CN114380786A - 基于氨基肽酶激活型化学发光探针及其在恶性肿瘤的活体检测与手术导航方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于氨基肽酶激活型化学发光探针及其在恶性肿瘤的活体检测与手术导航方面的应用，基于氨基肽酶(APN)在恶性肿瘤及新生血管中呈现特异性的高表达，本发明构建一种氨基肽酶激活型的化学发光探针，可与肿瘤部位高表达的氨基肽酶发生特异性反应，伴随强化学发光发射，实现活体肿瘤检测以及对原位实体瘤、转移瘤的快速成像，从而引导手术高效切除。

Description

基于氨基肽酶激活型化学发光探针及其在恶性肿瘤的活体检 测与手术导航方面的应用
技术领域
本发明涉及生物探针领域，具体涉及一种基于氨基肽酶激活型化学发光探针及其在恶性肿瘤的活体检测与手术导航方面的应用。
背景技术
恶性肿瘤是威胁人类健康的重要死因，其中实体瘤占比超过90％。目前恶性实体瘤的主要治疗手段仍然是手术。手术过程中，外科医生的眼睛依旧是决定手术切缘的主要“成像方式”，但由于人眼难以识别直径小于3毫米的病灶，因此微小病灶容易被遗漏，从而导致肿瘤复发。因此，对微小病灶的精确快速检测是亟待解决的问题。手术导航技术(即图像引导手术，是指将利用术前或术中成像，准确显像病灶，帮助术者判断切缘，或避开重要组织，使外科手术更快捷、更精确、更安全)的提出与发展可能导致癌症手术模式的转变，利用影像学技术提供实显像，能更精确引导医生进行判断，该技术有望改善患者的预后及降低整体医疗成本。
目前，术前成像主要技术包括电子计算机断层扫描(CT)、磁共振(MRI)，术前成像技术的提升，能促进恶性肿瘤的早期诊断、提高诊断的准确性和分期，有利于改进术前规划，对患者的预后转归有影响意义。
术中诊断技术主要包括病理学诊断与影像学诊断，其中，术中快速病理常指手术中快速冰冻活体组织病理学检查，进行切片及诊断的方法，是外科手术中是否进行扩大切除或淋巴结清扫的金标准，但快速病理需一系列化学及人为操作，费时费力的同时可能会改变组织样品的成分和形态，从而可能导致诊断上的偏差，且病理结论依赖于病理医生的经验，易增加患者被误诊的风险。而术中实时成像，临床常用的成像技术有超声或X射线透视成像，但其敏感性不足，缺乏靶向性，难以明确病灶部位。此外，X射线透视成像存在电离辐射危害、准确性依赖于操作者经验等缺点，且不适合含气脏器如肺、消化道及骨骼的成像。另外MRI和CT在术中也有一定应用，并起着相当重要的作用，但MRI和CT设备昂贵，成本较高，需要复杂的基础设施，难以在实际临床应用中推广。随着光学成像技术的发展，由于其高灵敏度、低成本、实时信号采集、高空间分辨率和无创性，荧光成像被认为是最有希望的检测方法之一。在近十年里，荧光手术导航技术已进入外科手术室，填补了术前成像与术中成像之间的空白。尤其是近几年来可激活探针的蓬勃发展，利用肿瘤高表达的生物标志物特异性地打开荧光信号，一定程度上提高了肿瘤检测的准确性和肿瘤切除的精确度，但同时由于荧光特性，使其在应用上受到一些固有的限制，包括光漂白、浅组织穿透深度和组织自发荧光。因此荧光探针的背景信号高，难以获得高信噪比图像，在区分微小病灶和正常组织上存在困难。
上述无论是CT、MRI或光学成像，造影剂的给药方式，多为全身给药，为了达到良好的成像效果，给药浓度较高，可能存在全身副作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于氨基肽酶激活型化学发光探针及其在恶性肿瘤的活体检测与手术导航方面的应用，基于氨基肽酶(APN)在恶性肿瘤及新生血管中呈现特异性的高表达，与新生血管生成及肿瘤侵袭转移具有密切关系，本发明构建一种氨基肽酶激活型的化学发光探针，可与肿瘤细胞膜表面的氨基肽酶作用，产生化学发光，从而实现原位实体瘤及转移瘤的快速成像，以实现对肿瘤的检测或引导手术切除。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面提供一种氨基肽酶激活型的化学发光探针，所述化学发光探针包含氨基肽酶特异性响应底物、自消除基团以及化学发光底物。
