CN115109585A - 一种近红外荧光探针的制备方法及近红外荧光探针 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种近红外荧光探针的制备方法及近红外荧光探针。本发明的制备方法包括：对含有羧基的近红外荧光染料进行第一活化处理，得到活化近红外荧光染料溶液；对Arg‑Leu‑Asn‑Val‑Gly‑Gly‑Thr‑Tyr‑Phe‑Leu‑Thr‑Thr‑Arg‑Gln肽链(L5肽链)或Tyr‑Phe‑Leu‑Thr‑Thr‑Arg‑Gln肽链(L5‑2肽链)进行第二活化处理，得到活化肽链溶液；将活化近红外荧光染料溶液与活化肽链溶液混合，得到混合液；对混合液进行沉降处理，得到近红外荧光探针。本发明的制备方法制备的近红外荧光探针可以主动靶向癌症细胞，尤其是HCC病变组织，实现对HCC的靶向荧光成像。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学成像技术领域，特别涉及一种近红外荧光探针的制备方法及近红外荧光探针。
背景技术
据世界卫生组织公布的世界癌症报告相关数据显示，肝癌的发病日趋严重，已成为致死率居第二位的癌症。目前，在肝癌治疗方面，首选的是手术治疗。但在应用外科手术切除肿瘤时，如何对肿瘤切缘进行准确的识别是医学界非常难以解决的问题。近年来，一些创新的医学治疗方法在进一步解决这一问题方面表现出了巨大的潜力，如近红外荧光成像技术。
近几年来，近红外荧光成像技术迅速发展，由于其具有优良的安全性以及光散射低、穿透深度最佳、生物荧光背景干扰小等荧光特性而成为有前景的抗肿瘤治疗方法之一。目前临床上批准的近红外荧光染料包括吲哚菁绿(ICG)和亚甲基蓝(MB)。并且由于ICG可以与体内血清相结合，显示出强烈的近红外荧光信号，目前我国已经将吲哚菁绿用于肝癌手术的成像和肿瘤前哨淋巴结的活检。
然而令人遗憾的是现有的临床批准的近红外荧光染料对肿瘤细胞没有特异性的选择。如何在临床上提高其影像学水平也是一个迫切需要解决的重要问题。
发明内容
本发明提供一种近红外荧光探针的制备方法，所述制备方法可以制备出具有主动靶向肿瘤位点，可以实现肿瘤特异性荧光成像的近红外荧光探针。
本发明提供一种近红外荧光探针，所述近红外荧光探针可以主动靶向肿瘤位点，从而实现肿瘤的特异性荧光成像。
本发明提供一种近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
对含有羧基的近红外荧光染料进行第一活化处理，得到活化近红外荧光染料溶液；
对Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链进行第二活化处理，得到活化肽链溶液；
将所述活化近红外荧光染料溶液与所述活化肽链溶液混合，得到混合液；
对所述混合液进行沉降处理，得到所述近红外荧光探针。
如上所述的制备方法，其中，所述含有羧基的近红外荧光染料包括吲哚菁绿衍生物。
如上所述的制备方法，其中，所述吲哚菁绿衍生物选自吲哚菁绿-羧酸或吲哚菁绿-聚乙二醇-羧基中的至少一种。
如上所述的制备方法，其中，所述沉降处理后，还包括对所述近红外荧光探针进行纯化处理；
所述纯化处理包括：将所述近红外荧光探针溶解得到近红外荧光探针溶液，利用色谱柱对所述近红外荧光探针溶液进行柱层析处理。
如上所述的制备方法，其中，所述色谱柱包括葡聚糖凝胶色谱柱。
如上所述的制备方法，其中，所述葡聚糖凝胶包括分离分子量小于1500Da的Sephadex G-15葡聚糖凝胶。
如上所述的制备方法，其中，利用第一活化试剂对所述含有羧基的近红外荧光染料进行所述第一活化处理；
所述第一活化试剂包括6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯。
如上所述的制备方法，其中，利用第二活化试剂对所述Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链或所述Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链进行所述第二活化处理；
