CN117430690A - 一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物医学影像技术领域，提供了一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白（NIR‑I/II FPs）的制备方法及其应用，所述NIR‑I/II FPs通过模仿天然荧光蛋白的结构和发光机理，利用外源性蛋白质和NIR‑I/II花菁染料分子经过可控共价自组装所形成的复合物。本发明有效地克服了现有NIR荧光蛋白的稀缺性、合成过程的复杂性以及发射波长的局限性。本发明提供了NIR‑I/II FPs在制备成像显像剂中的应用，含有NIR‑I/II FPs的成像显像剂可应用在如一级淋巴结手术导航、淋巴水肿、增生活体可视化、血池显影、皮瓣移植成活/坏死监测以及一体化多色成像等方面。
Description
技术领域
本发明属于生物医学影像技术领域，尤其涉及一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
荧光成像技术作为一种新兴的前沿成像技术，以其高灵敏度、强特异性和优异的时空分辨率在生物医学、分析化学和材料科学等多学科领域受到广泛关注。尽管荧光成像技术在理解生物系统的复杂性方面取得了巨大的进展，但由于生物组织的光学不透明性，活体深层组织成像仍然是一个巨大的挑战。近年来，激光和探测器制造技术的不断改进使非线性和线性荧光成像成功地延伸到第二个近红外 “组织透明”窗口（NIR-II，900~1700nm），有效地改善了深部组织的光学通路障碍，为临床准确诊断和预后开辟了一条全新的途径。生物事件的准确可视化主要取决于高性能荧光团的发展。在现有的NIR-II型荧光探针中，有机小分子由于其低毒性和特殊的药代动力学，一直是临床前和临床实践的有利候选者。然而，目前可用的NIR-II有机小分子荧光团极其稀缺，并伴随着次优的光学性质，不能满足临床实际应用的基本要求。因此，需要开发新的或改进的方法来进一步丰富NIR-II染料库，促进NIR-II生物成像技术的早期临床转化。
随着近红外荧光蛋白（FPs）的出现和快速传播，它为近红外荧光探针的构建提供了新的启示。荧光蛋白的内部发色团本身几乎是不发光的。由于FPs的生物自组装形成了特殊的β-筒结构，有效地抑制了FPs内部生色团的自由旋转，减少了非辐射跃迁引起的能量损耗，从而使得FPs表现出分子运动受限的明亮发光特性。迄今为止，已经报道了几个系列的近红外FPs。其中，包括iRFP670，iRFP682，iRFP702，iRFP713和iRFP720在内的红外荧光蛋白（iRFP）系列已被成功证明与其他已报道的近红外荧光蛋白相比具有最突出的有效亮度。通过个体iRFP的非峰值荧光发射尾部的NIR-II生物成像的概念也已经被成功地验证。然而，这些荧光团通常是基因编码的，必须通过基因转染到活细胞和动物中，才能进行生物成像，并且在血液蛋白酶环境中表现出快速的光漂白，使得它们难以通过外源注射的方式直接用于体内生物成像。此外，到目前为止还没有出现具有NIR-II峰值发射的荧光蛋白。因此，通过简单直接的外源性注射实现稳定和特异的生物成像和诊断，开发强大的NIR-II荧光蛋白仍然是一个重大的挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白的制备方法及其应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白，所述近红外一区和二区荧光蛋白是由蛋白质和花菁染料分子经过可控共价自组装所形成的复合物；
所述蛋白质为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、β-乳球蛋白以及具有合适疏水空腔结构的蛋白质中的任意一种，所述花菁染料分子为含氯的近红外一区和二区花菁染料分子；
所述蛋白质通过自身特定位点与花菁染料分子的氯原子发生亲核取代反应。
一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1：将花菁染料和蛋白质溶液按照不低于1:1摩尔比进行混合均匀，得到混合溶液；
S2：将混合溶液进行加热处理，形成仿生荧光蛋白。
一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白的制备方法，包括：在活体中注射花菁染料，在血液/体液中原位形成仿生荧光蛋白。
一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白在制备成像显像剂中的应用。
进一步的，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在通过外源性注射的方式进行活体成像中的应用。
进一步的，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在近红外一区和二区成像窗口下对于定位淋巴结和描绘淋巴管中的应用，其特征在于，包括手术导航淋巴结摘除以及继发性淋巴水肿的实时精准监测。
进一步的，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在近红外一区和二区成像窗口下对于血管成像中的应用，其特征在于，包括头/腿/全身血管成像、示踪动静脉、监测血流速度以及评估皮瓣功能性。
进一步的，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在近红外一区和二区成像窗口下对于肿瘤成像中的应用。
