CN107921287A - 基于纳米粒子的肝靶向疗法和成像 - Google Patents

基于纳米粒子的肝靶向疗法和成像 Download PDF

Info

Publication number
CN107921287A
CN107921287A CN201680046764.1A CN201680046764A CN107921287A CN 107921287 A CN107921287 A CN 107921287A CN 201680046764 A CN201680046764 A CN 201680046764A CN 107921287 A CN107921287 A CN 107921287A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano
particle
ligand
connector
particle according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680046764.1A
Other languages
English (en)
Inventor
A·G·巴黎安多斯
E·D·T·多明盖斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Midatech Ltd
Original Assignee
Midatech Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Midatech Ltd filed Critical Midatech Ltd
Publication of CN107921287A publication Critical patent/CN107921287A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0089—Particulate, powder, adsorbate, bead, sphere
    • A61K49/0091—Microparticle, microcapsule, microbubble, microsphere, microbead, i.e. having a size or diameter higher or equal to 1 micrometer
    • A61K49/0093—Nanoparticle, nanocapsule, nanobubble, nanosphere, nanobead, i.e. having a size or diameter smaller than 1 micrometer, e.g. polymeric nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种纳米粒子，其包含：包含金属和/或半导体的核心；和多种共价连接至所述核心的配体，其中所述配体包含：至少一种肝靶向配体；至少一种包含生物活性剂的有效载荷配体；和至少一种包含碳水化合物的稀释配体。还提供了包含所述纳米粒子的药物组合物，其医学用途，包括肝癌的治疗和成像，和用于产生所述纳米粒子的方法。

Description

基于纳米粒子的肝靶向疗法和成像
发明领域
本发明涉及作为用于将试剂靶向递送至具体组织类型或位置的媒剂、尤其用于医学的纳米粒子，并且包括用于如肝癌等肝病症的治疗的方法。还公开了药物组合物、用于所述纳米粒子的产生的方法和其使用方法。
发明背景
本发明针对组合物和产品，和制造和施用所述组合物和产品的方法，包括用于哺乳动物并且尤其人类的治疗。
药物递送提出了数种显著挑战，尤其关于作用位点。在治疗某些肿瘤的情况下，例如，仍需要能够使抗癌药物靶向肿瘤位点，同时使脱靶效应最小化的递送系统。
原发性肝癌是全球第六种最常见的癌症并且是癌症死亡的第二大原因。最常见的肝癌是肝细胞癌(HCC)，占所有原发性肝癌的大约75％。HCC由变成恶性的肝细胞形成。B型肝炎、C型肝炎、黄曲霉毒素B1和滥用酒精是造成大约80％的人类HCC的四种因素。因此，如脂肪肝炎、纤维化和肝硬化等潜在疾病通常使常规HCC疗法复杂化。目前，如果肿瘤可切除，那么手术切除是HCC的主要治疗选项。然而，仅10-20％的HCC可使用手术完全地去除。因此，靶向药物递送由于获批的化学治疗剂的功效改进和减少的其副作用而受到主要关注(ShiB.等人,J.Histochem.Cytochem.,2013,第61卷,第901-909页)。
WO0232404描述了碳水化合物偶合(包括乳糖偶合)的金纳米粒子。WO2014/125256描述了用于使生物活性剂靶向中枢神经系统(CNS)，例如用于治疗CNS病症的纳米粒子递送系统。
Garg等人,AAPS PharmSciTech,2013,第14卷,第3期,第1219-1226页描述了用于将荧光香豆素衍生物细胞内递送至肝细胞的经过乳糖表面改质的金纳米媒剂。
Penadés等人,Chem.Eur.J.,第9卷,第1909-1921页描述了荧光糖纳米粒子的合成。
Penadés等人,Carbohydrate Research,第344卷,第1474-1478页描述了评估配体密度和呈现对于使用乳糖官能化的金纳米粒子识别蛋白受体的影响的研究。
Penadés等人,Chem.Bio.Chem.,第5卷,第291-297页描述了调查提供乳糖的糖纳米粒子减少实验性转移的进展的用途的研究。
关于其它纳米粒子递送系统和关于将生物活性和/或可检测试剂递送至受试者中的具体组织或位置的方法，包括关于原发性肝癌的靶向治疗仍存在未满足的需要。本发明解决了这些和其它需要。
发明简述
广泛说来，本发明涉及具有肝靶向部分和有效载荷的纳米粒子，所述纳米粒子适用作用于将所述有效载荷递送至肝(包括肝的患病细胞)的媒剂。所述有效载荷可包含一种或多种分别用于治疗和/或成像应用的生物活性剂和/或可检测试剂。本发明人已经意外地发现其中乳糖配体经由形式乳糖-(OCH2CH2)m-(CH2)n-SH的相对长连接体共价连接至金核心的纳米粒子展现体内和体外靶向肝细胞。本文实施例中提供的证据表明了乳糖长连接体金纳米粒子(GNP)与在肝细胞上表达的无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)相互作用。不希望受任何特定理论束缚，本发明人相信最接近核心的相对刚性(烷基)连接体部分与最接近乳糖基团的相对柔性(乙二醇)连接体部分的组合提供了用于与ASGPR相互作用并且最终用于将药物有效载荷递送至肝的有利配体布置。此外，本发明人已经发现了某些磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽当共价连接至纳米粒子核心时用于使纳米粒子靶向肝细胞癌细胞，例如相对于基础纳米粒子的7倍靶向，并且可对具有例如美登素类DM4化学治疗性有效载荷的纳米粒子提供肝靶向功能。
因此，在第一方面，本发明涉及一种纳米粒子，其包含：
包含金属和/或半导体的核心；和
多种共价连接至所述核心的配体，其中所述配体包含：
(i)至少一种肝靶向配体；
(ii)至少一种包含生物活性剂和/或可检测试剂的有效载荷配体；和
(iii)至少一种包含碳水化合物的稀释配体。
因此，在一个相关第一方面，本发明可提供一种纳米粒子，其包含：
包含金属和/或半导体的核心；和
多种共价连接至所述核心的配体，其中所述配体包含：
(iv)至少一种肝靶向配体；
(v)至少一种包含生物活性剂的有效载荷配体；和
(vi)至少一种包含碳水化合物的稀释配体。
在一些情况下，所述肝靶向配体可选自：乳糖、FGF-4(成纤维细胞生长因子4)、c-Met(肝细胞生长因子受体)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合剂(例如，如US8388937所公开的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽，尤其如其中所公开的SEQ ID NO:1或10，或抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体)、α-胎蛋白(AFP)受体结合剂(例如，如US2012/0270238所公开的AFP受体结合肽或抗AFP受体抗体)和ASGPR结合剂(例如半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、乳糖、葡萄糖、甘露糖，或糖模拟配体，如Mamidyala等人,J.Am.Chem.Soc.,2012,第1334卷,第4期,第1978-1981页所公开)。所述肝靶向配体也可为抗体或其结合片段，例如Fab片段(抗原结合片段)、单一结构域抗体/针对如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、ASGPR、FGF-4、c-Met、AFP或其它肝表达蛋白或肝表达受体等肝或肝细胞标靶的纳米抗体。
在一些情况下，所述肝靶向配体可包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽，其包含如SEQ ID NO:1或2所陈述的氨基酸序列的肽或由所述肽组成；或为与所述氨基酸序列的不同之处在于不超过3个氨基酸的缺失、添加、修饰或取代的其变体，其中所述变体保持SEQ IDNO 1或2的肽与人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的结合亲和力的至少50％。结合亲和力可例如在竞争结合分析中确定，其中所述变体肽与SEQ ID NO:1或2的肽竞争结合于人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3多肽。
在某些情况下，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3肽具有N端乙酰化和/或C端酰胺化。
在一些情况下，所述肝靶向配体(例如乳糖或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽)可经由连接体共价连接至纳米粒子核心(例如，金核心)。
在一些情况下，所述肝靶向配体可经由第一连接体宫颈癌连接至核心，所述第一连接体具有2至50个原子的链长。具体说来，所述第一连接体可包含基团-(CH2)n-和/或-(OCH2CH2)m-，其中n和m独立地≥1。在某些情况下，所述第一连接体包含–(OCH2CH2)m-，其中m在1与10之间，例如其中m在范围5至9中，例如m为8。在某些情况下，所述第一连接体包含-(OCH2CH2)m-(CH2)n-，其中m＝1至0且n＝1至15。具体说来，m可在范围3至7中，和/或n可在范围5至12中。
在一些情况下，所述至少一种肝靶向配体和所述第一连接体可选自由以下组成的组：
HS-(OCH2CH2)8-CONH-RLNVGGTYFLTTRQ(SEQ ID NO:1)；
HS-(OCH2CH2)8-CONH-RLNVGGTYFLTTRQ-NH2(SEQ ID NO:1)；
HS-(OCH2CH2)8-CONH-YFLTTRQ(SEQ ID NO:2)；
HS-(OCH2CH2)8-CONH-YFLTTRQ-NH2(SEQ ID NO:2)；
