JP2024503292A - 光音響イメージング用のメタロヒドロポルフィリン - Google Patents

Abstract

銅錯体及び／若しくはマンガン錯体のクロリン及び／若しくはバクテリオクロリン並びに／若しくはそれらの誘導体、又はそれらの組合せを含む少なくとも１つの放射線吸収成分を含む光音響イメージング造影剤が提供される。開示の光音響イメージング造影剤を単独で又は組み合わせて使用し、ボリュームの、任意選択で対象又はその身体部分、細胞、組織、若しくは器官の画像を生成する方法も提供される。複数の本開示の銅錯体及び／若しくはマンガン錯体のクロリン及び／若しくはバクテリオクロリン並びに／又はそれらの誘導体を同時に含む光音響イメージング造影剤を使用して、ボリュームの、任意選択で対象又はその身体部分、細胞、組織、又は器官の、多重光音響イメージングのための組成物及び方法がさらに提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月４日に出願された米国特許出願公開第１７／１４０，９２０号の利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。

本開示の主題は、一般に、メタロヒドロポルフィリン並びにメタロヒドロポルフィリンのコンジュゲート及び誘導体、並びにこれらを光音響イメージング用の造影剤として使用する方法に関する。特に、本開示の主題は、メタロバクテリオクロリン及びメタロクロリン、並びに光音響イメージング方法論におけるそれらの使用方法に関する。

光音響イメージング（ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ：ＰＡＩ）は、光エネルギーが音響エネルギーに変換される現象（ベル、１８８０）に基づく最先端の医療用イメージングモダリティである。生理的組織は、音波に対する妨害が光に対する妨害よりもかなり小さいので、ＰＡＩには、蛍光などの完全に光学的な他の造影方法よりも明らかに利点がある。ＰＡＩには、定義上、光励起及びその後の内因性の吸収及び散乱による光の損失がやはり要求されるが、音響シグナル応答への妨害が小さいことにより、かなり深い深度、最大５ｃｍ又はさらには７ｃｍの特徴部のイメージングが可能である（ｄｅ Ｚｅｒｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｗａｎｇ＆Ｙａｏ，２０１６）。

ＰＡＩを使用すると、メラニン及びヘモグロビンなどの内因性の生体分子からシグナルを収集することに加えて、一般的な造影剤及び標的ＰＡＩプローブの両方を検出することができる。通常、そのような試薬は、生物学的な妨害が低減される近赤外（ｎｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ：ＮＩＲ）スペクトル領域（例えば、６８０～１１００ｎｍ）にピーク光吸収を有する。ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、量子ドット、金ナノ粒子、及びカーボンナノチューブ（ｄｅ Ｚｅｒｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）などのいくつかのＮＩＲ試薬が開発中であるが、今日までのほとんどのＰＡＩ研究は、内因性のプローブ（例えば、メラニン又はヘモグロビン）、又は外因性プローブのインドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ：ＩＣＧ）、すなわちカルボシアニン色素のいずれかを用いており、カルボシアニン色素については、規制上の承認を受けているものの、吸収スペクトルが著しく広いことに問題がある（図１を参照されたい）。ＩＣＧが造影剤として用いられる場合、ＩＣＧの吸収スペクトルが広いため対応するＰＡＩシグナルが広くなり、ＰＡＩシグナルが広いと、通常の実験では区別することができる追加の標的バイオマーカーでも、その数が制限されてしまう。

理想的には、臨床医は、がんなどの複雑な疾患を確認するために、１回の操作で複数のバイオマーカーについて測定したいであろう。ＮＩＲスペクトル範囲内の複数のバイオマーカーを同時に検出することができるように、本明細書においては、合成バクテリオクロリンに基づくＰＡＩ試薬を開示する。当該ＰＡＩ試薬は、極めて狭い吸収とＰＡＩスペクトルを示すため、重なりが最少でコンパクトなＮＩＲスペクトルウィンドウ（例えば、６５０～１０７０ｎｍ）での多重検出を可能にするＰＡＩ薬剤の類である。

本概要では、本開示の主題のいくつかの実施形態を列挙し、多くの場合、これらの実施形態の変形及び置換を列挙する。本概要は、多数の様々な実施形態の例示にすぎない。所与の実施形態の１つ又は複数の代表的な特徴についての言及も、同様に例示である。そのような実施形態は、通常、言及された（１つ又は複数の）特徴の有無にかかわらず存在し得る。同様に、これらの特徴は、本概要に列挙されているか否かにかかわらず、本開示の主題の他の実施形態に適用し得る。過度の繰り返しを避けるために、本概要は、そのような特徴の可能なすべての組合せを列挙又は提案するものではない。

本開示の主題は、いくつかの実施形態において、光音響イメージング（ＰＡＩ）造影剤を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＡＩ造影剤は、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、それらの誘導体、又はそれらの任意の組合せを含む少なくとも１つの放射線吸収成分を含み、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、又はそれらの誘導体は、銅及び／又はマンガンと錯体形成している。いくつかの実施形態では、ＰＡＩ造影剤は、複数の異なる銅錯体及び／若しくはマンガン錯体のバクテリオクロリン、銅錯体及び／若しくはマンガン錯体のクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組合せを含み、各銅錯体及び／若しくはマンガン錯体のバクテリオクロリン、銅錯体及び／若しくはマンガン錯体のクロリン、又はそれらの誘導体は、６５０～１０７０ｎｍの範囲で異なる吸収スペクトルを有する。いくつかの実施形態では、光音響イメージング造影剤は、少なくとも３つの異なるメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体を含み、各メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は、７００～９５０ｎｍの範囲にピーク吸収値がある吸収スペクトルを有する。少なくとも３つの吸収スペクトルは、７００～９５０ｎｍの範囲で実質的に重なり合わない。いくつかの実施形態では、メタロバクテリオクロリン及び／又はメタロクロリンは、亜鉛、銅、ニッケル、鉄、コバルト、マンガン、及び銅からなる群から選択される金属を含む。いくつかの実施形態では、メタロバクテリオクロリン及び／又はメタロクロリンは、銅及び／又はマンガンを含む。いくつかの実施形態では、光音響イメージング造影剤は、少なくとも１つの銅錯体のバクテリオクロリン、銅錯体のクロリン、及び／又はそれらの誘導体、並びに、亜鉛、ニッケル、鉄、マンガン、及びコバルトからなる群から選択される金属と錯体形成した少なくとも１つの追加のメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体を含む。

本開示の主題はまた、いくつかの実施形態において、ボリューム又はその一部の画像を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、当該方法は、少なくとも１つの放射線吸収成分であって、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、又はそれらの誘導体を含み、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は、銅及び／又はマンガンと錯体形成している、少なくとも１つの放射線吸収成分、を含む造影剤を、ボリューム又はその一部に投与することと、ボリューム又はその一部を放射線に曝露することと、放射線によりボリューム又はその一部において生成された超音波を検出することと、投与された造影剤を含有するボリューム又はその一部の光音響画像を、超音波から生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は、ミセル、リポソーム、ナノ粒子若しくはそれらの組合せの成分であり、かつ／又はミセル、リポソーム、ナノ粒子若しくはそれらの組合せに封入される。いくつかの実施形態では、６５０～１０７０ｎｍの波長の放射線が使用される。いくつかの実施形態では、６５０～９００ｎｍ、７００～９５０ｎｍ、及び／又は７５０～９５０ｎｍの波長の放射線が使用される。いくつかの実施形態では、生理的に許容可能な造影剤は、複数の異なるメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、それらの誘導体、及び／又はそれらの組合せを含み、各メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は、６５０～１０７０ｎｍの範囲で異なる吸収スペクトルを有する。いくつかの実施形態では、造影剤は標的化剤を含む。いくつかの実施形態では、標的化剤は、腫瘍細胞若しくはがん細胞又はそれに関連する血管内皮細胞上に存在するリガンド及び／又は標的に結合する部分を含む。いくつかの実施形態では、リガンド及び／又は標的は腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、前記部分は、腫瘍関連抗原に結合するペプチド又はペプチド模倣物を含む。

本開示の主題はまた、いくつかの実施形態において、ボリューム又はその一部の光音響イメージングを多重化する方法を提供する。いくつかの実施形態では、当該方法は、複数の放射線吸収成分であって、複数の放射線吸収成分の各要素が、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体を含み、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は、銅及び／又はマンガンと錯体形成している、複数の放射線吸収成分、を含む造影剤を、ボリューム又はその一部に投与することと、複数の放射線吸収成分によって特異的に吸収される波長に調整されている放射線に、ボリューム又はその一部を曝露することと、複数の放射線吸収成分によって放射線が特異的に吸収されるの際に、ボリューム又はその一部において放射線によって生成された超音波を特異的に検出することと、投与された造影剤を含有するボリューム又はその一部の光音響画像であって、特異的に検出する超音波から生成される光音響画像、を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、複数のメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体のうちの１つ又は複数は、ミセル、リポソーム、ナノ粒子若しくはそれらの組合せの成分であり、かつ／又はミセル、リポソーム、ナノ粒子、若しくはそれらの組合せに封入される。いくつかの実施形態では、６５０～１０７０ｎｍの波長の放射線が使用される。いくつかの実施形態では、６５０～９００ｎｍ、７００～９５０ｎｍ、及び／又は７５０～９５０ｎｍの波長の放射線が使用される。いくつかの実施形態では、複数の放射線吸収成分の各要素は、６５０～１０７０ｎｍの範囲で異なる吸収スペクトルを有する。いくつかの実施形態では、複数の放射線吸収成分のうちの１つ又は複数の要素は、標的化剤を含む。いくつかの実施形態では、標的化剤は、腫瘍細胞若しくはがん細胞又はそれに関連する血管内皮細胞上に存在するリガンド及び／又は標的に結合する部分を含む。いくつかの実施形態では、リガンド及び／又は標的は腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、前記部分は、腫瘍関連抗原に結合するペプチド又はペプチド模倣物を含む。いくつかの実施形態では、複数の放射線吸収成分の要素のうちの２つ以上は、標的化剤を含む。いくつかの実施形態では、複数の放射線吸収成分のうちの２つ以上の要素は、異なる標的化剤を含む。いくつかの実施形態では、異なる標的化剤は、同じか又は異なる標的及び／又は標的部位に結合し、かつ／又は、結合しなければ集積する。

