 수득하는데 이용될 수 있다.
상기 자성나노구조체에 의해 발산되는 신호를 감지하기 위해서는 자기공명영상장치(MRI)와 광학 이미징의 이용이 바람직하다.
자기공명영상장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵에 에너지를 흡수시켜 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다. 특히 상기 자기공명영상장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기공명영상장치인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 자성나노구조체; 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 자성나노구조체는 특정 단백질분해효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질이 결합되어 있어 상기 단백질분해효소가 존재하는 세포나 조직에서 표적지향이 가능하고, 조직 특이적 결합성분이 추가로 결합되어 있는 경우 역시 표적지향이 가능하므로 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 표적 부위의 이미징이 가능한 조영제로 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 자성나노구조체; 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 자성나노구조체는 약제학적 활성성분과 물리 화학적으로 결합하여 질환과 관련된 단백질분해효소가 발현되는 세포 또는 조직에서 형광을 나타낼 수 있어 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 생체 분자의 분리, 진단 또는 치료 등의 나노 프로브 및 약물 또는 유전자 전달체(delivery vehicle)등에 이용할 수 있다.
상기 자성나노구조체를 이용한 생체 진단의 한 대표적인 예로서 분자 자기공명영상 진단 또는 자기 이완 센서(magnetic relaxation sensor)를 들 수 있다. 자성나노구조체는 그 크기가 커짐에 따라 더 큰 T2 조영효과를 나타내는데, 이러한 성질을 이용하면 생체 분자를 검출하는 센서로 사용될 수 있다. 즉, 특정한 생체 분자가 자성나노구조체의 엉김을 유도하게 되면 이에 의해 T2 자기 공명 영상 효과가 증대된다. 이러한 차이를 이용하여 생체 분자를 검출한다.
또한, 본 발명의 자성나노구조체는 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암을 진단 및/또는 치료하는데 이용될 수 있다.　또한, 류마티스 관절염, 골관절염과 같은 염증성 질환과, 치매, 뇌졸중 등을 포함하는 난치성 질환에서의 단백질분해효소를 영상화하는 방법에 이용될 수 있다.
보다 구체적으로 설명하면, 종양 세포는 정상 세포에서는 거의 또는 전혀 생산되지 않는 특정 물질을 발현 및/또는 분비하는데 이들을 일반적으로 "종양 마커(tumor marker)"라고 명명한다. 그러한 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 상기 나노구조체의 펩타이드 기질에 결합시켜 만든 나노구조체는 종양 진단에 유용하게 이용될 수 있다.　당업계에는 다양한 종양 마커뿐만 아니라 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되어 있다.
또한 상기 종양 마커는 작용 기작에 따라 리간드, 항원, 수용체, 및 이들을 코딩하는 핵산으로 분류할 수 있다.
종양 마커가 "리간드"인 경우에는 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 나노구조체에 도입할 수 있는데 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 또는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 리간드 및 이와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 예로는 시냅토타그민의 C2(synaptotagmin의 C2)와 포스파티딜세린, 아넥신 V(annexin V)와 포스파티딜세린, 인테그린(integrin)과 이의 수용체, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 이의 수용체, 안지오포이에틴(angiopoietin)과 Tie2 수용체, 소마토스타틴(somatostatin)과 이의 수용체, 바소인테스티날 펩타이드(vasointestinal peptide)와 이의 수용체 등이 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
종양 마커가 "수용체"인 대표적인 예는 난소암 세포에서 발현되는 폴산 수용체가 있다. 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 물질(폴산 수용체의 경우에는 폴산)이 본 발명에 따른 나노구조체에 도입될 수 있는데 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 항체가 적합할 것이다.