HS-(OCH2CH2)6-NH(Ac)-RLNVGGTYFLTTRQ(SEQ ID NO:1)；和
HS-(OCH2CH2)6-NH(Ac)-YFLTTRQ(SEQ ID NO:2)。
在一些情况下，所述第一连接体可经由末端硫原子(例如，金硫或金-硫醇键)结合于核心。
在某些情况下，经由所述第一连接体共价连接至核心的肝靶向配体具有式(I)的结构：
其中所述第一连接体经由末端硫醇基结合于核心。
在一些情况下，所述有效载荷配体包含治疗剂，如化学治疗或细胞毒性化合物。在某些情况下，所述有效载荷配体可包含选自由以下组成的组的化合物：美登素类DM4、多柔比星、伊立替康、铂(II)、铂(IV)、替莫唑胺、卡莫司汀、喜树碱、多柔比星、多西紫杉醇、索拉非尼、美登素、美登素类DM1、一甲基澳瑞他汀E(MMAE)和帕比司他。所述有效载荷配体在一些情况下可经由第二连接体共价连接至所述纳米粒子的核心，所述第二连接体可与所述第一连接体相同或不同。在一些情况下，例如当所述有效载荷配体包含硫醇基时，所述有效载荷配体可例如使用所述有效载荷配体的硫醇基作为连接位点经由金-硫醇键直接地附接至纳米粒子核心。
在一些实施方案中，所述第二连接体具有2至50个原子的链长。具体说来，所述第二连接体可包含基团-(CH2)n-和/或-(OCH2CH2)m-，其中n和m独立地≥1。在某些情况下，所述第二连接体包含-(OCH2CH2)m-，其中m＝1至10，任选地其中m＝1、2、3、4、5或6。在一些情况下，较短连接体为优选的并且m为1。在一些情况下，较长连接体为优选的并且m为5。
在一些情况下，所述第二连接体可经由末端硫原子(例如，金硫或金-硫醇键)结合于核心。因此，在一些情况下，所述第二连接体包含-(OCH2CH2)mSH(其中所述连接体经由末端硫醇基结合于核心)。在一些情况下，所述第二连接体包含ω-氨基酸以促进所述有效载荷的附接，例如经由附接连接体。
因此，在一些情况下，所述第二连接体包含··NHCH2CH2-(OCH2CH2)mSH，(其中所述连接体经由末端硫醇基结合于核心并且··(即，如以下结构中的虚线)指示与所述生物活性剂或中间连接体的附接点)。尤其优选的第二连接体为：
生物活性分子或可检测标记可直接地结合于所述第二连接体，或经由中间连接体。合适的中间连接体可源于二羧酸。例如，合适的中间连接体包括琥珀酸盐和丙二酸盐。例如，有效载荷配体可为下式的配体：
例如，在一些实施方案中，所述纳米粒子包含下式的有效载荷配体：
一些治疗剂可通过络合结合于例如金属中心。可使用具有末端氧单元的琥珀酸盐中间连接体。
例如，在一些实施方案中，所述纳米粒子包含下式的有效载荷配体：
配位可为二齿的。例如，Pt(II)中心可配位至具有二羧酸部分的中间连接体。例如，所述中间连接体可包含2-丙二酸盐部分。
例如，在一些实施方案中，所述纳米粒子包含下式的有效载荷配体：
这种配体可通过使用具有丙二酸盐的连接体的纳米粒子组装、接着Pt(II)物质的后续络合来合成。
在某些情况下，所述有效载荷配体可选自由以下组成的组：
在一些实施方案中，所述纳米粒子包含下式的有效载荷配体：
这种配体可通过组装具有含ω-丙-2-烯酰胺基团的连接体的纳米粒子，接着实现与具有末端叠氮化物部分的生物活性衍生物的1,3-双极环加成来合成。说明一般“点击化学”反应方案的实例的概述在下文示出：
在一些情况下，所述纳米粒子进一步包含可检测试剂或可检测标记。所述纳米粒子可包含其它有效载荷配体，所述其它有效载荷配体包含可检测试剂或可检测标记。具体说来，所述可检测标记可为荧光标记或光声染料。
例如，所述可检测试剂可为染料，例如近红外染料，如若丹明染料(例如，若丹明B、磺酰若丹明B)或Cy5.5。例如，所述染料可为光声染料，如Cy7、Cy7.5、Cy8或
所述其它有效载荷配体可包含如上文所述的连接体(第一和第二连接体)。例如，所述其它有效载荷配体可包含式-(OCH2CH2)m-(CH2)n-的连接体，其中m＝1至10且n＝1至15。具体说来，m可在范围3至7中，和/或n可在范围5至12中。
在一些情况下，所述纳米粒子包含包括下式的可检测试剂的有效载荷配体：
在一些情况下，所述至少一种稀释配体包含单糖。在一些情况下，所述稀释配体包含具有至少一个六元环的碳水化合物。具体说来，所述单糖可为葡萄糖或半乳糖。
在某些情况下，所述至少一种稀释配体可经由第三连接体共价结合于核心。例如，所述第三连接体可包含2至10个原子的链长。所述第三连接体可与所述第一或所述第二连接体相同或不同。在一些情况下，所述第三连接体包含-(CH2)n-，其中n在范围1至10中，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些情况下，所述第三连接体经由末端硫原子结合于核心。
在一些情况下，经由所述第三连接体共价连接至核心的至少一种稀释配体具有式1、2、3、4或5的结构：
其中所述第三连接体经由末端硫醇基结合于核心。
在根据本发明的这一方面和其它方面的一些情况下，所述多种配体包含：
(i)含乳糖配体或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽；
(ii)含多柔比星配体或美登素类DM4配体；和
(iii)包含半乳糖或葡萄糖的单糖配体。
在根据本发明的这一方面和其它方面的一些情况下，所述配体以用数字表示的以下比例存在于所述纳米粒子上：
(i)所述肝靶向配体：1-99％
(ii)所述有效载荷配体：1-99％
(iii)所述稀释配体：1-99％
(iv)所述第一连接体：0-99％
(v)所述第二连接体：0-99％。
在一些情况下，所述第一连接体(用于所述肝靶向配体的附接)可在无肝靶向部分的情况下存在。例如，在其中所述肝靶向部分通过与存在于所述纳米粒子上的第一连接体反应而附接的情况下(例如在所述肝靶向部分包含抗体片段的情况下，其可为优选的)，所述反应可未使可获得的第一连接体完全饱和，从而使一些第一连接体在所述纳米粒子上“未反应”。
或者或另外，如果存在第二连接体，那么所述第二连接体(用于所述有效载荷的附接)可在不具有附接的有效载荷的情况下存在。例如，在其中所述有效载荷化合物通过与存在于所述纳米粒子上的第二连接体反应而附接的情况下(参见例如以下多柔比星)，所述反应可未使可获得的第二连接体完全饱和，从而使一些第二连接体在所述纳米粒子上“未反应”。在某些情况下，所述有效载荷未使所有可获得的第二连接体附接位点饱和可以是有利的。例如，本发明人已经发现在每个纳米粒子核心处多柔比星分子的多柔比星高负载水平(例如，超过20、超过15或超过9)下，水溶性减小。此外，未反应的第二连接体(例如，本文中进一步描述的胺连接体)本身可向所述纳米粒子赋予有利的特性，如改进的水溶性。
关于某些应用，可需要具有大量和/或高比例的肝靶向配体，例如在范围40％-90％或50％-80％或60％至70％中，其中百分率表示以所述纳米粒子上的所有配体的数目计的百分率。在一些情况下，可需要具有少量和/或低比例的肝靶向配体，例如在范围1％-40％或5％-30％或10％至20％中，其中百分率表示以所述纳米粒子上的所有配体的数目计的百分率。在一些情况下，每个纳米粒子的肝靶向配体(例如，如本文中进一步定义的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽)的数目可为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在特定情况下，较多的肝靶向配体(例如，如本文中进一步定义的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽)可增强本发明的纳米粒子的肝靶向程度，例如每个纳米粒子3个或更多个、4个或更多个或5个或更多个。在特定情况下，较少的肝靶向配体(例如，如本文中进一步定义的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽)仍然可对本发明的纳米粒子赋予充分的肝靶向，例如每个纳米粒子1或2个。
关于某些应用，可需要具有大量和/或高比例的有效载荷配体，例如在范围40％-90％或50％-80％或60％至70％中，其中百分率表示以所述纳米粒子上的所有配体的数目计的百分率。在例如溶解度允许的情况下，具有大量或高比例的有效载荷会允许递送较高浓度的有效载荷。在一些情况下，可需要具有少量和/或低比例的有效载荷配体，例如在范围1％-40％或5％-30％或10％至20％中，其中百分率表示以所述纳米粒子上的所有配体的数目计的百分率。在例如稳定性或溶解度限制有争议的情况下或在所述有效载荷的效能使得较低浓度安全并且有效的情况下，较低的百分率可为有利的。
关于某些应用，可需要具有大量和/或高比例的稀释配体，例如在范围40％-90％或50％-80％或60％至70％中，其中百分率表示以所述纳米粒子上的所有配体的数目计的百分率。在一些情况下，可需要具有少量和/或低比例的稀释配体，例如在范围1％-40％或5％-30％或10％至20％中，其中百分率表示以所述纳米粒子上的所有配体的数目计的百分率。
在第二方面，本发明提供一种纳米粒子，其包含：
包含金属和/或半导体的核心；和
多种共价连接至所述核心的配体，其中所述配体包含：
(i)式(I)的至少一种配体：
其中所述末端硫醇的硫原子键结至所述核心；和
(ii)至少一种包含生物活性剂的有效载荷配体；和
(iii)任选地，至少一种稀释配体。
根据本发明的第二方面，所述有效载荷配体可如关于本发明的第一方面所定义。
在其中存在所述至少一种稀释配体的根据本发明的第二方面的情况下，所述稀释配体可如关于本发明的第一方面所定义。
根据本发明的第一、第二和其它方面，所述核心在一些情况下可包含选自由以下组成的组的金属：Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd和Zn，或其任何组合。具体说来，所述核心可包含金。
在一些情况下，所述核心的直径可在范围1nm至5nm中。
在一些情况下，所述纳米粒子(包括其配体)的直径在范围3nm至50nm中。
在一些情况下，所述纳米粒子可包含每个纳米粒子核心至少5、10、20个或至少50个配体。
在第三方面，本发明提供一种药物组合物，其包含多种根据本发明的第一或第二方面的纳米粒子和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
在一些情况下，所述药物组合物可为持续释放制剂，其中所述多种纳米粒子中的至少一部分被封装于生物相容性聚合物中。具体说来，所述生物相容性聚合物可包含聚(D,L-丙交酯)和/或聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)。
在一些情况下，所述药物组合物可呈微粒、微球、珠粒或膜形式的形式。
在一些情况下，所述药物组合物可呈可注射形式，例如储槽注射剂。
在一些情况下，所述药物组合物可呈浓缩形式，由此所述组合物可在施用于受试者之前(例如，之前即刻)进行稀释或复原。
在第四方面，本发明提供根据本发明的第一或第二方面的纳米粒子或根据本发明的第三方面的药物组合物，其用于医学。
在第五方面，本发明提供根据本发明的第一或第二方面的纳米粒子或根据本发明的第三方面的药物组合物，其用于治疗哺乳动物受试者中的肝病症。
根据本发明，所述受试者可为人类、伴侣动物(例如，狗或猫)、实验室动物(例如，小鼠、大鼠、兔、猪或非人类灵长类动物)、家畜或农村动物(例如，猪、牛、马或绵羊)。优选地，所述受试者为人类。
