CN107796796B - IRDye 800CW、其衍生物或其类似物在近红外二区荧光成像中的应用 - Google Patents

IRDye 800CW、其衍生物或其类似物在近红外二区荧光成像中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明基于对IR800及其衍生物或类似物在近红外二区的发射性能的新发现，一方面提供IR800、其衍生物或其类似物作为荧光染料在近红外二区荧光分子成像中的应用；另一方面提供IR800、其衍生物或其类似物作为荧光染料与蛋白质类物质形成的生物接枝物在近红外二区荧光分子成像中的应用。与目前IR800在近红外一区的成像应用相比，本发明的应用具有极为显著的穿透深度和分辨率的优势，将大大提高活体成像的信噪比和穿透深度。

Description

IRDye 800CW、其衍生物或其类似物在近红外二区荧光成像中 的应用
技术领域
本发明属于生物荧光成像技术领域，具体涉及一种商业近红外发射荧光染料(IRDye 800CW)在近红外二区(900-1500纳米)生物成像方面的应用。
背景技术
生物荧光成像(fluorescence imaging)及分子成像(molecular imaging)技术是指利用荧光探针(分子)对细胞、组织甚至生物体进行成像，来研究生物学过程和信息的方法。荧光成像技术的关键是希望能获得直观清晰的图像来分辨细微结构，进而分析细胞或生物体特定区域的特征、状态，甚至特定分子的表达、分布等信息。生物荧光成像技术具有分辨率高、成像速度快和无损探测等优点，在探寻疾病的发病机理、临床表现、基因病变，疾病诊断和新的医疗手段的开发等方面具有重要的实践意义和应用前景。
生物荧光成像技术在细胞和组织等体外检测方面已经发展到了极其成熟的阶段，商业化的可生物接枝的荧光染料基本上覆盖了整个可见光区以及近红外一区(400-850纳米)；相关配套的荧光显微镜及成像系统也接近完善。然而生物荧光成像在活体成像方面仍然面临巨大的瓶颈和挑战，主要原因有两个方面：其一是生物体本身存在可见光波段的自发荧光，导致活体成像的背景增大，分辨率大大降低；其二由于光子在穿透生物体存在着强烈的散射作用，因此无法进行比较深的活体荧光成像。解决此问题的方法就是选用发射波长较长的红外一区(750-900纳米)甚至近红外二区(1000-1700纳米)的荧光材料进行生物成像。
IRDye 800CW作为一种高效的近红外一区(750-900纳米)荧光探针，目前已经被广泛应用在实验活体成像甚至临床成像方面，取得了相比于可见光波段成像较好的活体成像效果。而我们在实验过程中发现由于IRDye 800CW较高的荧光效率，其荧光发射拖尾可以到近红外二区(900-1500纳米)。这是非常振奋人心的发现，因为我们可以实现近红外一区的染料在近红外二区的成像应用，这将大大提高活体成像的信噪比和穿透深度。
发明内容
本发明的目的是提供商业化近红外一区的荧光染料IRDye 800CW(IR800)或其衍生物或类似物在近红外二区(900-1500纳米)荧光成像和分子成像方面的应用。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供IR800、其衍生物或其类似物作为荧光染料在近红外二区荧光分子成像中的应用。
第一个方面优选的方案中，所述的IR800的衍生物或类似物包括下式(I)所示的化合物：
Figure BDA0001435370680000021
其中，所述的R为磺酸根基团、活性酯基团、马来酰亚胺基团、羧酸基团、DBCO基团、叠氮基团或炔基等基团；进一步优选活性酯基团或马来酰亚胺基团；最优选活性酯基团。
同时，本发明的第二个方面，提供IR800、其衍生物或其类似物作为荧光染料与蛋白质类物质形成的生物接枝物在近红外二区荧光分子成像中的应用。我们认为大部分靶向蛋白、抗体、多肽以及靶向药都可以实现和IR800、其衍生物或其类似物的生物接枝及在近红外二区的成像应用。
第二个方面优选的方案中，所述的IR800的衍生物或类似物包括下式(I)所示的化合物：
Figure BDA0001435370680000022
其中，所述的R为磺酸根基团、活性酯基团、马来酰亚胺基团、羧酸基团、DBCO基团、叠氮基团或炔基等各种形式的基团。
