CN116963786A - 用于光声成像的金属氢卟啉 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了光声成像造影剂，其包含至少一种辐射吸收组分，所述辐射吸收组分包含铜络合和/或锰络合的二氢卟酚、和/或菌绿素、和/或它们的衍生物、或它们的组合。本发明还提供了单独或组合地使用所公开的光声成像造影剂来生成体积图像的方法，所述体积任选地为受试者或其身体部分、细胞、组织或器官。还提供了使用光声成像造影剂对体积进行多重光声成像的组合物和方法，所述体积任选地为受试者或其身体部分、细胞、组织或器官，所述造影剂同时包含多种本发明公开的铜络合和/或锰络合的二氢卟酚、和/或菌绿素、和/或它们的衍生物。

Description

用于光声成像的金属氢卟啉
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月4日提交的美国专利申请序列第17/140,920号的权益，该专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
总体而言，本公开主题涉及金属氢卟啉(metallohydroporphyrin)和金属氢卟啉缀合物(conjugate)和衍生物，以及使用其作为光声成像造影剂的方法。具体而言，本公开主题涉及金属菌绿素(metallobacteriochlorin)和金属二氢卟酚(metallochlorin)以及在光声成像方法学中使用其的方法。
背景技术
光声成像(photoacoustic imaging，PAI)为新兴的医学成像模式，其基于光能转换成声能的现象(Bell，1880)。PAI提供了超过其他严格的光学成像方法如荧光的明显优点，因为生理组织对声波造成的干扰比它对光造成的干扰小得多。虽然根据定义,PAI仍需要光激发以及随后通过内源吸收和散射的光损失，但声信号响应的较低干扰允许在高达5或甚至7cm的更大深度处的特征成像(de Zerda等人，2012；Wilson等人，2013；Wang&Yao，2016)。
除收集来自内源性生物分子(如黑色素和血红蛋白)的信号之外，PAI还可以用于检测通用造影剂和靶向PAI探针两者。通常，此类试剂在近红外(NIR)谱区域(例如，680-1100nm)内具有其峰值光吸收，在所述区域内生物干扰减少。虽然少数NIR试剂处于开发中，如IRDye 800CW(Marshall等人，2010)、量子点、金纳米颗粒和碳纳米管(de Zerda等人，2012)，但迄今为止大多数PAI研究都已采用内源性探针(例如，黑色素或血红蛋白)或外源性探针吲哚菁绿(ICG)，所述ICG为已获得监管部门批准但缺点是显著的宽吸收谱的碳菁染料(参见图1)。ICG的宽吸收谱导致相应宽PAI信号，其限制了当ICG用作造影剂时，能够在典型实验中区分的另外的靶向生物标记物的数目。
理想地，临床医生希望在单次试验中测定多个生物标记物，用于确认复杂疾病如癌症。为了使NIR谱范围内同时检测多个生物标记物成为可能，本文公开的是基于合成菌绿素的PAI试剂，该PAI试剂是提供了极窄的吸收和PAI谱的一类PAI试剂，从而允许以最低限度的重叠和在紧凑的NIR谱窗(例如，650-1070nm)内的多重检测(multiplex detection)。
发明内容
本发明内容列出了本公开主题的若干实施方案，并且在许多情况下列出了这些实施方案的变体和替代。本发明内容仅仅为众多不同实施方案的示例。提及给定实施方案的一个或多个代表性特征同样为示例性的。此类实施方案通常可以存在或不存在所提及的特征；同样地，这些特征可以应用于本公开主题的其他实施方案，无论是否在本发明内容中列出。为避免过度重复，本发明内容未列出或建议此类特征的所有可能组合。
在一些实施方案中，本公开主题提供了光声成像(PAI)造影剂(contrast agent)。在一些实施方案中，PAI造影剂包含至少一种辐射吸收组分，所述辐射吸收组分包括金属菌绿素、金属二氢卟酚、它们的衍生物或它们的任意组合，其中所述金属菌绿素、金属二氢卟酚或它们的衍生物与铜和/或锰络合。在一些实施方案中，PAI造影剂包含多种不同的铜络合和/或锰络合的菌绿素、铜络合和/或锰络合的二氢卟酚、它们的衍生物或它们的组合，其中每种铜络合和/或锰络合的菌绿素、铜络合和/或锰络合的二氢卟酚、或它们的衍生物具有在650-1070nm的范围内的不同吸收谱。在一些实施方案中，光声成像造影剂包含至少三种不同的金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或其衍生物，其中每种金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物具有峰值吸收值在700-1000nm的范围内的吸收谱；并且所述至少三种吸收谱在700-950nm的范围内基本上不重叠。在一些实施方案中，金属菌绿素和/或金属二氢卟酚包含选自锌、铜、镍、铁、钴、锰和铜的金属。在一些实施方案中，金属菌绿素和/或金属二氢卟酚包含铜和/或锰。在一些实施方案中，光声成像造影剂包含至少一种铜络合菌绿素、铜络合二氢卟酚和/或它们的衍生物，以及至少一种与选自锌、镍、铁、锰和钴的金属络合的另外的金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物。
在一些实施方案中，本公开主题还提供了用于生成体积(volume)或其部分的图像的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述体积或其部分施用造影剂，所述造影剂包含至少一种辐射吸收组分，所述辐射吸收组分包含金属菌绿素、金属二氢卟酚或它们的衍生物，其中所述金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物与铜和/或锰络合；使所述体积或其部分暴露于辐射；检测由辐射在所述体积或其部分中生成的超声波；并且从其中生成含有所施用的造影剂的所述体积或其部分的光声图像。在一些实施方案中，金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物为胶束、脂质体、纳米颗粒或它们的组合的组分，和/或包封在胶束、脂质体、纳米颗粒或它们的组合中。在一些实施方案中，使用波长为650-1070nm的辐射。在一些实施方案中，使用波长为650-900nm、700-950nm和/或750-950nm的辐射。在一些实施方案中，生理学上可耐受的造影剂包含多种不同的金属菌绿素、金属二氢卟酚、它们的衍生物和/或它们的组合，每种金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物具有在650-1070nm的范围内的不同吸收谱。在一些实施方案中，造影剂包含靶向剂(targetingagent)。在一些实施方案中，靶向剂包含与肿瘤细胞、或癌细胞、或者与它们相关的血管内皮细胞上存在的配体和/或靶标(target)结合的部分。在一些实施方案中，配体和/或靶标包含肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，所述部分包含与肿瘤相关抗原结合的肽或肽模拟物(mimetic)。