本開示の主題の方法のいくつかの実施形態では、ボリュームは、対象又はその身体部分、任意選択でそれらの細胞、組織、及び／又は器官である。いくつかの実施形態では、ボリュームは、腫瘍細胞、がん細胞、又は、腫瘍若しくはがんの関連血管細胞を含む。いくつかの実施形態では、造影剤は、生理的に許容可能な造影剤、又は生理的に許容可能な複数の造影剤である。いくつかの実施形態では、造影剤は、ヒトでの使用に生理学的に許容される。いくつかの実施形態では、造影剤は、光音響イメージング造影剤と、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は添加物とを含む薬学的組成物で提供される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ヒトでの使用に薬学的に許容される。いくつかの実施形態では、ボリュームは、標的化剤によって標的とされ得る１つ又は複数の標的及び／又は標的部位を含む。

いくつかの実施形態では、本開示の主題は、同じく光音響イメージング造影剤を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の主題の光音響イメージング造影剤は、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組合せを含む少なくとも１つの放射線吸収成分を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの放射線吸収成分は、

からなる群から選択される化合物を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの放射線吸収成分は、錯体形成金属を含むＢ１～Ｂ３及びＢ１０７の誘導体を含み、錯体形成金属は、亜鉛、銅、マンガン、ニッケル、コバルト、及び鉄からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、錯体形成金属は銅及び／又はマンガンである。いくつかの実施形態では、誘導体は、

からなる群から選択される化合物を含み、
式中、Ｍは金属であり、任意選択で、亜鉛、銅、マンガン、ニッケル、コバルト、及び鉄からなる群から選択される金属である。いくつかの実施形態では、錯体形成金属は銅及び／又はマンガンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの放射線吸収成分は、ＭＢＣ－１、ＭＢＣ－２、ＭＢＣ－３、及びＭＢＣ－２－ＰＥＧからなる群から選択される化合物を含み、ＭＢＣ－１、ＭＢＣ－２、ＭＢＣ－３、及びＭＢＣ－２－ＰＥＧは、以下の構造、

を有し、さらに式中、Ｍは、亜鉛（Ｚｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、マンガン（Ｍｎ）、及び銅（Ｃｕ）からなる群から選択される金属である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの放射線吸収成分は、ＣｕＢＣ－７２５、ＣｕＢＣ－７７５、ＣｕＢＣ－８４０、又はＣｕＢＣ－２－ＰＥＧを含み、ＣｕＢＣ－７２５、ＣｕＢＣ－７７５、ＣｕＢＣ－８４０、及びＣｕＢＣ－２－ＰＥＧは、以下の構造：

を有する。

いくつかの実施形態では、光音響イメージング造影剤は、対象、任意選択的にヒトでの使用に生理学的に許容される。

いくつかの実施形態では、本開示の主題は、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物は、本明細書に記載の１つ又は複数の光音響イメージング造影剤と、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は添加物とを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ヒトでの使用に薬学的に許容される。

いくつかの実施形態では、本開示の主題の光音響イメージング造影剤は、水溶性である。

いくつかの実施形態では、本開示の主題の光音響イメージング造影剤は、ＰＥＧ化されている。

いくつかの実施形態では、本開示の主題はまた、ＰＥＧ化Ｃｕ－バクテリオクロリンを作製する方法に関する。いくつかの実施形態では、当該方法は、ＰＥＧ化Ｃｕ－バクテリオクロリンを作製するのに十分な条件下、ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍｍａｍｉｄｅ：ＤＭＦ）中、酢酸銅及び水素化ナトリウムで、遊離塩基ＰＥＧ化バクテリオクロリンを処理することを含む。いくつかの実施形態では、遊離塩基ＰＥＧ化バクテリオクロリンは、ＭＢＣ－１、ＭＢＣ－２、及びＭＢＣ－３からなる群から選択されるバクテリオクロリンのＰＥＧ化誘導体である。いくつかの実施形態では、遊離塩基ＰＥＧ化バクテリオクロリンはＭＢＣ－２－ＰＥＧである。

本開示を読めば当業者には明らかとなるこれら及び他の態様及び実施形態は、特に光音響イメージング及び／又はマルチスペクトル光音響トモグラフィ（Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒａｌ Ｏｐｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＭＳＯＴ）に関連した、生体分子及び／又は細胞を検出及び／又は標識するのに有用な組成物及び方法を当業者に提供する。

ＩＣＧの水溶液（Ｌａｎｄｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７６から適合化）と対比した３つのバクテリオクロリンのトルエン溶液のパネルについての吸収スペクトルのプロットである。この例では、Ｂ２（２，１２－ジフェニル）についてのスペクトルは、同様の（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２からの）２，１２－ジメシチルバクテリオクロリンのスペクトルで表されている。 バクテリオクロロフィルａの構造である。 波長可変で調整可能な安定的バクテリオクロリンの一般的デザインの構造である。 ニッケル－バクテリオクロリンＢ１０７の構造である。 寒天ファントムにおいて、深度３ｍｍでイメージングしたＩＣＧのシグナル（破線）及びＮｉ－メタロバクテリオクロリンＢ１０７のシグナル（実線）を比較したプロットである。 寒天ファントムにおいて、深度６ｍｍでイメージングしたＩＣＧのシグナル（破線）及びＮｉ－メタロバクテリオクロリンＢ１０７のシグナル（実線）を比較したプロットである。それぞれの色素極大（７９５ｎｍ及び７６５ｎｍ）において、等しい光学濃度（７．５ＯＤ）で試料を導入した。 ８００ｎｍのレーザーで、Ｂ１０７（黒色）とＩＣＧ（灰色）の経時的なＰＡＩシグナル強度を比較したプロットである。 スペクトル的に異なる吸収帯を有する３つのバクテリオクロリン（バクテリオクロリンＢ１～Ｂ３）の構造を示す。バクテリオクロリンＢ１～Ｂ３の代表的な吸収スペクトルは、図１に示している。 バクテリオクロリン（Ｂ１：Ｒ^１＝Ｒ^２＝Ｈ；Ｂ２：Ｒ^１＝フェニル、Ｒ^２＝ＣＯ_２Ｍｅ；Ｂ３：Ｒ^１＝Ｂｒ、次に、後段の薗頭カップリングを介してフェニルエチニル基に変換、Ｒ^２＝ＣＯ_２Ｍｅ）の例示的で非限定的な合成スキームを示す。 生体共役性テザー（Ｍ＝Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ）を有する水溶性のメタロバクテリオクロリン（左）及びメタロクロリン（右）の例を示す。カルボキシレートは、生体分子上のアミンにバイオ共役するための反応性エステル（例として、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル、Ｎ－ヒドロキシ－スルホ－スクシンイミジル、ペンタフルオロフェニルなどが挙げられる）、又は生体分子上のチオールにカップリングするためのヨードアセトアミド若しくはマレイミドなどの他の基に変換することができる。 例示的な３つのメタロバクテリオクロリン（メタロバクテリオクロリンＭＢ１～ＭＢ３）の構造を示す。式中、Ｍは金属であり、任意選択で、亜鉛（Ｚｎ）、銅（Ｃｕ）、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、マンガン（Ｍｎ）及び鉄（Ｆｅ）からなる群から選択される金属である。いくつかの実施形態では、錯体形成金属は銅（Ｃｕ）である。 例示的な３つの追加のメタロバクテリオクロリン（メタロバクテリオクロリンＭＢＣ－１、ＭＢＣ－２、及びＭＢＣ－３）の構造を示す。式中、Ｍは金属であり、任意選択で、亜鉛（Ｚｎ）、銅（Ｃｕ）、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、マンガン（Ｍｎ）、及び鉄（Ｆｅ）からなる群から選択される金属である。いくつかの実施形態では、錯体形成金属は銅（Ｃｕ）である。 例示的な銅錯体のメタロバクテリオクロリンＣｕＢＣ－７２５、ＣｕＢＣ－７７５、及びＣｕＢＣ－８４０の構造を示し、それぞれメタロバクテリオクロリンＭＢＣ－１、ＭＢＣ－２、及びＭＢＣ－３の銅錯体バージョンに対応する。 例示的なマルチスペクトル光音響トモグラフィ（ＭＳＯＴ）実験におけるＣｕＢＣ－７２５、ＣｕＢＣ－７７５、及びＣｕＢＣ－８４０（それぞれ２０μＭ）についてのピーク吸収を示すグラフであり、ピーク吸収は、それぞれ７２５ｎｍ、７７５ｎｍ、及び８４０ｎｍで生じる。ＩＣＧも２０μＭで試験したが、ＣｕＢＣ－７２５、ＣｕＢＣ－７７５、及びＣｕＢＣ－８４０のそれぞれは、吸収に関してＩＣＧよりも優れており、ピークがより狭いことを特徴とした。ファントム及び水も試験したが、いずれの場合も吸収度が非常に小さく、これらの極微量は、ｘ軸と区別できない。ａ．ｕ．は吸光度単位。 本開示の主題の例示的な銅含有の水溶性バクテリオクロリンを合成するためのスキームを示す。

次に、本開示の主題を以下でより全体的に説明する。ここでは本開示の主題のすべてについてではなく、いくつかの実施形態について説明する。実際、本開示の主題は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満たすように提供されるものである。

Ｉ．定義
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本開示の主題を限定することを意図するものではない。

以下の用語は当業者には十分に理解されるものと考えられるが、本開示の主題について説明しやすくするために、以下の定義を述べる。

本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、下記で特に定義しない限り、当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を有することを意図している。本明細書で用いられる手法についての言及は、当技術分野で一般的に理解されている手法を指すことを意図しており、その手法には、当業者には明らかであろうその手法の変形又は同等手法の置換が含まれる。以下の用語は当業者には十分に理解されるものと考えられるが、本開示の主題について説明しやすくするために、以下の定義を述べる。