第二个方面优选的一种实施方式中，所述式(I)中的R为活性酯基团，即所述的IR800的衍生物是IRDye 800CW NHS ester(IR800N)；同时所述的蛋白质类物质是带氨基的蛋白质类物质。
进一步优选的实施方式中，所述的带氨基的蛋白质类物质的具体可选实例包括爱必妥(Erbitux)、anti-CD31抗体、促卵泡激素(FSH)、铃蟾肽(Bombesin,BBN)等。
第二个方面优选的另一种实施方式中，所述式(I)中的R为马来酰亚胺基团；同时所述的蛋白质类物质是带硫醇基的蛋白质类物质。
第二个方面的其他实施方式中，所述式(I)中的R为DBCO基团、叠氮基团或炔基；同时所述的蛋白质类物质分别是带叠氮基或炔基的蛋白质或其他靶向物质。
本发明上述两个方面优选的方案中，所述的近红外二区是波长在900纳米以上、1000纳米以上、1100纳米以上、1200纳米以上或1300纳米以上的区间。
本发明上述两个方面优选的方案中，所述的荧光分子成像包括在各种细胞、组织或其他活体生物的成像。
现有技术中，IR800在近红外一区活体成像信噪比、穿透深度及分辨率均较低，无法达到准确定位和深穿透性要求。本发明人首次发现并证实了IR800及其衍生物或类似物在近红外二区(900-1500纳米)具有非常强的荧光发射，其来源于极强的近红外一区发射拖尾到二区区间，且二区量子效率堪比目前报道的效率最高的近红外二区水溶性小分子染料。该发现赋予了IR800及其衍生物或类似物全新的高性能的近红外二区成像特质。基于这种成像特质，本发明提出了IR800及其衍生物和类似物在近红外二区的全新应用，由此克服了IR800在近红外一区活体成像信噪比低和穿透深度低及分辨率低的应用局限；然后利用其在近红外二区的发射性能，实现了高灵敏度和高穿透性的荧光成像技术。由于IR800已被多个权威机构批准可用于临床成像试验，我们的发明将实现其全新的使用范围，有望实现准确定位、深穿透性的荧光可视化手术。
我们通过现有的简单生物接枝的方法，将IR800和多种抗体或蛋白质结合而实现靶向活体成像。进而我们详细对比了其在近红外一区和近红外二区的成像效果，证明了IR800在近红外二区具有显著提高的成像效果。
首先，我们同时测试了四种商业化的近红外一区荧光染料IRDye 800CW NHSester(IR800N),IR797,Cyanine 7(Cy7)以及ICG和典型的已经公开的近红外二区染料IR-FGP(见Zhu,S；etc.PNAS,2017,114,962)、CH1055(见Antaris,A.L；etc.,NatureMater.2016,15,235)进行对比测试(参见图1-3)，此外还选用了近红外二区敏感的InGaAs检测器及已知量子效率的Hipco碳纳米管(0.4％)作为参比测试IR800N准确的量子效率值为6.24％(参见图4)。我们准确记录了几种染料在900到1500纳米区间的荧光发射情况，详细对比了900、1000、1100、1200以及1300纳米波段的荧光强度，发现IR800N具有领先的荧光强度。在相同摩尔浓度的情况下亮度远远超过典型的D-A-D型红外二区的荧光染料，即使在等OD的情况下也可以媲美此类二区荧光染料。详细量子效率数据如下表1所示，值得注意的是由于IR800N的消光系数远远大于近红外二区的分子，等摩尔浓度下的荧光强度要远远高于近红外二区分子：
表1：IR800N和典型二区染料在不同近红外二区波段的量子效率
Figure BDA0001435370680000041
由于IR800N是具有磺酸根基团的分子结构，比较容易与血液结合形成复合物，进而阻止分子聚集使荧光进一步增强。因此我们又详细测试了IR800N和其他两种带磺酸基的红外一区染料在磷酸缓冲盐溶液(PBS),二甲基亚砜(DMSO),以及牛血清蛋白(FBS)中的荧光量子效率，结果见下表2，证明IR800N在FBS中具有进一步的荧光增强效率且在近红外二区效率远高于其他两种带磺酸基的商业染料IR783和IR820。
表2：IR800N和其他两种带磺酸基团的商业染料在不同介质中近红外二区波段的量子效率
Figure BDA0001435370680000042
附图说明
图1、图2、图3体现了四种商业化的近红外一区染料(IR800N,Cy7,ICG,IR797)和文献报道的近红外二区染料IR-FGP在900-1500纳米区间的荧光发射谱线(激发光为808纳米激光)；其中，图1为等摩尔浓度下各个染料的光谱强度对比；图2为IR800N和IR-FGP在900，1000，1100，1200，1300波长以上荧光强度统计对比；图3为等808纳米处吸光度下各个染料的光谱强度对比；