在一些实施方案中，本公开主题还提供了对体积或其部分多重光声成像的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述体积或其部分施用包含多种辐射吸收组分的造影剂，所述多种辐射吸收组分的每个成员包括金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物，其中所述金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物与铜和/或锰络合；使所述体积或其部分暴露于辐射，其中所述辐射被校准到由所述多种辐射吸收组分差异地吸收的波长；当辐射被所述多种辐射吸收组分差异地吸收时，差异地检测由辐射在所述体积或其部分中生成的超声波；并且从其中生成含有所施用的造影剂的所述体积或其部分的光声图像，其中从所述差异地检测的超声波生成光声图像。在一些实施方案中，所述多种金属二氢卟酚、金属菌绿素和/或它们的衍生物中的一种或多种为胶束、脂质体、纳米颗粒或它们的组合的组分，和/或包封在胶束、脂质体、纳米颗粒或它们的组合中。在一些实施方案中，使用波长为650-1070nm的辐射。在一些实施方案中，使用波长为650-900nm、700-950nm和/或750-950nm的辐射。在一些实施方案中，所述多种辐射吸收组分的每个成员具有在650-1070nm的范围内的不同吸收谱。在一些实施方案中，所述多种辐射吸收组分的一个或多个成员包含靶向剂。在一些实施方案中，靶向剂包含与肿瘤细胞、或癌细胞、或者与它们相关的血管内皮细胞上存在的配体和/或靶标结合的部分。在一些实施方案中，配体和/或靶标包含肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，所述部分包含与肿瘤相关抗原结合的肽或肽模拟物。在一些实施方案中，所述多种辐射吸收组分的两个或更多个成员包含靶向剂。在一些实施方案中，所述多种辐射吸收组分的两个或更多个成员包含不同的靶向剂。在一些实施方案中，不同的靶向剂结合和/或以其他方式积聚在相同或不同的靶标和/或靶向位点(targeted sites)中。
在本公开主题的方法的一些实施方案中，所述体积为受试者或其身体部分，任选地为其细胞、组织和/或器官。在一些实施方案中，所述体积包括肿瘤细胞、癌细胞、或者肿瘤相关或癌症相关的血管细胞。在一些实施方案中，造影剂为生理学上可耐受的造影剂或多种生理学上可耐受的造影剂。在一些实施方案中，造影剂对于在人中的使用为生理学上可耐受的。在一些实施方案中，在药物组合物中提供造影剂，所述药物组合物包含光声成像造影剂和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物对于在人中的使用是药学上可接受的。在一些实施方案中，所述体积包括可以被靶向剂靶向的一种或多种靶标和/或靶向位点。
在一些实施方案中，本公开主题还提供了光声成像造影剂。在一些实施方案中，本公开主题的光声成像造影剂包含至少一种辐射吸收组分，所述辐射吸收组分包含菌绿素、金属菌绿素、它们的衍生物或它们的组合。在一些实施方案中，所述至少一种辐射吸收组分包括选自以下的化合物：
在一些实施方案中，所述至少一种辐射吸收组分包括含有络合金属的B1-B3和B107的衍生物，其中所述络合金属选自锌、铜、锰、镍、钴和铁。在一些实施方案中，络合金属为铜和/或锰。在一些实施方案中，所述衍生物包含选自以下的化合物：
其中M为金属，任选地为选自锌、铜、锰、镍、钴和铁的金属。在一些实施方案中，络合金属为铜和/或锰。在一些实施方案中，所述至少一种辐射吸收组分包括选自MBC-1、MBC-2、MBC-3和MBC-2-PEG的化合物，其中MBC-1、MBC-2、MBC-3和MBC-2-PEG具有以下结构：
并且进一步地，其中M为选自锌(Zn)、镍(Ni)、铁(Fe)、钴(Co)、锰(Mn)和铜(Cu)的金属。在一些实施方案中，所述至少一种辐射吸收组分包括CuBC-725、CuBC-775、CuBC-840或CuBC-2-PEG，其中CuBC-725、CuBC-775、CuBC-840和CuBC-2-PEG具有以下结构：
在一些实施方案中，光声成像造影剂对于在受试者中，任选地，在人中的使用为生理学上可耐受的。
在一些实施方案中，本公开主题提供了药物组合物。在一些实施方案中，本公开药物组合物包含一种或多种如本文所述的光声成像造影剂和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物对于在人中的使用是药学上可接受的。
在一些实施方案中，本公开主题的光声成像造影剂为水溶性的。
在一些实施方案中，本公开主题的光声成像造影剂为聚乙二醇化的。
在一些实施方案中，本公开主题还涉及用于制备聚乙二醇化Cu-菌绿素的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在足以产生聚乙二醇化Cu-菌绿素的条件下，在二甲基甲酰胺(DMF)中，用乙酸铜和氢化钠处理游离碱聚乙二醇化菌绿素。在一些实施方案中，游离碱聚乙二醇化菌绿素为选自MBC-1、MBC-2和MBC-3的菌绿素的聚乙二醇化衍生物。在一些实施方案中，游离碱聚乙二醇化菌绿素为MBC-2-PEG。
对于本领域技术人员来说，在阅读本公开后，这些和其他方面和实施方案将是显而易见的，这为本领域提供了可用于检测和/或标记生物分子和/或细胞的组合物和方法，特别是在光声成像和/或多光谱光声断层扫描(MSOT)的情况下。
附图说明
图1是关于ICG水溶液(修改自Landsman等人，1976)相对于三种菌绿素的甲苯溶液的组的吸收谱图。在该实施例中，关于B2(2,12-二苯基)的谱由相似的2,12-双三甲苯基菌绿素的谱(来自Chen等人，2012)表示。
图2A-2C是细菌叶绿素a(图2A)、一般设计的稳定波长可调的可调节菌绿素(图2B)和Ni-菌绿素B107(图2C)的结构。
图3A和3B是比较在3mm(图3A)或6mm(图3B)深度处，在琼脂体模中成像的ICG(虚线)和镍金属菌绿素B107(实线)信号的图。在相应的染料最大值(795和765nm)处，以相等的光密度(7.5OD)引入样品。
图4是比较在800nm下使用激光随时间推移的B107(黑色)相对于ICG(灰色)PAI信号强度的图。
图5显示了具有在光谱上不同的吸收带的三种菌绿素(菌绿素B1-B3)的结构。关于菌绿素B1-B3的代表性吸收谱在图1中描绘。
图6描绘了关于菌绿素的示例性非限制性合成方案(B1:R1＝R2＝H；B2:R1＝苯基,R2＝CO2Me；B3:R1＝Br，然后在后期将其通过Sonogashira偶联转换为苯乙炔基,R2＝CO2Me)。
图7显示了具有生物可缀合的系链的水溶性金属菌绿素(左)和金属二氢卟酚(右)的实例(M＝Ni、Fe、Co)。羧酸盐可以转换为反应性酯，用于与生物分子上的胺(实例包括N-羟基-琥珀酰亚胺基、N-羟基-磺基-琥珀酰亚胺基、五氟苯基等)生物缀合，或者转换为其它基团如碘代乙酰胺或马来酰亚胺，用于与生物分子上的硫醇偶联。
图8显示了三种示例性金属菌绿素(金属菌绿素MB1-MB3)的结构，其中M是金属，任选地为选自锌(Zn)、铜(Cu)、镍(Ni)、钴(Co)、锰(Mn)和铁(Fe)的金属。在一些实施方案中，络合金属为铜(Cu)。
图9A和9B显示了三种另外的示例性金属菌绿素(金属菌绿素MBC-1、MBC-2和MBC-3；参见图9A)的结构，其中M为金属，任选地为选自锌(Zn)、铜(Cu)、镍(Ni)、钴(Co)、锰(Mn)和铁(Fe)的金属。在一些实施方案中，络合金属为铜(Cu)。图9B显示了示例性铜络合金属菌绿素CuBC-725、CuBC-775和CuBC-840的结构，它们分别对应于金属菌绿素MBC-1、MBC-2和MBC-3的铜络合型式。
图10图示了CuBC-725、CuBC-775和CuBC-840(各自在20μM下)的峰值吸收，在一个示例性多光谱光声断层扫描(MSOT)实验中，峰值吸收分别出现在725、775和840nm处。还在20μM下对ICG进行了测试，CuBC-725、CuBC-775和CuBC-840各自的吸收性能均优于ICG，且特征在于峰更窄。还对体模和水进行了测试，但在每种情况下吸收都很小，以至于这些迹线无法与x轴区分。a.u.即吸光度单位。
图11A和11B描绘了合成本公开主题的一种示例性含铜水溶性菌绿素的方案。
具体实施方案
现在将在下文中更全面地描述本公开主题，其中描述了本公开主题的一些但并非全部实施方案。实际上，本公开主题可以许多不同的形式实施，并且不应该被解释为限制于本文阐述的实施方案；相反，提供这些实施方案使本公开满足适用的法律要求。
I.定义
本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不预期限制本公开主题。
