CN111269287B - 一种可激活光学分子探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于恶性乳腺癌双模态成像的可激活光学分子探针P及P‑Dex。该分子探针不仅可以区分检测高恶性乳腺癌细胞与预后良好的乳腺癌细胞,还能够实现高恶性、预后差的三阴性乳腺癌的活体近红外荧光、光声定性定量分析诊断。此外,与小分子探针P相比,P‑Dex具有更优异的光学性能和生物相容性,且可以通过肾清除,具有更高的成像应用前景。本发明还提供了所述分子探针的制备方法及成像应用。
Description
技术领域
本发明涉及分子探针技术领域,具体涉及一种可激活光学分子探针及其制备方法与应用。
背景技术
乳腺癌是女性较常见的恶性肿瘤之一,其中三阴性乳腺癌(TNBC)占所有乳腺癌病理类型的10.0%~20.8%。三阴性乳腺癌是一类雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2均为阴性的乳腺癌亚型。三阴性乳腺癌具有特殊的生物学行为和临床特征,其治疗及预后较其他乳腺癌类型差。目前,临床上对乳腺癌的诊断多依赖于X线乳腺造影、乳腺导管造影、彩超等,其敏感性低、难以鉴别良恶性,而且恶性程度极大的三阴性乳腺癌仅能通过组织或细胞病理学检查确诊,其诊断对于肿瘤的发生发展具有一定的延后性。因此,早期诊断并深入了解其病理过程,对实现疾病的早发现、早治疗就显得尤为重要。
尿激酶型纤溶酶原激活物(尿激酶,uPA)是一种丝氨酸蛋白酶,分子量约为50kDa。作为蛋白水解酶,uPA的主要生物学功能是将纤溶酶原水解活化成纤溶酶。纤溶酶可以激活下游蛋白酶如MMP-2、MMP-9,进一步促进细胞外基质(ECM)的降解和肿瘤侵袭。此外,uPA通过对纤溶酶原的活化,激活释放各种生长因子(比如:TGF-β)来促进细胞分化、血管再生、肿瘤侵袭和转移。uPA已被证实在恶性乳腺癌中高表达,因此可以将其作为一种早期恶性乳腺癌的诊断及其治疗效果评价的新靶点。
可激活光学探针因其具有极高的灵敏度和特异性,使检测疾病早期分子水平的变化成为可能。现有诊断恶性乳腺癌的光学探针,主要是荧光探针,然而由于荧光信号穿透深度有限,在深层组织的成像中有极大的局限性。而与荧光成像相比,光声成像作为一种混合光学成像方式,因其在光激发后检测声波而不是光波,使散射减小至最低,从而提供更大的穿透深度和更准确的空间定位能力。因此,集合荧光和光声的双模态恶性乳腺癌探针具有相当广阔的临床应用前景。然而遗憾的是,目前为止,尚未见激活光声成像探针用于恶性乳腺癌的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于恶性乳腺癌双模态成像的可激活光学分子探针P及P-Dex。该分子探针不仅可以区分检测高恶性乳腺癌细胞与预后良好的乳腺癌细胞,还能够实现高恶性、预后差的三阴性乳腺癌的活体近红外荧光、光声定性定量分析诊断。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种可激活光学分子探针,所述分子探针为分子探针P,其具有如下所示的结构式:
本发明还提供了另一种可激活光学分子探针,所述分子探针为分子探针P-Dex,其具有如下所示的结构式:
本发明的分子探针P和P-Dex,含有能被恶性乳腺癌分泌的尿激酶特异性识别的多肽链Cbz-Gly-Gly-Arg(pbf)-OH,其能被尿激酶特异性识别并切除,具有良好的尿激酶生物靶向性。
本发明的分子探针P和P-Dex,以花菁染料为发光基团,在肽链被尿激酶特异性切除后,连接基团发生自消除反应,释放染料分子,开启荧光,具体激发波长为640nm,最大发射波长范围为712nm;同时,特异性开启超声信号,通过探测680-840nm的光声信号,重建出生物体组织光吸收分布图像。
本发明的分子探针P-Dex,在花菁染料侧链连接亲水性高分子生物化合物葡聚糖,葡聚糖的引入有助于提高探针的水溶性。葡聚糖的平均分子量为6000左右,分子量范围为5000-7500。