本開示の主題を説明する中で、複数の手法及び工程が開示されることが理解されよう。手法及び工程のそれぞれには個々に有利性があり、それぞれはまた、他の開示された手法の１つ若しくは複数、又は場合によってはすべてと共に使用することができる。

したがって、理解しやすいように、ここでの説明は、個々の工程のすべての可能な組合せを不必要に繰り返すことを控える。しかしながら、本明細書及び特許請求の範囲は、そのような組合せが完全に本開示の主題及び特許請求の範囲内にあることを理解して、読まれるべきである。

長年の特許法の慣例に従って、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という用語は、本出願で使用される場合、特許請求の範囲を含み、「１つ又は複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を指す。したがって、例えば、「ＰＡＩ造影剤」に言及した場合は、複数のＰＡＩ造影剤を含み、その他も同様である。

本明細書で使用される場合、値又は質量、重量、時間、体積、濃度、若しくはパーセンテージの量を指す場合の「約」という用語は、特定の量から、いくつかの実施形態では±２０％、いくつかの実施形態では±１０％、いくつかの実施形態では±５％、いくつかの実施形態では±１％、及びいくつかの実施形態では±０．１％の変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示された方法を実施するのに適当なものである。

本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、実在物を列挙する文脈で使用される場合、実在物が単独で又は組合せで存在することを指す。したがって、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」という句は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを個々に含み、なおかつＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤの、任意のかつすべての組合せ及び部分組合せも含む。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」と同義であり、包括的又は無制限であり、列挙されていない追加の要素又は方法工程を排除しない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、特許請求の言い回しで使用される専門用語であり、指定された要素が存在するが、他の要素を追加してもなお特許請求の範囲内の構築物又は方法を形成することができることを意味する。

本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句は、特許請求の範囲で特定されていないいかなる要素、工程、又は成分も除外する。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という句が、プリアンブルの直後ではなく、請求項の本文の条項に現れる場合、その条項で述べられる要素のみを限定し、他の要素は特許請求の範囲全体からは除外されない。

本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という句は、特定の材料又は工程、並びに列挙された主題の基本的かつ新規な（１つ又は複数の）特徴に実質的に影響を及ぼさないものに、特許請求の範囲を限定する。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語に関して、これら３つの用語のうちの１つが本明細書で使用される場合、本開示の主題は、他の２つの用語のいずれかの使用を含むことができる。例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」によって包含される範囲は、いくつかの実施形態では「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」によって包含される範囲よりも広くなり得、いくつかの実施形態では「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」よりも広い範囲を有し得ることが理解されよう。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の使用は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も包含し、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の使用も「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を包含することがさらに理解されよう。

本明細書で使用される場合、「バクテリオクロリン」という用語は、コアにおいて、４つの＝ＣＨ－結合を介してカップリングした２つのピロール及び２つのピロリンからなる大複素環式芳香族環を指す。本明細書で使用される場合、「バクテリオクロリン」という用語は、バクテリオクロリン及びイソバクテリオクロリンの両方を包含し、金属化誘導体を含むがこれに限定されない誘導体も包含する。いくつかの実施形態では、金属化誘導体は、亜鉛、ニッケル、鉄、コバルト、及び銅からなる群から選択される金属と錯体形成したバクテリオクロリンである。いくつかの実施形態では、金属は銅である。

本明細書で使用される場合、「光音響イメージング造影剤」という用語は、標的（任意選択で対象内に存在する標的）と接触したときに、光音響イメージングによって標的がイメージングされることを可能にする組成物を指す。いくつかの実施形態では、光音響イメージング造影剤は、少なくとも１つの放射線吸収分子を含み、いくつかの実施形態では、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、クロリン、メタロクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、又はそれらの誘導体は、亜鉛、ニッケル、鉄、コバルト、及び銅からなる群から選択される金属と錯体形成している。いくつかの実施形態では、金属は銅である。放射線吸収分子自体が光音響イメージング造影剤であり得ることに留意されたい。したがって、異なる放射線吸収分子の組合せが存在する実施形態では、組成物全体を光音響イメージング造影剤と見なすことができ、いくつかの実施形態では、個々の放射線吸収分子それぞれを光音響イメージング造影剤と見なすことができる。

本明細書で使用される場合、吸収スペクトルに関する「実質的に重ならない」という句は、比較される吸収スペクトルの重なりの割合が、いくつかの実施形態では５０％未満、いくつかの実施形態では４０％未満、いくつかの実施形態では３０％未満、いくつかの実施形態では２５％未満、いくつかの実施形態では２０％未満、いくつかの実施形態では１５％未満、いくつかの実施形態では１０％未満、及び、いくつかの実施形態では５％未満であることを意味する。いくつかの実施形態では、吸収スペクトルに関する「実質的に重ならない」という句は、各吸収スペクトルが、少なくとも１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、又は９５ｎｍの差で異なるピークを有することを意味し、吸収スペクトルのすべては、６５０～１０７０ｎｍの範囲内にある。実質的に重なっていない吸収スペクトルの例は、図１のＢ１、Ｂ２、及びＢ３の吸収スペクトルである。

本明細書で使用される場合、「生理的に許容可能」及び「薬学的に許容される」という句は、本開示の主題の組成物及び方法を適用する対象での使用が安全であると認められる組成物、いくつかの実施形態では薬学的組成物を指す。

本明細書で使用される場合、「ボリューム」という用語は、光音響画像が所望され得るいかなるものも指す。限定ではなく例として、ボリュームは、対象内に存在するか又は対象から単離された細胞、組織、又は器官であり得る。いくつかの実施形態では、ボリュームは、対象内の生理的に関連する空間又は腔であり得る。

ＩＩ．本開示の主題の組成物
バクテリオクロロフィルａ（図２Ａを参照されたい）などの天然に存在する分子に由来する試薬とは異なり、クロリン、バクテリオクロリン、及びそれらの誘導体の完全な合成設計により、波長可変のクロリン及びバクテリオクロリンが得られる（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。クロリン、バクテリオクロリン、及びそれらの誘導体が、合成的に設計可能であることの利点は、この設計が、ＰＡＩにとって明らかに有利な非常に狭い吸収帯を有するＮＩＲ試薬パレットの開発を、容易にすることである。色素の吸収幅を表す半値全幅（ｆｕｌｌ－ｗｉｄｔｈ－ｈａｌｆ－ｍａｘ：ｆｗｈｍ）の表示に基づくと、クロリン及び／又はバクテリオクロリンのＮＩＲ吸収帯ｆｗｈｍは、通常、２５ｎｍ以下である。合成のクロリン及びバクテリオクロリンの吸収最大値及び他のスペクトル特性は容易に「調整」することができるため、好適なクロリン、バクテリオクロリン、及びそれらの誘導体のポートフォリオは、色素間の重なりが最小限で、より小さいスペクトル範囲内に納まるように設計することができる。図１に、例示的な３つのバクテリオクロリン（Ｂ１～Ｂ３）の吸収スペクトルとＩＣＧの吸収スペクトルとの違いを示す。図１０に、例示的な３つのメタロバクテリオクロリン（ＣｕＢＣ－７２５、ＣｕＢＣ－７７５、ＣｕＢＣ－８４０）の吸収スペクトルとＩＣＧの吸収スペクトルとの違いを示す。ＩＣＧ検出に通常割り当てられるスペクトル空間内では、最大３つのバクテリオクロリンを検出することが可能であり、それは、それらのバクテリオクロリンのスペクトルの重なりが最小限で吸収プロファイルが狭いためである。この利点により、同じ実験で複数の疾患特異的なバイオマーカーのより複雑な分析が可能になり、最終的にはＰＡＩに基づく多重臨床アッセイの開発が加速される。

バクテリオクロリンとしては例えばバクテリオクロロフィルａ（図２Ａを参照されたい）があるが、これは、多数の（疎水性）置換基及びキラル中心が存在するために、広範な合成修飾を容易に受けない天然産物である。その還元型ピロール環はまた、合成操作中に脱水素化を受ける。しかし最近の一連の合成の進歩により、安定で調整可能なバクテリオクロリンが得られるようになった。還元型ピロリン環にジェミナルジメチル基が存在すると、脱水素化又は酸化のプロセスがブロックされ、高弾力的なバクテリオクロリンが得られる（図２Ｂ）。ベータピロール位（図２ＢのＲ２、Ｒ３、Ｒ１２、Ｒ１３）及びメソ位（図２ＢのＲ５、Ｒ１５）に様々な基を導入することにより、吸収極大を容易に操作して、７００ｎｍ～９００ｎｍ超のどこでも所望の吸収を得ることができる。

ＰＡＩについてのクロリン及びバクテリオクロリンの第２の説得力のある利点が本明細書に記載の結果によって示されているが、この結果は、クロリン及びバクテリオクロリンを金属と錯体形成することによって、ＰＡＩシグナルが実質的に増大することを示すものであり、前記金属としては、銅、亜鉛、ニッケル、パラジウム、銅、コバルト、マンガンなどが挙げられるが、これらに限定されない。遊離塩基バクテリオクロリン及びいくつかのメタロバクテリオクロリン（Ｚｎ、Ｐｄ）は、通常、量子収率（Φ（ｆ））が最大で０．２５、場合によっては実質的な三重項状態（最大で０．８０Φ（ｉｓｃ））の蛍光を呈する。ニッケル－バクテリオクロリン錯体は、その一重項状態の極めて急速な非放射減衰を有し（Ｂ１０７の超高速動態は、その基底状態への減衰が約１０ｐｓであることを示唆している）、その三重項状態への変換が本質的に起こらないと考えられている。いかなる特定の作用機序にも束縛されることを望むものではないが、励起状態が非常に短命であるため、これがＰＡＩシグナルをさらに増強すると仮定される。これらの特性は以前から認識されており、クロロフィル及びバクテリオクロロフィルのニッケル誘導体を特性評価した研究（Ｐｉｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）で報告されているが、そのような設計の分子を用いてＰＡＩ試薬を生成及び特性評価した試みは報告されていない。これは、前述したように、バクテリオクロロフィルａ及び他の天然産物の合成操作の難しさが原因であることは明らかである。図３に、寒天ファントム及び６８０～９７０ｎｍの波長可変レーザー走査を用いる市販のＰＡＩシステムを使用して、ニッケル－バクテリオクロリン（Ｂ１０７）についてのＰＡＩデータを、ＩＣＧと比較して示す。この化合物は、寒天の２つの深度において、同等の光学濃度のＩＣＧよりも５倍強いシグナルを呈することがわかった。このようにシグナル強度がかなり増強されたことにより、標的化プローブを用いたＰＡＩが、ＩＣＧを用いた現在利用可能なＰＡＩよりも、実質的により深い組織深度で行える可能性のあることが示唆された。データを表１にまとめる。
表１
寒天ファントムに埋め込んだＮｉ－バクテリオクロリン及びＩＣＧについての異なる表面深度における表示波長でのＰＡＩシグナル強度