在一些情况下，所述肝病症包含原发性肝癌或继发性肝癌(即，已经侵袭肝的非肝起源的转移性癌症)。
在一些情况下，所述肝病症为肝细胞癌(HCC)。
在一些情况下，所述肝病症为选自以下的癌症：肝母细胞瘤、胆管癌、胆管细胞囊腺癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、胚胎性肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。
在第六方面，本发明提供一种治疗哺乳动物受试者中的肝病症的方法，所述方法包括向需要疗法的受试者施用根据本发明的第一或第二方面的纳米粒子或根据本发明的第三方面的药物组合物。所述肝病症可如关于本发明的第五方面所定义。
在第七方面，本发明提供根据本发明的第一或第二方面的纳米粒子或根据本发明的第三方面的药物组合物的用途，其用于制备用于根据本发明的第六方面的方法的药剂。
在第八方面，本发明提供一种制造物件，其包括：
根据本发明的第一或第二方面的纳米粒子或根据本发明的第三方面的药物组合物；
用于容纳所述纳米粒子或药物组合物的容器；和
插页或标签。
在一些方面，所述插页和/或标签提供关于所述纳米粒子或药物组合物用于治疗哺乳动物受试者中的肝病症的用途的说明书、剂量和/或施用信息。所述肝病症可如关于本发明的第五方面所定义。
在第九方面，本发明提供一种用于产生根据本发明的第一方面的纳米粒子的方法，所述方法包括：
组合：
包含含硫肝靶向配体和/或第一连接体的溶液；
包含含硫第二连接体的溶液；
包含碳水化合物-连接体-硫醇或碳水化合物-连接体-S-S-连接体-碳水化合物的溶液；
包含形成核心的金属盐的溶液；和
还原剂，
由此使所述纳米粒子自组装，和
使至少一种有效载荷化合物与所述第二连接体反应，由此使所述至少一种有效载荷化合物经由所述第二连接体共价连接至所述纳米粒子；
和任选地使至少一种肝靶向化合物与所述第一连接体反应，从而使所述至少一种肝靶向化合物经由所述第一连接体共价连接至所述纳米粒子。
合适地，所述溶液包含含硫肝靶向配体，例如所述溶液可包含式(I)的配体：
在一些情况下，所述有效载荷包含多柔比星或美登素类DM4。
在一些情况下，所述碳水化合物包含葡萄糖或半乳糖。
在一些情况下，所述形成核心的金属盐包含金盐。
在一些情况下，所述还原剂包含硼氢化钠。
所述第一和/或第二连接体可官能化以促进所述有效载荷的偶合。例如，末端ω-氨基官能性可针对酰胺键形成使用已知的肽偶合试剂(如EDC)来起动。所述有效载荷可经由中间连接体偶合至所述第二连接体。所述中间连接体可首先偶合至所述生物活性剂/可检测试剂，并且接着偶合至所述第二连接体，或所述第二连接体可用与所述生物活性剂/可检测试剂偶合的中间连接体官能化。例如，以铂为中心的生物活性部分可使用酰胺偶合技术首先偶合至琥珀酸盐部分并且接着偶合至所述第二连接体。例如，多柔比星可偶合至琥珀酸盐-第二连接体部分。
在一些情况下，所述方法包括如下步骤：使至少一种可检测化合物与所述第一连接体或所述第二连接体反应，从而使所述至少一种肝靶向化合物经由所述第一或所述第二连接体共价连接至所述纳米粒子。
在第十方面，本发明提供根据本发明的第一或第二方面的纳米粒子或根据本发明的第三方面的药物组合物，其用于使肝肿瘤成像的方法，其中所述至少一种有效载荷配体包含可检测试剂。具体说来，所述可检测试剂可为荧光试剂。在一些情况下，所述成像方法是在手术切除期间描绘肿瘤边缘的方法。
在第十一方面，本发明提供一种使肝肿瘤成像的方法，所述方法包括
向具有或疑似具有肝肿瘤的受试者施用根据本发明的第一或第二方面的纳米粒子或根据本发明的第三方面的药物组合物，其中所述至少一种有效载荷包含可检测试剂；和
检测所述可检测试剂，由此对所述肝肿瘤的全部或一部分定界限或形成图像。在一些情况下，所述可检测试剂可为荧光试剂。在一些情况下，所述方法是用于在手术切除期间描绘肿瘤边缘。
本发明包括所述方面的组合和所述的优选特征，除非其中此类组合清楚地为不可允许的或被陈述为明确地加以避免。本发明的这些和其它方面和实施方案在下文中更详细并且参考随附实施例和图式加以描述。
附图简述
图1示出了针对常规化学治疗剂和肝靶向纳米粒子的生物分布的示意性和简化描绘。
图2示出了用碳水化合物(稀释)配体、含靶向剂(R1)配体和含化学治疗剂(R2)配体官能化的金纳米粒子的示意性描绘。重复的乙二醇和烷基分别由下标x和y指示。
图3示出了不具有有效载荷的LacLL-NP(a)和具有Pt-琥珀酸盐有效载荷的相应Pt-LacLL-NP(b)的示意性描绘。
图4示出了在KCN蚀刻后，图3的纳米粒子的1H NMR光谱。(a)示出了在KCN蚀刻后，LacLL-NP1的光谱。报告信号：LacLL＝4.09ppm，AL＝2.81ppm，GlcC2＝3.27ppm；(b)示出了在KCN蚀刻后，Pt-LacLL-NP3的光谱。报告信号：Pt(IV)-suc＝2.47ppm，LacLL＝4.08ppm，AL＝2.79ppm，GlcC2＝3.26ppm。
图5示出了针对LacLL-NP1的TEM图像和资料。
图6示出了针对若丹明结合的GNP在身体中的多种器官中的积聚的ICP-MS结果。从左至右，x轴读出：脑、心脏、肾脏、肝、肺、胰腺、脾、肿瘤、膀胱和肠。MBLB-0126-012是对照物，MBLB-126-078是LacLL-NP2，MBLB-135-042是LacLL-NP1，MBLB-126-082是LacSL-NP1，并且MBLB-126-084是LacSL-NP2。
图7示出了在用(a)Pt-LacLL-NP、(b)游离Pt、(c)Doxo-LacLL-NP和(d)游离多柔比星治疗后72h的MTT细胞活力分析结果。
图8示出了如在20x放大率下每个场的计数所测量的GNP体外靶向HCC细胞的情况。左侧图示出了由阴性对照物展现的计数的缺乏。中间图和条纹示出了针对具有半乳糖-C2配体和HSPEG8COOH配体的冠的GNP的计数。右侧图和条纹示出了针对具有半乳糖-C2配体和HSPEG8COOH配体的冠的GNP的计数，其中一定比例的HSPEG8COOH配体已经经由其N端(每个纳米粒子大约4个肽分子)结合有磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽RLNVGGTYFLTTRQ(SEQ IDNO:1)。显而易见的是，与缺乏所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽的GNP相比，具有所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽的GNP展现显著增加的靶向HCC细胞(大约7倍增加的靶向)。
图9示出了在所指示的浓度下的72小时处理后，多种GNP构建体和游离美登素类DM4对HEPG2细胞的细胞活力的影响。在MTT分析中以百分率对照测量的细胞活力针对以μg/ml计的(在存在时，DM4的)浓度作图(注意x轴的log刻度)。具有半乳糖-C2和HSPEG8COOH配体(40:60比率)的冠的GNP以正方形示出。这种缺乏DM4的GNP在所测试的条件下基本上不展现毒性。具有半乳糖-C2、HSPEG8COOH和DM4配体的冠的GNP以圆形示出。所述剂量-毒性曲线与以菱形示出的游离DM4的剂量-毒性曲线非常相似。具有半乳糖-C2、HSPEG8COOH和DM4配体的冠的GNP以三角形示出，其中一定比例的HSPEG8COOH配体结合至所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽RLNVGGTYFLTTRQ(SEQ ID NO:1)的N端—每个纳米粒子大约<1个肽。这些负载DM4和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽的GNP的剂量-毒性曲线与以菱形示出的游离DM4的剂量-毒性曲线非常相似。
发明详述
在描述本发明时，将使用以下术语，并且所述术语意图如下文所指示加以定义。
肝靶向配体
所述肝靶向配体与存在于肝细胞处、中或上(在一些情况下健康肝细胞，在其它情况下仅仅或主要是肝肿瘤(例如肝细胞癌)的癌细胞，在其它情况下存在于肝肿瘤的健康肝细胞和癌细胞处、中或上)的受体、标记物、蛋白质或抗原结合、偶合或相互作用。在结合或以其他方式被吸引至肝(或其肿瘤)时，所述肝靶向配体辅助本发明的纳米粒子靶向预期作用的位点。所述肝靶向配体共价连接至纳米粒子核心(直接地或更常见经由连接体)并且因此用于使纳米粒子(包括其有效载荷)以与所述肝靶向配体不存在时所述纳米粒子的情况相比较大频率、持续较长持续时间和/或以较高浓度与肝(或其肿瘤)缔合或以其它方式接触。
肝靶向配体的实例包括：乳糖、FGF-4(成纤维细胞生长因子4)、c-Met(肝细胞生长因子受体)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合剂(例如，如US8388937(其中特定地包括SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7和10的肽，其明确地以引用的方式并入本文中)所公开的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽，或抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体)、α-胎蛋白(AFP)受体结合剂(例如，如US2012/0270238所公开的AFP受体结合肽或抗AFP受体抗体)和ASGPR结合剂(例如半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、乳糖、葡萄糖、甘露糖，或糖模拟配体，如Mamidyala等人,J.Am.Chem.Soc.,2012,第1334卷,第4期,第1978-1981页所公开)。所述肝靶向配体也可为抗体或其结合片段，例如Fab片段(抗原结合片段)、单一结构域抗体/针对如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、ASGPR、FGF-4、c-Met、AFP或其它肝表达蛋白或肝表达受体等肝或肝细胞标靶的纳米抗体。
无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)被认为是用于使携带有效载荷的纳米粒子靶向肝的合适标靶。ASGPR识别半乳糖残基并且在肝中而不在其它人类组织中表达。靶向剂(如乳糖)和化学治疗剂组合附接至超小型糖涂布的金纳米粒子(1.6-1.8nm)会提供用于HCC的治疗的独特特性。在身体中施用并且循环后，经过靶向的Au-NP在肝和过度表达HCC的ASPGR中积聚(图1，“靶向”)，而常规化学治疗剂广发分布(图1，“非靶向”)。此外，小Au-NP(<2nm)与较大NP(约15nm)相比显示增加的肿瘤渗透潜力并且提供有益的表面覆盖度(Huang,K.等人,ACS Nano,2012,第6卷,第4483-4493页；Kumara,C.等人,ACS Nano,2014,第8卷,第6431-6439页)。图2示出了此类官能化金纳米粒子的示意图。