本发明还公开了所述的可激活光学分子探针P的制备方法,包括以下步骤:
(1)合成化合物B
将化合物A、1-羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、N,N'-二异丙基乙胺(DIPAE)溶于N,N-二甲基甲酰胺中,氮气保护,搅拌均匀;将对氨基苯甲醇溶于N,N-二甲基甲酰胺,加入上述反应液中,室温反应3-5小时;反应结束后使用高效液相色谱提纯获得化合物B;
(2)合成化合物C
取化合物B溶于无水四氢呋喃中,氮气保护,0℃搅拌预冷;取三溴化磷加入上述反应液,冰水浴反应2-3小时;反应结束后,加入3%的碳酸氢钠水溶液,乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥、将溶剂旋蒸抽干后再使用冷冻干燥机干燥后,得化合物C;
(3)合成化合物D
取化合物C、花菁染料CyN3OH溶于无水乙腈,加入N,N'-二异丙基乙胺,氮气保护,55℃反应3-4小时;待反应结束后使用高效液相色谱提纯得化合物D;
(4)合成分子探针P
取化合物D溶于二氯甲烷和三氟乙酸混合溶液,冰水浴下搅拌反应3小时;反应结束后加入二氯甲烷,再缓慢加入5%碳酸氢钠水溶液至无气泡产生,再使用去离子水萃取、有机相使用无水硫酸钠干燥、旋蒸抽干溶剂,使用高效液相色谱提纯得分子探针P;
其中,所述化合物A、化合物B、化合物C、花菁染料CyN3OH、化合物D的结构式如下所示:
进一步地,所述化合物A是采用固相合成的方法,以2-氯三苯甲基氯树脂为载体,无水N,N-二甲基甲酰胺为溶剂合成的,具体合成方法为:
取Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中,加入含有树脂的固相反应管中,摇床振荡;随后排出N,N-二甲基甲酰胺,使用含体积比20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc;
取Fmoc-L-Gly-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺,加入所述固相反应管,摇床振荡;随后排出N,N-二甲基甲酰胺,以20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc;
取Cbz-L-Gly-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺,加入所述固相反应管,摇床振荡;以1%三氟乙酸的二氯甲烷溶液将肽链从树脂上切割下来,经旋蒸浓缩、无水乙醚沉淀和干燥处理,得化合物A。
进一步地,所述花菁染料CyN3OH的合成方法为:
取NaN3,1-溴-4-氯丁烷(产物1)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺,室温搅拌,把反应液倒入超纯水中,乙醚萃取,无水硫酸钠干燥,旋蒸除去乙醚后,产物和NaI溶于丙酮中,60℃回流搅拌;反应结束恢复至室温,反应液倒入超纯水中,乙醚萃取,有机层用无水硫酸钠干燥,旋蒸除去乙醚得到产物2;
取2,3,3-三甲基-3H-吲哚(产物3),产物2溶于无水乙腈,88℃回流搅拌;反应结束后冷却,逐滴加入乙酸乙酯中,超声,离心,去除上层溶液,得黑色油状产物4;
取POCl3溶于二氯甲烷,逐滴加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液中,氮气保护,搅拌均匀;加入环己酮(产物5),80℃回流搅拌;反应结束回复至室温,倒入冰水混合物中,0℃密封保存,抽滤,冷冻干燥机干燥,得黄色产物6;
取产物4,产物6,醋酸钠溶于醋酸酐中,60℃搅拌,冷却,提纯,旋蒸干燥后,得金绿色产物7;