ニッケル－バクテリオクロリン錯体の第３の利点、さらに有利性は、向上したその光安定性である。図４に、連続的な８００ｎｍレーザー照射を用いて測定した寒天ファントム中のＩＣＧ及びニッケル－バクテリオクロリンＢ１０７についてのシグナルを示す。安定性が向上したのは、励起三重項状態への変換が抑えられ、かつその後、一重項酸素の生成時の劣化が抑えられたことに起因している可能性がある。

まとめると、ＰＡＩ造影剤としてバクテリオクロリン及びバクテリオクロリン誘導体を用いることのいくつかの有利性としては、以下が挙げられる。
・波長が可変で、かつ放射が狭いことにより、多重化が可能となる。合成設計が、可溶化基及び生体共役性テザーを付加するのに適している。
・シグナルが大きく増強されたメタロバクテリオクロリン（Ｍ＝Ｚｎ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、及び／又はＣｕ）により、従来のマーカーよりも深い深度でバイオマーカーのＰＡＩ検出が可能になる。
・プローブ安定性の向上により、光音響顕微鏡法、画像誘導手術、及び画像取得に長時間を要するその他の処置に有用となる。

ニッケルクロリン及びバクテリオクロリンに加えて、いくつかの実施形態において、本開示の主題は、対応する銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、亜鉛（Ｚｎ）、マンガン（Ｍｎ）、及び／又はコバルト（Ｃｏ）のメタロクロリン及び／又はメタロバクテリオクロリンを提供し、これらはＰＡＩのシグナルを増強する。いくつかの実施形態では、メタロクロリン及び／又はメタロバクテリオクロリンにおける錯体形成金属は、銅である。いくつかの実施形態では、メタロクロリン及び／又はメタロバクテリオクロリンにおける錯体形成金属は、マンガンである。

メタロクロリン及び／又はメタロバクテリオクロリンは、いくつかの実施形態では、臓器、静脈、リンパ節、及びリンパ系などであるがこれらに限定されない生理的特徴部の一般的なイメージングのための造影剤として使用することができ、いくつかの実施形態では、標的化剤を付着させることによって標的化プローブとして使用することができる。本明細書で使用される場合、「標的化剤」という用語は、本開示の主題の組成物に付着すると、標的部位における組成物の集積性を向上させるいかなる分子をも指し、標的部位とは、細胞、組織、又は器官などであるが、これらに限定されない。例えば、反応性リンカー又はテザーを介したメタロクロリン及び／又はメタロバクテリオクロリンの抗体への付着は、遊離塩基のクロリン及び／又はバクテリオクロリンについて以前から確立されている方法によって成し得る。いくつかの実施形態では、カルボキシレート又はＰＥＧ鎖などの可溶化基は、本開示の主題（すなわち、標的化剤が錯体形成しているメタロクロリン、バクテリオクロリン又はそれらの誘導体）の標的化組成物の生体標識効率及び生体共役安定性を高めることができる。例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６も参照されたい。

いくつかの実施形態では、メタロクロリン及び／又はメタロバクテリオクロリンをナノ粒子、マイクロビーズ、ミセル、又は他の担体構造に組み込んでＰＡＩシグナルをさらに増強し、かつ／又は生体内分布を促進することが好ましい可能性がある。クロリン、バクテリオクロリン、及びそれらの誘導体、例えばメタロクロリン、メタロバクテリオクロリン、及びそれらの誘導体が挙げられるもののこれらに限定されないヒドロポルフィリンを、マイクロビーズに組み込む例示的な方法が、例えばＰＣＴ国際公開第２０１７／２１４６３７号に開示されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。他のナノ粒子としては、リポソームやドープされたシリカナノ粒子が含まれる。

クロリン及び／又はバクテリオクロリン並びにそれらの誘導体に加えて、いくつかの実施形態では、限定されないが、ＮＩＲ吸収がより長い波長のイソバクテリオクロリン及びいくつかのクロリンなど、他のヒドロポルフィリンがＰＡＩパネルに使用される。

クロリン、メタロクロリン、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、及びそれらの誘導体は、いくつかの実施形態において、イメージング療法又は画像誘導療法（例えば、画像誘導手術又は画像誘導薬物送達）のためのマルチカラーＰＡＩパネル及びマルチモーダル・マルチカラーパネルに使用することができる。マルチモードの例としては、蛍光／ＰＡＩ及びＭＲＩ／ＰＡＩが挙げられる。

生体共役のためのテザーを有する水溶性のメタロバクテリオクロリン及びメタロクロリンの非限定的な例を図７に示す。

ＰＥＧ化水溶性メタロバクテリオクロリンの非限定的な例を図１１に示す。

この本開示の主題は、いくつかの実施形態において、光音響イメージング（ＰＡＩ）造影剤を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＡＩ造影剤は、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、それらの誘導体、又はそれらの任意の組合せを含む少なくとも１つの放射線吸収成分を含み、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、又はそれらの誘導体は、銅及び／又はマンガンと錯体形成している。いくつかの実施形態では、ＰＡＩ造影剤は、複数の異なる銅錯体及び／若しくはマンガン錯体のバクテリオクロリン、銅錯体及び／若しくはマンガン錯体のクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組合せを含み、各銅錯体及び／若しくはマンガン錯体のバクテリオクロリン、銅錯体及び／若しくはマンガン錯体のクロリン、又はそれらの誘導体は、６５０～１０７０ｎｍの範囲で異なる吸収スペクトルを有する。いくつかの実施形態では、光音響イメージング造影剤は、少なくとも３つの異なるメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体を含み、各メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は、７００～９５０ｎｍの範囲にピーク吸収値がある吸収スペクトルを有する。少なくとも３つの吸収スペクトルは、７００～９５０ｎｍの範囲で実質的に重なり合わない。いくつかの実施形態では、メタロバクテリオクロリン及び／又はメタロクロリンは、亜鉛、銅、ニッケル、鉄、コバルト、マンガン、及び銅からなる群から選択される金属を含む。いくつかの実施形態では、メタロバクテリオクロリン及び／又はメタロクロリンは、銅及び／又はマンガンを含む。いくつかの実施形態では、光音響イメージング造影剤は、少なくとも１つの銅錯体のバクテリオクロリン、銅錯体のクロリン、及び／又はそれらの誘導体、並びに、亜鉛、ニッケル、鉄、マンガン、及びコバルトからなる群から選択される金属と錯体形成した少なくとも１つの追加のメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体を含む。

いくつかの実施形態では、本開示の主題は、同じく光音響イメージング造影剤を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の主題の光音響イメージング造影剤は、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、それらの誘導体、又はそれらの組合せを含む少なくとも１つの放射線吸収成分を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの放射線吸収成分は、

からなる群から選択される化合物を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの放射線吸収成分は、錯体形成金属を含むＢ１～Ｂ３及びＢ１０７の誘導体を含み、錯体形成金属は、亜鉛、銅、マンガン、ニッケル、コバルト、及び鉄からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、錯体形成金属は銅及び／又はマンガンである。いくつかの実施形態では、誘導体は、

からなる群から選択される化合物を含み、
式中、Ｍは金属であり、任意選択で、亜鉛、銅、マンガン、ニッケル、コバルト、及び鉄からなる群から選択される金属である。いくつかの実施形態では、錯体形成金属は銅及び／又はマンガンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの放射線吸収成分は、ＭＢＣ－１、ＭＢＣ－２、ＭＢＣ－３、及びＭＢＣ－２－ＰＥＧからなる群から選択される化合物を含み、ＭＢＣ－１、ＭＢＣ－２、ＭＢＣ－３、及びＭＢＣ－２－ＰＥＧは、以下の構造：

を有し、さらに式中、Ｍは、亜鉛（Ｚｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、マンガン（Ｍｎ）、及び銅（Ｃｕ）からなる群から選択される金属である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの放射線吸収成分は、ＣｕＢＣ－７２５、ＣｕＢＣ－７７５、ＣｕＢＣ－８４０、又はＣｕＢＣ－２－ＰＥＧを含み、ＣｕＢＣ－７２５、ＣｕＢＣ－７７５、ＣｕＢＣ－８４０、及びＣｕＢＣ－２－ＰＥＧは、以下の構造、

を有する。

いくつかの実施形態では、光音響イメージング造影剤は、対象、任意選択的にヒトでの使用に生理学的に許容される。

いくつかの実施形態では、本開示の主題は、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物は、本明細書に記載の１つ又は複数の光音響イメージング造影剤と、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は添加物とを含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ヒトでの使用に薬学的に許容される。

本開示を読めば当業者には明らかとなるこれら及び他の態様及び実施形態は、特に光音響イメージング及び／又はマルチスペクトル光音響トモグラフィ（Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒａｌ Ｏｐｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＭＳＯＴ）に関連した、生体分子及び／又は細胞を検出及び／又は標識するのに有用な組成物及び方法を当業者に提供する。