所述第二活化试剂包括二异丙基乙胺。
如上所述的制备方法，其中，利用沉降剂对所述混合液进行所述沉降处理；
所述沉降剂包括乙醚。
本发明还提供一种近红外荧光探针，其中，所述近红外荧光探针根据上述的制备方法获得。
本发明提供一种近红外荧光探针的制备方法，对含有羧基的近红外荧光染料进行第一活化处理，得到活化近红外荧光染料溶液；对Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链(L5肽链)或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链(L5-2肽链)进行第二活化处理，得到活化肽链溶液；将所述活化近红外荧光染料溶液与所述活化肽链溶液混合，得到混合液；使用沉降剂对所述混合液进行沉降处理，得到所述近红外荧光探针。由于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)主要在肝细胞癌(HCC)的细胞膜上大量表达，而L5肽链或L5-2肽链可以主动靶向GPC-3，所以本发明的制备方法制备的近红外荧光探针可以主动靶向癌症细胞，尤其是HCC病变组织，实现对HCC的靶向荧光成像。此外，目前使用抗体制备近红外荧光探针时，存在实验室操作困难、制得的近红外荧光探针的体内动力学较差的缺点。与使用抗体制备近红外荧光探针相比，本发明使用肽链制备近红外荧光探针可以克服上述缺点，制备得到的近红外荧光探针具有免疫原性低、性能简单的优点，并且由于肽链的生产成本也低于抗体的生产成本，所以本发明的制备方法还具有成本低的优点。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的第一方面提供一种近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
对含有羧基的近红外荧光染料进行第一活化处理，得到活化近红外荧光染料溶液；
对Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链(L5肽链)或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链(L5-2肽链)进行第二活化处理，得到活化肽链溶液；
将活化近红外荧光染料溶液与活化肽链溶液混合，得到混合液；
对混合液进行沉降处理，得到近红外荧光探针。
本发明中，为了使近红外荧光染料中的活性官能团可以与肽链更好的进行反应，本发明对含有羧基的近红外荧光染料进行第一活化处理得到活化近红外荧光染料溶液，对L5肽链或L5-2肽链进行第二活化处理得到活化肽链溶液，然后将活化近红外荧光染料溶液与活化肽链溶液混合，使含有羧基的近红外荧光染料与L5肽链或L5-2肽链发生共价偶联反应，得到含有近红外荧光探针的混合液，最后使用沉降剂将混合液中的近红外荧光探针沉降，获得近红外荧光探针。在具体的实施方式中，将活化近红外荧光染料和活化肽链溶液在冰浴下进行搅拌混合。
本领域的技术人员知晓的，肽链的终端具有羧基。本发明中，与终端羧基相邻的碳(C)为α-C，与α-C连接的氨基则为α-氨基。示例性的，结构式为
的肽链中，与羧基相连的C为α-C，与α-C相连的氨基为α-氨基。本发明中，含有羧基的近红外荧光染料与L5肽链或L5-2肽链发生共价偶联反应时，近红外荧光染料中的羧基会脱去-OH，L5肽链或L5-2肽链中的α-氨基会脱去一个氢原子，羧基中的酰基与L5肽链或L5-2肽链中的α-氨基会脱去一个氢原子形成的基团结合，形成近红外荧光探针。
由于L5肽链或L5-2肽链可作为在HCC细胞膜上过表达的GPC-3蛋白的亲和配体，所以本发明中含有L5肽链或L5-2肽链的近红外荧光探针可以主动靶向HCC细胞，使荧光染料在HCC组织中富集，从而实现准确检测HCC病变组织。
此外，目前使用抗体制备近红外荧光探针时，存在实验室操作困难，制得的近红外荧光探针的体内动力学较差的缺点，本发明使用肽链制备近红外荧光探针可以克服上述缺点，制备得到的近红外荧光探针具有免疫原性低、性能简单的优点，并且由于肽链的生产成本也低于抗体的生产成本，所以本发明的近红外荧光探针的制备方法还具有成本低的优点。
