CN115109119A - 一种近红外荧光探针、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种近红外荧光探针、制备方法及其应用。本发明的近红外荧光探针具有式1所示的结构：Ra‑Rb，式1；其中，Ra为含有琥珀酰亚胺酯的近红外荧光染料化合物，Rb为Arg‑Leu‑Asn‑Val‑Gly‑Gly‑Thr‑Tyr‑Phe‑Leu‑Thr‑Thr‑Arg‑Gln肽链或Tyr‑Phe‑Leu‑Thr‑Thr‑Arg‑Gln肽链中的α‑氨基脱去一个氢原子后的基团。本发明的近红外荧光探针可以选择性的标记肿瘤细胞，尤其是肝细胞癌(HCC)，实现了对HCC病灶组织的主动靶向荧光成像。

Description

一种近红外荧光探针、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学成像技术领域，特别涉及一种近红外荧光探针、制备方法及其应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是全球癌症相关死亡的第三大原因，HCC患者通常诊断为晚期，因此HCC的预后往往较差。目前，手术切除和局部消融治疗仍是HCC的标准治疗方法，然而这些治疗方法并不能治愈大多数患者。所以寻找更加有效的治疗方法显得尤为重要，而为了开发新的治疗方法，迫切需要识别新的分子靶点。
近几年来，近红外二区(NIR-II)荧光成像技术迅速发展，通过减少光子散射、光吸收和自发荧光，NIR-II荧光探针能够实现更高穿透率和分辨率的成像。目前临床上批准的近红外荧光染料包括吲哚菁绿(ICG)和亚甲基蓝(MB)。其中，ICG作为一种菁型近红外染料，除了其主要的近红外一区(NIR-I)发射外，还具有较强的NIR-II尾峰荧光发射。ICG可以与体内血清相结合，减轻血清中白蛋白的二聚作用，提高量子产率，从而显示出更强的NIR-II荧光信号。然而令人遗憾的是现有的临床批准的近红外荧光染料对肿瘤组织没有特异性的选择。
发明内容
本发明提供一种近红外荧光探针，所述近红外荧光探针可以主动靶向肿瘤位点，从而实现肿瘤的特异性荧光成像。
本发明提供一种近红外荧光探针的制备方法，所述制备方法操作简单，制备成本低。
本发明提供一种近红外荧光探针成像系统，所述成像系统可以对癌症细胞进行主动靶向，使癌症细胞实现特异性荧光成像。
本发明提供一种上述近红外荧光探针或近红外荧光成像系统的应用，可以应用于肿瘤位点的近红外荧光成像中。
本发明提供一种近红外荧光探针，所述近红外荧光探针具有式1所示的结构：
Ra-Rb 式1
其中，Ra为含有琥珀酰亚胺酯的近红外荧光染料化合物中的酰基，Rb为Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链中的α-氨基脱去一个氢原子后的基团。
如上所述的近红外荧光探针，其中，所述近红外荧光染料化合物包括吲哚菁绿衍生物。
如上所述的近红外荧光探针，其中，所述吲哚菁绿衍生物选自吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯、磺酸吲哚菁绿琥珀酰亚胺酯、吲哚菁绿-聚乙二醇-琥珀酰亚胺中的至少一种。
如上所述的近红外荧光探针，其中，所述近红外荧光探针具有式1-1或式1-2所示的结构：
Figure BDA0002987912290000021
Figure BDA0002987912290000031
如上所述的近红外荧光探针，其中，所述近红外荧光探针通过包括以下过程的方法制备得到：
将活化后的近红外荧光染料溶液与Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链溶液或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链溶液混合反应后，对混合液进行干燥处理，得到所述近红外荧光探针。
本发明提供一种近红外荧光探针的制备方法，其中，包括以下步骤：
对所述近红外荧光染料进行活化处理，得到活化近红外荧光染料溶液；
将所述活化近红外荧光染料溶液与Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链溶液或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链溶液混合并搅拌反应，得到混合液；
对所述混合液进行干燥处理，得到所述近红外荧光探针。
如上所述的制备方法，其中，所述干燥处理前，还包括利用截留分子量小于所述近红外荧光探针的相对分子质量的透析袋和磷酸盐缓冲液对所述混合液进行透析处理，得到所述近红外荧光探针。
本发明提供一种近红外荧光成像系统，所述近红外荧光成像系统包括上述的近红外荧光探针。
本发明提供一种上述的近红外荧光探针或上述的近红外荧光成像系统在细胞近红外荧光成像中的应用。
如上所述的应用，其中，所述细胞近红外荧光成像包括肝癌细胞的荧光成像。