종양 마커가 "항원"인 경우 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 나노구조체에 도입할 수 있는데 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 항원 및 이와 특이적으로 결합하는 항체의 예로는 암성 태아성 항원(carcinoembryonic antigen - 대장암 표지 항원)과 허셉틴(Genentech, USA), HER2/neu 항원(HER2/neu antigen - 유방암 표지 항원)과 허셉틴, 전립선 특이 항원(prostate-specific membrane antigen - 전립선암 표지 항원)과 리툭산(IDCE/Genentech, USA) 등이 있다. 이러한 항체는 상업적으로 입수하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 일반적으로 포유동물(예, 마우스, 랫트, 염소, 토끼, 말 또는 양)을 적절한 양의 항원으로 1회 이상 면역화시킨다.　일정 시간 후 역가가 적정 수준에 이르렀을 때, 포유동물의 혈청으로부터 회수한다. 회수한 항체는 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고 사용 시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 이러한 방법의 상세한 사항은 당업계에 잘 알려져 있다.
한편, 상기 "핵산"은 전술한 리간드, 항원, 수용체 또는 이의 일부분을 코딩하는 RNA 및 DNA를 포함한다. 핵산은 당업계에 알려진 바와 같이 상보적인 서열 간에 염기쌍(base pair)을 형성하는 특징을 갖고 있기 때문에 특정 염기서열을 갖는 핵산은 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 이용하여 검출할 수 있다. 상기 효소, 리간드, 항원, 수용체를 코딩하는 핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 본 발명에 따른 나노구조체에 도입할 수 있다.
또한, 핵산은 5'- 및 3'- 말단에 -NH2, -SH, -COOH 등의 작용기가 있어 펩타이드 기질과 결합하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이러한 핵산은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌(Stein et al . Nucl . Acids Res. 1988, vol.16, p.3209)에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다(Sarin et al . Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 1988, vol.85, p.7448).
본 발명은 또한 상기 자성나노구조체; 및
진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브에 관한 것이다.
상기 진단 프로브는 T1 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브, 또는 방사선 동위원소 등을 사용할 수 있다.
상기 다중 진단 프로브는 예를 들면, 펩타이드 기질에 T1 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면 T2 자기공명영상 및 T1 자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있고, 광학 진단 프로브를 결합시키면 자기공명 영상과 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상과 PET, SPECT 진단을 동시에 할 수 있다.
상기 T1 자기공명 영상 진단 프로브로는 Gd 화합물, 또는 Mn화합물 등을 포함하며, 광학 진단 프로브로는 유기 형광 염료(dye), 양자점, 또는 염료 표지(dye labelled) 무기 지지체(예 SiO2, Al2O3))를 포함하며, CT 진단 프로브로는 I(요오드) 화합물, 또는 금 나노 입자를 포함하고, 방사선 동위원소로는 In, Tc, 또는 F 등을 포함한다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<제조예 1> 형광체-펩타이드 기질-소광체의 제조
형광체와 소광체가 결합된 펩타이드 기질을 제조하기 위해, 펩타이드는 고체상 합성법(solid phase synthesis)을 따라 에프목 방법(Fmoc strategy)으로 제조하고, 상기 제조된 펩타이드 서열에 형광체와 소광체를 화학적으로 결합하였다.
형광체로는 Cy5.5 (ex/em, 670/690)을 사용하였고, Cy5.5 형광체의 형광을 소광시킬 수 있는 소광체로는 BHQ-3 (abs. 620 nm∼730 nm) (Biosearch Technologies Inc.)를 사용하였다.
MT1-MMP 단백질분해효소에 선택적으로 분해되는 펩타이드 기질인 NH2-Gly-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Ser-Try-Gly-Leu-Lys(Fmoc)-COOH(서열번호 1)을 에프목(Fmoc) 펩타이드 합성방법으로 제조하고(도 3), 펩타이드 기질 2.1 mg에 근적외선 형광체인 Cy5.5-HNS 에스터 2.5㎎, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 8.9mg, 다이메틸설폭사이드 2mL에 녹인 후 12시간 상온에서 반응시켰다. 반응이 종료된 용액을 차가운 에틸 에테르 4mL로 침전시키고 원심분리하여 상등액을 제거한 후 차가운 에틸 에테르 2mL로 다시 세척하였다. 표면의 에틸 에테르를 제거한 후 진공 오븐(vacuum oven)으로 건조시켜 Cy5.5-Gly-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Ser-Try-Gly-Leu-Lys(Fmoc)-COOH 전구체를 제조하였다.