在本发明的一些实施方式中，上述含有羧基的近红外荧光染料包括吲哚菁绿衍生物(ICG衍生物)。
本发明选择ICG衍生物作为近红外荧光染料，是由于ICG衍生物作为一种菁型近红外染料，除了其主要的近红外一区(NIR-I)发射外，还具有较强的NIR-II尾峰荧光发射。而NIR-II荧光信号具有更强的穿透深度，更少受到生物自发荧光干扰的特点，可以实现对肿瘤长效、稳定的标记，满足外科医师对术中导航时间的要求。具体的作用过程为，ICG衍生物与体内血清相结合，减轻血清中白蛋白的二聚作用，提高量子产率，从而显示出更强的NIR-II荧光信号。
具体地，上述吲哚菁绿衍生物选自吲哚菁绿-羧酸或吲哚菁绿-聚乙二醇-羧基中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，上述沉降处理后，还包括对近红外荧光探针进行纯化处理；
纯化处理包括：将近红外荧光探针溶解得到近红外荧光探针溶液，利用色谱柱对近红外荧光探针溶液进行柱层析处理。
由于沉降处理获得的近红外荧光探针存在小分子量的杂质，所以可以对沉降处理得到的近红外荧光探针进行纯化处理，去除近红外荧光探针中的小分子量杂质，获得纯度高的近红外荧光探针，进一步提高获得近红外荧光探针的生物活性。
在具体进行纯化处理的过程中，可以将近红外荧光探针溶解在去离子水中制备近红外荧光探针溶液，随后利用色谱柱对近红外荧光探针溶液进行柱层析处理，在柱层析处理过程中，近红外荧光探针溶液中的小分子量杂质会被色谱柱吸附，从而能够得到纯化处理后的近红外荧光探针溶液。进一步地，为了便于保存，可以对纯化后的近红外荧光探针溶液进行干燥处理，得到纯化后的近红外荧光探针。在一种具体的实施方式中，可以通过冷冻干燥的方式进行上述干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃，真空度为13Pa，时间为3-5天。
在本发明的一些实施方式中，上述色谱柱包括葡聚糖凝胶色谱柱，葡聚糖凝胶色谱柱可以更好的吸附小分子量的杂质。
葡聚糖凝胶色谱柱的分离分子量可以根据预期获得的近红外荧光探针的相对分子质量进行合理设置，只要分离分子量小于预期获得的近红外荧光探针的相对分子量即可。在具体的实施方式中，选择分离分子量小于1500的Sephadex G-15葡聚糖凝胶，可以最大限度的除去小分子量的杂质，最大限度的获得高纯净的近红外荧光探针。
本发明不限定第一活化试剂的组成，凡是可以对含有羧基的近红外荧光染料进行活化的试剂，都属于本发明的保护范围之内。本发明不限定第二活化试剂的组成，凡是可以对本发明中的肽链进行活化的试剂都属于本发明的保护范围之内。本发明不限定沉降剂的组成，凡是可以沉降近红外荧光探针的试剂都属于本发明的保护范围之内。
在本发明的一些实施方式中，可以利用第一活化试剂对含有羧基的近红外荧光染料进行第一活化处理；第一活化试剂包括6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯。本发明中，可以将第一活化试剂和含有羧基的近红外荧光染料混合，然后添加至有机溶剂中，得到活化近红外荧光染料溶液。有机溶剂可以为二氯甲烷(DCM)。
在本发明的一些实施方式中，利用第二活化试剂对Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链进行第二活化处理；第二活化试剂包括二异丙基乙胺。本发明中，可以将第二活化试剂和L5肽链或L5-2肽链进行混合，然后添加至有机溶剂中，得到活化肽链溶液。有机溶剂可以为二氯甲烷(DCM)。
在本发明的一些实施方式中，利用沉降剂对混合液进行沉降处理；沉降剂包括乙醚。
本发明的第二方面提供一种近红外荧光探针，根据上述的制备方法获得。
由于L5肽链或L5-2肽链可作为在HCC细胞膜上过表达的GPC-3蛋白的亲和配体，所以本发明中含有L5肽链或L5-2肽链的近红外荧光探针可以主动靶向HCC细胞，使荧光染料在HCC组织中富集，从而实现准确检测HCC病变组织。并且，与抗体相比，本发明的近红外荧光探针具有免疫原性低、性能简单的优点；由于肽链的生产成本低于与抗体的生产成本，所以本发明的近红外荧光探针还具有生产成本低的优点。