ＩＩＩ．クロリン、メタロクロリン、バクテリオクロリン、メタロバクテリオクロリン、及びそれらの誘導体の合成
本開示の主題の放射線吸収分子を合成するための出発物質として利用することができるクロリン及びバクテリオクロリンは、当業者に公知の任意の方法によって生成することができる。クロリン及びバクテリオクロリン並びに関連分子を合成するための例示的な方法は、例えば、米国特許第６，５５９，３７４号、同７，４７０，７８５号、同７，５３４，８０７号、同８，１２９，５２０号、同８，１７３，６９１号、同８，１７３，６９２号、同８，２０７，３２９号、同８，３０４，５６１号、同８，６６４，２６０号、同９，３６５，７２２号、及び同９，８２２，１２３号明細書、並びに国際公開第２０１７／２１４６３７号に開示されており、それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。バクテリオクロリン及び関連分子を合成するための特定の例示的な方法は、以下の通りである。

いくつかの実施形態では、本開示の主題のバクテリオクロリンを合成する方法は、有機溶媒中、酸の存在下で、式ＩＩＡ：

の化合物を、一対、縮合させることを含む。
上記式中、各Ｒ’は独立してＣ１～Ｃ４アルキルを表すか、又は両方のＲ’は一緒になってＣ２～Ｃ４アルキレンを表して、Ｒ^５がＨ又はアルコキシである式Ｉの化合物を生成し、
Ｒ^５がＨである場合、任意選択で臭素化し、次いで任意選択で、当該化合物をＲ^５位でさらに置換して、式ＩＡを生成する。式ＩＡは、

であり、式中、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、及びＲ^８は、それぞれ、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルケニル、シクロアルキルアルキニル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキニル、アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、アルコキシ、ハロ、メルカプト、アジド、シアノ、ホルミル、カルボン酸、ヒドロキシル、ニトロ、アシル、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアルキルアミノ、二置換アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、エステル、アミド、スルホキシル、スルホニル、スルホネート、スルホン酸、スルホンアミド、尿素、アルコキシルアシルアミノ、アミノアシルオキシ、親水性基、結合基、表面付着基、及び標的化基からなる群から独立して選択され、
又は、Ｒ^１及びＲ^２は、一緒になって＝Ｏ又はスピロアルキルであり、
又は、Ｒ^３及びＲ^４は、一緒になって＝Ｏ又はスピロアルキルであり、
又は、式中、Ｒ^６及びＲ^７、又はＲ^７及びＲ^８は、一緒になって、縮合芳香族系又は芳香族複素環系を表す。いくつかの実施形態では、次いで、式Ｉの化合物を所望に応じて金属化することができ、例えば銅で金属化するが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｒ^３及びＲ^４のそれぞれはメチルである。

あるいは、本開示の主題のバクテリオクロリンを合成する方法は、
式ＩＩＢの化合物であって、

で表される構造を有し、
式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、及びＲ^７は下記の通りである
式ＩＩＢの化合物と、
式ＩＩＩの化合物であって、

で表される構造を有し、
式中、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、及びＲ^１４は下記の通りであり、
Ｒ^２１及びＲ^２２は、それぞれ独立して、水素、アルキル及びアリールからなる群から選択されるか、又は合わさったＲ^２１及びＲ^２２は、Ｃ２～Ｃ４アルキレンを表す
式ＩＩＩの化合物とを、
第１の溶媒を含む組成物中で縮合して中間体を生成することと、
酸の存在下、第２の溶媒中で前記中間体を縮合して、式ＩＶの化合物又はその金属コンジュゲートを生成することとであって、式ＩＶは、

又はその金属コンジュゲート（例えば、その銅キレート）として定義され、
式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、及びＲ^１６は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルケニル、シクロアルキルアルキニル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキニル、アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、アルコキシ、ハロ、メルカプト、アジド、シアノ、ホルミル、カルボン酸、ヒドロキシル、ニトロ、アシル、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、二置換アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、エステル、アミド、スルホキシル、スルホニル、スルホネート、スルホン酸、スルホンアミド、尿素、アルコキシルアシルアミノ、アミノアシルオキシ、親水性基、結合基、表面付着基、及び標的化基からなる群から選択され、
又は、Ｒ^１及びＲ^２は、一緒になって＝Ｏ又はスピロアルキルであり、
又は、Ｒ^３及びＲ^４は、一緒になって＝Ｏ又はスピロアルキルであり、
又は、Ｒ^３及びＲ^４はそれぞれメチルであり、
又は、Ｒ^９及びＲ^１０は、一緒になって＝Ｏ又はスピロアルキルであり、
又は、Ｒ^１１及びＲ^１２は、一緒になって＝Ｏ又はスピロアルキルであり、
又は、Ｒ^１５及びＲ^１６は、一緒になって＝Ｏであり、
又は、Ｒ^５及びＲ^６は、一緒になって縮合芳香族系又は芳香族複素環系を表し、
又は、Ｒ^６及びＲ^７は、一緒になって縮合芳香族系又は芳香族環複素環系を表し、
又は、Ｒ^１３及びＲ^１４は、一緒になって縮合芳香族又は芳香族複素環系を表し、かつ、
Ｚは、電子求引基（例えば、－ＣＯ_２Ｒ^１７、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１７、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１７Ｒ^１８、－Ｃ（Ｏ）Ｒ^１７、－ＣＮ、－Ｃ＝Ｎ－ＮＲ^１７Ｒ^１８、－ＰＯ（ＯＲ^１７）_２、－ＳＯ_２ＯＲ^１７、－ＳＯ_２ＮＲ^１７Ｒ^１８、－ＳＯ_２Ｒ^１７、及び－ＳｉＲ^１７Ｒ^１８Ｒ^１９であり、ここで、Ｒ^１７、Ｒ^１８、及びＲ^１９は、出現するごとに、水素、アルキル、及びアリールからなる群から独立して選択される）である、
式ＩＶの化合物又はその金属コンジュゲートを生成することと、
を含むことができる。

バクテリオクロリン合成の例示的な経路としては、さらに、Ｌｉｕ＆Ｌｉｎｄｓｅｙ，２０１６に記載されているノーザンサザン経路（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｏｕｔｅ）、及びＺｈａｎｇ＆Ｌｉｎｄｓｅｙ，２０１７に記載されている環状単素環を有するバクテリオクロリン大環状環を合成する方法が挙げられ、それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

バクテリオクロリンパネル（例えば、バクテリオクロリンＢ１～Ｂ３）で用いることができる３つの例示的なバクテリオクロリンを図５に示す。これらは、（図８に示す）対応する各メタロバクテリオクロリンに変換することができ、これらのメタロバクテリオクロリンは、ＰＡＩにおいて、ピークシグナルが、お互いに重なりが小さく同様の広がりであり、ピークスペクトル波長が、遊離塩基バクテリオクロリンから２０～３０ｎｍシフトすると予想される。図６は、バクテリオクロリンＢ１～Ｂ３の合成方法の概要である。バクテリオクロリンＢ１及びＢ２は、対応するピロール－２－カルボキシアルデヒドから出発して、既知の方法（Ｋｒａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０を参照されたい）によって５工程で合成することができる。バクテリオクロリンＢ３には、７９０ｎｍ付近での所望の吸収を達成するために、フェニルエチニル基を導入するための薗頭カップリングを受けるブロモ置換バクテリオクロリン（Ｒ^１＝Ｂｒ）が必要である。バクテリオクロリンＢ３の類似体が合成されており、この波長が期待通り得られることが確認された。

メタロクロリンは、メタロバクテリオクロリンと比べて、通常は短い波長で、同様の光音響シグナルを示す。メタロクロリンを作製する合成方法にはまた、通常、塩基の存在下で、通常はテトラヒドロビラジエン前駆体の最終的な閉環反応の間に金属塩を添加して、メタロクロリンを形成することも含まれる。そのような方法は、Ｐｔａｓｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００７に詳細に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

各クロリン及び／又は各バクテリオクロリンの金属化は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２に本質的に記載されている、最近開発された方法によって行うことができる。合成クロリン及び／又は合成バクテリオクロリンの金属化を進めて、電子吸引官能基から電子過剰官能基にいたる様々な置換型を有する合成クロリン及び／又は合成バクテリオクロリンを取り扱った。一般に、クロリン及び／又はバクテリオクロリンの性質に応じて、２つの方法を金属化に利用することができる。電子過剰なクロリン及び／又はバクテリオクロリンは、ＴＨＦ中、強塩基（ＮａＨ又はＬＤＡ）で処理し、続いて６０℃で金属塩（ＭＸ_ｎ）を添加することによって金属化することができる。電子不足のバクテリオクロリンは、高温において、ＤＭＦ中、金属塩（ＭＸ_ｎ）で処理することによって金属化することができる。上記の２つの方法は、様々な合成のＺｎ－、Ｃｕ－、Ｐｄ－、及びＮｉ－バクテリオクロリンを作製するために以前から使用されている。これらの方法は、遊離塩基バクテリオクロリンをＭｎ、Ｆｅ、及びＣｏでの金属化を介した合成のＭｎ－、Ｆｅ－、及びＣｏ－バクテリオクロリンにも用いることができる。限定するものではなく例としては、Ｍｎ－バクテリオクロリンの関連方法による合成が、Ｓｃｈａｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ（２０１７）に記載されている。

バクテリオクロリンパネル（例えば、バクテリオクロリンＭＢＣ－１、ＭＢＣ－２、及びＭＢＣ－３）で用いることができる例示的な３つの追加のバクテリオクロリンを図９Ａに示す。これらは、対応する各メタロバクテリオクロリン（その例を図９Ｂに示す）に変換することができ、これらのメタロバクテリオクロリンは、ＰＡＩのピークシグナルが、お互いに重なりが小さく同様の広がりであり、ピークスペクトル波長が、遊離塩基バクテリオクロリンから２０～３０ｎｍシフトすると予想される。