配体冠由于在血浆中稳定并且在细胞溶质中释放的Au-硫键而在生理学条件下展现亚稳定性。此处，我们提出了经过靶向的GNP化学治疗剂筛选研究的有希望的结果，所述研究利用了针对有效肝靶向的体外、离体和体内模型。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽包括RLNVGGTYFLTTRQ(SEQ ID NO:1)、YFLTTRQ(SEQID NO:2)和其变体，所述变体与所述序列的不同之处在于不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸的添加、缺失、取代或化学修饰(例如，非天然或经过修饰的氨基酸)。所述变体可例如包含一个、两个或三个非天然或经过修饰的氨基酸。合适的非天然氨基酸包括例如D-氨基酸、鸟氨酸、二氨基丁酸鸟氨酸、正亮氨酸鸟氨酸、吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸、苯基甘氨酸、α和α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、天然氨基酸的卤化物衍生物(如三氟酪氨酸、对Cl-苯基丙氨酸、对Br-苯基丙氨酸、对I-苯基丙氨酸)、L-烯丙基-甘氨酸、b-丙氨酸、L-a-氨基丁酸、L-g-氨基丁酸、L-a-氨基异丁酸、L-e-氨基己酸、7-氨基庚酸、L甲硫氨酸砜、L-正亮氨酸、L-正缬氨酸、对硝基-L-苯基丙氨酸、L-羟基脯氨酸、L-硫杂脯氨酸、苯基丙氨酸的甲基衍生物—如1-甲基-Phe、五甲基-Phe、L-Phe(4-氨基)、L-Tyr(甲基)、L-Phe(4-异丙基)、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)、L-二氨基丙酸和L-Phe(4-苯甲基)。所述肽可进一步经过修饰。例如，一个或多个酰胺键可由酯或烷基骨架键置换。可存在N或C烷基取代基、侧链修饰或限制(如二硫桥、侧链酰胺或酯键联)。所述变体肽可包括经过修饰的肽和合成肽类似物。肽可例如经过修饰以改进溶解度、配制和存储特性，或通过并入非肽结构来保护不稳定肽。
本文中特定地涵盖，如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽等肽的N端和/或C端可通过N端乙酰化和/或C端酰胺化进行修饰。具体说来，所述末端修饰可辅助所述肝靶向肽共价附接至所述纳米粒子(例如，经由连接体)。
纳米粒子
如本文所用，“纳米粒子”是指具有纳米规模的粒子，并且不意图涵盖任何特定形状限制。具体说来，“纳米粒子”涵盖纳米球、纳米管、纳米盒、纳米簇、纳米棒等。在某些实施方案中，本文中所涵盖的纳米粒子和/或纳米粒子核心具有一般多面体或球形几何形状。对纳米粒子或纳米粒子核心的“直径”的提及一般分别意指纳米粒子或纳米粒子核心的最长尺寸。关于具有大体上多面体或球形几何形状的纳米粒子，横贯所述粒子的最短尺寸将典型地在横贯所述粒子的最长尺寸的50％内并且可例如在25％或10％内。
包含多种含碳水化合物配体的纳米粒子已经描述于例如WO 2002/032404、WO2004/108165、WO 2005/116226、WO 2006/037979、WO 2007/015105、WO 2007/122388、WO2005/091704中(其中每一者的完整内容明确地以引用的方式并入本文中)并且所述纳米粒子可根据本发明加以使用。
如本文所用，“冠(corona)”是指层或涂层，其可部分地或完全地覆盖纳米粒子核心的暴露表面。所述冠包括多个共价附接至纳米粒子的核心的配体。因此，所述冠可被视为围绕或部分地围绕金属核心的有机层。在某些实施方案中，所述冠提供和/或参与纳米粒子的核心的钝化。因此，在某些情况下，所述冠可包括充分完整的涂层，其大体上使核心稳定化。在某些情况下，所述冠促进本发明的纳米粒子的溶解度，如水溶解度。
纳米粒子为可用作用于固定配体的衬底的小粒子，例如金属或半导体原子的簇。
优选地，所述纳米粒子具有平均直径在0.5与50nm之间、更优选地在0.5与10nm之间、更优选地在0.5与5nm之间、更优选地在0.5与3nm之间且更优选地在0.5与2.5nm之间的核心。当除了所述核心之外还考虑配体时，优选地所述粒子的总体平均直径在2.0与50nm之间，更优选地在3与10nm之间并且最优选地在4与5nm之间。所述平均直径可使用本领域中众所周知的技术，如透射电子显微术来测量。
核心材料可为金属或半导体并且可由超过一种类型的原子形成。优选地，核心材料为选自Au、Fe或Cu的金属。纳米粒子核心也可由包括Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd的合金形成，并且可用于本发明。优选的核心材料为Au和Fe，其中最优选的材料为Au。所述纳米粒子的核心优选地包含约100个与500个之间的原子(例如，金原子)以提供在纳米范围内的核心直径。其它特别适用的核心材料掺杂有一种或多种具有NMR活性的原子，从而允许体外和体内使用NMR检测所述纳米粒子。NMR活性原子的实例包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和镧系元素+3，或量子点。
包含半导体化合物的纳米粒子核心可加以检测，因为纳米规模的半导体晶体能够充当量子点，也就是说其可吸光，由此激发所述材料中的电子至较高能级，随后以所述材料所特有的频率释放光的光子。半导体核心材料的实例为硒化镉、硫化镉、碲化镉。还包括锌化合物，如硫化锌。
在一些实施方案中，所述纳米粒子或其配体包含可检测标记。所述标记可为所述纳米粒子的核心或所述配体的元素。所述标记可由于所述纳米粒子的那种元素的固有特性或通过与另一可检测的部分连接、结合或缔合而可检测。标记的优选实例包括作为荧光基团、放射性核素、磁性标记或染料的标记。荧光基团包括荧光素、若丹明或四甲基若丹明、德克萨斯红、Cy3、Cy5等，并且可通过所述荧光标记的激发和使用拉曼散射光谱法检测发射的光来检测(Y.C.Cao,R.Jin,C.A.Mirkin,Science 2002,297:1536-1539)。
在一些实施方案中，所述纳米粒子可包含放射性核素，其用于使用由所述放射性核素发射的放射能，例如通过使用PET、SPECT来检测纳米粒子，或用于疗法，即用于杀死标靶细胞。可容易地经调适用于本发明的通常用于本领域中的放射性核素的实例包括99mTc，其以多种氧化态存在，不过最稳定的是TcO4-；32P或33P；57Co；59Fe；67Cu，其通常用作Cu2+盐；67Ga，其通常用作Ga3+盐，例如柠檬酸镓；68Ge；82Sr；99Mo；103Pd；111In，其通常用作In3+盐；125I或131I，其通常用作碘化钠；137Cs；153Gd；153Sm；158Au；186Re；201Tl，通常用作Tl+盐，如氯化铊；39Y3+；71Lu3+；和24Cr2+。如标记和示踪剂等放射性核素的一般用途是本领域中众所周知的并且可容易地由熟练人员调适用于本发明的多个方面。所述放射性核素可最容易通过掺杂纳米粒子的核心或以作为固定于纳米粒子上的配体的一部分存在的标记形式包括在内来使用。
活性剂
如本文所用，术语“生物活性剂(biologically active agent)”或“生物活性剂(bioactive agent)”意图涵盖对生物系统发挥效应、优选地治疗效应的药物和前药。本文所涵盖的活性剂的类别包括小分子有机化合物、肽、多肽和核酸。治疗剂的示范性类别为抗癌剂(如细胞毒性化合物)、抗增生剂或抗血管生成剂。特定实例包括化学治疗剂，例如多柔比星、替莫唑胺、伊立替康、卡莫司汀、铂(IV)、铂(II)、喜树碱、多西紫杉醇、索拉非尼、美登素、美登素类(例如美登素类DM1或美登素类DM4)、一甲基澳瑞他汀E(MMAE)和组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂(例如帕比司他)。
在某些情况下，所述至少一种有效载荷配体是选自：
可检测试剂
可检测试剂包括荧光标记和光声染料。两者的实例为本领域中已知的。不受限制，荧光染料的实例包括若丹明染料(如若丹明B和磺酰若丹明B)和Cy5.5。不受限制，光声染料的实例包括Cy7、Cy7.5、Cy8或
施用和治疗
本发明的纳米粒子和组合物可通过多种不同途径，包括肠或肠胃外途径施用于患者。肠胃外施用包括通过以下途径施用：静脉内、经皮或皮下、经鼻、肌肉内、眼内、经上皮、腹膜内和经表面(包括皮肤、眼、直肠、鼻、吸入和气雾剂)，和直肠全身性途径。
施用例如通过注射、包括储槽注射来执行。
本发明的纳米粒子可配制为可呈固体或液体组合物形式的药物组合物。所述组合物一般将包含某一种类的载体，例如固体载体或液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液，或二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。所述组合物和制剂一般地含有至少0.1wt％的所述化合物。
关于静脉内、经皮或皮下注射，或在患病位点处注射，活性成分将呈肠胃外可接受的水溶液或液体形式，其无热原质并且具有合适的pH、等张性和稳定性。相关领域的技术人员能够充分地使用例如所述化合物或其衍生物例如在生理盐水中的溶液、用甘油、液体聚乙二醇或油制备的分散液制备合适的溶液。
除了一种或多种任选地与其它活性成分组合的所述化合物以外，所述组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂、等张剂、防腐剂或抗氧化剂或本领域技术人员众所周知的其它材料中的一者或多者。所述材料应为无毒的并且应不干扰所述活性成分的功效。所述载体或其它材料的精确性质可取决于施用途径，例如静脉内注射。
优选地，所述药物组合物以预防有效量或治疗有效量(看情况，不过预防可被视为疗法)给予个体，这一量足以显示对所述个体的益处。典型地，这一量将引起治疗上适用的活性，从而对所述个体提供益处。所施用的化合物的实际量和施用速率和时程将取决于正在治疗的病况的性质和严重程度。治疗的处方(例如，对剂量等的决定)在一般从业人员和其他医生的职责内，并且典型地考虑到待治疗的病症、个别患者的病况、递送位点、施用方法和从业人员已知的其它因素。上文提及的技术和方案的实例可发现于Handbook ofPharmaceutical Additives,第2版(M.Ash和I.Ash编),2001(Synapse InformationResources,Inc.,Endicott,New York,USA)；Remington’s Pharmaceutical Sciences,第20版,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins；和Handbook of PharmaceuticalExcipients,第2版,1994中。举例说明，并且所述组合物优选地以在每kg体重约0.01与100mg活性化合物之间并且更优选地在约0.5与10mg/kg体重之间的剂量施用于患者。本发明的纳米粒子的肝靶向的一个益处在于与以游离药物形式例如通过全身性施用来施用时同一活性剂的有效剂量相比，所述活性“有效载荷”的治疗有效剂量可较低。
下文举例提供并且不应解释为对权利要求书的范围的限制。
实施例
合成示范性配体和连接体
乳糖长连接体配体