进一步的，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在近红外二区成像窗口下进行互不串色的一体化多色实时活体成像中的应用，其特征在于，包括淋巴结共定位、药代行为示踪以及淋巴系统/血管一体化显影。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提出的利用仿生策略来构建近红外一区和二区荧光蛋白，有效弥补了当下具有近红外二区明亮发光的荧光蛋白的空白，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂有望彻底改变基于荧光蛋白的生物成像，并最大限度地提高NIR-II荧光成像技术的临床转化效益；
2、本发明提出的近红外一区和二区仿生荧光蛋白与传统荧光蛋白相比，无需繁琐的基因编辑，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂可直接通过简单的外源性注射的方式进行活体成像应用；
3、本发明提出的含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂与当下临床上常用的吲哚菁绿（ICG）探针相比，可以实现更高的时空分辨率、深层组织穿透和成像对比度/稳定性，有望成为下一代淋巴/血管造影技术；并且操作者可在白光环境下进行成像检测和/或引导手术；
4、本发明提出的含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂具有优异的肿瘤靶向性，能够精准定位肿瘤；
5、本发明提出的近红外一区仿生荧光蛋白与近红外二区仿生荧光蛋白组合使用时，可以实现互不干扰的多色荧光成像，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂能够对活体多生物事件实现一体可视化呈现，包括淋巴结共定位、药代行为示踪、淋巴系统/血管一体化显影等。
附图说明
图1为本发明的实施例1中近红外一区和二区仿生荧光蛋白的结构示意图。
图2为本发明的实施例1对近红外一区和二区仿生荧光蛋白的反应温度、反应时间以及反应比例的优化结果图。
图3为本发明的实施例1对近红外一区和二区仿生荧光蛋白的反应浓度的优化结果图。
图4为本发明的实施例1中近红外一区和二区仿生荧光蛋白的制备流程图。
图5为本发明的实施例1中含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂的体外光学性能表征图。
图6为本发明的实施例1中含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂的生物安全性表征图。
图7为本发明的实施例2对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂的活体代谢行为探究结果图。
图8为本发明的实施例2对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂在手术导航淋巴结切除方面的应用探究结果图。
图9为本发明的实施例2对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂在淋巴水肿方面的应用探究结果图。
图10为本发明的实施例2对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂和临床批准应用的ICG在近红外二区淋巴系统方面的对比图。
图11为本发明的实施例3对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂的头和腿部血管成像能力探究。
图12为本发明的实施例3对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂的全身血管成像能力探究结果图。
图13为本发明的实施例3对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂的动静脉成像/区分以及血流速度评估探究结果图。
图14为本发明的实施例3中对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂在皮瓣移植方面的应用探究结果图。
图15为本发明的实施例4中对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂在肿瘤成像方面的应用探究结果图。
图16为本发明的实施例5中对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂在实现多色实时成像方向的可行性探究结果图。
图17为本发明的实施例5中对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂在淋巴结共定位方面的应用探究结果图。
图18为本发明的实施例5中对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂在淋巴系统/血管一体化显影方面的应用探究结果图。
图19为本发明的实施例5中对含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂在一体化药代显影方面的应用探究结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明一个实施例提供的一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白，所述近红外一区和二区荧光蛋白是由蛋白质和花菁染料分子经过可控共价自组装所形成的复合物；
所述蛋白质为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、β-乳球蛋白以及具有合适空腔结构的蛋白质中的任意一种，所述花菁染料分子为含氯的近红外一区和二区花菁染料分子；
所述蛋白质通过自身特定位点与花菁染料分子的氯原子发生亲核取代反应，从而得到共价结合复合物。