いくつかの実施形態では、本開示の主題はまた、ＰＥＧ化したクロリン、メタロクロリン、バクテリオクロリン、及びメタロバクテリオクロリンを作製する方法に関する。いくつかの実施形態では、当該方法は、ＰＥＧ化Ｃｕ－バクテリオクロリンを作製するのに十分な条件下、ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍｍａｍｉｄｅ：ＤＭＦ）中、酢酸銅及び水素化ナトリウムで、遊離塩基ＰＥＧ化バクテリオクロリンを処理することを含む。いくつかの実施形態では、遊離塩基ＰＥＧ化バクテリオクロリンは、ＭＢＣ－１、ＭＢＣ－２、及びＭＢＣ－３からなる群から選択されるバクテリオクロリンのＰＥＧ化誘導体である。いくつかの実施形態では、遊離塩基ＰＥＧ化バクテリオクロリンはＭＢＣ－２－ＰＥＧである。ＰＥＧ化バクテリオクロリンを作製し、次いでＰＥＧ化バクテリオクロリンをＰＥＧ化Ｃｕ－バクテリオクロリンに誘導体化するための例示的なスキームを図１１に提供する。図１１に関して、バクテリオクロリンはＭＢＣ－２であるが、ＭＢＣ－１及びＭＢＣ－３が挙げられるもののこれらに限定されない他のクロリン及びバクテリオクロリンもまた、記載のようにＰＥＧ化及び／又は金属化し得ることが理解されよう。同様に、図１１は、ＰＥＧ化バクテリオクロリンに銅を付加するための酢酸銅との反応を示しているが、他の試薬を使用して、他の金属を同様に用いることができることが理解されよう。他の試薬とは、酢酸マンガン、酢酸亜鉛、酢酸ニッケル、酢酸鉄、及び酢酸コバルト、並びにマンガン、亜鉛、ニッケル、鉄、コバルト、及び／又は銅の他の化学形態などであるが、これらに限定されない。

ＩＶ．本開示の主題の組成物を使用したＰＡＩの方法
光音響イメージングは、非イオン化レーザーパルスを生体組織に送達する手法である。送達したエネルギーの一部が吸収され、熱に変換されて、一過性の熱弾性膨張、そして超音波放射を生じる。その後、生成した超音波を検出及び分析して、生体組織の画像を生成する。一般に、超音波放射が大きいと、生理的に特異な光吸収コントラストが明確になる。次いで、標的領域の２Ｄ又は３Ｄ画像を形成することができる。例えば、米国特許出願公開第２００５／００８５７２５号、同２００９／００６６９４９号、同２００９／００６９６５３号、同２０１０／０２２６００３号、及び同２０１２／０２９６１９２号明細書、米国特許第６，７３８，６５３号、同７，８６４，３０７号、同７，９１６，２８３号明細書、国際公開第２００２／００８７４０号、並びに、Ｘｕ＆Ｗａｎｇ，２００６、Ｌｉ＆Ｗａｎｇ，２００９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｗａｎｇ，２００９、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９を参照されたい。上記のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示の主題は、ボリュームの画像を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、当該方法は、少なくとも１つの放射線吸収成分であって、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、又はそれらの誘導体を含み、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は、銅及び／又はマンガンと錯体形成している、少なくとも１つの放射線吸収成分、を含む造影剤を、ボリューム又はその一部に投与することと、ボリューム又はその一部を放射線に曝露することと、放射線によりボリューム又はその一部において生成された超音波を検出することと、投与された造影剤を含有するボリューム又はその一部の光音響画像を、超音波から生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は、ミセル、リポソーム、ナノ粒子若しくはそれらの組合せの成分であり、かつ／又はミセル、リポソーム、ナノ粒子若しくはそれらの組合せに封入される。いくつかの実施形態では、６５０～１０７０ｎｍの波長の放射線が使用される。いくつかの実施形態では、６５０～９００ｎｍ、７００～９５０ｎｍ、及び／又は７５０～９５０ｎｍの波長の放射線が使用される。いくつかの実施形態では、生理的に許容可能な造影剤は、複数の異なるメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、それらの誘導体、及び／又はそれらの組合せを含み、各メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は、６５０～１０７０ｎｍの範囲で異なる吸収スペクトルを有する。いくつかの実施形態では、造影剤は標的化剤を含む。いくつかの実施形態では、標的化剤は、腫瘍細胞若しくはがん細胞又はそれに関連する血管内皮細胞上に存在するリガンド及び／又は標的に結合する部分を含む。いくつかの実施形態では、リガンド及び／又は標的は腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、前記部分は、腫瘍関連抗原に結合するペプチド又はペプチド模倣物を含む。

本開示の主題はまた、いくつかの実施形態において、ボリュームの光音響イメージングを多重化する方法を提供する。いくつかの実施形態では、当該方法は、複数の放射線吸収成分であって、複数の放射線吸収成分の各要素が、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体を含み、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は、銅及び／又はマンガンと錯体形成している、複数の放射線吸収成分、を含む造影剤を、ボリューム又はその一部に投与することと、複数の放射線吸収成分によって特異的に吸収される波長に調整されている放射線に、ボリューム又はその一部を曝露することと、複数の放射線吸収成分によって放射線が特異的に吸収される際に、ボリューム又はその一部において放射線によって生成された超音波を特異的に検出することと、投与された造影剤を含有するボリューム又はその一部の光音響画像であって、特異的に検出する超音波から生成される光音響画像、を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、複数のメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体のうちの１つ又は複数は、ミセル、リポソーム、ナノ粒子若しくはそれらの組合せの成分であり、かつ／又はミセル、リポソーム、ナノ粒子若しくはそれらの組合せに封入される。いくつかの実施形態では、６５０～１０７０ｎｍの波長の放射線が使用される。いくつかの実施形態では、６５０～９００ｎｍ、７００～９５０ｎｍ、及び／又は７５０～９５０ｎｍの波長の放射線が使用される。いくつかの実施形態では、複数の放射線吸収成分の各要素は、６５０～１０７０ｎｍの範囲で異なる吸収スペクトルを有する。いくつかの実施形態では、複数の放射線吸収成分のうちの１つ又は複数の要素は、標的化剤を含む。いくつかの実施形態では、標的化剤は、腫瘍細胞若しくはがん細胞又はそれに関連する血管内皮細胞上に存在するリガンド及び／又は標的に結合する部分を含む。いくつかの実施形態では、リガンド及び／又は標的は腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、前記部分は、腫瘍関連抗原に結合するペプチド又はペプチド模倣物を含む。いくつかの実施形態では、複数の放射線吸収成分の要素のうちの２つ以上は、標的化剤を含む。いくつかの実施形態では、複数の放射線吸収成分のうちの２つ以上の要素は、異なる標的化剤を含む。いくつかの実施形態では、異なる標的化剤は、同じか又は異なる標的及び／又は標的部位に結合し、かつ／又は、結合しなければ集積する。

さらに、本開示の主題の方法のいくつかの実施形態では、ボリュームは、対象又はその身体部分、任意選択でそれらの細胞、組織、及び／又は器官である。いくつかの実施形態では、ボリュームは、腫瘍細胞、がん細胞、又は、腫瘍若しくはがんの関連血管細胞を含む。いくつかの実施形態では、造影剤は、生理的に許容可能な造影剤、又は生理的に許容可能な複数の造影剤である。いくつかの実施形態では、造影剤は、ヒトでの使用に生理学的に許容される。いくつかの実施形態では、造影剤は、光音響イメージング造影剤と、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は添加物とを含む薬学的組成物で提供される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ヒトでの使用に薬学的に許容される。いくつかの実施形態では、ボリュームは、標的化剤によって標的とされ得る１つ又は複数の標的及び／又は標的部位を含む。

したがって、本開示の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏの用途に用いることができる。本開示の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで用いられる場合、対象、任意選択的にヒトでの使用に生理学的に許容される造影剤を用いることができる。いくつかの実施形態では、造影剤は薬学的組成物の一部として製剤化され、薬学的組成物は、いくつかの実施形態では、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は添加物をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、ヒトでの使用に薬学的に許容される。適切な製剤としては、水性及び非水性の滅菌注射溶液が挙げられ、滅菌注射溶液は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、殺菌性抗生物質、及び、対象となるレシピエントの体液と等張である製剤が得られる溶質、並びに、懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液を含有することができる。製剤は、単位用量又は複数用量の容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルに入れて提供することができ、使用直前に、滅菌液体担体、例えば注射用水を添加するだけでよい凍結又はフリーズドライ（凍結乾燥）の状態で保存することができる。いくつかの例示的成分としては、いくつかの実施形態では０．１～１０ｍｇ／ｍｌの範囲、いくつかの実施形態では約２．０ｍｇ／ｍｌのドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ：ＳＤＳ）、及び／又は、いくつかの実施形態では１０～１００ｍｇ／ｍｌの範囲、いくつかの実施形態では約３０ｍｇ／ｍｌのマンニトール若しくは別の糖、及び／又はホスフェート緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）がある。当該製剤の種類を考慮して、当技術分野で従来品の他のいかなる薬剤も使用することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、造影剤として、かつ／又はイメージング若しくは画像誘導療法（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６１７，５２２号明細書を参照されたい）のためのマルチカラーＰＡＩパネル及び／若しくはマルチモーダル・マルチカラーパネルの成分として用いられる。

以下の実施例は、例示的な実施形態を提供する。本開示及び当業者の一般的なレベルに照らして、当業者は、以下の実施例が単なる例示を意図しており、本開示の主題の範囲から逸脱することなく、多くの変更、改変、及び修正を用いることができることを理解するであろう。

実施例で使用した材料及び方法
インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号Ｉ２６３３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。ニッケルバクテリオクロリンＢ１０７を、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２に記載されているように作製した。イメージング実験の前に、各色素を、所望の濃度でＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。寒天ファントムを作製するための型は、通常通り、直径９０ｍｍのガラス製ペトリ皿とした。