还被称作Lac-O-EG6-C11-SH和LacLL，这种配体+连接体部分具有IUPAC名称(ω-11-硫代十一烷基)-六乙二醇基β-D-乳糖苷。其可根据A.G.Barrientos,J.M.de laFuente,T.C.Rojas,A.Fernandez,S.Penades,Chem.Eur.J.2003,9,1909–1921合成。
葡萄糖短连接体(稀释配体)
还被称作Glc-C2-SH、GlcSL、GlcC2，这种配体具有IUPAC名称硫代乙基β-D-吡喃葡糖苷。其可根据Midatech专利WO 2006/037979A2和R.Ojeda,J.L.de Paz,A.G.Barrientos,M.Martin-Lomas,S.Penades,Carbohydr.Res.2007,342,448–459合成。
氨基连接体
通常被称作氨基连接体，这种连接体也缩写为AL和NH2-EG6-SH。其IUPAC名称为α-氨基-ω-硫代六乙二醇。其可如下合成并且从六乙二醇分离为相应的二硫化物：
描述了以下代表性程序。
六乙二醇(90.0g，318.8mmol)溶解于二氯甲烷(1l)中并且添加三甲胺(177mL,1275mmol)和DMAP(1.94g，15.9mmol)。所述混合物冷却至4℃并且经30分钟逐份添加甲苯磺酰氯(181.8g，956.3mmol)。在约5℃下10分钟后，使所述反应温至室温并且搅拌持续3小时，接着倒入乙二胺于二氯甲烷中的溶液(23.0ml 344.4mmol于630mL中)中。洗涤有机层(HCl，630ml，5％；NaHCO3，5％；盐水，各630mL)，经Na2SO4干燥并且在真空中浓缩以生成217.69g产物，所述产物无需进一步纯化即使用。
这一产物溶解于二甲基甲酰胺(1.4l)中并且添加叠氮化钠(24.9g，382.5mmol)。所述反应在氩气下在室温下搅拌持续18h，接着倒入盐水(1300ml)中并且用乙酸乙酯(2x630ml)萃取。干燥萃取物(Na2SO4)，在真空中浓缩并且纯化(色谱法，SiO2，15→40％丙酮/己烷)以提供62.67g(42％)对甲苯磺酰叠氮。
这种对甲苯磺酰叠氮溶解于丙酮(630ml)中并且添加硫代乙酸钾(20.2g，176.5g)。19h后，反应混合物倒入盐水(1.2l)中并且用乙酸乙酯(3x 600ml)萃取。干燥萃取物(Na2SO4)，浓缩并且纯化(色谱法，SiO2，0→4％甲醇/二氯甲烷)以提供46.1g硫代乙酰叠氮(93％)。
这种硫代乙酰叠氮溶解于甲醇(1.1l)中并且逐份添加甲醇钠(68.1g，1261.5mmol)。所述反应搅拌(在空气中敞开)持续5天，接着用水(700ml)稀释并且用二氯甲烷(2x 700ml)萃取。干燥萃取物(Na2SO4)，浓缩并且纯化(色谱法，SiO2，40％丙酮/己烷)以提供22.3g二硫化物(55％)。
这种二硫化物溶解于四氢呋喃(225ml)中并且添加水(70ml)和三苯膦(18.6g，71.0mmol)。反应混合物在室温下在氩气下搅拌持续16h，接着用水(50ml)稀释并且用乙酸乙酯(3x 100ml)洗涤。所得水溶液在真空中浓缩以提供11.3g氨基连接体。
实施例1-合成肝靶向乳糖长连接体金纳米粒子
下文描述负载有肝靶向分子、附接连接体和连接至金表面的碳水化合物稀释剂的金纳米粒子的制备和表征。
使用配体LacLL、AL和GlcC2。六乙二醇基十一烷基乳糖糖苷被选择为肝靶向部分，而较短的C2葡糖苷用作稀释剂部分。关于化学治疗性有效载荷或其它治疗或诊断分子(如药物、荧光染料和放射性示踪剂)的附接，使用氨基官能化的六乙二醇。偶合至金核心经由金硫键实现。
合成具有不同比率的肝靶向分子LacLL的金纳米粒子：LacLL-NP1(LacLL:AL:GlcC2-9:50:41)和LacLL-NP2(LacLL:AL:GlcC2-27:50:23)。
关于所述纳米粒子的制备，配体LacLL、AL和GlcC2以所需比例溶解于甲醇中并且添加至HAuCl4于水中的溶液中。所述金盐在硫醇/二硫化物存在下还原为具有配体冠的金(0)簇。在通过重复的离心机过滤来纯化并且最终稀释至所需体积后，获得呈水溶液形式的纳米粒子(图3A)。所述纳米粒子上的配体比率通过1H NMR确认。因此，在溶剂交换为D2O后，用氘化水中的0.3m KCN和0.1m KOH处理所述纳米粒子溶液的等分试样。在金核心的蚀刻后，采集游离配体的光谱并且通过报告信号整合来确定配体比率，指示了原始比率在反应后在纳米粒子上维持于误差范围内(图4A)。使用透射电子显微术(TEM)确定的这些构建体的平均直径关于LacLL-NP1和LacLL-NP2为2.06nm和1.98nm(图5示出了LacLL-NP1的TEM)。
实验部分
LAcLL、AL和GlcC2根据参考文献合成。HAuCl4、NaBH4、KCN、KOH和甲醇购自Sigma-Aldrich。所有试剂均无需进一步纯化即使用。MilliQ水(18.2mΩ)获自Simplicity水纯化系统(Merck Millipore)。所述纳米粒子通过1H NMR(在KCN/KOH蚀刻后)、DLS、TEM和ζ电位表征。所述纳米粒子溶液的金浓度通过ICP-MS或MPAES确定。
关于NMR样品制备，浓缩所述纳米粒子的1mL溶液并且通过离心机过滤(Amicon，10kDa，4mL)来洗涤(3x 2mL D2O)。残留NP溶液(约200μL)在50℃下用0.3m KCN/0.1m KOH于D2O(约400μL)中的溶液孵育持续30分钟。所述混合物短暂地离心并且上清液转移至NMR管。在Bruker AVANCE III 500NMR光谱仪上记录1H NMR光谱。化学位移针对相应的溶剂(D2O＝4.79ppm)进行校准。
a)LacLL-NP1(LacLL:AL:GlcC2-9:50:41)
LacLL(0.0410mmol；32.5mg；1.41mL)、GlcC2(0.185mmol；44.5mg；1.58mL)和AL(0.228mmol；67.7mg；2.40mL)的甲醇溶液添加至100mL圆底烧瓶中并且用甲醇(32.4mL)稀释以获得0.012M浓度的配体溶液。接着添加HAuCl4(60.0mg；0.152mmol；1eq.)于水(6.09mL)中的溶液。反应混合物在涡旋搅拌下用NaBH4(126mg；3.34mmol；22eq.)于水(3.33mL)中的溶液还原。所得黑色纳米粒子溶液在室温下在轨道振荡器上振荡持续35分钟。所述纳米粒子随时间沉淀。在完成溶液中的反应后，剩余纳米粒子通过离心(在4500rpm下1min)短暂离心并且沉淀物再溶解于4mL MilliQ水中。所述水性NP悬浮液转移至先前经过洗涤的AMICON过滤器(4mL，10kDa)中。在浓缩后，所述纳米粒子通过离心机过滤用MilliQ水(3-4mL)洗涤四次。最后，所述纳米粒子收集于6mL最终体积的MilliQ水中。所述纳米粒子通过1H NMR(在KCN/KOH蚀刻后)、DLS、TEM和ζ电位表征。所述纳米粒子溶液的金浓度通过ICP-MS确定。
TEM：平均直径2.06nm。
b)LacLL-NP2(LacLL:AL:GlcC2–27:50:23)
LacLL(0.0870mmol；69.8mg；3.55mL)、GlcC2(0.0710mmol；17.0mg；1.67mL)和AL(0.159mmol；47.2mg；1.96mL)的甲醇溶液添加至100mL圆底烧瓶中并且用甲醇(19.3mL)稀释以获得0.012M浓度的配体溶液。接着添加HAuCl4(40.0mg；0.102mmol；1eq)于水(4.24mL)中的溶液。反应混合物在涡旋搅拌下用NaBH4(84.8mg；2.24mmol；22eq)于水(2.33mL)中的溶液还原。所得黑色纳米粒子溶液在室温下在轨道振荡器上振荡持续35分钟。所述纳米粒子随时间沉淀。在完成溶液中的反应后，剩余纳米粒子通过离心(在4500rpm下1min)短暂离心并且沉淀物再溶解于4mL MilliQ水中。所述水性NP悬浮液转移至先前经过洗涤的AMICON过滤器(4mL，10kDa)中。在浓缩后，所述纳米粒子通过离心机过滤用MilliQ水(3-4mL)洗涤四次。最后，所述纳米粒子收集于4mL最终体积的MilliQ水中。
所述纳米粒子通过1H NMR(在KCN/KOH蚀刻后)、DLS、TEM和ζ电位表征。所述纳米粒子溶液的金浓度通过ICP-MS确定。
TEM：平均直径1.98nm。
实施例2-用不同的有效载荷使肝靶向乳糖长连接体金纳米粒子官能化
下文描述配备有化学治疗剂和荧光染料的肝靶向金纳米粒子的附接连接体官能化和表征。
关于肝靶向纳米粒子的官能化，选择两种抗肿瘤剂作为化学治疗剂：铂-(IV)-琥珀酸盐(Pt(IV)-suc)和多柔比星。两种化学治疗剂均经由EDC*HCl/NHS促进的酰胺结合形成偶合至附接连接体。在Pt(IV)-suc的情况下，所述反应在DMSO中执行，因为所述化合物不溶于水性系统中。因此，所述纳米粒子溶液经由冻干或离心机浓缩和后续稀释交换为DMSO。接着，EDC*HCl/NHS预活化的琥珀酸盐与所述纳米粒子反应过夜。最后洗涤以去除剩余的试剂提供了具有基于铂的化学治疗性有效载荷的肝靶向金纳米粒子的水溶液(图3B)。Pt/Au比率通过MPAES确定为1/15。所述药物共价附接至所述纳米粒子由蚀刻后的最终构建体的1H NMR显示(图4B)。具有2.81ppm化学位移的氨基亚甲基的原始信号实际上消失，而琥珀酸亚乙基在2.47ppm下的新多重峰可在光谱中观察到。报告基因信号的积分未改变，指示了在纳米粒子操纵期间的冠稳定性。
关于多柔比星偶合，应用反向附接策略。首先，氨基官能通过LacLL-NP与琥珀酸酐的反应转化为羧酸部分。所述羧酸接着在DMSO中与EDC*HCl/NHS反应。在溶剂交换后，预活化的纳米粒子溶液在HEPES缓冲液中用多柔比星溶液孵育。在通过离心机过滤来纯化并且最终稀释于MES缓冲液中之后，获得具有多柔比星有效载荷的肝靶向纳米粒子。通过比色分析确定金和多柔比星浓度。
荧光染料磺酰若丹明B酰基氯用作诊断模拟物。通过用所述肝靶向金纳米粒子上的附接连接体的氨基官能对磺酰若丹明B酰基氯的磺酰氯部分进行磺酰胺附接来实现偶合。所述反应在碳酸盐缓冲液中在pH 9.3下执行以获得经过标记的粒子。
所述三个实验示出了肝靶向金纳米粒子的官能化的化学灵活性。
实验部分
磺酰若丹明B酰基氯、EDC*HCl、NHS和DMSO购自Sigma-Aldrich。Pt(IV)-琥珀酸盐购自Charnwood Molecular。多柔比星购自LC Labs。所有试剂均无需进一步纯化即使用。MilliQ水(18.2mΩ)获自Simplicity水纯化系统(Merck Millipore)。所述纳米粒子通过1HNMR(在KCN/KOH蚀刻后)、DLS、TEM和ζ电位表征。所述纳米粒子溶液的金浓度通过ICP-MS或MPAES确定。
关于NMR样品制备，浓缩所述纳米粒子的1mL溶液并且通过离心机过滤(Amicon，10kDa，4mL)来洗涤(3x 2mL D2O)。残留NP溶液(约200μL)在50℃下用0.3m KCN/0.1m KOH于D2O(约400μL)中的溶液孵育持续30分钟。所述混合物短暂地离心并且上清液转移至NMR管。在Bruker AVANCE III 500NMR光谱仪上记录1H NMR光谱。化学位移针对相应的溶剂(D2O＝4.79ppm)进行校准。
a)Pt-LacLL-NP3