本发明一个实施例提供的一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1：将花菁染料和蛋白质溶液按照不低于1:1摩尔比进行混合均匀，得到混合溶液；
S2：将混合溶液进行加热处理，形成仿生荧光蛋白。
本发明一个实施例提供的一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白的制备方法，包括：在活体中注射花菁染料，在血液中原位形成仿生荧光蛋白。
本发明一个实施例提供的一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白作为成像显像剂通过外源性注射的方式进行活体成像应用。
实施例1、本发明一个实施例提供的一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白，该仿生荧光蛋白是由人血清白蛋白与含氯花菁染料分子经过可控共价自组装所形成的复合物，人血清白蛋白作为近红外一区和二区荧光蛋白的蛋白外壳，含氯花菁染料分子作为仿生荧光蛋白的内部发光中心（图1）。
所述近红外一区和二区仿生荧光蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1：将含有人血清白蛋白的溶液A与含有花菁染料分子的溶液B按不同比例混合，从而得到不同的反应液，所述反应液中人血清白蛋白与花菁染料分子的摩尔比分别为1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5，所述反应液中β-乳球蛋白的浓度为0~600 μM；
S2：随后在0~90℃温度条件下加热共孵育0~5 h，得到近红外一区和二区仿生荧光蛋白，所述花菁染料分子包括Et-1080，CO-1080、FD-1080、IR-780和IR-808等。
如图2、图3和图4所示，经实验验证，上述步骤S1中，反应液中人血清白蛋白与花菁染料分子摩尔比大于1:1并且反应浓度大于10 μM时，仿生荧光蛋白已经发生部分淬灭现象，不符合线性递增趋势，故选取人血清白蛋白与花菁染料分子的摩尔比为1:1和反应浓度为10 μM为最佳反应条件。上述步骤S2中，最优选的加热共孵育温度为60℃，最优选的加热时间为2 h。
如图5所示，可以清晰地发现含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂在二区成像窗口表现出优异的发光能力和光辐照稳定性。与此同时，还进行了一系列生物安全性比较，如图6所示，通过溶血实验、细胞毒性实验、生化指标评估实验以及组织病理切片分析结果可以清晰地证实含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂表现出优异的生物安全性，可与临床批准应用ICG吲哚菁绿（Indo Cyanine Green）相媲美。另外，如图7所示，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂在尾静脉注射后表现出优异且快速的代谢能力。鉴于以上特征，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂有望取替临床广泛应用的ICG，推动NIR-II成像技术的真正临床转译。
实施例2、本实施例探究了含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在近红外一区和二区成像窗口下对于定位淋巴结和描绘淋巴管中的应用，包括手术导航淋巴结摘除以及继发性淋巴水肿的实时精准监测等。
如图8和图9所示，在小鼠下肢注射含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂，在近红外一区和二区成像窗口下不仅能够准确清晰地定位淋巴结和描绘淋巴管，而且还能够有效引导淋巴结精准摘除和快速实时可视化淋巴水肿情况。除此之外，还将其与目前临床批准应用的ICG的淋巴系统成像能力进行了比较。如图10所示，相比于ICG，下肢注射含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂的小鼠表现出更优异的近红外二区淋巴系统成像能力，可以更清晰地描绘淋巴结和淋巴管。对比还发现，该含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂表现出更优异的淋巴系统成像时间窗。以上结果也证实了本发明所提出的含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂有望取代ICG成为下一代近红外二区淋巴造影剂。
实施例3、本实施例探究了含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在近红外一区和二区成像窗口下对于血管成像中的应用，包括头/腿/全身血管成像、示踪动静脉、监测血流速度以及评估皮瓣功能性等。
如图11和图12所示，尾静脉注射含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂后，在近红外一区和二区成像窗口下对小鼠头部、腿部以及全身的血管实现了实时清晰地描绘，尤其在大于1400 nm和大于1500 nm 的成像窗口，几乎没有背景/皮肤吸收信号干扰。如图13所示，本发明提供的含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂能够清晰地示踪/区分动静脉和实时监测/评估血流速度。