取4-氯间苯二酚(产物8)、K2CO3,氮气保护,搅拌;取产物7溶于N,N-二甲基甲酰胺,将产物7加入4-氯间苯二酚中,75℃搅拌;反应结束后冷却,提纯,旋蒸至干燥,得墨绿色产物花菁染料CyN3OH(产物9);
其中,所述产物2、产物4、产物6、产物7的结构式如下所示:
本发明还提供了所述可激活光学分子探针P-Dex的制备方法,包括以下步骤:
(1)合成Dextran-alkyne
取葡聚糖溶于二甲亚砜,加入NaH,搅拌;加入溴丙炔,搅拌过夜。反应结束后,加入超纯水,盐酸中和,透析袋(分子量3500D)透析48h,冷冻干燥机干燥,得产物Dextran-alkyne;
(2)合成分子探针P-Dex
取化合物P,CuSO4·5H2O,抗坏血酸钠,Dextran-alkyne溶于二甲亚砜和水的混合溶液中,氮气保护,搅拌反应;反应结束后,反应液逐滴加入丙酮中沉淀,离心,沉淀用超纯水溶解,透析袋(分子量3500D)透析,冷冻干燥机干燥,得分子探针P-Dex;
其中,所述Dextran-alkyne、P的结构式如下所示:
本发明还提供了所述可激活光学分子探针P、P-Dex在尿激酶检测中的应用。
本发明还提供了所述的可激活光学分子探针P、P-Dex在恶性乳腺癌检测中的应用,尤其是在三阴性乳腺癌检测中的应用。
本发明还提供了一种恶性乳腺癌检测试剂盒,该试剂盒中包括所述的可激活光学分子探针P或P-Dex。
本发明的有益效果:
1.本发明创造性地设计合成了一种用于恶性乳腺癌双模态成像的可激活大分子探针,为恶性乳腺癌,尤其是三阴性乳腺癌的早期诊断和鉴别诊断提供了一种新的方法。
2.本发明的可激活分子探针,仅在靶细胞内表现出不同的荧光及光声信号,且荧光发射波长及光声吸收波长均在650nm以上,远离生物体正常吸收信号,故具有较高的信噪比。
3.本发明的可激活大分子探针光学信号稳定,波长较长,穿透性好,能进行深层组织的诊断。
4.本发明的可激活大分子探针P-Dex具有良好的生物相容性,未见明显细胞毒性;且水溶性极好,可以在较短时间内被肾脏清除。
附图说明
图1是可激活光学分子探针P、P-Dex的合成路线图;
图2是花菁染料CyN3OH的合成路线图;
图3是Dextran-alkyne的合成路线图;
图4是在加入与不加入uPA(2.0*10-3U mL-1)时,在含有0.01%(v/v)吐温20的Tris缓冲液(50mM,pH=7.4)中,在37℃下20分钟,P或P-Dex(浓度为10μM)的紫外吸收光谱(a)和荧光(b),激发波长650nm;
图5是在加入与不加入uPA(2.0*10-3U mL-1)的情况下,高效液相色谱检测P(c)或P-Dex(d)的孵育混合物,以及在水中检测CyN3OH或CyN3OH-Dex,激发波长600nm;
图6是P和P-Dex对uPA的酶促动力学研究;
图7是当加入与不加入uPA(2.0*10-3U mL-1)时,在含有0.01%(v/v)吐温20的Tris缓冲液(50mM,pH=7.4)中,37℃下30分钟,P或P-Dex(20M)的光声(PA)光谱;
插图:在没有或存在uPA的情况下,P或P-Dex(10M)在700nm处的PA图像,误差条代表了三个独立测量值的标准偏差;
图8是MDA-MB-231细胞的荧光成像技术在用P-Dex或P(2μM)孵育2h;uPA抑制剂(4-CPG,50μM)孵育1h后P-Dex或P(2μM)孵育2h;以及用P-Dex或P(2μM)孵育MCF-7细胞2h;细胞核使用核染料(hoechst 33342)孵育20分钟,标尺:20μM;
图9是量化细胞(MDA-MB-231和MCF-7)与P-Dex或P孵化后的荧光强度,误差条代表了三个独立测量值的标准偏差;
图10是细胞悬液(MDA-MB-231或MCF-7)经P、P-Dex(5μM)或P-Dex(5μM)联合uPA抑制剂(4-CPG,50μM)处理8h后的PA谱,误差条代表了三个独立测量值的标准偏差,*:p<0.01;