本发明提供一种近红外荧光探针，该近红外荧光探针的结构式为Ra-Rb，其中，Ra为含有琥珀酰亚胺酯的近红外荧光染料化合物中的酰基，Rb为Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链(L5肽链)或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链(L5-2肽链)中的α-氨基脱去一个氢原子后的基团。由于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)主要在HCC细胞膜上大量表达，而L5肽链或L5-2肽链可以主动靶向GPC-3，所以本发明的近红外荧光探针可以主动靶向癌症细胞，尤其是HCC病变组织，实现对HCC的靶向荧光成像。此外，目前使用抗体制备近红外荧光探针时，存在实验室操作困难，制得的近红外荧光探针的体内动力学较差的缺点，与使用抗体相比制备近红外荧光探针相比，本发明使用肽链制备近红外荧光探针可以克服上述缺点，制备得到的近红外荧光探针具有免疫原性低、性能简单的优点，并且由于肽链的生产成本也低于抗体的生产成本，所以本发明的近红外荧光探针还具有生产成本低的优点。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的第一方面提供一种近红外荧光探针，其具有式1所示的结构：
Ra-Rb式1
其中，Ra为含有琥珀酰亚胺酯的近红外荧光染料化合物中的酰基，Rb为Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链(L5肽链)或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链(L5-2肽链)中的α-氨基脱去一个氢原子后的基团。
本领域的技术人员知晓的，肽链的终端具有羧基。本发明中，与终端羧基相邻的碳(C)为α-C，与α-C连接的氨基则为α-氨基。示例性的，结构式为
Figure BDA0002987912290000041
的肽链中，与羧基相连的C为α-C，与α-C相连的氨基为α-氨基。本发明结构式1中的Rb是L5肽链或L5-2肽链中的α-氨基脱去一个氢原子后的基团。
由于L5肽链或L5-2肽链可作为在HCC细胞膜上过表达的GPC-3蛋白的亲和配体，所以本发明中含有L5肽链或L5-2肽链的近红外荧光探针可以主动靶向HCC细胞，使荧光染料在HCC组织中富集，从而实现准确检测HCC病变组织。
此外，目前使用抗体制备近红外荧光探针时，存在实验室操作困难，制得的近红外荧光探针的体内动力学较差的缺点，与使用抗体制备近红外荧光探针相比，本发明使用肽链制备近红外荧光探针可以克服上述缺点，制备得到的近红外荧光探针具有免疫原性低、性能简单的优点，并且由于肽链的生产成本也低于抗体的生产成本，所以本发明的近红外荧光探针还具有生产成本低的优点。
在本发明的一些实施方式中，上述近红外荧光染料化合物包括吲哚菁绿衍生物(ICG衍生物)。
本发明选择ICG衍生物作为近红外荧光染料，是由于ICG衍生物作为一种菁型近红外染料，除了其主要的近红外一区(NIR-I)发射外，还具有较强的NIR-II尾峰荧光发射。而NIR-II荧光信号具有更强的穿透深度，更少受到生物自发荧光干扰的特点，可以实现对肿瘤长效、稳定的标记，满足外科医师对术中导航时间的要求。具体的作用过程为，ICG衍生物与体内血清相结合，减轻血清中白蛋白的二聚作用，提高量子产率，从而显示出更强的NIR-II荧光信号。
具体地，上述吲哚菁绿衍生物选自吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯、磺酸吲哚菁绿琥珀酰亚胺酯、吲哚菁绿-聚乙二醇-琥珀酰亚胺中的至少一种。
在一种实施方式中，上述近红外荧光探针具有式1-1或式1-2所示的结构：
Figure BDA0002987912290000061
式1-1中，Ra为吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯中的酰基，Rb为L5肽链中的α-氨基脱去一个氢原子后的基团；式1-2中，Ra为吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯中的酰基，Rb为L5-2肽链中的的α-氨基脱去一个氢原子后的基团。
在本发明的一些实施方式中，上述近红外荧光探针通过包括以下过程的方法制备得到：
将活化后的近红外荧光染料溶液与Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链溶液或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链溶液混合反应后，对混合液进行干燥处理，得到近红外荧光探针。
可以理解的是，在活化后的近红外荧光染料溶液和L5肽链溶液或L5-2肽链溶液的混合过程中，活化后的近红外荧光染料与L5肽链或L5-2肽链发生共价偶联化学反应合成近红外荧光探针，所得到的混合液中含有近红外荧光探针。对含有近红外荧光探针的混合液进行干燥处理，可以得到本发明的近红外荧光探针。
本发明的第二方面提供一种上述的近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
对近红外荧光染料进行活化处理，得到活化近红外荧光染料溶液；
将活化近红外荧光染料溶液与Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链溶液混合并搅拌，得到混合液；
对混合液进行干燥处理，得到近红外荧光探针。
为了使近红外荧光染料中的活性官能团可以与肽链更好的进行偶联反应，所以本发明首先使用活化溶液对近红外荧光染料进行活化处理，得到活化近红外荧光染料溶液。本发明中的活化溶液可以选择本领域常用的对近红外荧光染料进行活化的溶液，上述活化溶液的溶剂可以为去离子水或磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)。在一些具体的实施方式中，活化溶液的溶剂为PBS溶液，溶质包含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