进一步地，所述化学发光探针的氨基肽酶特异性响应底物为L-丙氨酸，自消除基团为氨基苯甲醇，化学发光底物为高量子产率的丙烯酸酯基取代的苯氧基-二氧杂环丁烷。
进一步地，所述化学发光探针的结构式如下所示：
Figure BDA0003429327530000031
简称为APN-ACLP。
进一步地，所述APN-ACLP的制备方法如下所示：
Figure BDA0003429327530000032
进一步地，上述反应①中，通过薄层色谱测试反应液，监测反应进程；反应②中，通过高效液相色谱法测试反应液，监测反应进程。
进一步地，所述化学发光探针与氨基肽酶作用发光，所述发光的发射峰为540nm。
进一步地，所述化学发光探针对生物组织的穿透深度不低于2cm。
进一步地，所述化学发光探针对氨基肽酶的检测限为0.056ng/mL。
本发明第二方面提供了一种基于氨基肽酶激活型化学发光探针在恶性肿瘤手术导航方面的应用。
进一步地，所述氨基肽酶激活型化学发光探针包含第一方面所述的化学发光探针。
进一步地，所述化学发光探针通过在恶性肿瘤部位喷洒的方式给药。
进一步低，所述化学发光探针在恶性肿瘤手术导航中的使用方法具体为：手术过程中，将化学发光探针喷洒至病灶组织区域，进行化学发光成像，根据图像信息区分手术区域和边界，切除肿瘤，切除后再次将化学发光探针喷洒在病灶组织区域，确定残余组织不再发光，进行缝合。
进一步地，所述化学发光探针与所述恶性肿瘤的过表达氨基肽酶作用，释放化学发光。
进一步地，所述恶性肿瘤包括但不限于肝癌、纤维肉瘤、乳腺癌及其相关的转移肿瘤。
本发明第三方面提供了一种基于氨基肽酶激活型化学发光探针在活体恶性肿瘤检测方面的应用。
进一步地，所述氨基肽酶激活型化学发光探针包含第一方面所述的化学发光探针。
进一步地，所述化学发光探针通过注射的方式给药。
进一步地，所述化学发光探针与所述恶性肿瘤的过表达氨基肽酶作用，释放化学发光。
进一步地，所述恶性肿瘤包括但不限于肝癌、纤维肉瘤、乳腺癌及其相关的转移肿瘤。
本发明第四方面提供了一种包含第一方面所述化学发光探针的组合物在恶性肿瘤的活体检测及手术成像方面的应用。
进一步地，所述组合物还包含一种或多种药学上可接受的药物和/或辅料。
上述应用中，所述APN-ACLP与肿瘤细胞表面的氨基肽酶的作用机理为：APN-ACLP在肿瘤的过表达氨基肽酶的作用下，其识别基团被识别水解，相连的氨基苯甲醇自发断裂，释放二氧杂环丁烷，在生理条件下去质子化，进一步裂解，同时释放出强的化学发光。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明设计合成处一种氨基肽酶激活型的化学发光探针，可通过与氨基肽酶作用识别氨基肽酶高表达的肿瘤细胞，由于上述作用通过一步酶切反应，反应速率快，且制备的化学发光探针具有高量子产率，可在短时间内释放大量光子，无需激发介质，背景信号低、信噪比高，实现快速成像，可应用于活体恶性肿瘤的检测。
2.将氨基肽酶激活型的化学发光探针应用于恶性肿瘤手术导航中，可直接进行局部喷洒给药的方式，探针的组织穿透深度大于2cm，满足术中成像的要求，且操作简便，可大大缩短手术时长；此外，通过上述方式在手术中引导术者进行手术切除，可减少微小肿瘤的遗漏，降低术后的复发率，同时局部给药的方式可减少用药剂量，从而避免了给药过量而产生较大的副作用。
附图说明