5mL LacLL-NP1纳米粒子水溶液(低浓度的靶向配体)(21.4μmol反应性AL)通过在Amicon过滤器(4mL，10kDa)中离心(在4500rpm下2x 15分钟)而浓缩并且用DMSO稀释至2.5mL的体积。在添加至Pt(IV)-琥珀酸盐(22.9mg，52.9μmol)于DMSO(528μL，0.1m)中的溶液中之前，使EDC*HCL(12.2mg，63.4μmol)于DMSO(127μL，0.5m)中的溶液和含NHS(7.29mg，63.4μmol)的DMSO(63.4μL，1.0m)混合并且在室温下孵育持续15分钟。在30分钟的预活化之后，反应混合物添加至所述纳米粒子溶液中并且所述混合物在室温下在轨道振荡器上振荡过夜。反应溶液用25mL MilliQ水稀释并且浓缩并且用MilliQ水重复地洗涤。黑色残留物收集于5.00mL MilliQ水中。所述纳米粒子通过1H NMR(在KCN/KOH蚀刻后)、DLS、TEM和ζ电位表征。所述纳米粒子溶液的金和铂浓度通过ICP-MS确定。[Au]，MPAES：2.84mg/mL；[Pt]，MPAES：0.19mg/mL。
b)Doxo-LacLL-NP4
LacLL-NP上的氨基官能的琥珀酸化：8.0mL LacLL-NP1纳米粒子水溶液(低浓度的靶向配体)(33.8μmol反应性AL)通过在Amicon过滤器(15mL，10kDa)中离心(在4500rpm下15分钟)而浓缩并且用DMSO稀释至8.0mL的体积。琥珀酸酐(16.9mg，169μmol)溶解于DMSO(564μL)中以获得0.5m溶液并且添加至所述纳米粒子溶液中。反应混合物在室温下在轨道振荡器上振荡过夜。反应溶液用25mL MilliQ水稀释并且浓缩并且用MilliQ水重复地洗涤。黑色残留物收集于5.00mL MilliQ水中。所述纳米粒子通过1H NMR(在KCN/KOH蚀刻后)、DLS、TEM和ζ电位表征。所述纳米粒子溶液的金和铂浓度通过ICP-MS确定。
多柔比星附接至LacLL-NP的琥珀酸化附接连接体：3.0mL LacLL-NP纳米粒子水溶液(10.0μmol反应性琥珀酸化AL)通过在Amicon过滤器(4mL，10kDa)中离心(在4500rpm下15分钟)而浓缩并且用DMSO稀释至3.0mL的体积。EDC*HCl(4.82mg，25.1μmol)和(5.75mg，50.0μmol)于DMSO(416μL)中的溶液孵育持续15分钟，添加至所述纳米粒子溶液中并且所述混合物在室温下在轨道振荡器上振荡持续2小时。所述纳米粒子溶液用水(80mL)稀释，通过离心过滤，用HEPES缓冲液(pH 7.8，25.0mL)稀释并且立即添加多柔比星的溶液(2.50mL，2.00mg/mL于HEPES 20mM中)。所述偶合反应在室温下孵育持续1小时。与DOX偶合的纳米粒子通过离心机过滤(Amicon，15mL，10kDa)用MilliQ水纯化。残留溶液收集于MES缓冲液(3.0mL)中。所述纳米粒子通过1H NMR(在KCN/KOH蚀刻后)、DLS、TEM和ζ电位表征。所述纳米粒子溶液的金浓度通过ICP-MS确定。[Au]，比色：1.05mg/mL；[Doxo]，比色：0.66mg/mL。
c)sRhoB-LacLL-NP5
3mL LacLL-NP1纳米粒子水溶液(0.609μmol纳米粒子)(低浓度的靶向配体)通过离心机过滤(AMICON，4mL，10kDa)而浓缩并且用Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.3)洗涤一次。残留溶液溶解于1.5mL所述缓冲液中。向所述NP溶液中添加磺酰若丹明B酰基氯于DMF(133μL，9.14μmol，5.27mg)中的溶液并且混合物在室温下在轨道振荡器上振荡过夜，屏蔽日光。所述反应混合物转移至先前经过洗涤的AMICON过滤器(4mL，10kDa)中。对纳米粒子溶液进行离心并且用Na2CO3/NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 9.3)重复地洗涤三次并且用Milli-Q水重复地洗涤直至滤液看起来无色。最后，所述纳米粒子收集于3mL Milli-Q水中。所述纳米粒子通过1H NMR(在KCN/KOH蚀刻后)、DLS、TEM和ζ电位表征。所述纳米粒子溶液的金浓度通过ICP-MS确定。
实施例3-体内证明的纳米粒子的肝靶向
乳糖长连接体金纳米粒子的肝靶向特性可能通过在体内生物分布研究中比较不同的纳米粒子构建体而示出。具有高和低含量的所述肝靶向分子的两种乳糖长连接体纳米粒子(LacLL-NP1(低)+LAcLL-NP2(高))、两种相似的乳糖短连接体纳米粒子(LacSL-NP1(低)+LacSL-NP2(高))(所述乳糖连接至C2连接体)和非靶向性纳米粒子(Glc-NP)分别地静脉内注射至小鼠。
90分钟循环时间之后，将所述动物处死，收集主要器官并且通过ICP-MS进行分析以确定所述器官中的金浓度。这些资料的作图提供了关于不同构建体的生物分布图(图6)。如所预期，肝靶向构建体主要发现于肝中，而非靶向性纳米粒子积聚于肾脏中。观察到所述肝靶向分子的连接体长度会影响金纳米粒子的肝摄取。关于短连接体形式，总体发现的金量的42-46％存在于肝中。相比之下，关于长连接体构建体，几乎所有金均在肝中检测到(高达91％)。
这一实验证明了使用肝靶向性乳糖长连接体金纳米粒子，合适的有效载荷可针对肝高度有效。
实验部分
细胞系和转染
肝癌细胞系HepG2细胞在37℃、95％空气和5％CO2下在10-cm皮氏培养皿(BD)中在补充有10％FCS(Gibco)的DMEM(Sigma Aldrich)中生长，用PBS 1X(Sigma Aldrich)洗涤并且在用胰蛋白酶EDTA 0.05％(Gibco)处理时传代。活细胞在锥虫蓝排除分析中在血球计中计数。使用支原体属的所有成员所共有的引物的集合针对支原体定期地测试HepG2细胞(Choppa等人,1998)。细胞以2-3 104个细胞/cm2的密度接种于6孔板中并且随后用1:3和1:5摩尔比率的pEGFP-Luc载体(Clontech)和PEI25(Sigma-Aldrich)转染。在转染时，通过添加800μg/μL G418至培养基中持续四十八小时来选择细胞。随后，细胞维持于新鲜培养基中并且生长直至汇合。为了分析体外生物发光信号，借助于Mithras多模式板式读取器通过添加D-荧光素酶至CCLR缓冲液中的细胞溶解产物中来执行简单荧光素酶分析(25mM Tris·HClpH 7.8、2mM DTT、2mM EGTA、10％甘油、1％Triton X-100)。
动物圈养
七十只雌性BALB/c裸小鼠(6周龄)购自授权商(Janvier Labs)。所有小鼠均在特定无病原体条件下在室温下以12小时光/暗循环圈养于层流柜中并且随意地用压缩饲料和水喂养。USC的实验动物委员会批准了所述动物研究；因而，所有动物实验均满足动物福利准则。
异种移植物和体内近红外荧光成像
对数生长期的HepG2细胞(105个细胞于0.1ml PBS中)皮下注射至无胸腺裸小鼠(n＝6只每个实验组)的左侧腹中以建立携带肿瘤的小鼠的模型。通过肉眼检查定期地检查肿瘤植入并且最终通过在IVIS Spectrum(Caliper LifeSciences)中登记生物发光信号来确认。施用D-荧光素(150mg/kg)以便用荧光NP对肿瘤细胞中的生物发光共定位。携带肿瘤的小鼠被分成5个组(包括对照组)，每组六只小鼠。肿瘤体积通过下式计算：[(长度2x宽度)/2](Soengas等人,1999)。一旦肿瘤达到400mm3的体积，i.v施用纳米粒子。
使用IVIS Spectrum(Caliper LifeSciences)采集体内荧光成像以在注射后0min、45min和90min检测若丹明结合的GNP。小鼠在图像采集期间使用异氟烷进行麻醉，并且在荧光/生物发光图像采集时安乐死(在注射后90min)并且收集其器官(脑、肺、心脏、肝、脾、胰腺、肠子、膀胱和肾脏)和肿瘤用于后续ICP-MS分析。
ICP-MS结果
实施例4-携带化学治疗性有效载荷的肝靶向乳糖长连接体金纳米粒子的体外细胞毒性
在MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑)细胞活力分析中与游离药物相比较来测试具有化学治疗剂Pt(IV)-琥珀酸盐(Pt-LacLL-NP+铂)和多柔比星(Doxo-LacLL-NP+多柔比星)有效载荷的肝靶向乳糖长连接体金纳米粒子的细胞毒性(图7)。人类肝细胞癌细胞系HepG2用于所述分析中。
在基于铂的抗肿瘤剂Pt(IV)-琥珀酸盐的情况下，证明了Pt-LacLL-NP比游离药物更有效。关于所述纳米粒子，观察到12.8μM的IC50值，而关于游离药物，可能发现38.6μM的值。关于多柔比星，所述游离化合物与具有有效载荷的纳米粒子相比显示了略微较高的细胞毒性。所述药物附接至所述纳米粒子维持了化学治疗活性并且允许使用肝靶向乳糖长连接体金纳米粒子作为药物递送系统。
MTT分析结果
化合物 IC50(μM)
Pt-LacLL-NP 12.78
铂 38.61
Doxo-LacLL-NP 0.24
多柔比星 0.06
实验部分
96孔微量滴定板中的细胞接种
HepG2细胞在T-75烧瓶中生长。关于所述细胞的转移，从所述烧瓶中取出培养基并且使细胞胰蛋白酶化持续5分钟。所述细胞收集于Falcon管中并且用完全细胞培养基稀释。在Neubauer室中进行细胞计数。制备细胞溶液以每孔(每孔200μL)接种4000个细胞。所述微量滴定板在37℃下孵育持续24h。
经过接种的HepG2细胞的处理
关于各NP和药物，制备细胞培养基中的制剂。所述化合物以不同浓度(基于药物量为0.01、0.05、0.2、1、5、25和125μM)加以测试。关于所述处理，从所有孔中取出细胞培养基并且换成药物制剂。每一式三份200μl处理剂添加至各孔中。所述微量滴定板在37℃下孵育持续24h、48h和72h。
处理后24h、48h和72h的MTT测量
1.5mL MTT溶液(8.0mg于1.6mL DMSO中)用完全细胞培养基(无酚红)稀释。从所述微量滴定板取出处理细胞培养基，各孔用100μLPBS洗涤并且100μL所述MTT反应性溶液添加至各孔中。在37℃下一小时孵育后，取出所述MTT溶液并且添加100μL DMSO以溶解甲臜染料。在570nm下测量吸光度。
统计学分析和IC50计算
使用OriginPro8分析数据。对标准化的数据作图并且使用非线性回归曲线拟合对曲线进行拟合(具有可变斜率的S型剂量-反应曲线)。通过内插法获得绝对IC50值。
实施例5-经过靶向的GNP的选择和体外HCC靶向
体外筛选数种基础/肽靶向的GNP。根据类似于上文在实施例1和2中所述的方法的方法，然而半乳糖-C2-SH置换葡萄糖-C2-SH并且HSPEG8COOH(还缩写为SH-EG8-COOH或SH-(OCH2CH2)8-COOH)置换氨基连接体NH-2-EG6-SH来合成具有包含半乳糖-C2-SH(Gal-C2)配体和HSPEG8COOH的混合冠的GNP。
发现在Gal-C2:HSPEG8COOH下的Au GNP展现较低的非特异性结合(正常:肿瘤细胞)和良好的体内血浆循环。因此，针对HCC靶向研究使用磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽选择Gal-C2和HSPEG8COOH的冠。