随后，将活化近红外荧光染料溶液与L5肽链溶液或L5-2肽链溶液进行混合，搅拌均匀得到混合液。在此过程中，近红外荧光染料与L5肽链或L5-2肽链发生共价偶联化学反应，所获得的混合液中包括近红外荧光探针。本发明不限定活化近红外荧光染料溶液与L5肽链溶液或L5-2肽链溶液的加入顺序，可以将活化近红外荧光染料溶液加入到L5肽链溶液或L5-2肽链溶液中，也可以将L5肽链溶液或L5-2肽链溶液加入到活化近红外荧光染料溶液中。
最后对混合液进行干燥处理，去除混合液中的溶剂，可以得到近红外荧光探针。在具体的实施方式中，上述干燥处理为冷冻干燥处理，冷冻干燥处理的温度为-40℃，然后在真空13Pa下，冷冻干燥3-5天，使其中的溶剂直接升华成气态，去除混合液中的溶剂。
本发明的近红外荧光探针的制备方法，不仅可以获得具有主动靶向的近红外荧光探针，而且还具有制备过程简单，制备原料成本低且容易获得的优点，具有广泛的应用空间。
在本发明的一些实施方式中，上述干燥处理前，还包括利用截留分子量小于近红外荧光探针的相对分子质量的规格透析袋和磷酸盐缓冲液分别对混合液进行透析处理，得到近红外荧光探针。
由于上述混合液中不仅包括近红外荧光探针，还包括一些小分子量的杂质，所以在干燥处理前，可以对混合液进行纯化处理。例如，将混合液置于截留分子量为小于近红外荧光探针的相对分子质量的透析袋中，将透析袋置于盛有PBS溶液的烧杯中，对透析袋中的混合溶液进行透析2-5天。在具体的实施方式中，为了达到好的透析效果，可以视具体的情况对PBS溶液进行更换，例如，透析的第一天每隔4小时更换PBS溶液，透析的第二天，每隔6小时更换PBS溶液。
在透析过程中，混合液中相对分子质量小于透析袋截留分子量的物质会从透析袋的孔隙渗出，通过透析袋的孔隙进入PBS溶液中，而相对分子质量大于透析袋截留分子量的近红外荧光探针则保留在透析袋中，使透析袋中获得相对纯净的近红外荧光探针混合液。对该混合液进行干燥处理，可以获得纯净的近红外荧光探针。
上述截留分子量可以根据预期获得的近红外荧光探针的相对分子质量进行合理设置，只要截留分子量小于预期获得的近红外荧光探针的相对分子量即可。在具体的实施方式中，可以选择截留分子量为1000Da或2000Da的透析袋。
本发明的第三方面提供一种近红外荧光成像系统，包括上述的近红外荧光探针。
将上述获得的近红外荧光探针与成像仪器进行搭配得到近红外荧光成像系统，该近红外荧光探针成像系统可以对肿瘤进行定位成像，当应用于手术中时，可以实时定位肿瘤，为术者彻底切除肿瘤提供实时反馈。
本发明的第四方面提供一种上述的近红外荧光探针或上述的近红外荧光成像系统在细胞近红外荧光成像中的应用。
本发明的近红外荧光探针或近红外荧光探针成像系统由于可以主动靶向癌症组织，实现对癌症组织成像，在肿瘤的近红外荧光成像中具有很好的应用前景。在具体的实施方式中，上述细胞近红外荧光成像包括肝癌细胞的荧光成像。
以下，通过具体实施例对本发明的提取方法进行详细的介绍。
实施例1
本实施例的制备方法包括以下步骤：
1)在5mL的小试剂瓶中，首先将吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯(ICG-NHS，0.34mmol，29mg)溶于1mL的PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，避光搅拌4h得到活化的ICG-NHS溶液；
其中，ICG-NHS：EDC：NHS(摩尔比)＝1.0：1.1：1.2；
2)将L5肽链(500mg，0.34mmol)溶于200μL的PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)，避光搅拌5min得到L5肽链溶液；
3)将步骤1)中得到的活化的ICG-NHS溶液缓慢加入步骤2)中得到的L5肽链溶液，室温下避光搅拌2h后，得到混合液，对混合液进行冷冻干燥处理，得到ICG-L5粗品探针，-20℃避光保存；
其中，冷冻干燥的温度为-40℃，真空度为13Pa，时间为3天。
合成路线为式1-3：
Figure BDA0002987912290000091
实施例2
本实施例的制备方法包括以下步骤：
1)在5mL的小试剂瓶中，首先将吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯(ICG-NHS，0.34mmol，29mg)溶于1mL的PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，避光搅拌4h得到活化的ICG-NHS溶液；
其中，ICG-NHS：EDC：NHS(摩尔比)＝1.0：1.1：1.2；
2)将L5肽链(500mg，0.34mmol)溶于200μL的PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)，避光搅拌5min得到L5肽链溶液；
3)将步骤1)中得到的活化的ICG-NHS溶液缓慢加入步骤2)中得到的L5肽链溶液，室温下避光搅拌2h后，得到混合液，将混合液置于截留分子量为2000Da的透析袋中，将透析袋置于盛有PBS溶液的体积为1.5L的烧杯中，持续透析3天，随后对透析袋中的混合液冷冻干燥并收集纯净的ICG-L5探针，并在-20℃避光保存；
其中，第一天每隔4小时更换PBS溶液，后两天，每隔6小时更换PBS溶液；冷冻干燥的温度为-40℃，真空度为13Pa，时间为3天。
实施例3
本实施例的制备方法包括以下步骤：