実施例１
ファントム作製
高度に精製された寒天粉末（カタログ番号Ａ７９２１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、米国ミズーリ州セントルイス）を水（試薬グレード、タイプＩ）に溶解して、最終濃度を２．０％にし、電子レンジで溶融温度９５℃に加熱した。混合するために加熱及び旋回の３０秒間サイクルを３回行って、滑らかな寒天調製物を得た。焦げ付き（これは、吸収係数を検出できるほど増大させる）を避けるために、標準的なホットプレート及び二重ボイラーを使用して、寒天を入れた瓶を７５～８５℃で１～３時間保持した。このように高温で待つ間に、気泡がゆっくりと放出され、吸収がごくわずかで濁度が非常に低い寒天溶液が生成する。散乱媒体として１．０％低脂肪乳、及び吸収媒体としてインドインク（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｂｌａｃｋ ４４２０１、Ｃｈａｒｔｐａｋ，Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州リーズ）を最終濃度２０％（１：５ｖ／ｖ）で添加することによって、ファントムは所望の光学特性に達した。これらの添加は、乳タンパク質の沈殿を避けるために５４～５８℃の範囲で行った。前記の乳及びインクの均一性は維持するが気泡や発泡は生じない速度で、溶液を、撹拌棒でゆっくりと連続的に撹拌した。

ファントムマトリックスを分配する前に、ペトリ皿を５０℃のホットプレート上で１分間予熱した。ファントムマトリックス溶液を、予熱した２５ｍｌの血清ピペットを使用して型に分配し、適切に硬化して安定した光学特性（２０～２５℃）に達するように静置した。形成したファントムを４時間以内に使用しなかった場合は、蒸発を抑えるためにファントムを密封した。一般に、形成したファントムは、冷蔵保存した場合、８時間以内又は７２時間以内に使用した。ファントムを冷蔵した場合は、使用前に常温に温めた。これにより、ファントムマトリックスは硬化前に均一に広がり、（５０～５３℃のファントムマトリックスで２回、迅速に吸引及び分配された）ファントム表面を、光学的に平坦にすることができる。通常通り、ファントムマトリックス２０ｍｌを添加して、厚さ３±１０％ｍｍの型を得た。所望の深度で寒天層を横切って下方に延在するポリエチレンチューブ内の色素からのＰＡＩシグナルを測定するために、３ｍｍ厚のファントムを必要に応じて積み重ねた。

実施例２
寒天ファントム及び色素の光音響イメージング
光音響イメージングは、ソフトウェアバージョン１．７．２を備えたＶＥＶＯ（登録商標）ＬＡＺＲ ２１００イメージングシステム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．、カナダ、オンタリオ州トロント）を使用して行った。この機器は、超音波を光音響モード（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃｓ Ｍｏｄｅ：ＰＡ）イメージングと組み合わせており、二重Ｎｄ：ＹＡＧ波長可変レーザーによって励起された光パラメトリック発振器レーザー（ｏｐｔｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ ｌａｓｅｒ：ＯＰＯ）を用いている。所定の時間、５ｎｍのステップサイズのＰＡ走査モード（６８０～９００ｎｍ）又は固定波長で、イメージングを行った。シリンジを介してＰＥ５０ポリエチレンチューブ（０．０２３インチ×０．０３８インチ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ブレイントリー）に色素を導入し、イメージング実験の間、各端部を固定した。超音波ゲルを寒天ファントムの表面に塗布して、確実に、トランスデューサとファントムとの間を効率的にカップリングした。ＰＡ強度の定量化のために、チューブ及びそれに関連した画像領域を、超音波シグナル及びＰＡシグナルによって分離した。図３及び図４に示すデータは、６３μＭのＮｉ－バクテリオクロリン（Ｂ１０７）及び５０μＭのＩＣＧの溶液についてのものであり、Ｎｉ－バクテリオクロリンは、寒天の２つの深度で、ＩＣＧよりも約５倍大きいシグナルを示した。

実施例３
他のメタロバクテリオクロリンの作製、並びにそのメタロバクテリオクロリンを使用した色素及び寒天ファントムの光音響イメージング
Ｎｉ－バクテリオクロリンＢ１０７に対応するコバルト－（Ｃｏ）及び鉄－（Ｆｅ）バクテリオクロリンもまた、図６に示される基本スキームを使用して作製される。さらに、バクテリオクロリンＢ１～Ｂ３に対応するＮｉ－、Ｃｏ－、及びＦｅ－バクテリオクロリンも、図６に示す基本スキームを使用して作製される。例示的な金属化バクテリオクロリンを図８に示す。

Ｂ１０７のＣｏ－及びＦｅ－バクテリオクロリン誘導体、並びにバクテリオクロリンＢ１～Ｂ３のＮｉ－、Ｃｏ－及びＦｅ－バクテリオクロリン誘導体を使用した色素及び寒天ファントムの光音響イメージングは、本質的に実施例２で述べたように行われる。様々なシグナル及び正規化されたシグナルの強度を互いに比較し、かつＩＣＧの強度と比較する。

実施例４
銅錯体メタロバクテリオクロリンの作製、並びに銅錯体メタロバクテリオクロリンを使用した色素及び寒天ファントムの光音響イメージング
３つの銅バクテリオクロリン（ＣｕＢＣ－７２５、ＣｕＢＣ－７７５、ＣｕＢＣ－８４０）を使用して、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で希釈したＰＡＩ造影剤（ピーク吸収がそれぞれ７２５ｎｍ、７７５ｎｍ、及び８４０ｎｍ）及びＩＣＧを作製した。３つの造影色素をストローに入れ、本明細書に記載のようにＤＭＦ又はＩＣＧのいずれかで満たした対照チューブの隣で、４ウェル寒天散乱ファントムにおいてイメージングした。２０μＭ、５μＭ、及び１μＭの希釈液を作製した。各試料について、全吸収スペクトルを収集した。２つの混合色素（ＣｕＢＣ－７２５／ＣｕＢＣ－７７５、ＣｕＢＣ－７２５／ＣｕＢＣ－８４０、ＣｕＢＣ－７７５／ＣｕＢＣ－８４０）を含む試料についてもアッセイした。ＭＳＯＴ ｉｎＶｉｓｉｏｎ ５１２－Ｅｃｈｏ（ｉＴｈｅｒａ Ｍｅｄｉｃａｌ ＧｍｂＨ、ドイツ、ミュンヘン）を使用し、６８０～９８０ｎｍの範囲のイメージング波長で、畳み込みＭＳＯＴ吸収スペクトルを評価した。すべての記録波長で再構成された画像について、関心領域（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：ＲＯＩ）分析を行って、光吸収（Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：ＯＡ）スペクトルを得た。試料及び対照のチューブの周囲を関心領域とした。３つのＺ断面でスペクトルを測定し、平均してＳＮ比（ｓｉｇｎａｌ－ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ：ＳＮＲ）を増大させた。

結果を図１０に示す。図１０に示すように、ＣｕＢＣ－７２５、ＣｕＢＣ－７７５、及びＣｕＢＣ－８４０のそれぞれは、ＩＣＧよりもピークが鋭く、かつ吸収極大が大きいことを特徴とした。

実施例５
ＰＥＧ化バクテリオクロリンへの直接的な銅の挿入による例示的な水溶性ＰＥＧ化銅バクテリオクロリンの作製
ＭＢＣ－２－ＰＥＧ Ｍ＝Ｈ，Ｈ）の合成。例示的な水溶性ＰＥＧ化バクテリオクロリンの合成を図１１Ａに示す。２５ｍＬの丸底フラスコ中で、ＭＢＣ－２遊離塩基（Ｍ＝Ｈ，Ｈ）（２６ｍｇ、２２μｍｏｌ）を、ジオキサン（１．５ｍＬ）中、４．０ＭのＨＣｌで処理した。アルゴン下、暗所において、室温（ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ｒｔ）で反応混合物を撹拌した。０．５時間後、反応混合物を高真空下に置いて、ＨＣｌ／ジオキサンを除去した。フラスコをセプタム密封し、排気し、アルゴンを流した。ＤＭＦ（５．４ｍＬ）、Ｅｔ_３Ｎ（４８μＬ、３５ｍｇ、３４６μｍｏｌ）、ＣＨ_３（ＯＣ_２Ｈ_４）_１２ＣＯＮＨＳ（ｍＰＥＧ１２－ＮＨＳ、６７ｍｇ、９７μｍｏｌ）を添加し、室温（ｒｔ）で一晩撹拌した。液体クロマトグラフィー質量分析（ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＬＣＭＳ）により、所望の生成物を確認した。ＤＭＦを除去し、Ｃ１８ ２５０×２０カラムに３０％ＡｃＣＮ水溶液で２０～８０％のアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ：ＡｃＣＮ）グラジエント溶出水溶液を用いて、試料を６０分間ロードし、緑がかったピンク色の半固体ＭＢＣ－２－ＰＥＧを収率５９％（３９ｍｇ）で得た。

次いで、図１１Ｂに示すように、水溶性ＰＥＧ化ＭＢＣ－２－ＰＥＧに銅を添加した。１０ｍＬの丸底フラスコ（ｒｏｕｎｄ ｂｏｔｔｏｍ ｆｌａｓｋ：ＲＢＦ）中で、ＭＢＣ－２－ＰＥＧ（１０ｍｇ、３．３μｍｏｌ）をＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解し、室温で０．５時間、ＮａＨ（約１２ｍｇ、４８９μｍｏｌ、１５０当量、６０％の鉱油分散体、ヘキサン類で事前に洗浄）で処理した。Ｃｕ（ＯＡｃ）_２（１８ｍｇ、９８μｍｏｌ）を添加し、アルゴン下、６０℃で、混合物を加熱還流した。８０分間の加熱後、紫外可視分光法（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＵＶ－ｖｉｓ）及びＬＣＭＳにより、所望の生成物の形成を確認した。反応物を２．０ｍＬの水で急冷し、３０分間撹拌した後、水性ワークアップを行い、５０分間にわたって２０～８０％のＡｃＣＮグラジエント水溶液を用いた逆相分取液体クロマトグラフィー（ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＬＣ）にかけた。単離されたＣｕＢＣ－２－ＰＥＧの収量は、暗赤色半固体として７．７ｍｇ（７５％）であった。

図１１Ａ及び図１１Ｂでは、ＰＥＧ化に続いて、水溶性ＰＥＧ化バクテリオクロリンに銅が添加されることに留意されたい。しかし、いくつかの実施形態では、銅（又は別の金属）は、ＰＥＧ化の前に、本開示の主題のバクテリオクロリンと錯体形成することができる。