本发明的近红外荧光探针具有式1所示的结构：
Ra-Rb 式1
其中，Ra为含有羧基的近红外荧光染料化合物中的酰基，Rb为L5肽链或L5-2肽链中的α-氨基脱去一个氢原子后的基团。
示例性地，上述近红外荧光探针具有式1-1或式1-2所示的结构：
式1-1中，Ra为吲哚菁绿-羧酸，Rb为L5肽链中的α-氨基脱去一个氢原子后的基团；式1-2中，Ra为吲哚菁绿-羧酸，Rb为L5-2肽链中的的α-氨基脱去一个氢原子后的基团。
本发明获得的近红外荧光探针可以用于近红外荧光成像系统中。将上述获得的近红外荧光探针与成像仪器进行搭配得到近红外荧光成像系统，该近红外荧光探针成像系统可以对肿瘤进行定位成像，应用于手术中时，可以实时定位肿瘤，为术者彻底切除肿瘤提供实时反馈。
本发明的近红外荧光探针或近红外荧光成像系统由于可以主动靶向癌症组织，实现对癌症组织成像，在肿瘤的近红外荧光成像中具有很好的应用前景。在具体的实施方式中，上述肿瘤包括肝细胞癌。
以下，通过具体实施例对本发明的提取方法进行详细的介绍。
实施例1
本实施例的制备方法包括以下步骤：
1)在25mL的试剂瓶中，首先将1.60g(2.56mmol)的ICG-COOH和1.06g(2.56mmol)的HCTU活化试剂溶解在10mL的DCM中，在氮气保护和冰浴条件下，搅拌20min，得到活化ICG-COOH溶液；
2)将L5肽链(1.2g，1.28mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA)(2.48mL,14.60mmol)溶于4mL的DCM中，避光搅拌5min得到活化L5肽链溶液；
3)将步骤1)中得到的活化的ICG-COOH溶液缓慢加入步骤2)中得到的活化L5肽链溶液，室温下避光搅拌48h后，得到混合液，用乙醚沉降，抽滤，收集产物，得到粗品近红外荧光探针，-20℃避光保存。
合成路线为式1-3：
实施例2
本实施例的制备方法包括以下步骤：
1)在25mL的试剂瓶中，首先将1.60g(2.56mmol)的ICG-COOH和1.06g(2.56mmol)的HCTU活化试剂溶解在10mL的DCM中，在氮气保护和冰浴条件下，搅拌20min，得到活化ICG-COOH溶液；
2)将L5肽链(1.2g，1.28mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA)(2.48mL,14.60mmol)溶于4mL的DCM中，避光搅拌5min得到活化L5肽链溶液；
3)将步骤1)中得到的活化的ICG-COOH溶液缓慢加入步骤2)中得到的活化L5肽链溶液，室温下避光搅拌48h后，得到混合液，用乙醚沉降，得到粗品近红外荧光探针；
将粗品近红外荧光探针溶于去离子水中得到粗品近红外荧光探针溶液，利用填充有分离分子量小于1500Da的Sephadex G-15葡聚糖凝胶的色谱柱对粗品近红外荧光探针溶液进行柱层析处理，收集流穿液。随后对流穿液进行冷冻干燥并收集纯净的近红外荧光探针，在-20℃避光保存；
其中，冷冻干燥的温度为-40℃，真空度为13Pa，时间为3天。
实施例3
本实施例的制备方法包括以下步骤：
1)在25mL的试剂瓶中，首先将1.60g(2.56mmol)的ICG-COOH和1.06g(2.56mmol)的HCTU活化试剂溶解在10mL的DCM中，在氮气保护和冰浴条件下，搅拌20min，得到活化ICG-COOH溶液；
2)将L5-2肽链(1.2g，1.28mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA)(2.48mL,14.60mmol)溶于4mL的DCM中，避光搅拌5min得到活化L5-2肽链溶液；
3)将步骤1)中得到的活化的ICG-COOH溶液缓慢加入步骤2)中得到的活化L5-2肽链溶液，室温下避光搅拌48h后，得到混合液，用乙醚沉降，抽滤，收集产物，得到粗品近红外荧光探针，-20℃避光保存。
合成路线为式1-4：
实施例4
本实施例的制备方法包括以下步骤：