描述于US8,388,937B2(其内容明确地以引用的方式并入本文中)中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3肽(参见其SEQ ID NO:1，其具有氨基酸序列：RLNVGGTYFLTTRQ(SEQ ID NO:1))经由所述肽的N端连接至一定比例的HSPEG8COOH配体的末端COOH基。在“高负载的”GNP构建体(参见下表中的第1行)中，每个纳米粒子核心连接大约4个肽。发现“高负载的”在Gal-C2:HSPEG8COOH:HSPEG8CONHRLNVGGTYFLTTRQ下的Au GNP相对于缺乏RLNVGGTYFLTTRQ肽的基础GNP展现大约7倍靶向(参见图8和下表中的第一行)。“低负载的”在Gal-C2:HSPEG8COOH:HSPEG8CONHRLNVGGTYFLTTRQ下的Au GNP(参见下表中的第3行)相对于缺乏RLNVGGTYFLTTRQ肽的基础GNP展现大约4.6倍靶向。
已经进行了进一步调查，其中评估所连接的RLNVGGTYFLTTRQ肽的取向和/或封端。具体说来，RLNVGGTYFLTTRQ(经由N端附接至PEG8COOH，游离末端—上文所述)和RLNVGGTYFLTTRQ-NH2(经由N端附接至PEG8COOH，伯酰胺末端置换标准C端)。
已经调查的其它构建体包含呈大约50:50比率的半乳糖-C2-SH和氨基连接体(还称作“AL”或NH2-EG6-SH)的混合冠。所述RLNVGGTYFLTTRQ肽经由所述肽的C端或通过使用所述肽的酰基-N端形式并且使所述肽的酰基-N端附接至所述氨基连接体而附接至所述氨基连接体。使用两种方法：(1)所述肽经由C端附接至GNP-AL(产生阳性粒子)；或(2)所述肽在第一步骤中附接至AL-SH并且SH-EG6-NHCO-RLNVGGTYFLTTRQ用作纳米粒子合成中的配体，产生阴性粒子。所得粒子可表示为：在GalC2:AL:AL-(Ac)-RLNVGGTYFLTTRQ下的Au。
描述于US8,388,937B2(其内容明确地以引用的方式并入本文中)中的其它磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽(参见其SEQ ID NO:10，其具有氨基酸序列：YFLTTRQ(SEQ ID NO:2))如下连接至GNP配体。具有呈大约50:50比率的半乳糖-C2-SH和氨基连接体(NH2-EG6-SH)的混合冠的GNP具有YFLTTRQ肽，所述YFLTTRQ肽经由YFLTTRQ肽的酰基N端连接至所述氨基连接体以生成可由下式表示的GNP：在GalC2:AL:AL-(Ac)-YFLTTRQ下的Au。本文所产生或涵盖的其它GNP包括：在GalC2:HSPEG8CONH-YFLTTRQ下的Au(经由N端附接至PEG8COOH，游离COOH末端)和在GalC2:HSPEG8CONH-YFLTTRQ-NH2下的Au(经由N端附接至PEG8COOH，伯酰胺末端)。如由上表的第2行可见，在GalC2:AL:AL-(Ac)-YFLTTRQ下的Au GNP与缺乏所述YFLTTRQ肽的基础纳米粒子相比展现大约5倍靶向HCC细胞。因此，这些结果示出了磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽促进HCC靶向并且较高的肽负载(即，每个纳米粒子更多的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽)进一步增加HCC靶向。
实施例6-GLY-3靶向的GalC2GNP在DM4有效载荷下示出了HEPG2细胞毒性
合成以下GNP构建体以便分析其针对HepG2(肝细胞癌)细胞的肿瘤细胞杀死能力：
具有半乳糖-C2和HSPEG8COOH配体(40:60比率)的冠的GNP，其可由在GalC2:HSPEG8COOH下的Au表示。
具有半乳糖-C2、HSPEG8COOH和美登素类DM4配体的冠的GNP，其可由在GalC2:HSPEG8COOH:DM4下的Au表示。
具有半乳糖-C2、HSPEG8COOH和美登素类DM4配体的冠的GNP，其中一定比例的HSPEG8COOH配体结合至所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽RLNVGGTYFLTTRQ(SEQ ID NO:1)的N端，每个纳米粒子大约<1个肽。所述GNP可如下表示：在GalC2:DM4:HSPEG8COOH:HSPEG8CONHRLNVGGTYFLTTRQ下的Au。
游离美登素类DM4还在HepG2细胞毒性实验中用作阳性对照物。
图9示出了在72小时处理后，多种GNP构建体和游离美登素类DM4对HEPG2细胞的细胞活力的影响。在MTT分析中以百分率对照测量的细胞活力针对浓度作图。所述缺乏DM4的GNP在所测试的条件下基本上不展现毒性。具有DM4的GNP展现与游离DM4的剂量-毒性曲线非常相似的剂量-毒性曲线。联合由具有作为肝靶向剂的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽的GNP证明的HCC靶向(参见实施例5)，这些结果指示了预期具有稀释配体、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽和如美登素类DM4等化学治疗剂的混合冠的GNP证明所选择的肝癌细胞杀死，同时最小化脱靶效应(即，最小化针对健康细胞的毒性)。
-oOo-
本文中所引用的所有参考文献均以引用的方式并且出于所有目的整体并入，其并入程度就如同各个别公布或专利或专利申请具体地并且个别地被指示以引用的方式整体并入一般。
本文所述的具体实施方案经由举例而非经由限制来提供。本文中的任何子标题均仅出于便利性包括在内，并且不应被解释为以任何方式限制本公开。

Claims (57)

1.一种纳米粒子，其包含：
包含金属和/或半导体的核心；和
多种共价连接至所述核心的配体，其中所述配体包含：
(i)至少一种肝靶向配体；
(ii)至少一种包含生物活性剂的有效载荷配体；和
(iii)至少一种包含碳水化合物的稀释配体。
2.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中所述肝靶向配体是选自：
乳糖、半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺或其它无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合剂；
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合剂；
α-胎蛋白(AFP)受体结合剂；
FGF-4(成纤维细胞生长因子4)；
c-Met(肝细胞生长因子受体)；和
特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、ASGPR、FGF-4、c-Met或AFP的抗体或其结合片段。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的纳米粒子，其中所述肝靶向配体包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽或乳糖。
4.根据权利要求3所述的纳米粒子，其中所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽包含氨基酸序列RLNVGGTYFLTTRQ(SEQ ID NO:1)或YFLTTRQ(SEQ ID NO:2)的肽或由所述肽组成，或为其变体，与所述氨基酸序列的不同之处在于不超过3个氨基酸的缺失、添加、修饰或取代，其中所述变体保持所述SEQ ID NO 1或SEQ ID NO:2的肽与人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的结合亲和力的至少50％。
5.根据权利要求4所述的纳米粒子，其中所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3肽具有N端乙酰化和/或C端酰胺化。
6.根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其中所述肝靶向配体经由第一连接体共价连接至所述核心，所述第一连接体具有2至50个原子的链长。
7.根据权利要求6所述的纳米粒子，其中所述第一连接体包含基团-(CH2)n-和/或-(OCH2CH2)m-，其中n和m独立地≥1。
8.根据权利要求7所述的纳米粒子，其中所述第一连接体包含–(OCH2CH2)m-，并且其中m在1与10之间，任选地其中m为8。
9.根据权利要求8所述的纳米粒子，其中所述至少一种肝靶向配体和所述第一连接体选自由以下组成的组：
HS-(OCH2CH2)8-CONH-RLNVGGTYFLTTRQ；
HS-(OCH2CH2)8-CONH-RLNVGGTYFLTTRQ-NH2；
HS-(OCH2CH2)8-CONH-YFLTTRQ；
HS-(OCH2CH2)8-CONH-YFLTTRQ-NH2；
HS-(OCH2CH2)6-NH(Ac)-RLNVGGTYFLTTRQ；和
HS-(OCH2CH2)6-NH(Ac)-YFLTTRQ。
10.根据权利要求7所述的纳米粒子，其中所述第一连接体包含-(OCH2CH2)m-(CH2)n-，其中m＝1至10且n＝1至15。
11.根据权利要求10所述的纳米粒子，其中m＝3至7且n＝5至12。
12.根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其中所述第一连接体经由末端硫原子结合于所述核心。
13.根据权利要求7所述的纳米粒子，其中所述经由所述第一连接体共价连接至所述核心的肝靶向配体具有式(I)的结构：
其中所述第一连接体经由末端硫醇基结合于所述核心。
14.根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其中所述至少一种有效载荷配体包含治疗剂。
15.根据权利要求14所述的纳米粒子，其中所述治疗剂为化学治疗或细胞毒性化合物。
16.根据权利要求15所述的纳米粒子，其中所述有效载荷配体包含选自由以下组成的组的化合物：美登素类DM4、多柔比星、伊立替康、铂(II)、铂(IV)、替莫唑胺、卡莫司汀、喜树碱、多西紫杉醇、索拉非尼、美登素美登素、美登素类DM1、一甲基澳瑞他汀E(MMAE)和帕比司他。
17.根据权利要求16所述的纳米粒子，其中所述有效载荷配体包含美登素类DM4、MMAE或多柔比星。
18.根据权利要求15所述的纳米粒子，其中所述有效载荷配体是选自：
19.根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子进一步包含至少一种包含可检测标记的其它有效载荷配体。
20.根据权利要求19所述的纳米粒子，其中所述可检测标记包含荧光标记或光声染料。
21.根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其中所述至少一种稀释配体包含单糖。
22.根据权利要求21所述的纳米粒子，其中所述单糖为葡萄糖或半乳糖。
23.根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其中所述至少一种稀释配体经由第三连接体共价结合于所述核心。