건조된 상기 펩타이드 전구체의 보호기를 탈보호하기 위하여, 상기 물질을 트리플로오로아세트산 0.1mL, 다이메틸설폭사이드 500㎕를 넣어서 5분 동안 상온에서 반응시켰다. 이를 다시 다이메틸설폭사이드 2mL에 분산시킨 후, 상기 물질 2㎎에 BHQ3-NHS 에스터 (Biosearch TechnologiesInc., 1.8㎎), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 5.2mg를 넣어 상온에서 12시간 반응시켰다(도 4 참조).
상기와 같이 형광체와 소광체가 결합된 Cy5.5-GPLPLRSWGLK(BHQ-3)-COOH 물질을 ActFP이라 명명하였다.
상기와 같은 방법으로 MT1-MMP에 반응하지 않는 Cy5.5-GPLPLRSW (BHQ-3)-COOH(서열번호 14) 및 Cy5.5-GPLPGASTGLL(BHQ-3)-COOH(서열번호 15: "ScrFP"라 명명함).
<제조예 2> 자성나노입자의 제조
6nm의 산화철 나노입자(MnFe2O4)는 라우르산(lauric acid)(0.6M) 및 라우릴 아민(0.6M)을 포함하는 290℃의 벤질에테르 용매에서 철 트리아세틸아세토네이트(Aldrich) 및 망간 트리아세틸아세토네이트를 열분해 화학반응(thermal decomposition)시켜 합성하였다(1시간).
또한, 12nm의 산화철 나노입자는 라우르산(0.1M), 라우릴 아민(0.1M), 상기 6nm 산화철 나노입자(8mg/mL), 철 트리아세틸아세토네이트 및 망간 트리아세틸아세토네이트를 포함하는 벤질에테르 용액을 300℃에서 1시간 동안 가열하여 제조하였다.
<실시예 1> 형광체-펩타이드 기질-소광체-자성나노입자의 나노구조체의 제조
상기 제조예 1 및 2에서 제조된 형광체-펩타이드 기질-소광체를 자성나노입자에 화학적으로 결합시켜 본 발명의 나노구조체를 제조하였다.
상기 제조예 2에서 상전이된 12nm 자성나노입자 0.4mg를 튜브에 담고 5mL의 PBS(pH7.4)에 첨가한 후 형광체-펩타이드 기질-소광체 2.1mg을 100㎕의 DMSO로 녹인 후 100㎕의 PBS(pH 7.4)를 첨가한 후 EDC(5mg) 및 Sulfo-NHS(5mg)를 첨가하여 상온에서 5시간 반응시켰다. 증류수 용액에서 24 시간 투석(dialysis)한 후 동결건조 시켰다.
<실험예 1> 나노구조체의 MT1-MMP 특이적 분해에 의한 광학 특성 변화 측정
상기 실시예 1에서 제조된 나노구조체의 MT1-MMP에 대한 선택 특이성을 관찰하였다. 각각의 펩타이드 기질(ActFP, ScrFP)을 단백질분해효소가 첨가된 반응액에 각각 첨가한 후 시간에 따라 복원되는 형광(fluorescent intensity, FI)을 측정하였다.