尽管认为下述术语是本领域普通技术人员充分理解的，但阐述下述定义以便于解释本公开主题。
除非下文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都预期具有与由本领域普通技术人员通常理解相同的含义。对本文采用的技术的提及预期是指如本领域通常理解的技术，包括对本领域技术人员显而易见的关于那些技术的变化或等价技术的替代物。尽管认为下述术语由本领域普通技术人员充分理解，但阐述下述定义以便于解释本公开主题。
在描述本公开主题时，应该理解，公开了许多技术和步骤。这些各自具有相应益处并且各自也可以与其它公开技术的一种或多种结合使用，或在一些情况下与其它公开技术全部结合使用。
相应地，为了清楚起见，本说明书将避免以不必要的方式重复各个步骤的每种可能组合。然而，说明书和权利要求应该伴随以下理解进行阅读：此类组合完全在本公开主题和权利要求的范围内。
根据长期存在的专利法惯例，在本申请中，包括在权利要求中使用时，术语“一个”、“一种”和“该/所述”是指“一个或多个”或者“一种或多种”。因此，例如，提及“(一种)PAI造影剂”包括多种PAI造影剂等等。
如本文使用的，当提及质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时，术语“约”意欲涵盖：在一些实施方案中指定量±20％的变化，在一些实施方案中指定量±10％的变化，在一些实施方案中指定量±5％的变化，在一些实施方案中指定量±1％的变化，以及在一些实施方案中±指定量0.1％的变化，因为此类变化适合于进行所公开的方法。
如本文使用的，当在实体列表的上下文中使用时，术语“和/或”是指单独或组合存在的实体。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”包括个别地A、B、C和D，但也包括A、B、C和D的任何和所有组合和子组合。
与“包括”、“含有”或“特征在于”同义的术语“包含”是包含在内的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。“包含”是权利要求语言中使用的专门术语，其意指存在所述元素，但可以添加其它元素并且仍然形成在权利要求的范围内的构造或方法。
如本文使用的，短语“由......组成”排除权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。当短语“由......组成”出现在权利要求主体的一个条款中，而不是紧接在前序之后时，它仅限制该条款中阐述的元素；其它元素不作为整体排除在权利要求之外。
如本文使用的，短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤，加上不会实质上影响所述主题的基本和新型特征的那些材料或步骤。
关于术语“包含”、“由......组成”和“基本上由......组成”，当在本文中使用这三个术语之一时，本公开主题可以包括其它两个术语中的任一的使用。例如，应该理解，在一些实施方案中，由“包含”所涵盖的范围可以比由“基本上由......组成”所涵盖的范围更宽，在一些实施方案中，所述“基本上由......组成”可以具有比“由......组成”更宽的范围。因此，还应该理解，术语“包含”的使用还涵盖“基本上由......组成”以及“由......组成”，并且“基本上由......组成”的使用也涵盖“由......组成”。
如本文使用的，术语“菌绿素(bacteriochlorin)”是指大的杂环芳环，其在核心处由通过四个＝CH-连接键偶联的两个吡咯和两个吡咯啉组成。如本文使用，术语“菌绿素”涵盖菌绿素和异菌绿素两者、和衍生物包括但不限于金属化衍生物。在一些实施方案中，金属化衍生物为与选自锌、镍、铁、钴和铜的金属络合的菌绿素。在一些实施方案中，金属为铜。
如本文使用的，短语“光声成像造影剂”是指当与靶标(任选地为存在于受试者内的靶标)接触时允许靶标通过光声成像进行成像的组合物。在一些实施方案中，光声成像造影剂包含至少一种辐射吸收分子，在一些实施方案中，辐射吸收分子包含菌绿素、金属菌绿素、二氢卟酚、金属二氢卟酚、它们的衍生物或它们的组合。在一些实施方案中，金属菌绿素、金属二氢卟酚或它们的衍生物与选自锌、镍、铁、钴和铜的金属络合。在一些实施方案中，金属为铜。应注意，辐射吸收分子本身可以是光声成像造影剂。因此，在其中存在不同辐射吸收分子的组合的那些实施方案中，组合物作为整体可以被视为光声成像造影剂，并且在一些实施方案中，每个单独的辐射吸收分子可以被视为光声成像造影剂。
如本文使用的，当涉及吸收谱时，短语“基本上不重叠”意指被比较的吸收谱的重叠百分比在一些实施方案中小于50％，在一些实施方案中小于40％，在一些实施方案中小于30％，在一些实施方案中小于25％，在一些实施方案中小于20％，在一些实施方案中小于15％，在一些实施方案中小于10％，并且在一些实施方案中小于5％。在一些实施方案中，当涉及吸收谱时，短语“基本上不重叠”意指吸收谱具有相差至少15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm或95nm的峰，所有这些都落入650-1070nm的范围内。基本上不重叠的吸收谱的实例是图1中关于B1、B2和B3的那些吸收谱。
如本文使用的，短语“生理学上可耐受的”和“药学上可接受的”是指组合物，在一些实施方案中药物组合物，其被公认为在受试者中使用是安全的，其中本公开主题的组合物和方法待应用于所述受试者。
如本文使用的，术语“体积(volume)”是指可能需要光声图像的任何东西。例如但不限于，体积可以是存在于受试者中或从受试者中分离的细胞、组织或器官。在一些实施方案中，体积可以是受试者内的生理学上相关的空间或腔。
II.本公开主题的组合物
与衍生自天然存在的分子如细菌叶绿素a(参见图2A)的试剂不同，二氢卟酚、菌绿素及它们的衍生物的完全合成设计提供了获得波长可调的二氢卟酚和菌绿素的途径(Taniguchi等人，2008)。能够以合成方式设计二氢卟酚、菌绿素及它们的衍生物的优点在于，这促进具有极窄吸收带的许多NIR试剂的开发，所述NIR试剂对于PAI具有独特益处。基于描述染料吸收的宽度的半峰全宽(fwhm)的规定，二氢卟酚和/或菌绿素的NIR吸收带的fwhm通常小于或等于25nm。由于合成二氢卟酚和菌绿素的吸收最大值和其它谱性能可以很容易地“调整”，因此可以设计一系列匹配的二氢卟酚、菌绿素及它们的衍生物，以适应具有染料之间的最小重叠的较小谱范围。图1示出了三种示例性菌绿素(B1-B3)的吸收谱和ICG的吸收谱之间的差异。图10示出了三种示例性金属菌绿素(CuBC-725、CuBC-775和CuBC-840)的吸收谱与ICG的吸收谱之间的差异。在通常分配给ICG检测的谱空间内，由于其窄吸收特性伴随最小的谱重叠，可以检测到高达三种菌绿素。这些优点允许在同一实验中的多重疾病特异性生物标记物的更复杂分析，并且最终加速基于PAI的多重临床测定的开发。
菌绿素由细菌叶绿素a(参见图2A)例示，由于众多(疏水)取代基和手性中心的存在，因此细菌叶绿素a是不容易进行广泛的合成修饰的天然产物。它的还原的吡咯环在合成操作期间也经受脱氢。然而，一系列最近的合成进展已提供了获得稳定、可定制的菌绿素的途径。还原的吡咯啉环中偕二甲基的存在阻断脱氢或氧化过程，提供高弹性的菌绿素(图2B)。通过在β-吡咯位置(图2B的R2、R3、R12、R13)和中间位置(图2B的R5、R15)处引入各种基团，可以容易地操纵吸收最大值，以提供从700nm至大于900nm的任何地方的所需吸收。