图11是动物实验:uPA过表达肿瘤的体内近红外荧光成像(a)和光声(b)成像,P-Dex、P、P-Dex+uPA抑制剂4-CPG(提前半小时给药)静脉给药后不同时间点MDA-MB-231荷瘤小鼠的代表性近红外荧光(a)、PA(b)图像,以及P-Dex静脉给药后MCF-7荷瘤小鼠的图像;图a、b中,710nm处的近红外荧光强度和700nm处的PA强度增量随探针注射后时间的变化;
图12是图11中近红外荧光成像(a)和光声(b)成像的定量结果;在静脉注射探针后2小时,体内肿瘤实时PA强度增量谱(c)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例
1.合成化合物A
取0.5g树脂(约0.75mmol)加入固相反应管中,加入10mL无水N,N-二甲基甲酰胺,摇床10min以活化树脂后吸耳球吹去。取Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH 973.2mg(约1.5mmol)、HBUT682.6mg(约1.8mmol)、HOBT 273.9mg(约1.8mmol)、DIPEA 320μL(约1.8mmol)溶于3mL无水N,N-二甲基甲酰胺中,加入固相反应管,摇床5h。随后排出N,N-二甲基甲酰胺,以20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc。
取Fmoc-Gly-OH 446.0mg(约1.5mmol)、HBUT 682.6mg(约1.8mmol)、HOBT 273.9mg(约1.8mmol)、DIPEA 320μL(约1.8mmol)溶于3mL无水N,N-二甲基甲酰胺中,加入固相反应管,摇床3h。随后排出N,N-二甲基甲酰胺,以20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc。
取Cbz-Gly-OH 310.8mg(约1.5mmol)、HBUT 682.6mg(约1.8mmol)、HOBT 273.9mg(约1.8mmol)、DIPEA 320μL(约1.8mmol)溶于3mL无水N,N-二甲基甲酰胺中,加入固相反应管,摇床3h。以1%三氟乙酸的二氯甲烷溶液将肽链从树脂上切割下来,旋蒸浓缩,无水乙醚沉淀,干燥处理,得产物A。
2.合成花菁染料CyN3OH
取NaN3 660mg(约10mmol),1-溴-4-氯丁烷1152.3μL(产物1,约10mmol),溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中,室温搅拌20h后,把反应液倒入50mL超纯水中,乙醚萃取三次,无水硫酸钠干燥,旋蒸除去乙醚后,产物和NaI 2937.8mg(约20mmol)溶于10mL丙酮中,60℃回流搅拌48h。反应结束恢复至室温后,反应液倒入50mL超纯水中,乙醚萃取三次,有机层用无水硫酸钠干燥,旋蒸除去乙醚得到产物2。
取2,3,3-三甲基-3H-吲哚1g(产物3,约6.3mmol),产物2:1.55g(约6.9mmol)溶于5mL无水乙腈中,88℃回流搅拌4h。反应结束冷却至室温后,逐滴加入30mL乙酸乙酯中,边滴加边超声,3000rpm离心,去除上层溶液,可得黑色油状产物4。
取N,N-二甲基甲酰胺20mL(约250mmol)溶于10mL二氯甲烷中,0℃冰水浴预冷。取POCl3 9.5mL(约100mmol)溶于9mL二氯甲烷后,将POCl3缓慢逐滴加入N,N-二甲基甲酰胺溶液中,搅拌均匀,氮气保护。通过注射器加入环己酮2.5g(产物5,约25mmol),80℃回流搅拌3h。反应结束回复至室温,倒入100mL冰水混合物中,0℃密封保存12h,抽滤收集黄色晶状固体,冷冻干燥机干燥得黄色产物6。
取产物4,327.7mg(约1.27mmol),产物6,103.2mg(0.6mmol),醋酸钠54.12mg(约0.66mmol)用于5mL醋酸酐中,60℃搅拌3h。冷却至室温,过梯度硅胶色谱柱提纯,旋蒸干燥后,得金绿色产物7。