1)在25mL的试剂瓶中，首先将1.60g(2.56mmol)的ICG-COOH和1.06g(2.56mmol)的HCTU活化试剂溶解在10mL的DCM中，在氮气保护和冰浴条件下，搅拌20min，得到活化ICG-COOH溶液；
2)将L5-2肽链(1.2g，1.28mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA)(2.48mL,14.60mmol)溶于4mL的DCM中，避光搅拌5min得到活化L5-2肽链溶液；
3)将步骤1)中得到的活化的ICG-COOH溶液缓慢加入步骤2)中得到的活化L5-2肽链溶液，室温下避光搅拌48h后，得到混合液，用乙醚沉降，抽滤，收集产物，得到粗品近红外荧光探针；
将粗品近红外荧光探针溶于去离子水中得到粗品近红外荧光探针溶液，利用填充有分离分子量小于1500Da的Sephadex G-15葡聚糖凝胶的色谱柱对粗品近红外荧光探针溶液进行柱层析处理，收集流穿液。随后对流穿液进行冷冻干燥并收集纯净的近红外荧光探针，在-20℃避光保存；
其中，冷冻干燥的温度为-40℃，真空度为13Pa，时间为3天。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
对含有羧基的近红外荧光染料进行第一活化处理，得到活化近红外荧光染料溶液；
对Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链或Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链进行第二活化处理，得到活化肽链溶液；
将所述活化近红外荧光染料溶液与所述活化肽链溶液混合，得到混合液；
对所述混合液进行沉降处理，得到所述近红外荧光探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含有羧基的近红外荧光染料包括吲哚菁绿衍生物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述吲哚菁绿衍生物选自吲哚菁绿-羧酸或吲哚菁绿-聚乙二醇-羧基中的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述沉降处理后，还包括对所述近红外荧光探针进行纯化处理；
所述纯化处理包括：将所述近红外荧光探针溶解得到近红外荧光探针溶液，利用色谱柱对所述近红外荧光探针溶液进行柱层析处理。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述色谱柱包括葡聚糖凝胶色谱柱。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖凝胶包括分离分子量小于1500Da的Sephadex G-15葡聚糖凝胶。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，利用第一活化试剂对所述含有羧基的近红外荧光染料进行所述第一活化处理；
所述第一活化试剂包括6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，利用第二活化试剂对所述Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链或所述Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln肽链进行所述第二活化处理；
所述第二活化试剂的溶剂包括二异丙基乙胺。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法，其特征在于，利用沉降剂对所述混合液进行所述沉降处理；
所述沉降剂包括乙醚。
10.一种近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光探针根据权利要求1-9任一项所述的制备方法获得。
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