图1为APN-ACLP与氨基肽酶的作用机理图；
图2a为APN-ACLP与氨基肽酶相互作用的化学发光动力学曲线；
图2b为APN-ACLP与氨基肽酶在37℃孵育下相互作用10小时后的吸收光谱；
图2c为APN-ACLP与氨基肽酶在37℃孵育下相互作用10小时后的荧光光谱；
图2d为APN-ACLP与氨基肽酶反应前后的高效液相色谱；
图2e为APN-ACLP与含不同离子或物质的碱性磷酸酶以及氨基肽酶孵育20分钟后的化学发光强度；
图2f为APN-ACLP探针及与氨基肽酶在不同pH的缓冲液中孵育20分钟的化学发光信号；
图3a为APN-ACLP探针与不同浓度氨基肽酶相互作用20分钟的化学发光图像；
图3b为APN-ACLP探针与不同浓度氨基肽酶相互作用20分钟的化学发光强度与氨基肽酶浓度的线性关系；
图3c为APN-ACLP探针与氨基肽酶反应20分钟所发出的化学发光通过不同厚度的鸡胸肉组织后所能捕获的化学发光(CL)和荧光(FL)图像；
图3d为图3c中的化学发光及荧光的信噪比，其中误差条代表了三个独立测量值的标准偏差；
图4a为向皮下异位种植的肝肿瘤内注射APN-ACLP探针和氨基肽酶抑制剂+APN-ACLP探针后，在不同时间的化学发光及荧光图像；
图4b为给药(APN-ACLP探针、氨基肽酶抑制剂+APN-ACLP探针)后肿瘤部位随时间变化的化学发光的定量曲线；
图4c为给药(APN-ACLP探针、氨基肽酶抑制剂+APN-ACLP探针)后肿瘤部位随时间变化的化学发光及荧光的信噪比变化。误差条代表了三个独立测量值的标准偏差；
图5a为对离体肝肿瘤与肝脏喷洒APN-ACLP探针前和喷洒后10分钟的化学发光和荧光图像；
图5b为喷洒APN-ACLP探针后不同时间点的化学发光与荧光的肿瘤正常组织比(TNR)，误差条代表了三个独立测量值的标准偏差；
图5c为利用化学发光图像引导小鼠原位肝肿瘤手术，右侧为切除的肿瘤的病理染色结果，其中比例尺代表500微米；
图5d为化学发光图像引导腹腔转移模型的微小肿瘤切除，在可疑肿瘤部位喷洒探针前和后10分钟记录的化学发光成像，以及在化学发光引导下切除的微小转移灶，其中比例尺代表5毫米；
图5e为图5d中切除的肿瘤的病理染色结果，比例尺代表500微米。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1制备氨基肽酶激活型的化学发光探针ANP-ACLP
ANP-ACLP的制备方法如下所示：
Figure BDA0003429327530000071
主要包含两个反应过程，①由化合物A与化合物B合成化合物C；②由化合物C与二乙胺反应制备得到目标化合物ANP-ACLP。具体的制备步骤如下所示：
①合成化合物C
将57mg的化合物A(0.120mmol)、31mg的化合物B(0.08mmol)、45mg的NaI(0.3mmol)和21mg的K2CO3(0.15mmol)加入到2mL的无水DMF中。室温下搅拌6h，用薄层色谱(正己烷:乙酸乙酯＝2:1)进行监测。反应结束后，在反应溶液中加入20mL的乙酸乙酯，用去离子水洗涤(20mL/次，3次)、分离，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤后旋掉有机溶剂，所得的混合物经硅胶柱纯化得到33.1mg的化合物C(产率为52.5％)。