取4-氯间苯二酚60mg(产物8,约0.75mmol)、K2CO3 130.5mg(约0.75mmo),室温搅拌0.5h,氮气保护;随后,取产物7,64mg(约0.25mmol),溶于6mL N,N-二甲基甲酰胺中,将产物7用注射器缓慢加入4-氯间苯二酚中,75℃搅拌10h。反应结束后冷却至室温,过梯度硅胶柱提纯,旋蒸至干燥,得墨绿色产物花菁染料CyN3OH(产物9)。
3.化合物A与花菁染料的连接
化合物B的合成:取产物A 337mg(约0.5mmol)、HOBT 81mg(约0.6mmol)、HBTU227mg(约0.6mmol)、DIPAE 102μL(约0.6mmol)溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺中,氮气保护,室温搅拌20min,取对氨基苯甲醇123mg(约1mmol)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺后,加入反应液,室温搅拌3h。反应结束后过制备型高效液相色谱仪(高效液相色谱)提纯产物B。
化合物C的合成:取化合物B150mg(约0.19mmol)溶于2mL无水四氢呋喃中,氮气保护,0℃搅拌预冷。取PBr3 23μL(约0.29mmol)通过注射器加入反应液,0℃冰水浴搅拌3h。反应结束后,倒入3%的碳酸氢钠水溶液,通过乙酸乙酯萃取三次,无水硫酸钠干燥,旋蒸干燥的产物C。
化合物D的合成:取化合物C143mg(约0.17mg),花菁染料30mg(约0.06mmol)溶于3mL无水乙腈中,随后加入DIPEA 41μL(0.24mmol)加入反应液中,氮气保护,55℃搅拌4h。反应结束后,制备型高效液相色谱提纯产物D。
化合物P的合成:取化合物D 38mg(约0.03mmol)溶于二氯甲烷和三氟乙酸混合溶液(二氯甲烷/三氟乙酸,1:1.5mL),0℃冰水浴下搅拌3h。反应结束后加入30mL二氯甲烷稀释,缓慢滴加5%碳酸氢钠水溶液直至无气泡产生,随后用超纯水萃取两次,有机相无水硫酸钠干燥,旋蒸至干燥后,制备型高效液相色谱提纯得产物P。
4.探针与葡聚糖的连接
取葡聚糖1g(0.167mmol,cas No.:9004-54-0)溶于二甲亚砜后,加入NaH24mg(约1.0mmol),室温搅拌0.5h,加入溴丙炔30μL(约0.33mmol),室温搅拌过夜。反应结束后,加入超纯水,随后以1M的盐酸溶液中和,透析袋(分子量3500D)透析48h,冷冻干燥机干燥得产物Dextran-alkyne。
P-Dex的合成:取产物P10mg(约0.01mmol),CuSO4·5H2O 5.0mg(约0.02mmol),抗坏血酸钠10mg(约0.05mmol),Dextran-alkyne 60mg(约0.01mmol)溶于二甲亚砜和水的混合溶液中(二甲亚砜/水,1:1.5mL),氮气保护,室温搅拌过夜。反应结束后,反应液逐滴加入30mL丙酮中沉淀,离心后沉淀用超纯水溶解,透析袋(分子量3500D)透析48h后,冷冻干燥机干燥得最终产物P-Dex。
体外酶切实验
图4中a图是紫外-可见吸收光谱图,可以发现P和P-Dex在uPA存在的条件下,发生了紫外吸收的改变。b图是荧光光谱仪测得荧光信号,可以发现P和P-Dex在uPA存在的条件下,P-Dex在725nm处的荧光强度增强了12.7倍,而P只有9.6倍,这是由于uPA激活后产生的游离染料CyN3OH的水溶性较差造成的。
图5中a图为高效液相色谱分析,从图中可以发现,P与uPA共同孵育后,生成CyN3OH,即P与uPA反应的终产物。d图为P-Dex的高效液相色谱分析,同样的,P-Dex与uPA共同孵育后,P-Dex被uPA酶切生成CyN3OH-Dex。
图6为酶促反应动力学研究结果,可以发现uPA对P-Dex的酶催化效率明显高于P,约2.8倍。
图7为酶切反应体外光声结果。可以发现,在加入uPA后,P和P-Dex在680~720nm范围的吸收明显增加。