구체적으로, MT1-MMP에 특이적으로 반응하여 형광이 복원되는 ActFP, 복원되지 않는 ScrFP (각 10㎍/mL)를 활성화된, MMP-3, MMP-7 그리고 억제제 GM6001(1㎍/mL)에 첨가한 후 효소 분해반응에 의한 형광 발현을 관찰하였다. 각 MT1-MMP를 활성화하기 위하여 MT1-MMP를 펩타이드 하이드롤리시트 완충용액 반응액(0.05M Tris, 5mM 염화칼슘, 150mM NaCl, 0.025% 브리즈(Brij))에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰고, 활성화된 MT1-MMP를 각 96-웰에 200㎕의 반응액 상에서 나노입자 기반과 37℃에서 반응시킨 후 시간에 따른 형광 복원 정도를 형광분석기를 통하여 관찰하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, ActFP는 MT1-MMP, MT1-MMP+억제제, MMP-3, MMP-7에 60분간 반응 시 각각 1280, 90, 75, 42 배 형광이 복원되는 결과를 나타내었으며 ScrFP는 MT1-MMP에 대해 87배 복원되었음을 알 수 있었다.
<실험예 2> 나노구조체의 단백질분해효소의 농도에 대한 형광 복원 및 영상화
상기 실시예 1에서 제조된 나노구조체를 이용하여 단백질분해효소의 농도를 정량적으로 분석하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1과 동일한 실험방식으로, MT1-MMP 에 농도가 각각 0, 25, 50, 100, 200nmol/mL의 ActFP를 첨가하고, 37℃에서 60분간 반응시킨 후 형광 발광 정도를 형광분석기를 이용하여 관찰하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, ActFP 의 형광 발광이 첨가된 ActFP 의 농도에 따라 비례적으로 증가하므로 실험군의 발광도를 측정하는 것에 의해 검체 내의 특정 효소농도를 정략적으로 검출할 수 있음이 입증되었으며, 광학영상기기를 이용하여 영상화가 가능하였다.
<실험예 3> 암 질환 동물모델에서 나노구조체를 이용한 MT1-MMP 발현 및 암조직 영상화
섬유육종 세포주(HT1080)를 누드 마우스에 피하 이식하여 암 질환 동물모델을 만들고, 암 조직 크기가 5mm 이상 되었을 때 MNC-ActFP을 질환 동물에 정맥 투여하여 암 조직에서 발현되는 MT1-MMP 영상화를 통한 암 조직 영상화 가능성을 평가하였다.
섬유육종 세포주(HT1080)는 다량의 MT1-MMP를 발현하는 암 세포로 알려져 있다. 정상 마우스와 암 질환 마우스에 MNC-ActFP(200㎍, [Mn+ Fe])를 투여하고, 또한 암 질환 마우스에 MNC-ScrFP과 MT1-MMP 발현 억제제(GM6001)를 동시에 투여한 세 가지의 동물 실험군을 나누어 진행하였다. 광학 영상화는 eXplore OptixTMsystem을 이용하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 암 세포를 함유한 마우스(MNC-ActFP)에서는 강한 형광이 시간이 지남에 따라 밝게 발광함을 관찰할 수 있었다. 또한 MT1-MMP가 발현된 암 세포에서 나타난 강한 형광 복원은 MT1-MMP의 활성을 억제하는 MT1-MMP 억제제 및 MNC-ScrFP 투여 시에는 나타나지 않았다(MNC-ActFP+억제제). 이와 같이 MT1-MMP 활성 억제제를 투여 시 형광 복원율이 4.2 배 낮게 관찰되므로, MNC-ActFP은 생체 내 MT1-MMP가 과다 발현된 암 세포에 특이적으로 반응하여 강한 형광 발광을 나타낸 것이고, 이에 생체 내에서 발현되는 MT1-MMP 발현 정도 및 이에 기인한 암 세포를 특이적으로 영상화할 수 있음을 증명하였다.
또한, MT1-MMP를 과다 발현하는 암 조직에서 단백질분해효소 유무에 따른 표적화 실험을 하였다.
암 세포를 함유한 마우스에 상기 실험예와 동일한 방법으로 MNC-ActFP을 정맥 투여한 후, MT1-MMP 억제제를 투여한 마우스와 투여하지 않은 마우스에서 암 조직을 절개하여 형광 현미경을 이용하여 암 세포에 특이적으로 발광된 형광을 관찰하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 정상 마우스에서는 형광이 복원되지 않았지만, 암세포를 함유한 마우스의 암 조직에서는 강한 형광이 발현됨을 관찰할 수 있었다. 하지만, 상기 동물 실험결과와 같이 MT1-MMP 억제제를 처리한 암 조직에서는 형광 복원이 억제되어 형광 발광이 매우 낮음을 관찰할 수 있었다.