通过本文描述的结果显示了二氢卟酚和菌绿素对于PAI的第二个令人信服的优点，其通过将二氢卟酚和菌绿素与金属络合而证实PAI信号中的显著增加，所述金属包括但不限于铜、锌、镍、钯、铜、钴、锰等。游离碱菌绿素和几种金属菌绿素(Zn、Pd)通常展示量子产率(Φ(f))范围高达0.25的荧光，且在某些情况下的大量三重态(高达0.80Φ(isc))。认为Ni-菌绿素络合物具有其单线态的极快速的非辐射衰变(B107的超快动力学提示其衰变到基态为～10ps)，基本上没有到其三重态的转换发生。不希望受任何特定作用机制的束缚，假设由于激发态是如此短暂，这进一步增强了PAI信号。尽管这些特性先前已认识到，并且在表征叶绿素和细菌叶绿素的镍衍生物的研究中得到报道(Pilch等人，2013)，但用此类设计的分子生产且表征PAI试剂的尝试尚未得到报道。这无疑是由于细菌叶绿素a及其它天然产物的合成操作的上述困难。图3显示了使用琼脂体模和具有由680-970nm扫描的可调激光的商业PAI系统，关于Ni-菌绿素(B107)与ICG比较的PAI数据。确定在两个琼脂深度处，与等价光密度的ICG相比，该化合物展示强五倍的信号。这种极大增强的信号强度提示，具有靶向探针的PAI可以在比目前用ICG可获得的组织深度基本上更大的组织深度下完成。数据概括于表1中。
表1
在不同表面深度处，琼脂体模中植入的Ni-菌绿素
和ICG的指示波长处的PAI信号强度
Ni-菌绿素络合物的第三个优点和进一步的益处是其改善的光稳定性。图4显示了用连续800nm激光照射测定的在琼脂体模中关于ICG和Ni-菌绿素B107的信号。增强的稳定性可能是由于对激发三重态的有限转换以及在单线态氧的生成时的后续有限降解。
总之，采用菌绿素和菌绿素衍生物作为PAI造影剂的一些益处包括下述：
·可调波长和窄发射允许多重化(multiplexing)，合成设计顺应添加增溶基团和生物可缀合的系链；
·极大增强的信号金属菌绿素(M＝Zn、Ni、Fe、Mn、Co和/或Cu)允许在比常规标记物更大的深度处的生物标记物的PAI检测；和
·增强的探头稳定性可用于光声显微镜检查、图像指导外科手术和需要延长图像采集时间的其它手术。
除镍的二氢卟酚和菌绿素之外，在一些实施方案中，本公开主题提供了相应的铜(Cu)、铁(Fe)、锌(Zn)、锰(Mn)和/或钴(Co)的金属二氢卟酚和/或金属菌绿素，其提供了关于PAI信号的增强。在一些实施方案中，金属二氢卟酚和/或金属菌绿素中的络合金属为铜。在一些实施方案中，金属二氢卟酚和/或金属菌绿素中的络合金属为锰。
在一些实施方案中，金属二氢卟酚和/或金属菌绿素可以用作造影剂，用于生理特征例如但不限于器官、静脉、淋巴结和淋巴系统的一般成像，并且在一些实施方案中，它们可以通过附着靶向剂而用作靶向探针。如本文使用的，短语“靶向剂(targeting agent)”是指当与本公开主题的组合物附着时，增强组合物在靶部位例如但不限于细胞、组织或器官处的积累的任何分子。例如，通过反应性接头或系链，将金属二氢卟酚和/或金属菌绿素附着至抗体，可以通过先前对于游离碱二氢卟酚和/或菌绿素已建立的方法来完成。在一些实施方案中，增溶基团例如羧酸盐或PEG链可以改善本公开主题的靶向组合物(即，靶向剂已与之络合的金属二氢卟酚、菌绿素或它们的衍生物)的生物标记效率和生物缀合物稳定性。还参见例如，Jiang等人，2015；Zhang等人，2016。
在一些实施方案中，可以优选将金属二氢卟酚和/或金属菌绿素掺入纳米颗粒、微珠、胶束或其它载体结构内，以进一步增强PAI信号和/或影响生物分布。用于将氢卟啉(包括二氢卟酚、菌绿素及它们的衍生物，例如但不限于金属二氢卟酚、金属菌绿素及它们的衍生物)掺入微珠内的示例性方法，公开于例如PCT国际专利申请公开号WO 2017/214637中，其全部内容通过引用并入本文。其它纳米颗粒包括脂质体和掺杂的二氧化硅纳米颗粒。
除二氢卟酚和/或菌绿素及它们的衍生物之外，在一些实施方案中，其它氢卟啉(例如但不限于异菌绿素和具有更长波长NIR吸收的一些二氢卟酚)也用于PAI组。
在一些实施方案中，二氢卟酚、金属二氢卟酚、菌绿素、金属菌绿素及它们的衍生物可以用于多色PAI组以及多模式多色组中，用于成像或图像指导治疗(例如，图像指导外科手术或图像指导药物递送)。多模式实例包括荧光/PAI和MRI/PAI。
图7中呈现了用于生物缀合的具有系链的水溶性金属菌绿素和金属二氢卟酚的非限制性实例。
图11中呈现了聚乙二醇化水溶性金属菌绿素的非限制性实例。
在一些实施方案中，本公开主题提供了光声成像(PAI)造影剂。在一些实施方案中，PAI造影剂包含至少一种辐射吸收组分，所述辐射吸收组分包含金属菌绿素、金属二氢卟酚、它们的衍生物或它们的任意组合，其中所述金属菌绿素、金属二氢卟酚或它们的衍生物与铜和/或锰络合。在一些实施方案中，PAI造影剂包含多种不同的铜络合和/或锰络合的菌绿素、铜络合和/或锰络合的二氢卟酚、它们的衍生物或它们的组合，其中每种铜络合和/或锰络合的菌绿素、铜络合和/或锰络合的二氢卟酚或它们的衍生物具有在650-1070nm的范围内的不同吸收谱。在一些实施方案中，光声成像造影剂包含至少三种不同的金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物，其中每种金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物具有峰值吸收值在700-950nm的范围内的吸收谱，并且所述至少三个吸收谱在700-950nm范围内基本上不重叠。在一些实施方案中，金属菌绿素和/或金属二氢卟酚包含选自锌、铜、镍、铁、钴、锰和铜的金属。在一些实施方案中，金属菌绿素和/或金属二氢卟酚包含铜和/或锰。在一些实施方案中，光声成像造影剂包含至少一种铜络合菌绿素、铜络合二氢卟酚和/或它们的衍生物，以及至少一种与选自锌、镍、铁、锰和钴的金属络合的另外的金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物。
在一些实施方案中，本公开主题还提供了光声成像造影剂。在一些实施方案中，本公开主题的光声成像造影剂包含至少一种辐射吸收组分，所述辐射吸收组分包括菌绿素、金属菌绿素、它们的衍生物或它们的组合。在一些实施方案中，所述至少一种辐射吸收组分包括选自以下的化合物：
在一些实施方案中，所述至少一种辐射吸收组分包含含有络合金属的B1-B3和B107的衍生物，其中所述络合金属选自锌、铜、锰、镍、钴和铁。在一些实施方案中，络合金属为铜和/或锰。在一些实施方案中，所述衍生物包含选自以下的化合物：
其中M为金属，任选地为选自锌、铜、锰、镍、钴和铁的金属。在一些实施方案中，络合金属为铜和/或锰。在一些实施方案中，所述至少一种辐射吸收组分包括选自MBC-1、MBC-2、MBC-3和MBC-2-PEG的化合物，其中MBC-1、MBC-2、MBC-3和MBC-2-PEG具有以下结构：
且进一步地，其中M为选自锌(Zn)、镍(Ni)、铁(Fe)、钴(Co)、锰(Mn)和铜(Cu)的金属。在一些实施方案中，所述至少一种辐射吸收组分包括CuBC-725、CuBC-775、CuBC-840或CuBC-2-PEG，其中CuBC-725、CuBC-775、CuBC-840和CuBC-2-PEG具有以下结构：
在一些实施方案中，光声成像造影剂对于在受试者中，任选地在人中的使用为生理学上可耐受的。
在一些实施方案中，本公开主题提供了药物组合物。在一些实施方案中，本公开药物组合物包含一种或多种如本文所述的光声成像造影剂和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物对于在人中的使用是药学上可接受的。
对于本领域技术人员来说，在阅读本公开后，这些和其他方面和实施方案将是显而易见的，这为本领域提供了可用于检测和/或标记生物分子和/或细胞的组合物和方法，特别是在光声成像和/或多光谱光声断层扫描(MSOT)的情况下。
III.二氢卟酚、金属二氢卟酚、菌绿素、金属菌绿素及它们的衍生物的合成
可以通过本领域技术人员已知的任何方法，生产可以充当用于合成本公开主题的辐射吸收分子的起始材料的金属二氢卟酚和菌绿素。用于合成金属二氢卟酚和菌绿素和相关分子的示例性方法公开于例如美国专利号6,559,374；7,470,785；7,534,807；8,129,520；8,173,691；8,173,692；8,207,329；8,304,561；8,664,260；9,365,722和9,822,123；以及PCT国际专利申请公开号WO2017/214637中，所述专利各自的内容在此通过引用整体并入。用于合成菌绿素和相关分子的具体示例性方法如下。