1)在5mL的小试剂瓶中，首先将吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯(ICG-NHS，0.34mmol，29mg)溶于1mL的PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，避光搅拌4h得到活化的ICG-NHS溶液；
其中，ICG-NHS：EDC：NHS(摩尔比)＝1.0：1.1：1.2；
2)将L5-2肽链(500mg，0.34mmol)溶于200μL的PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)，避光搅拌5min得到L5-2肽链溶液；
3)将步骤1)中得到的活化的ICG-NHS溶液缓慢加入步骤2)中得到的L5肽链溶液，室温下避光搅拌2h后，得到混合液，对混合液进行冷冻干燥处理，得到ICG-L5-2粗品探针，-20℃避光保存；
其中，冷冻干燥的温度为-40℃，真空度为13Pa，时间为3天。
合成路线为式1-4：
Figure BDA0002987912290000111
实施例4
本实施例的制备方法包括以下步骤：
1)在5mL的小试剂瓶中，首先将吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯(ICG-NHS，0.34mmol，29mg)溶于1mL的PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，避光搅拌4h得到活化的ICG-NHS溶液；
其中，ICG-NHS：EDC：NHS(摩尔比)＝1.0：1.1：1.2；
2)将L5-2肽链(500mg，0.34mmol)溶于200μL的PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)，避光搅拌5min得到L5-2肽链溶液；
3)将步骤1)中得到的活化的ICG-NHS溶液缓慢加入步骤2)中得到的L5肽链溶液，室温下避光搅拌2h后，得到混合液，将混合液置于截留分子量为1000Da的透析袋中，将透析袋置于盛有PBS溶液的体积为1.5L的烧杯中，持续透析3天，随后对透析袋中的混合液冷冻干燥并收集纯净的ICG-L5-2探针，并在-20℃避光保存；
其中，第一天每隔4小时更换PBS溶液，后两天，每隔6小时更换PBS溶液；冷冻干燥的温度为-40℃，真空度为13Pa，时间为3天。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光探针具有式1所示的结构：
Ra-Rb式1
其中，Ra为含有琥珀酰亚胺酯的近红外荧光染料化合物中的酰基，Rb为Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链中的α-氨基脱去一个氢原子后的基团。
2.根据权利要求1所述的近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光染料化合物包括吲哚菁绿衍生物。
3.根据权利要求2所述的近红外荧光探针，其特征在于，所述吲哚菁绿衍生物选自吲哚菁绿-琥珀酰亚胺酯、磺酸吲哚菁绿琥珀酰亚胺酯、吲哚菁绿-聚乙二醇-琥珀酰亚胺中的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光探针具有式1-1或式1-2所示的结构：
Figure FDA0002987912280000011
5.根据权利要求1-4任一项所述的近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光探针通过包括以下过程的方法制备得到：
将活化后的近红外荧光染料溶液与Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链溶液或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链溶液混合反应后，对混合液进行干燥处理，得到所述近红外荧光探针。
6.一种权利要求1-5任一项所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
对所述近红外荧光染料进行活化处理，得到活化近红外荧光染料溶液；
将所述活化近红外荧光染料溶液与Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链溶液或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链溶液混合并搅拌反应，得到混合液；
对所述混合液进行干燥处理，得到所述近红外荧光探针。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述干燥处理前，还包括利用截留分子量小于所述近红外荧光探针的相对分子质量的透析袋和磷酸盐缓冲液对所述混合液进行透析处理，得到所述近红外荧光探针。
8.一种近红外荧光成像系统，其特征在于，所述近红外荧光成像系统包括权利要求1-5任一项所述的近红外荧光探针。
9.一种权利要求1-5任一项所述的近红外荧光探针或权利要求8所述的近红外荧光成像系统在细胞近红外荧光成像中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细胞近红外荧光成像包括肝癌细胞的荧光成像。
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