对化合物C进行核磁氢谱、碳谱以及质谱表征，表征结果如下所示：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.35(br,1H),7.90(d,J＝16.2Hz,1H),7.76(d,J＝7.5Hz,2H),7.59-7.51(m,4H),7.43-7.37(m,5H),7.29(t,J＝7.3Hz,2H),7.07(d,J＝8.0Hz,1H),6.43(d,J＝16.2Hz,1H),5.40(br,1H),4.97(d,J＝4.2Hz,2H),4.46(m,3H),4.22(t,J＝6.8Hz,1H),3.79(s,3H),3.33(s,3H),3.28(s,1H),2.07-1.66(m,13H),1.48(d,J＝6.7Hz,3H)。
13C NMR(100MHz,CDCl3):δ＝166.7,153.2,143.2,140.9,139.0,138.5,137.8,132.0,129.3,127.4,126.7,124.5,119.4,75.3,66.9,56.8,51.4,46.7,38.6,38.2,36.7,33.1,31.5,29.4,29.0,22.9,22.3,18.0,13.7。
MALD-TOF-MS:Calcd.For C47H47ClN2O7Na[M+Na]+:809.2969；Found:809.966。
②合成ANP-ACLP
取30mg上述制备的化合物C(0.038mmol)溶解于1mL的DMF中，加入0.25mL的二乙胺，得到混合物。将混合物在室温下搅拌1小时，并用高效液相色谱进行监测。反应完成后，减压除去溶剂，将剩余物溶解在10mL的二氯甲烷中，加入3mg的亚甲基蓝，通氧并用白光进行照射。反应溶液用高效液相色谱法进行监测，反应结束后，减压除去溶剂，用制备型高效液相色谱进行纯化，得到14mg的白色固体APN-ACLP(产率为62％)。
对APN-ACLP进行核磁氢谱、碳谱以及质谱表征，表征结果如下所示：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝9.84(s,1H),7.88(d,J＝8.2Hz,1H),7.77(d,J＝16.3Hz,1H),7.57-7.40(m,3H),7.30(d,J＝6.6Hz,2H),6.41(d,J＝16.0Hz,2H),4.83(s,2H),4.36(br,1H),3.74(s,3H),3.18(s,3H),3.00(s,1H),1.93.-1.42(m,16H)。
13C NMR(100MHz,CDCl3):δ＝167.5,154.2,138.7,137.5,135.4,132.2,131.4,129.7,125.2,120.5,111.7,96.3,75.9,52.0,49.7,47.0,39.3,36.3,33.6,31.9,31.5,29.7,27.5,26.1,25.8,23.3,22.7,17.2,14.1。
HR-MS:Calcd.For C32H38ClN2O7[M+H]+:597.2368；Found:597.2339。
ANP-ACLP探针的性能研究
①体外评价探针的响应能力
将10μM的ANP-ACLP探针与200ng/mL氨基肽酶相互作用，观察其化学发光强度随时间的变化，其动力学曲线如图2a所示，在短时间内(10min左右)，可达到最大的发光强度；
将ANP-ACLP探针与人重组氨基肽酶APN在37℃下孵育10小时后，表征探针与氨基肽酶反应前后的吸收光谱以及荧光光谱，表征结果分别如图2b、2c所示，反应后的混合溶液在400nm激发下可产生相应的荧光，峰值为550nm左右；此外，测试探针以及探针与氨基肽酶反应后溶液的高效液相色谱，结果如图2d所示，保留时间发生变化，说明探针与氨基肽酶发生化学反应，生成新化合物；
将ANP-ACLP探针与100μM的ClO-、H2O2、NO2 -、ONOO-、1O2、CO3 2-、HCO3 -、CH3CO3 -、谷胱甘肽(GSH)、100U/L的碱性磷酸酶以及100ng/mL氨基肽酶分别孵育20min，测试各溶液的化学发光强度，如图2e所示，由图可知，ANP-ACLP探针仅在氨基肽酶溶液中产生强化学发光，该现象说明ANP-ACLP探针对氨基肽酶具有特异选择性；