在一些实施方案中，用于合成本公开主题的菌绿素的方法包括在酸的存在下，在有机溶剂中，缩合一对式IIA的化合物：
其中每个R'独立地表示C1-C4烷基，或两个R'一起表示C2-C4亚烷基；以产生式I的化合物，其中R5为H或烷氧基；
当R5为H时，任选地溴化，然后任选地进一步在R5位置处取代化合物；以产生式IA，其中式IA为：
其中：
每个R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烷基烯基、环烷基炔基、杂环基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、烷氧基、卤素、巯基、叠氮基、氰基、甲酰基、羧酸、羟基、硝基、酰基、烷硫基、氨基、烷基氨基、芳基烷基氨基、二取代氨基、酰氨基、酰氧基、酯、酰胺、硫氧基、磺酰基、磺酸根、磺酸、磺酰胺、脲、烷氧基酰氨基、氨基酰氧基、亲水基团、连接基团、表面附着基团和靶向基团；
或R1和R2一起为＝O或螺烷基；
或R3和R4一起为＝O或螺烷基；
或其中R6和R7、或R7和R8一起表示稠合芳族或杂芳族环系。在一些实施方案中，然后可以根据需要将式I的化合物金属化，包括但不限于用铜金属化。在一些实施方案中，R3和R4中的每一个为甲基。
可替代地，用于合成本公开主题的菌绿素的方法可以包括将式IIB的化合物和式III的化合物在包含第一溶剂的组合物中缩合，以产生中间体；
其中式IIB的化合物具有由下式表示的结构：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7如下文所提供；
其中式III的化合物具有由下式表示的结构：
其中R9、R10、R11、R12、R13和R14如下文所提供；和
R21和R22各自独立地选自氢、烷基和芳基，或R21和R22一起表示C2-C4亚烷基；和
在酸的存在下使中间体在第二溶剂中缩合，以产生式IV的化合物或其金属缀合物，其中式IV定义为：
或其金属缀合物(例如，其铜螯合物)，其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15和R16各自独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烷基烯基、环烷基炔基、杂环基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、芳氧基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、烷氧基、卤素、巯基、叠氮基、氰基、甲酰基、羧酸、羟基、硝基、酰基、烷硫基、氨基、烷基氨基、芳基烷基氨基、二取代氨基、酰氨基、酰氧基、酯、酰胺、硫氧基、磺酰基、磺酸根、磺酸、磺酰胺、脲、烷氧基酰氨基、氨基酰氧基、亲水基团、连接基团、表面附着基团和靶向基团；
或R1和R2一起为＝O或螺烷基；
或R3和R4一起为＝O或螺烷基；
或R3和R4各自为甲基；
或R9和R10一起为＝O或螺烷基；
或R11和R12一起为＝O或螺烷基；
或R15和R16一起为＝O；
或R5和R6一起表示稠合芳族或杂芳族环系；
或R6和R7一起表示稠合芳族或杂芳族环系；
或R13和R14一起表示稠合芳族或杂芳族环系；和
Z是吸电子基团(例如，-CO2R17、-C(O)NHR17、-C(O)NR17R18、-C(O)R17、-CN、-C＝N–NR17R18、-PO(OR17)2、-SO2OR17、-SO2NR17R18、-SO2R17和-SiR17R18R19，并且其中R17、R18和R19在每次出现时独立地选自氢、烷基和芳基)。
合成菌绿素的另外的示例性途径包括Liu&Lindsey，2016中描述的Northern-Southern Route，以及Zhang&Lindsey，2017中描述的用于合成具有环形同素环的菌绿素大环的方法，所述参考文献各自的内容通过引用整体并入本文。
可以在菌绿素组中采用的三种示例性菌绿素(例如，菌绿素B1-B3)显示于图5中。这些可以转换为相应的金属菌绿素(在图8中描绘)，其预期具有PAI中的峰值信号的相似扩散，伴随在其之间的低重叠以及来自游离碱菌绿素的峰值谱波长中的20-30nm偏移。图6是菌绿素B1-B3的合成方法的简要概述。菌绿素B1和B2可以通过已知方法(参见Krayer等人，2010)，以从相应的吡咯-2-甲醛开始的五个步骤合成。菌绿素B3需要经历Sonogashira偶联的溴取代的菌绿素(R1＝Br)，以安放苯基乙炔基，以实现在约790nm处的所需吸收。菌绿素B3的类似物已得到合成，并且证实为符合该波长预期。
金属二氢卟酚通常在较短的波长下表现出与金属菌绿素类似的光声信号。用于制备金属二氢卟酚的合成方法通常还涉及：通常在四氢二次甲基胆色素(tetrahydrbiladiene)前体的最终闭环反应以形成金属二氢卟酚期间，在碱存在下添加金属盐。Ptaszek等人(2007)详细描述了此类方法，其全部内容通过引用并入本文。
每种二氢卟酚和/或菌绿素的金属化可以通过基本上如Chen等人(2012)中所述的最近开发的方法实现。合成二氢卟酚和/或菌绿素的金属化被提前，以覆盖携带各种取代模式的合成二氢卟酚和/或菌绿素，范围从吸电子到富电子的功能。一般而言，取决于二氢卟酚和/或菌绿素的性质，可以在金属化中利用两种方法。富含电子的二氢卟酚和/或菌绿素可以通过以下而金属化：在THF中用强碱(NaH或LDA)处理，随后在60℃加入金属盐(MXn)。通过在升温下用金属盐(MXn)在DMF中处理，可以使缺电子的菌绿素金属化。这两种方法以前已用于制备各种合成的Zn-、Cu-、Pd-和Ni-菌绿素。这些方法也可以用于合成Mn-、Fe-和Co-菌绿素，经由用Mn、Fe和Co使游离碱菌绿素金属化。通过举例而非限制的方式，Schaberle等人(2017)描述了通过相关方法合成Mn-菌绿素。
图9A中示出了可以在菌绿素组中使用的三种另外的示例性菌绿素(例如，菌绿素MBC-1、MBC-2，和MBC-3)。这些可以转换为相应的金属菌绿素(其实例在图9B中示出)，预计PAI中峰值信号具有相似的扩展，它们之间的重叠度较低，并且峰值光谱波长与游离碱菌绿素相比有20-30nm的偏移。
在一些实施方案中，本公开主题还涉及用于制备聚乙二醇化二氢卟酚、金属二氢卟酚、菌绿素和金属菌绿素的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在足以产生聚乙二醇化Cu-菌绿素的条件下，在二甲基甲酰胺(DMF)中，用乙酸铜和氢化钠处理游离碱聚乙二醇化菌绿素。在一些实施方案中，游离碱聚乙二醇化菌绿素为选自MBC-1、MBC-2和MBC-3的菌绿素的聚乙二醇化衍生物。在一些实施方案中，游离碱聚乙二醇化菌绿素为MBC-2-PEG。图11中提供了用于制备聚乙二醇化菌绿素然后将聚乙二醇化菌绿素衍生成聚乙二醇化Cu-菌绿素的示例性方案。应当理解，关于图11，菌绿素描绘为MBC-2，但是也可以如所述将其他二氢卟酚和菌绿素(包括但不限于MBC-1和MBC-3)聚乙二醇化和/或金属化。类似地，应当理解，图11描绘了与乙酸铜的反应，以便将铜添加到聚乙二醇化菌绿素中，但是可以类似地采用其他金属以及使用其他试剂，所述其他试剂例如但不限于乙酸锰、乙酸锌、乙酸镍、乙酸铁和乙酸钴，以及锰、锌、镍、铁、钴和/或铜的其他化学形式。
IV.使用本公开主题的组合物的PAI方法