除此之外，利用含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂对大鼠皮瓣移植术后的皮瓣功能性进行了评估。如图14所示，该含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂可以清楚地对术后皮瓣功能性进行监测，随着时间的延长，可以清楚地观测到“Choke”区发生了开放以及皮瓣部分血路发生了重构。并且通过成像也可以精准地定位和评估皮瓣坏死情况。综上所述，上述结果成功验证了本发明所提出的含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂在血管成像中的优势，能够提供实时清晰地可视化血管，并有望通过活体成像定量评估术后血路损伤/恢复情况，对其进行合理化预后。
实施例4、本实施例探究了含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在近红外一区和二区成像窗口下对于肿瘤成像中的应用。
选取Balb/c小鼠用于皮下肿瘤成像模型。首先通过皮下注射4T1乳腺癌细胞到小鼠背部，以进行肿瘤孵育。接种4周后，尾静脉注射含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂，在近红外二区窗口下对肿瘤的靶向情况进行监测。如图15所示，尾静脉注射含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂可以准确定位肿瘤组织，实现对肿瘤的有效靶向成像，在尾静脉注射探针后48 h。其肿瘤/正常组织的信噪比高达5以上。综上所述，上述结果成功验证了本发明所提出的含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂在肿瘤成像中的优势，表现出优越的灵敏度和成像质量，有望应用于肿瘤疾病研究及手术导航，加速近红外二区荧光成像技术实现临床应用的进程。
实施例5、本实施例探究了含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在近红外二区成像窗口下进行互不串色的一体化多色实时活体成像中的应用，包括淋巴结共定位、药代行为示踪以及淋巴系统/血管一体化显影。
如图16所示，通过体外实验，成功证实了利用近红外一区仿生荧光蛋白（β-LG@IR-780）和近红外二区仿生荧光蛋白（HSA@CO-1080）实现互不串色的一体化多色实时活体成像的可能性。随后，利用含有两种仿生荧光蛋白的成像显像剂展开了一系列活体成像探索。如图17所示，将β-LG@IR-780探针进行尾根注射，将HSA@CO-1080探针进行下肢脚掌注射，两种探针实现了对骶骨淋巴结的精准共定位成像。如图18所示，将β-LG@IR-780探针进行下肢脚掌注射，将HSA@CO-1080探针进行尾静脉注射，利用两种探针成功实现了对淋巴系统和血管互不串色的一体化NIR-II生物成像。此外，如图19所示，将β-LG@IR-780和HSA@CO-1080均通过尾静脉注射到体内，成功地实现了对两种探针的药代行为进行互不串色的一体化示踪。
综上所述，上述结果成功验证了本发明所提出的含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的成像显像剂具有优秀的多通道生物成像应用潜力，有望更好地实现对多生物事件的一体化活体实时成像，以便辅佐临床医生更好地攻克疑难杂症，进而造福全人类。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (9)
1.一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白，其特征在于，所述近红外一区和二区荧光蛋白是由蛋白质和花菁染料分子经过可控共价自组装所形成的复合物；
所述蛋白质为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、β-乳球蛋白以及具有合适疏水空腔结构的蛋白质中的任意一种，所述花菁染料分子为含氯的近红外一区和二区花菁染料分子；
所述蛋白质通过自身特定位点与花菁染料分子的氯原子发生亲核取代反应。
2.一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将花菁染料和蛋白质溶液按照不低于1:1摩尔比进行混合均匀，得到混合溶液；
S2：将混合溶液进行加热处理，形成仿生荧光蛋白。
3.一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白的制备方法，其特征在于，包括：在活体中注射花菁染料，在血液/体液中原位形成仿生荧光蛋白。
4.一种近红外一区和二区仿生荧光蛋白在制备成像显像剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在通过外源性注射的方式进行活体成像中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在近红外一区和二区成像窗口下对于定位淋巴结和描绘淋巴管中的应用，其特征在于，包括手术导航淋巴结摘除以及继发性淋巴水肿的实时精准监测。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在近红外一区和二区成像窗口下对于血管成像中的应用，其特征在于，包括头/腿/全身血管成像、示踪动静脉、监测血流速度以及评估皮瓣功能性。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在近红外一区和二区成像窗口下对于肿瘤成像中的应用。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，含有近红外一区和二区仿生荧光蛋白的所述成像显像剂在近红外二区成像窗口下进行互不串色的一体化多色实时活体成像中的应用，其特征在于，包括淋巴结共定位、药代行为示踪以及淋巴系统/血管一体化显影。
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