此外，将ANP-ACLP探针与氨基肽酶在不同pH的缓冲液中孵育20分钟，测试反应后溶液的化学发光信号，结果如图2f所示，由图可知，ANP-ACLP探针与氨基肽酶在pH为7左右的缓冲液中反应后的化学发光强度最高。
②探针的灵敏度及组织穿透性研究
灵敏度研究：将一定浓度的ANP-ACLP探针分别与不同浓度(0、2、5、10、25、50、100、200，单位为ng/mL)的氨基肽酶在体外进行孵育，平行进行3组实验，孵育后采集各溶液的化学发光图像，结果如图3a所示，随着氨基肽酶浓度的增加，产生化学发光的强度越高，并将其化学发光强度与氨基肽酶的浓度进行线性拟合，如图3b所示，其拟合优度R2达到0.98，根据拟合的线性关系，计算可得最低检测下限低至0.056ng/mL。
组织穿透性研究：将ANP-ACLP探针与氨基肽酶孵育20分钟后，在相应溶液上覆盖不同厚度(0、0.5、1.0、1.5、2.0，单位为cm)的鸡胸肉，检测组织中穿透出的化学发光和荧光(荧光成像的激发波长为430nm)，结果如图3c所示，随着鸡胸肉厚度的增加，透过的化学发光强度减弱，而荧光的强度无明显变化，推测由于背景信号过高导致；进而对比化学发光和荧光的信噪比，结果如图3d所示，化学发光的信噪比明显高于荧光的信噪比，高信噪比有利于区分病灶和正常组织。
实施例2ANP-ACLP探针在体内肿瘤的成像
使用活体光学成像系统进行化学发光及荧光成像研究：使用氨基肽酶高表达的人源性肝癌细胞HepG2在4组小鼠体内建立异位肿瘤模型，其中2组小鼠，提前半小时在肿瘤内注射氨基肽酶抑制剂(BT)，再对4组小鼠均进行瘤内ANP-ACLP探针溶液(通过将ANP-ACLP化合物溶解在DMSO中，配置成1mM的溶液，再用PBS缓冲液稀释至10μM)的注射。
对其中一组仅注射ANP-ACLP探针溶液以及另一组先注射BT再注射ANP-ACLP探针溶液的小鼠进行化学发光成像研究，对注射ANP-ACLP探针溶液0、10、20、30、40min后的两组小鼠进行化学发光成像，结果如图4a中CL image所示，先注射BT的小鼠，注入ANP-ACLP探针溶液后未产生化学发光现象，另一组仅注入ANP-ACLP探针溶液的小鼠，在肿瘤部分产生化学发光现象，进一步研究给药后肿瘤部位的化学发光强度与时间的变化关系，如图4b所示，在ANP-ACLP探针溶液注入10min示，化学发光强度最强。
另外，对其中一组仅注射ANP-ACLP探针溶液以及另一组先注射BT再注射ANP-ACLP探针溶液的小鼠进行荧光成像研究，荧光成像的激发波长为430nm，对注射ANP-ACLP探针溶液0、10、20、30、40min后的两组小鼠进行荧光成像，结果如图4a中FL image所示，由于小鼠其他组织的背景信号过高，无法准确找出病灶组织。
在不同给药以及不同成像方式下，上述四组小鼠肿瘤部位的化学发光或荧光的信噪比随时间的变化如图4c所示，图中误差条表示三个独立测量值的标准偏差，由图可知，在相同时间下，注射ANP-ACLP探针溶液在肿瘤处产生的化学发光的信噪比远高于荧光成像的信噪比。
实施例3化学发光引导手术切除
①离体喷洒实验：在异位肿瘤小鼠中手术切除肿瘤与正常肝组织，在肿瘤和正常肝组织上喷洒ANP-ACLP探针溶液，作用10min后，采集其化学发光及荧光信号，结果如图5a所示，通过化学发光的方式可明显区分肿瘤与正常肝组织，进而计算肿瘤正常组织的光强度比，结果如图5b所示，化学发光的方式可更好的区分病灶和正常组织。