光声成像是其中将非电离激光脉冲传递给生物组织的技术。传递能量的一部分被吸收并且转换成热，导致瞬时热弹性膨胀和超声发射。其后检测并分析所生成的超声波，以产生生物组织的图像。一般地，超声发射的量级揭示了生理学上特异性的光吸收对比度。然后可以形成靶向区域的2D或3D图像。参见例如美国专利申请公开号2005/0085725；2009/0066949；2009/0069653；2010/0226003；和2012/0296192；美国专利号6,738,653；7,864,307；7,916,283；PCT国际专利申请公开号WO 2002/008740；以及Xu&Wang，2006；Li&Wang，2009；Li等人，2009；Wang，2009；Yang等人，2009；所述参考文献各自通过引用整体并入本文。
因此，在一些实施方案中，本公开主题提供了用于生成体积图像的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述体积或其部分施用造影剂，所述造影剂包含至少一种辐射吸收组分，所述辐射吸收组分包括金属菌绿素、金属二氢卟酚或它们的衍生物，其中所述金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物与铜和/或锰络合；使所述体积或其部分或暴露于辐射；检测由辐射在所述体积或其部分中生成的超声波；并且从其中生成含有所施用的造影剂的所述体积或其部分的光声图像。在一些实施方案中，金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物为胶束、脂质体、纳米颗粒或它们的组合的组分和/或包封在胶束、脂质体、纳米颗粒或它们的组合中。在一些实施方案中，使用波长为650-1070nm的辐射。在一些实施方案中，使用波长为650-900nm、700-950nm和/或750-950nm的辐射。在一些实施方案中，生理学上可耐受的造影剂包含多种不同的金属菌绿素、金属二氢卟酚、它们的衍生物和/或它们的组合，每种金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物具有在650-1070nm的范围内的不同吸收谱。在一些实施方案中，造影剂包含靶向剂。在一些实施方案中，靶向剂包含与肿瘤细胞或癌细胞或者与它们相关的血管内皮细胞上存在的配体和/或靶标结合的部分。在一些实施方案中，配体和/或靶标包含肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，所述部分包含与肿瘤相关抗原结合的肽或肽模拟物。
在一些实施方案中，本公开主题还提供了用于体积的多重光声成像的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述体积或其部分施用包含多种辐射吸收组分的造影剂，所述多种辐射吸收组分的每个成员包括金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物，其中所述金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物与铜和/或锰络合；使所述体积或其部分暴露于辐射，其中所述辐射被校准到由所述多种辐射吸收组分差异地吸收的波长；当辐射被所述多种辐射吸收组分差异地吸收时，差异地检测由辐射在所述体积或其部分中生成的超声波；并且从其中生成含有所施用的造影剂的所述体积或其部分的光声图像，其中从差异检测的超声波生成光声图像。在一些实施方案中，所述多种金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物中的一种或多种为胶束、脂质体、纳米颗粒或它们的组合的组分，和/或包封在胶束、脂质体、纳米颗粒或它们的组合中。在一些实施方案中，使用波长为650-1070nm的辐射。在一些实施方案中，使用波长为650-900nm、700-950nm和/或750-950nm的辐射。在一些实施方案中，所述多种辐射吸收组分中的每个成员具有在650-1070nm的范围内的不同吸收谱。在一些实施方案中，所述多种辐射吸收组分的一个或多个成员包含靶向剂。在一些实施方案中，靶向剂包含与肿瘤细胞、或癌细胞、或者与它们相关的血管内皮细胞上存在的配体和/或靶标结合的部分。在一些实施方案中，配体和/或靶标包含肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，所述部分包含与肿瘤相关抗原结合的肽或肽模拟物。在一些实施方案中，所述多种辐射吸收组分的两个或更多个成员包含靶向剂。在一些实施方案中，所述多种辐射吸收组分的所述两个或更多个成员包含不同的靶向剂。在一些实施方案中，不同的靶向剂结合和/或以其它方式积聚在相同或不同的靶标和/或靶向位点中。
此外，在本公开主题的方法的一些实施方案中，所述体积是受试者或其身体部分，任选地是其细胞、组织和/或器官。在一些实施方案中，所述体积包括肿瘤细胞、癌细胞、或者肿瘤相关或癌症相关的血管细胞。在一些实施方案中，造影剂是生理学上可耐受的造影剂或多种生理学上可耐受的造影剂。在一些实施方案中，造影剂对于在人中的使用是生理学上可耐受的。在一些实施方案中，在药物组合物中提供造影剂，药物组合物包含光声成像造影剂和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物对于在人中的使用是药学上可接受的。在一些实施方案中，所述体积包括可以被靶向剂靶向的一种或多种靶标和/或靶向位点。
因此，本公开方法可以用于体内、离体和体外用途。当在体内采用时，本公开方法可以采用对于在对象中，任选地在人中使用是生理学上可耐受的造影剂。在一些实施方案中，造影剂被配制为药物组合物的部分，在一些实施方案中，药物组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物对于在人中的使用是药学上可接受的。合适的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素和溶质，其致使制剂与预期接受者的体液等渗；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以在冷冻或冷冻干燥(冻干)条件下贮存，仅需要在使用前立即添加无菌液体载体，例如注射用水。一些示例性成分是在一些实施方案中范围为0.1至10mg/ml，在一些实施方案中约2.0mg/ml的十二烷基硫酸钠(SDS)；和/或在一些实施方案中范围为10至100mg/ml，在一些实施方案中约30mg/ml的甘露醇或其他糖；和/或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。关于所讨论的制剂类型，可以使用本领域常规的任何其它试剂。
在一些实施方案中，本公开组合物用作造影剂，和/或用作多色PAI组和/或多模式多色组的组分，用于成像或图像指导疗法(参见例如美国专利号8,617,522；通过引用并入本文)。
实施例
下述实施例提供了说明性实施方案。根据本公开内容和本领域的一般技术水平，本领域技术人员将了解，下述实施例仅预期是示例性的，并且可以采用众多变化、修改和改变，而不脱离本公开主题的范围。
实施例中使用的材料与方法
吲哚菁绿(ICG)得自Sigma-Aldrich(目录号I2633；Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，Missouri，美国)。如在Sun等人，2013和Chen等人，2012中所述制备Ni-菌绿素B107。在成像实验之前，每种染料以所需浓度溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。用于制备琼脂体模的模具通常是直径90mm的玻璃培养皿。
实施例1
体模制备
将高度纯化的琼脂粉末(目录号A7921；Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，Missouri，美国)溶解于水(试剂级，I型)中至2.0％的终浓度，并且在微波炉中加热至95℃的熔化温度。加热和旋转混合的三个30秒循环得到平滑的琼脂制剂。使用标准热板和双层蒸锅，将含有琼脂的瓶子在75-85℃保持1-3小时，以避免烧焦(其引起吸收系数的可检测增加)。在升温下的这个等待时期允许气泡的缓慢释放，并产生具有可忽略的吸收和非常低的浊度的琼脂溶液。通过添加作为散射介质的20％(1:5v/v)终浓度为1.0％的低脂乳和作为吸收介质的印度油墨(Higgins Black 44201；Chartpak，Inc.，Leeds，Massachusetts，美国)，达到体模的所需光学特性。这些添加在54-58℃的范围内进行，以避免乳蛋白的沉淀。用搅拌棒以一定速度缓慢且连续地搅拌溶液，以维持乳和油墨的同质性，但不引起气泡或起泡。