参考文献
下記に列挙するすべての参考文献、並びに本開示において引用されるすべての参考文献には、そのすべての特許、特許出願及び刊行物、科学雑誌論文、及びデータベースエントリーが含まれるが、これらに限定されず、前記参考文献が、本明細書で用いられる方法論、手法、及び／又は組成物を補足、説明、背景を提供、又は教示している限り、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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米国特許第６，５５９，３７４号、同６，７３８，６５３号、同７，４７０，７８５号、同７，５３４，８０７号、同７，８６４，３０７号、同７，９１６，２８３号、同８，１２９，５２０号、同８，１７３，６９１号、同８，１７３，６９２号、同８，２０７，３２９号、同８，３０４，５６１号、同８，６１７，５２２号、同８，６６４，２６０号、同９，３６５，７２２号、同９，８２２，１２３号明細書
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本開示の主題の様々な詳細事項は、本開示の主題の範囲から逸脱することなく変更されてもよいことが理解されよう。さらに、前述の記載は単に例示を目的としており、限定を目的とするものではない。

Claims (39)

1. 少なくとも１つの放射線吸収成分を含む光音響イメージング造影剤であって、少なくとも１つの放射線吸収成分は、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、それらの誘導体又はそれらの任意の組合せを含み、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、又はそれらの誘導体は、銅又はマンガンと錯体形成している、光音響イメージング造影剤。
2. 複数の異なるメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、それらの誘導体又はそれらの組合せを含み、各メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン又はそれらの誘導体は、６５０～１０７０ｎｍの範囲で異なる吸収スペクトルを有し、銅又はマンガンと錯体形成している、請求項１に記載の光音響イメージング造影剤。
3. 請求項２に記載の光音響イメージング造影剤であって、
   （ｉ）光音響イメージング造影剤が、少なくとも３つの異なるメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体を含み、
   （ｉｉ）各メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は、ピーク吸収値が７００～９５０ｎｍの範囲で吸収スペクトルを有し、
   （ｉｉｉ）少なくとも３つの吸収スペクトルが、７００～９５０ｎｍの範囲で実質的に重なり合わない、
   光音響イメージング造影剤。
4. 光音響イメージング造影剤が、少なくとも１つの銅錯体バクテリオクロリン、銅錯体クロリン、及び／又はそれらの誘導体、並びに、マンガン、亜鉛、ニッケル、鉄、及びコバルトからなる群から選択される金属と錯体形成した少なくとも１つの追加のメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体を含む、請求項３に記載の光音響イメージング造影剤。
5. ボリュームの画像を生成する方法であって、
   （ａ）少なくとも１つの放射線吸収成分であって、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン又はそれらの誘導体を含み、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体が銅又はマンガンと錯体形成している、少なくとも１つの放射線吸収成分を含む造影剤にボリュームを接触させることと、
   （ｂ）ボリュームを放射線に曝露することと、
   （ｃ）放射線によってボリューム内に発生した超音波を検出することと、
   （ｄ）造影剤を含有するボリューム又はその一部の光音響画像を超音波から生成することと
   を含む、方法。
6. メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体が、ミセル、リポソーム、ナノ粒子若しくはそれらの組合せの成分であり、かつ／又はミセル、リポソーム、ナノ粒子若しくはそれらの組合せに封入されている、請求項５に記載の方法。
7. ボリュームが、６５０～１０７０ｎｍの波長の放射線に曝露される、請求項５に記載の方法。
8. ボリュームが、６５０～９００ｎｍ、７００～９５０ｎｍ、及び／又は７５０～９５０ｎｍの波長の放射線に曝露される、請求項７に記載の方法。
9. 造影剤が、複数の異なるメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、それらの誘導体、及び／又はそれらの組合せを含み、各メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は、６５０～１０７０ｎｍの範囲で異なる吸収スペクトルを有する、請求項５に記載の方法。
10. 造影剤が標的化剤を含む、請求項５に記載の方法。
11. 標的化剤が、腫瘍細胞若しくはがん細胞又はそれに関連する血管内皮細胞上に存在するリガンド及び／又は標的に結合する部分を含む、請求項１０に記載の方法。
12. リガンド及び／又は標的が腫瘍関連抗原を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 部分が、腫瘍関連抗原に結合するペプチド又はペプチド模倣物を含む、請求項１１に記載の方法。
14. ボリュームの多重光音響イメージングの方法であって、
    （ａ）複数の放射線吸収成分であって、複数の放射線吸収成分の各要素がメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体を含み、メタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体は銅又はマンガンと錯体形成している複数の放射線吸収成分を含む造影剤をボリュームと接触させることと、
    （ｂ）放射線にボリュームを曝露することであって、放射線は、複数の放射線吸収成分によって特異的に吸収される波長に調整される、放射線にボリュームを曝露することと、
    （ｃ）複数の放射線吸収成分によって放射線が特異的に吸収される際に、放射線によってボリューム内に発生した超音波を特異的に検出することと、
    （ｄ）投与された造影剤を含有するボリューム又はその一部の光音響画像であって、特異的に検出する超音波から生成される光音響画像を生成することと
    を含む、方法。
15. 複数のメタロバクテリオクロリン、メタロクロリン、及び／又はそれらの誘導体のうちの１つ又は複数が、ミセル、リポソーム、ナノ粒子若しくはそれらの組合せの成分であり、かつ／又はミセル、リポソーム、ナノ粒子若しくはそれらの組合せに封入されている、請求項１４に記載の方法。
16. ボリュームが、６５０～１０７０ｎｍの波長の放射線に曝露される、請求項１４に記載の方法。
17. ボリュームが、６５０～９００ｎｍ、７００～９５０ｎｍ、及び／又は７５０～９５０ｎｍの波長の放射線に曝露される、請求項１６に記載の方法。
18. 複数の放射線吸収成分の各要素が、６５０～１０７０ｎｍの範囲で異なる吸収スペクトルを有する、請求項１４に記載の方法。
19. 複数の放射線吸収成分のうちの１つ又は複数の要素が標的化剤を含む、請求項１４に記載の方法。
20. 標的化剤が、腫瘍細胞若しくはがん細胞又はそれに関連する血管内皮細胞上に存在するリガンド及び／又は標的に結合する部分を含む、請求項１９に記載の方法。
21. リガンド及び／又は標的が腫瘍関連抗原を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 部分が、腫瘍関連抗原に結合するペプチド又はペプチド模倣物を含む、請求項２０に記載の方法。
23. 複数の放射線吸収成分のうちの２つ以上の要素が標的化剤を含む、請求項１４に記載の方法。
24. 複数の放射線吸収成分のうちの２つ以上の要素が異なる標的化剤を含む、請求項２３に記載の方法。
25. ボリュームが、対象又はその身体部分、任意選択でその細胞、組織、及び／又は器官である、請求項５から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. ボリュームが、腫瘍細胞、がん細胞、又は腫瘍若しくはがんの関連血管細胞を含む、請求項２７に記載の方法。
27. 造影剤が、対象、任意選択的にヒトでの使用に生理学的に許容される、請求項５から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 造影剤が、光音響イメージング造影剤と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は添加物とを含む薬学的組成物で提供される、請求項５から２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 薬学的組成物がヒトでの使用に薬学的に許容される、請求項２８に記載の方法。
30. メタロバクテリオクロリン及び／若しくはその誘導体又はそれらの組合せを含む少なくとも１つの放射線吸収成分を含む光音響イメージング造影剤であって、少なくとも１つの放射線吸収成分は、ＭＢＣ－１、ＭＢＣ－２、ＭＢＣ－３、及びＭＢＣ－２－ＰＥＧからなる群から選択される化合物を含み、ＭＢＣ－１、ＭＢＣ－２、ＭＢＣ－３、及びＭＢＣ－２－ＰＥＧは、以下の構造：
    

    

    を有し、さらに式中、Ｍは、亜鉛（Ｚｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、マンガン（Ｍｎ）、及び銅（Ｃｕ）からなる群から選択される金属である、
    光音響イメージング造影剤。
31. 少なくとも１つの放射線吸収成分が、ＣｕＢＣ－７２５、ＣｕＢＣ－７７５、ＣｕＢＣ－８４０又はＣｕＢＣ－２－ＰＥＧを含み、ＣｕＢＣ－７２５、ＣｕＢＣ－７７５、ＣｕＢＣ－８４０、及びＣｕＢＣ－２－ＰＥＧは、以下の構造：
    

    

    を有する、請求項３０に記載の光音響イメージング造影剤。
32. 光音響イメージング造影剤が、対象、任意選択的にヒトでの使用に生理学的に許容される、請求項１から４、３０、及び３１のいずれか一項に記載の光音響イメージング造影剤。
33. 請求項１から４及び請求項３０から３２のいずれか一項に記載の光音響イメージング造影剤と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は添加物とを含む薬学的組成物。
34. 薬学的組成物がヒトでの使用に薬学的に許容される、請求項３３に記載の薬学的組成物。
35. 請求項１から４及び請求項３０から３２のいずれか一項に記載の光音響イメージング造影剤が水溶性である、請求項３３又は請求項３４に記載の薬学的組成物。
36. 請求項１から４及び請求項３０から３２のいずれか一項に記載の光音響イメージング造影剤がＰＥＧ化されている、請求項３３又は請求項３４に記載の薬学的組成物。
37. ＰＥＧ化Ｃｕ－バクテリオクロリンを作製する方法であって、ＰＥＧ化Ｃｕ－バクテリオクロリンを作製するのに十分な条件下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、酢酸銅及び水素化ナトリウムで遊離塩基ＰＥＧ化バクテリオクロリンを処理することを含む、方法。
38. 遊離塩基ＰＥＧ化バクテリオクロリンが、ＭＢＣ－１、ＭＢＣ－２、及びＭＢＣ－３からなる群から選択されるバクテリオクロリンのＰＥＧ化誘導体である、請求項３７に記載の方法。
39. 遊離塩基ＰＥＧ化バクテリオクロリンがＭＢＣ－２－ＰＥＧである、請求項３７又は請求項３８に記載の方法。

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