②化学发光引导肝部肿瘤的切除：首先在小鼠体内建立人源性肝癌HepG2的原位模型，暴露肝脏，在肝右叶注射高浓度的细胞悬液，后关闭腹壁，缝合伤口。建模后7-10天进行手术切除。利用化学发光图像引导小鼠原位肝肿瘤手术如图5c所示，具体的手术过程为：先切开小鼠的腹壁，暴露肝区，在其表面喷洒ANP-ACLP探针溶液，10分钟后进行化学发光成像；根据图像信息进行手术区域与手术边界的判断，切除肝部肿瘤；术后再次进行喷洒，确定残余肝组织不再发光，关闭腹部，缝合腹壁。
③化学发光引导转移肿瘤的切除：首先将乳腺癌细胞悬液腹腔注射进入小鼠体内，约5-7天进行成像。利用化学发光图像引导腹腔转移模型的微小肿瘤切除如图5c所示，具体的手术过程为：在小鼠处于麻醉状态下时，打开腹壁，肉眼观察并未发现任何可疑肿瘤，喷洒ANP-ACLP探针溶液，10分钟后采集化学发光信号；从化学发光成像中发现又多个发光团，根据图像位置探寻微小肿瘤，共发现5块肿瘤，并切除；再次喷洒腹部及切除肿瘤，采集化学发光信号成像，腹部并未发现其余发光团，关闭腹部，缝合腹壁。将上述切除肿瘤进行病理学分析，结果如图5e所示，病理染色结果显示通过化学发光图像引导腹腔内微小肿瘤切除的准确性高。
从上述性能表征及实施例可知，氨基肽酶激活的化学发光探针能特异性的被氨基肽酶快速识别，并发出强的化学发光，具有很高的灵敏度与穿透性。通过动物实验数据验证，ANP-ACLP探针能应用于活体肿瘤的检测、术中的肿瘤及微小转移瘤的快速成像，进而引导术者进行手术切除，减少微小肿瘤的遗漏，降低术后复发率。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种基于氨基肽酶激活型化学发光探针，其特征在于，所述化学发光探针的分子结构中包含氨基肽酶特异性响应底物、自消除基团以及化学发光底物；所述氨基肽酶特异性响应底物为L-丙氨酸，自消除基团为氨基苯甲醇，化学发光底物为丙烯酸酯基取代的苯氧基-二氧杂环丁烷。
2.根据权利要求1所述的一种基于氨基肽酶激活型化学发光探针，其特征在于，所述化学发光探针的结构式如下所示：
Figure FDA0003429327520000011
3.根据权利要求2所述的一种基于氨基肽酶激活型化学发光探针，其特征在于，所述化学发光探针与氨基肽酶作用发光的发射峰为540nm；所述化学发光探针对氨基肽酶的检测限为0.056ng/mL。
4.根据权利要求1所述的一种基于氨基肽酶激活型化学发光探针，其特征在于，所述化学发光探针对生物组织的穿透深度大于2cm。
5.一种权利要求1～4任一项所述的氨基肽酶激活型化学发光探针在恶性肿瘤手术导航方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述化学发光探针通过在恶性肿瘤部位喷洒的方式给药；所述化学发光探针在恶性肿瘤手术导航中的使用方法具体为：将化学发光探针喷洒至病灶组织表面，进行化学发光成像，根据图像信息区分手术区域和边界，切除肿瘤，切除后再次将化学发光探针喷洒在病灶组织表面，确定残余组织不再发光，进行缝合。
7.一种权利要求1～4任一项所述的氨基肽酶激活型化学发光探针在活体恶性肿瘤检测方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述化学发光探针通过注射的方式给药。
9.根据权利要求5或7所述的应用，其特征在于，所述化学发光探针与所述恶性肿瘤中的过表达氨基肽酶作用，释放化学发光；所述恶性肿瘤包括肝癌、纤维肉瘤、乳腺癌及其相关的转移肿瘤。
10.一种包含权利要求1-4任一项所述的化学发光探针的组合物在恶性肿瘤的活体检测及手术成像方面的应用，其特征在于，所述组合物还包含一种或多种药学上可接受的药物和/或辅料。
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