以上结果酶切实验结果说明:uPA的确与底物P和P-Dex发生酶切反应;随着酶切反应的进行,紫外吸收改变,荧光强度增加,且P-Dex在725nm处的荧光强度增强了12.7倍,而P只有9.6倍,这是由于uPA激活后产生的游离染料CyN3OH的水溶性较差造成的。在uPA存在的情况下,两种探针在690nm处的PA信号均明显升高,但P-Dex的信号较P高2.1倍,这与uPA处理后的吸收变化一致(图7)。
所有数据均证实,P-Dex在体外检测uPA时具有优于P的光学特性。
细胞实验
图8为细胞在经过P和P-Dex处理后的共聚焦显微镜拍下的结果,第一列为细胞核,第二列为P或P-Dex以及第三列为他们的融合(merge)图像,可以发现,P和P-Dex可以被MDA-MD-231人源乳腺癌细胞高表达的uPA特异性激活开启荧光,而加入了uPA抑制剂(4-CPG)抑制uPA活性后基本观察不到探针的荧光,进一步证明探针是由于uPA选择性激活的;对于uPA低表达的MCF-7人源乳腺癌细胞未见明显荧光;小分子P比P-Dex具有更高的荧光强度,是由于小分子P具有更高的细胞摄取率。
图9为细胞成像的定量结果。
图10为不同细胞不同处理手段后细胞悬液测得的光声信号。
总结:P与P-Dex对于uPA高表达的细胞可以实现高选择性、高特异性成像。
动物实验
图11为231细胞和MCF-7细胞的荷瘤小鼠不同处理方式后的活体成像结果。可以发现,由于其良好的水溶性,P-Dex组可以对MDA-MB-231肿瘤具有高效的富集且被肿瘤区域高表达的uPA激活产生荧光、光声信号,而P、P+4-CPG以及P-Dex-MCF-7组在肿瘤内未见明显荧光、光声信号。这说明P-Dex因其极好的水溶性和光学性能,在生物体内的成像效果优于P。
图12a为P与P-Dex在荷瘤小鼠肿瘤内的荧光强度随时间的变化关系,可以发现,与其他组相比,P-Dex处理的MDA-MB-231皮下瘤具有最高的强度,且在1.5小时强度达最高值。
b图为P与P-Dex在各种荷瘤小鼠肿瘤内的光声信号强度变化关系,结果与a图一致。
c图为在尾静脉注射P与P-Dex 2小时后,对其进行的光声强度的测定。可以发现,在680-720nm吸收范围内,P-Dex处理的MDA-MB-231皮下瘤光声信号最高,其余组较低,这支持了P-Dex在生物体内的成像效果优于P的结论。
通过以上实验结果可知,本发明成功地合成了一种双模态成像的可激活光学分子探针,该分子探针在与uPA作用后,可以特异性开启荧光信号和光声信号,因此可用于高表达uPA的恶性乳腺癌细胞定性、定量检测分析;uPA同时利用该分子探针实现了三阴性乳腺癌的活体荧光、光声定性、定量成像;该探针具有良好的生物相容性和可肾清除能力,未见明显生物毒性。总之,该可激活光学分子探针在恶性乳腺癌,尤其是三阴性乳腺癌的早期诊断和鉴别诊断提供了一种新的方法。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (3)
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述分子探针P-Dex的制备方法包括以下步骤:
(1)合成Dextran-alkyne
取葡聚糖溶于二甲亚砜,加入NaH,搅拌;加入溴丙炔,搅拌过夜,反应结束后,加入超纯水,盐酸中和,分子量3500D的透析袋透析48h,冷冻干燥机干燥,得产物Dextran-alkyne;
(2)合成分子探针P-Dex
取化合物P,CuSO4·5H2O,抗坏血酸钠,Dextran-alkyne溶于二甲亚砜和水的混合溶液中,氮气保护,搅拌反应;反应结束后,反应液逐滴加入丙酮中沉淀,离心,沉淀用超纯水溶解,分子量3500D的透析袋透析,冷冻干燥机干燥,得分子探针P-Dex;
其中,所述Dextran-alkyne、P的结构式如下所示:
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