在分配体模基质之前，将培养皿在50℃热板上预热1分钟。使用预热的25ml血清移液管，将体模基质溶液分配到模具内，并且保持不受干扰，以达到适当的硬化和稳定的光学特性(20-25℃)。如果在四小时内不使用形成的体模，则将它们密封以限制蒸发。一般而言，如果冷藏贮存，则在8小时或72小时内使用所形成的体模。如果冷藏，则在使用前将它们加温至环境温度。这允许体模基质在硬化之前均匀扩散，允许体模表面的光学平度(快速抽吸且在50-53℃体模基质中分配两次)。通常，加入20ml体模基质，以获得3±10％mm厚的模具。根据需要堆叠3mm厚的体模，以便测定在所需深度处，来自贯穿琼脂层和在琼脂层下方延伸的聚乙烯管中的染料的PAI信号。
实施例2
琼脂体模和染料的光声成像
使用配备有软件版本1.7.2的LAZR 2100成像系统(VisualSonics，Inc.，Toronto，Ontario，加拿大)进行光声成像。该仪器将超声与光声模式(PA)成像组合，并且采用由双倍Nd:YAG可调激光器抽泵的光学参量振荡器激光器(OPO)。以PA扫描模式(680-900nm)以5nm步长或在固定波长下进行成像并持续指定的时间段。经由注射器将染料引入PE50聚乙烯管(0.023英寸x 0.038英寸；Braintree Scientific，Braintree，Massachusetts，美国)内，并且在成像实验期间在每个端部处夹紧。将超声凝胶应用于琼脂体模的表面，以确保转导器和体模之间的有效偶联。通过超声和PA信号分离管道及其相关的图像区域，用于PA强度定量。图3和4中呈现的数据是关于63μM Ni-菌绿素(B107)和50μMICG的溶液，并且指示与ICG相比，在两个琼脂深度处关于Ni-菌绿素大约高5倍的信号。
实施例3
其它金属菌绿素的制备、以及使琼脂体模和使用所述其它金属菌绿素的染料光声成像
也使用图6中描绘的基本方案，制备对应于Ni-菌绿素B107的钴-(Co)和铁-(Fe)菌绿素。另外，也使用图6中描绘的基本方案，制备对应于菌绿素B1-B3的Ni-、Co-和Fe-菌绿素。示例性金属化菌绿素呈现于图8中。
基本上如实施例2中所述，进行琼脂体模和使用B107的Co-和Fe-菌绿素衍生物以及菌绿素B1-B3的Ni-、Co-和Fe-菌绿素衍生物的染料的光声成像。将各种信号和归一化信号的强度彼此比较并与ICG信号的强度进行比较。
实施例4
铜络合金属菌绿素的制备、以及使琼脂体模和使用铜络合金属菌绿素的染料光声成像
使用三种Cu-菌绿素(CuBC-725、CuBC-775和CuBC-840)来制备PAI造影剂(吸收峰值分别在725、775和840nm处)，并将ICG在二甲基甲酰胺(DMF)中稀释。将这三种造影染料置于吸管中并在4孔琼脂散射体模中成像，旁边为填充有DMF或如本文所述的ICG的对照管。制备20μM、5μM和1μM的稀释液。收集每个样品的完整吸收谱。还对使用两两相混染料(CuBC-725/CuBC-775、CuBC-725/CuBC-840和CuBC-775/CuBC-840)的样品进行了测定。使用MSOTinVision 512-Echo(iThera Medical GmbH,Munich,德国)，在680至980nm的成像波长下，对卷积MSOT吸收谱进行评估。在所有记录波长下，对重建图像进行ROI分析，以获得OA光谱。在样品管和对照管周围绘制ROI。在3Z-slices处测定光谱并取平均值以提高SNR。
结果如图10所示。如图10所示，与ICG相比，CuBC-725、CuBC-775和CuBC-840各自的特征在于，更尖锐的峰和增加的吸收最大值。
实施例5
通过将铜直接插入聚乙二醇化菌绿素中来制备示例性水溶性聚乙二醇化铜菌绿素
MBC-2-PEG(M＝H,H)的合成。示例性水溶性聚乙二醇化菌绿素的合成描绘于图11A中。用4.0M HCl的二氧六环溶液(1.5mL)对在25mL圆底烧瓶中的MBC-2游离碱(M＝H,H)(26mg，22μmol)进行处理。在室温(rt)，在氩气下和黑暗中搅拌反应混合物。0.5小时后，将反应混合物置于高真空下以除去HCl/二氧六环。用隔膜将烧瓶密封、抽真空并用氩气冲洗。添加DMF(5.4mL)、Et3N(48μL,35mg,346μmol)、CH3(OC2H4)12CONHS(mPEG12-NHS,67mg,97μmol)并在室温(rt)下搅拌过夜。LCMS证实了所需产物。除去DMF，并将在30％的AcCN水溶液中的样品加载到C18 250x 20柱上，采用20-80％ AcCN的梯度洗脱水溶液并历时60分钟，以得到MBC-2-PEG绿粉色半固体。产率为59％(39mg)。
然后如图11B所示，将铜添加到水溶性聚乙二醇化MBC-2-PEG中。将在10mL RBF中的MBC-2-PEG(10mg，3.3μmol)溶解在DMF(2.0mL)中并在室温下用NaH(约12mg，489μmol，150当量，在矿物油中的60％分散体，用己烷预先洗涤)处理0.5小时。添加Cu(OAc)2(18mg，98μmol)并在氩气下将混合物于60℃加热至回流。UV-vis和LCMS证实加热80分钟后形成所需产物。用2.0mL水将反应猝灭，搅拌30分钟，接着进行水性后处理，使用20-80％ AcCN的梯度水溶液进行反相制备型LC并历时50分钟。分离的CuBC-2-PEG的产量为7.7mg(75％)，为深红色半固体。
值得注意的是，在图11A和11B中，在聚乙二醇化之后将铜添加到水溶性聚乙二醇化菌绿素中。然而，在一些实施方案中，铜(或另一种金属)可以在聚乙二醇化之前与本公开主题的菌绿素络合。
参考文献
下文列出的所有参考文献，以及本公开内容中引用的所有参考文献，包括但不限于所有专利、专利申请及其公开，科学期刊论文和数据库条目，均通过引用整体并入本文，至它们补充、解释、提供背景或教导本文所用的方法、技术和/或组合物的程度。
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应当理解，可以改变本公开主题的各种细节，而不脱离本公开主题的范围。此外，前文说明书仅用于说明的目的，而不是为了限制的目的。

Claims (39)

1.光声成像造影剂，其包含至少一种辐射吸收组分，其中所述至少一种辐射吸收组分包含金属菌绿素、金属二氢卟酚、它们的衍生物或它们的任意组合，其中所述金属菌绿素、金属二氢卟酚或它们的衍生物与铜或锰络合。
2.根据权利要求1所述的光声成像造影剂，其包含多种不同的金属菌绿素、金属二氢卟酚、它们的衍生物或它们的组合，其中每种金属菌绿素、金属二氢卟酚或它们的衍生物具有在650-1070nm的范围内的不同吸收谱并且与铜或锰络合。
3.根据权利要求2所述的光声成像造影剂，其中：
(i)所述光声成像造影剂包含至少三种不同的金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物；
(ii)每种金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物具有峰值吸收值在700-950nm的范围内的吸收谱；和
(iii)所述至少三个吸收谱在700-950nm的范围内基本上不重叠。
4.根据权利要求3所述的光声成像造影剂，其中所述光声成像造影剂包含至少一种铜络合菌绿素、铜络合二氢卟酚和/或它们的衍生物，以及至少一种与选自锰、锌、镍、铁和钴的金属络合的另外的金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物。