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Claims (18)

  1. 하기 구조식 1로 표현되는 자성나노구조체:
    [구조식 1]
    Figure 112013097234801-pat00004


    상기 식에서,
    A는 형광체이고,
    B는 멤브레인 타입 1 기질 금속단백분해효소(membrane-type 1 matrix metalloproteinase)에 의해 분해되는 펩타이드 기질로서, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되며,
    C는 상기 형광체의 발광을 흡수하여 소광 효과를 나타낼 수 있는 소광체이고,
    D는 자성나노입자를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서,
    형광체 및 소광체는 펩타이드 기질과 각각 펩타이드 결합되는 자성나노구조체.
  3. 제1항에 있어서,
    자성나노입자는 펩타이드 기질의 카르복실기, 티올기 및 아민기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 작용기에 결합되는 자성나노구조체.
  4. 제1항에 있어서,
    형광체는 가시광선 영역 또는 근적외선의 형광을 발광하는 것인 자성나노구조체.
  5. 제4항에 있어서,
    형광체는 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 알렉사 및 보디피로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 자성나노구조체.
  6. 제1항에 있어서,
    소광체는 형광을 소광시킬 수 있는 블랙홀 소광체(blackhole quencher) 및 블랙베리 소광체(blackberry quencher)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 자성나노구조체.
  7. 제1항에 있어서,
    자성나노입자는 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 구성된 군에서 선택되는 금속; Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MxOy (여기서, M 및 M'는 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, 0 < x ≤3, 0 < y≤5)로 구성된 군에서 선택되는 자성 물질; 또는 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 구성된 군에서 선택되는 자성 합금으로 제조된 것인 자성나노구조체.
  8. 멤브레인 타입 1 기질 금속단백분해효소(membrane-type 1 matrix metalloproteinase)에 의해 분해되고, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드 기질과 형광체 및 소광체를 반응시켜 형광체-펩타이드 기질-소광체 복합체를 제조하는 단계; 및
    상기 복합체와 자성나노입자를 결합시켜 자성나노구조체를 제조하는 단계를 포함하는 자성나노구조체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    자성나노입자는 아민기를 갖도록 표면 개질된 것인 자성나노구조체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    표면 개질은 암모늄 하이드록사이드(ammonium hydroxide), 에탄올(ethanol), 아미노프로필 트리메틸실란(aminopropyl trimethylsilane, APTMS), N-(3-디메틸프로필)-N-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(N-(3-dimethylpropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC), N-하이드록시술포숙신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide, sulfo-NHS) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 이루어진 군에서 선택되는 것으로 수행되는 자성나노구조체의 제조방법.
  11. 멤브레인 타입 1 기질 금속단백분해효소(membrane-type 1 matrix metalloproteinase)에 의해 분해되고, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드 기질.
  12. 제1항에 따른 자성나노구조체를 포함하는 멤브레인 타입 1 기질 금속단백분해효소(membrane-type 1 matrix metalloproteinase)의 활성 또는 정량 분석용 조성물.
  13. 삭제
  14. 제1항에 따른 자성나노구조체를 포함하는 멤브레인 타입 1 기질 금속단백분해효소(membrane-type 1 matrix metalloproteinase)의 과다발현을 억제하는 약물 스크리닝용 조성물.
  15. 제1항에 따른 자성나노구조체; 및
    약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물.
  16. 제1항에 따른 자성나노구조체; 및
    약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물.
  17. 제1항에 따른 자성나노구조체; 및
    약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물.
  18. 제1항에 따른 자성나노구조체; 및
    진단 프로브를 포함하고, 상기 진단 프로브는 영상 판독을 위한 표지 물질인 다중 진단 프로브.
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