图4是用已知红外二区发光效率的Hipco碳纳米管(量子效率为0.40％)对比测试IR800N准确的量子效率值的结果图；具体测试方法是：分别配置两种材料的梯度水溶液，再用各梯度溶液的荧光强度对吸收值做线性图，最后用斜率比率计算IR800N的二区荧光效率为0.40％×155191216.80/9946801.65等于6.24％；
图5是实施例1中所用鳞状上皮细胞癌(SCC)的老鼠模型实物图；
图6是实施例1的IR800N@Erbitux靶向SCC肿瘤在近红外一区/二区的成像效果图；
图7是实施例1的IR800N@Erbitux靶向SCC肿瘤在近红外一区/二区的肿瘤和周围组织的荧光信号强度比统计图，图中每个老鼠编号对应的柱体从左至右分别为注射后1、6、24、48、72、144和168小时的肿瘤和周围组织的荧光信号强度比；
图8是实施例2中所用IR800N@FSH靶向雌性老鼠在可见光和近红外二区成像效果图；
图9是实施例2中所用IR800N@FSH靶向雌性老鼠在不同近红外二区的卵巢成像图；
图10为实施例2中将IR800N@FSH靶向雌性老鼠卵巢取出之后的近红外二区高分辨的成像图；
图11是实施例2的IR800N@FSH靶向卵巢在近红外一区和二区不同区间的信噪比对比图；
图12是实施例3中所用IR800N@BBN靶向老鼠皮下U87肿瘤的成像图；
图13是实施例4中所用IR800N@FSH靶向老鼠骨头染色切片在商业化近红外一区检测器和近红外二区检测器上的成像效果对比图；
图14是实施例4中所用IR800N@FSH靶向老鼠在1100纳米以上近红外二区骨头的精细结构图；
图15是实施例4中未接枝的IR800N和用FSH封端之后加IR800N@FSH的成像效果图；
图16是实施例5中所用IR800N@anti-CD31靶向老鼠血管的近红外二区荧光成像图；
图17是实施例6中直接尾静脉注射IR800N后记录的老鼠大脑在近红外一区和二区的血管成像图；
图18是实施例7中在老鼠脚掌肌肉注射IR800N后记录的老鼠腰椎淋巴结(Lumbarlymph nodes)在近红外一区和二区的成像图。
图19是实施例8中在接枝马来酰亚胺基团、羧酸基团、DBCO基团的IR800和IR800N在红外二区的亮度对比图。
图20是实施例8中在老鼠尾静脉注射IR800马来酰亚胺后记录的老鼠腰大腿血管在近红外二区的成像效果图。
具体实施方式
IRDye 800CW NHS Ester是非常高效的生物接枝染料，其具有的NHS活性酯基团能够和几乎所有的带氨基的抗体/多肽反应，从而赋予蛋白质近红外区的发光性能。我们在这里也选用几种蛋白质与IR800N接枝，进而达到靶向的近红外二区成像的目的。具体生物接枝步骤如下。
将IR800N溶解在DMSO中形成大约1-5毫摩的溶液；再在配好的IR800N溶液中取少量进行100-500倍稀释，测试确定吸收峰774纳米处的吸光值，用消光系数240000M-1cm-1准确计算配制溶液的摩尔浓度；配制将要反应的蛋白质或抗体[爱必妥(Erbitux)，促卵泡激素(FSH),Anti-CD31抗体，靶向多肽(Bombesin,BBN)]溶液浓度为5-20微摩，计算并吸取蛋白质和IR800N摩尔比为1：5到1：20的溶液进行共混；反应在室温避光下振动1.5到3小时；最后将产物进行GE NAP-5分离柱进行提纯去掉未接枝上的IR800N。
进一步我们运用IR800N的生物接枝物或未接枝的IR800N进行近红外二区活体成像。值得注意的是，本发明核心基于IR800N的近红外二区发射性能的新发现，不局限于其和具体某种蛋白质接枝。本发明也包含基于IR800N的衍生物或类似物在近红外二区应用的保护，所述衍生物或类似物如IR800及IR800带有马来酰亚胺基团、羧酸基团、DBCO基团、叠氮基团或炔基等基团的产物。
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。实施例1-5主要说明IR800N和不同抗体结合之后在老鼠活体进行靶向的荧光二区成像，实施例6-7主要说明未接枝的IR800N在老鼠体内较强的近红外二区发射信号。实施例8主要说明接枝马来酰亚胺基团、羧酸基团、DBCO基团的IR800和IR800N在红外二区的亮度对比，可以证明IR800不同的接枝形式都具有比较优异的红外二区发光性能。