5.生成体积图像的方法，所述方法包括：
(a)使所述体积与包含至少一种辐射吸收组分的造影剂接触，其中所述至少一种辐射吸收组分包含金属菌绿素、金属二氢卟酚或它们的衍生物，其中所述金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物与铜或锰络合；
(b)使所述体积暴露于辐射；
(c)检测由所述辐射在所述体积中生成的超声波；和
(d)从其中生成含有所述造影剂的所述体积或其部分的光声图像。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物为胶束、脂质体、纳米颗粒或它们的组合的组分，和/或包封在胶束、脂质体、纳米颗粒或它们的组合中。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述体积暴露于波长为650-1070nm的辐射。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述体积暴露于波长为650-900nm、700-950nm和/或750-950nm的辐射。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述造影剂包含多种不同的金属菌绿素、金属二氢卟酚、它们的衍生物和/或它们的组合，每种金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物具有在650-1070nm的范围内的不同吸收谱。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述造影剂包含靶向剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述靶向剂包含与肿瘤细胞、或癌细胞、或者与它们相关的血管内皮细胞上存在的配体和/或靶标结合的部分。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述配体和/或靶标包含肿瘤相关抗原。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述部分包含与所述肿瘤相关抗原结合的肽或肽模拟物。
14.用于体积的多重光声成像的方法，所述方法包括：
(a)使所述体积与包含多种辐射吸收组分的造影剂接触，所述多种辐射吸收组分的每个成员包含金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物，其中所述金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物与铜或锰络合；
(b)使所述体积暴露于辐射，其中所述辐射被校准到由所述多种辐射吸收组分差异地吸收的波长；
(c)当所述辐射被所述多种辐射吸收组分差异地吸收时，差异地检测由所述辐射在所述体积中生成的超声波；和
(d)从其中生成含有所施用的造影剂的所述体积或其部分的光声图像，其中从所述差异地检测的超声波生成所述光声图像。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述多种金属菌绿素、金属二氢卟酚和/或它们的衍生物中的一种或多种为胶束、脂质体、纳米颗粒或它们的组合的组分，和/或包封在胶束、脂质体、纳米颗粒或它们的组合中。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述体积暴露于波长为650-1070nm的辐射。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述体积暴露于波长为650-900nm、700-950nm和/或750-950nm的辐射。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述多种辐射吸收组分中的每个成员具有在650-1070nm的范围内的不同吸收谱。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述多种辐射吸收组分中的一个或多个成员包括靶向剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶向剂包含与肿瘤细胞、或癌细胞、或者与它们相关的血管内皮细胞上存在的配体和/或靶标结合的部分。
21.根据权利要求20的所述方法，其中所述配体和/或靶标包含肿瘤相关抗原。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述部分包含与肿瘤相关抗原结合的肽或肽模拟物。
23.根据权利要求14所述的方法，其中所述多种辐射吸收组分中的两个或更多个成员包括靶向剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述多种辐射吸收组分中的所述两个或更多个成员包括不同的靶向剂。
25.根据权利要求5-24中任一项所述的方法，其中所述体积为受试者或其身体部分，任选地为其细胞、组织和/或器官。
26.根据权利要求27所述的方法，其中所述体积包括肿瘤细胞、癌细胞、或者肿瘤相关或癌症相关的血管细胞。
27.根据权利要求5-26中任一项所述的方法，其中所述造影剂对于在受试者中、任选地在人中的使用为生理学上可耐受的。
28.根据权利要求5-27中任一项所述的方法，其中在药物组合物中提供所述造影剂，所述药物组合物包含所述光声成像造影剂、和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述药物组合物对于在人中的使用是药学上可接受的。
30.光声成像造影剂，其包含至少一种辐射吸收组分，所述辐射吸收组分包括金属菌绿素、和/或它们的衍生物、或它们的组合，其中所述至少一种辐射吸收组分包括选自以下的化合物：MBC-1、MBC-2、MBC-3和MBC-2-PEG，其中MBC-1、MBC-2、MBC-3和MBC-2-PEG具有以下结构：
并且进一步地，其中M为选自锌(Zn)、镍(Ni)、铁(Fe)、钴(Co)、锰(Mn)和铜(Cu)的金属。
31.根据权利要求30所述的光声成像造影剂，其中所述至少一种辐射吸收组分包括CuBC-725、CuBC-775、CuBC-840或CuBC-2-PEG，其中CuBC-725、CuBC-775、CuBC-840和CuBC-2-PEG具有以下结构：
32.根据权利要求1-4、30和31中任一项所述的光声成像造影剂，其中所述光声成像造影剂对于在受试者中、任选地在人中的使用为生理学上可耐受的。
33.药物组合物，其包含根据权利要求1-4和30-32中任一项所述的光声成像造影剂和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述药物组合物对于在人中的使用是药学上可接受的。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的药物组合物，其中根据权利要求1-4和30-32中任一项所述的光声成像造影剂为水溶性的。
36.根据权利要求33或权利要求34所述的药物组合物，其中根据权利要求1-4和30-32中任一项所述的光声成像造影剂为聚乙二醇化的。
37.用于制备聚乙二醇化Cu-菌绿素的方法，所述方法包括在足以产生聚乙二醇化Cu-菌绿素的条件下，在二甲基甲酰胺(DMF)中，用乙酸铜和氢化钠处理游离碱聚乙二醇化菌绿素。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述游离碱聚乙二醇化菌绿素为选自MBC-1、MBC-2和MBC-3的菌绿素的聚乙二醇化衍生物。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述游离碱聚乙二醇化菌绿素为MBC-2-PEG。
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