实施例1
将IR800N溶解在DMSO中形成大约1毫摩的溶液；再在配好的IR800N溶液中取少量进行100倍稀释，测试确定吸收峰774纳米处的吸光值，用消光系数240000M-1cm-1准确计算原始溶液的摩尔浓度；配置Erbitux溶液浓度为13.7微摩，计算蛋白质和IR800N摩尔比为1：5进行共混；反应在室温避光下振动1.5小时；最后将产物进行GE NAP-5分离柱进行提纯得到IR800N@Erbitux。
在老鼠皮下注射SCC细胞促使老鼠生长鳞状上皮细胞癌，老鼠模型实物如图5所示。将200微升浓度为10μM/mL的IR800N@Erbitux对老鼠进行尾静脉注射，之后分别在Pearl近红外一区成像系统和Princeton近红外二区成像系统中进行不同的时间点成像，成像记录的时间点分别为尾静脉注射IR800N@Erbitux后1、6、24、48、72、144和168小时，结果显示IR800N@Erbitux靶向SCC肿瘤在注射后144小时仍有较好成像效果(参见图6)，此外通过统计肿瘤和周围组织的荧光信号强度比，可以看到二区信号比要比一区的信号比强两倍(参见图7)。
实施例2
将IR800N溶解在DMSO中形成大约2毫摩的溶液；再在配好的IR800N溶液中取少量进行100倍稀释，测试确定吸收峰774纳米处的吸光值，用消光系数240000M-1cm-1准确计算原始溶液的摩尔浓度；配置FSH溶液浓度为3.5微摩，计算蛋白质和IR800N摩尔比为1：20进行共混；反应在室温避光下振动3小时；最后将产物进行GE NAP-5分离柱进行提纯得到IR800N@FSH。
对于活体老鼠卵巢成像，将100微升浓度为3μM/mL的IR800N@FSH对老鼠进行尾静脉注射，之后分别在近红外一区和近红外二区成像系统中进行不同放大倍数，以及不同近红外二区区间(1000，1100，1200纳米子区间)的成像，发现不同纳米区间的近红外二区成像效果良好(图8-9)，在较高放大倍数下甚至可以清楚地分辨卵泡的精细结构(图10)；我们进一步对比了IR800N@FSH靶向卵巢在近红外一区和二区不同区间的信噪比，图11中，上方五张图片分别对应850、900、1000、1100和1200纳米区间的IR800N@FSH靶向卵巢成像效果；下方线条图统计了不同纳米区间的成像荧光强度变化，可以发现随着检测波长的增大，我们可以获得更好的检测灵敏度。
实施例3
将IR800N溶解在DMSO中形成大约2毫摩的溶液；再在配好的IR800N溶液中取少量进行100倍稀释，测试确定吸收峰774纳米处的吸光值，用消光系数240000M-1cm-1准确计算原始溶液的摩尔浓度；配置靶向多肽BBN(市售)溶液浓度为11微摩，计算蛋白质和IR800N摩尔比为1：5进行共混；反应在室温避光下振动2小时；最后将产物进行GE NAP-5分离柱进行提纯得到IR800N@BBN。IR800N@BBN溶液在不同近红外二区滤镜下均匀较好荧光亮度。
在老鼠皮下注射胶质瘤细胞(U87)促使老鼠生长胶质瘤，对于U87肿瘤成像，将50微升浓度为10μM/mL的IR800N@BBN对老鼠进行尾静脉注射，之后在近红外二区成像系统中进行老鼠靶向成像，如图12所示，注射IR800N@BBN之后1、24、48、72及96小时，带有U87肿瘤的老鼠在1100纳米以上区间的近红外二区成像图效果非常理想，可以看到几乎没有肝脏吸收和正常组织信号。
实施例4
将IR800N溶解在DMSO中形成大约2毫摩的溶液；再在配好的IR800N溶液中取少量进行100倍稀释，测试确定吸收峰774纳米处的吸光值，用消光系数240000M-1cm-1准确计算原始溶液的摩尔浓度；配置FSH溶液浓度为3.5微摩，计算蛋白质和IR800N摩尔比为1：20进行共混；反应在室温避光下振动3小时；最后将产物进行GE NAP-5分离柱进行提纯得到IR800N@FSH。
对于老鼠骨组织切片染色，首先用10％牛血清蛋白进行封端，之后用0.2μM/mL的IR800N@FSH进行孵育染色(骨头已经被证实具有一定的FSH受体)，之后分别在Licor近红外一区成像系统和Princeton近红外二区成像系统中进行不同放大倍数的成像，我们还在1100纳米以上近红外二区观察了骨头的精细结构(图13-14)，同时还对比了未接枝的IR800N和用FSH封端之后加IR800N@FSH的成像效果(图13-15)。实验结果证明了IR800N@FSH的靶向特异性。
实施例5
将IR800N溶解在DMSO中形成大约5毫摩的溶液；再在配好的IR800N溶液中取少量进行500倍稀释，测试确定吸收峰774纳米处的吸光值，用消光系数240000M-1cm-1准确计算原始溶液的摩尔浓度；配置anti-CD31溶液浓度为11微摩，计算蛋白质和IR800N摩尔比为1：10进行共混；反应在室温避光下振动1.5小时；最后将产物进行GE NAP-5分离柱进行提纯得到IR800N@anti-CD31。
对于老鼠脑组织切片染色，首先用10％牛血清蛋白进行封端，之后用0.2μM/mL的IR800N@anti-CD31进行孵育染色，之后分别在近红外一区成和近红外二区成像系统中进行荧光成像比较，结果如图16所示，IR800N@anti-CD31进行老鼠脑组织染色后在近红外二区的血管成像具有更低的背景信号，从而具有更高的信噪比。
实施例6
对于老鼠脑部血管的活体成像，我们直接对老鼠进行尾静脉注射IR800N的PBS溶液(吸光度2，体积为200微升)，在Princeton检测器上记录近红外一区(850-900纳米)和近红外二区(1100-1300纳米)的成像效果(见图17)，可以发现相比于一区区间，二区成像可以清楚地分辨老鼠脑血管。
实施例7
对于老鼠体内腰椎淋巴结的活体成像，我们直接对老鼠进行脚掌肌肉注射IR800N的PBS溶液(吸光度10，20微升)，在Princeton检测器上记录近红外一区(850-900纳米)和近红外二区(1100-1300纳米)的成像效果(见图18)，我们可以看到在近红外一区很难分辨两个淋巴结，而在近红外二区两个淋巴结可以清楚地分辨，证明了近红外二区在活体成像中具有更好的穿透深度和分辨率。
实施例8
我们测试了接枝马来酰亚胺基团、羧酸基团、DBCO基团的IR800和IR800N在红外二区的亮度对比，可以证明IR800不同的接枝形式都具类似的较优异的红外二区发光性能(见图19)。对于老鼠大腿血管活体成像，们直接对老鼠进行尾静脉注射IR800马来酰亚胺的PBS溶液(吸光度2，200微升)，在Princeton检测器上记录近红外二区(1100-1300纳米)的成像效果(见图20)，我们可以看到在近红外二区可以清楚的分辨大腿血管的形状。

Claims (7)

1.IR800、其衍生物或其类似物作为荧光染料在1100-1300纳米的近红外二区荧光分子成像中的应用；
所述的IR800、其衍生物或类似物为下式(I)所示的化合物：
Figure FDA0002500920170000011
其中，所述的R为磺酸根基团、活性酯基团、马来酰亚胺基团、羧酸基团、DBCO基团、叠氮基团或炔基。
2.权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的式(I)中的R为活性酯基团或马来酰亚胺基团。
3.IR800、其衍生物或其类似物作为荧光染料与蛋白质类物质形成的生物接枝物在1100-1300纳米近红外二区荧光分子成像中的应用；
所述的IR800、其衍生物或类似物包括下式(I)所示的化合物：
Figure FDA0002500920170000012
其中，所述的R为磺酸根基团、活性酯基团、马来酰亚胺基团、羧酸基团、DBCO基团、叠氮基团或炔基。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述式(I)中的R为活性酯基团，即所述的IR800的衍生物是IRDye 800CW NHS ester(IR800N)；同时所述的蛋白质类物质是带氨基的蛋白质类物质。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的带氨基的蛋白质类物质选自爱必妥(Erbitux)、anti-CD31抗体、促卵泡激素(FSH)、铃蟾肽(Bombesin,BBN)中的任意一种或几种。
6.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述式(I)中的R为马来酰亚胺基团；同时所述的蛋白质类物质是带硫醇基的蛋白质类物质。
7.权利要求1或3任意一项所述的应用，其特征在于：所述的荧光分子成像包括在各种细胞、组织或其他活体生物成像。
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