24.根据权利要求23所述的纳米粒子，其中所述第三连接体具有2至10个原子的链长。
25.根据权利要求24所述的纳米粒子，其中所述第三连接体包含-(CH2)n-，其中n＝2至3。
26.根据权利要求25所述的纳米粒子，其中所述第三连接体经由末端硫原子结合于所述核心。
27.根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其中所述至少一种经由所述第三连接体共价连接至所述核心的稀释配体具有式1、2、3、4或5的结构：
其中所述第三连接体经由末端硫醇基结合于所述核心。
28.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中所述多种配体包含：
含乳糖配体或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合肽；
含多柔比星配体或美登素类DM4配体；和
包含半乳糖或葡萄糖的单糖配体。
29.根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其中所述配体以用数字表示的以下比率存在：
(i)所述肝靶向配体：1-30％；
(ii)所述有效载荷配体：10-70％；
(iii)所述稀释配体：10-70％；
(iv)所述第一连接体：0-10％；和
(v)所述第二连接体：0-70％，
其中所述百分率是以占所述纳米粒子的配体的总数的数目计，并且其中所述百分率的和为100。
30.根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其中所述核心包含选自由以下组成的组的金属：Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd、Zn或其任何组合。
31.根据权利要求30所述的纳米粒子，其中所述核心包含金。
32.根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其中所述核心的直径在范围1nm至5nm中。
33.根据前述权利要求中任一项所述的纳米粒子，其中所述纳米粒子(包括其配体)的直径在范围3nm至50nm中。
34.一种药物组合物，其包含多种如前述权利要求中任一项所述的纳米粒子和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述药物组合物为持续释放制剂并且其中所述多种纳米粒子中的至少一部分被封装于生物相容性聚合物中。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述持续释放制剂呈微粒、微球、珠粒或膜形式。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物呈可注射形式。
38.根据权利要求1至33中任一项所述的纳米粒子或根据权利要求34至37中任一项所述的药物组合物，其用于医学。
39.根据权利要求1至33中任一项所述的纳米粒子或根据权利要求34至37中任一项所述的药物组合物，其用于治疗哺乳动物受试者中的肝病症。
40.根据权利要求39所述的供使用的纳米粒子或组合物，其中所述肝病症包含原发性或继发性肝癌。
41.根据权利要求40所述的供使用的纳米粒子或组合物，其中所述癌症为肝细胞癌(HCC)。
42.根据权利要求40所述的供使用的纳米粒子或组合物，其中所述癌症是选自：肝母细胞瘤、胆管癌、胆管细胞囊腺癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、胚胎性肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。
43.一种治疗哺乳动物受试者中的肝病症的方法，所述方法包括向所述需要疗法的受试者施用根据权利要求1至33中任一项所述的纳米粒子或根据权利要求34至37中任一项所述的药物组合物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述肝病症包含原发性或继发性肝癌。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述癌症为肝细胞癌(HCC)。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述癌症是选自：肝母细胞瘤、胆管癌、胆管细胞囊腺癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、胚胎性肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。
47.根据权利要求1至33中任一项所述的纳米粒子或根据权利要求34至37中任一项所述的药物组合物的用途，其用于制备用于根据权利要求43至46中任一项所述的方法的药剂。
48.一种制造物件，其包括：
根据权利要求1至33中任一项所述的纳米粒子或根据权利要求34至37中任一项所述的药物组合物；
用于容纳所述纳米粒子或药物组合物的容器；和
插页或标签。
49.根据权利要求48所述的制造物件，其中所述插页和/或标签提供关于所述纳米粒子或药物组合物用于治疗哺乳动物受试者中的肝病症的用途的说明书、剂量和/或施用信息。
50.一种用于产生如权利要求1至33中任一项所述的纳米粒子的方法，所述方法包括：
组合：
包含含硫肝靶向配体和/或第一连接体的溶液；
包含含硫第二连接体的溶液；
包含碳水化合物-连接体-硫醇或碳水化合物-连接体-S-S-连接体-碳水化合物的溶液；
包含形成核心的金属盐的溶液；和
还原剂，
由此使所述纳米粒子自组装，和
使至少一种有效载荷化合物与所述第二连接体反应，由此使所述至少一种有效载荷化合物经由所述第二连接体共价连接至所述纳米粒子；
和任选地使至少一种肝靶向化合物与所述第一连接体反应，从而使所述至少一种肝靶向化合物经由所述第一连接体共价连接至所述纳米粒子。
51.根据权利要求50所述的方法，其中：
(i)所述有效载荷包含多柔比星、美登素类DM4或MMAE；
(ii)所述碳水化合物包含葡萄糖或半乳糖；
(iii)所述形成核心的金属盐包含金盐；和/或
(iv)所述还原剂包含硼氢化钠。
52.根据权利要求1至33中任一项所述的纳米粒子或根据权利要求34至37中任一项所述的药物组合物，其用于使肝肿瘤成像的方法，其中所述至少一种有效载荷包含可检测试剂。
53.根据权利要求52所述的供使用的纳米粒子或组合物，其中所述可检测试剂为荧光试剂或光声染料。
54.根据权利要求52或权利要求53所述的供使用的纳米粒子或组合物，其中所述成像方法是在手术切除期间描绘肿瘤边缘的方法。
55.一种使肝肿瘤成像的方法，所述方法包括
向具有或疑似具有肝肿瘤的受试者施用根据权利要求1至33中任一项所述的纳米粒子或根据权利要求34至37中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种有效载荷包含可检测试剂；和
检测所述可检测试剂，由此形成所述肝肿瘤的全部或一部分的图像。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述可检测试剂为荧光试剂。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述方法是用于在手术切除期间描绘肿瘤边缘。
CN201680046764.1A 2015-07-24 2016-07-25 基于纳米粒子的肝靶向疗法和成像 Pending CN107921287A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1513103.0A GB2541166A (en) 2015-07-24 2015-07-24 Nanoparticle-based liver-targeting therapy and imaging
GB1513103.0 2015-07-24
PCT/EP2016/067682 WO2017017063A2 (en) 2015-07-24 2016-07-25 Nanoparticle-based liver-targeting therapy and imaging

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107921287A true CN107921287A (zh) 2018-04-17

Family

ID=54106588

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680046764.1A Pending CN107921287A (zh) 2015-07-24 2016-07-25 基于纳米粒子的肝靶向疗法和成像

Country Status (9)

Country Link
US (1) US11179474B1 (zh)
EP (1) EP3325099A2 (zh)
JP (1) JP6908605B2 (zh)
KR (1) KR20180031736A (zh)
CN (1) CN107921287A (zh)
AU (1) AU2016299336B2 (zh)
CA (1) CA2993278A1 (zh)
GB (1) GB2541166A (zh)
WO (1) WO2017017063A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115109119A (zh) * 2021-03-23 2022-09-27 南京微纳视界医疗科技有限公司 一种近红外荧光探针、制备方法及其应用
CN115109585A (zh) * 2021-03-23 2022-09-27 南京微纳视界医疗科技有限公司 一种近红外荧光探针的制备方法及近红外荧光探针

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017095924A1 (en) * 2015-11-30 2017-06-08 Georgetown University Liver-targeted prodrug compositions and methods of using the same
GB201701745D0 (en) 2017-02-02 2017-03-22 Midatech Ltd Nanoparticle-based liver-targeting therapy and imaging
GB201818977D0 (en) * 2018-11-21 2019-01-09 Univ Nottingham Islet cell engraftment
GB201819430D0 (en) * 2018-11-29 2019-01-16 Midatech Ltd Therapeutic compounds, nanoparticles and uses thereof
GB201820471D0 (en) * 2018-12-14 2019-01-30 Midatech Ltd Nanoparticle-based therapy of inflammatory disorders
GB201820470D0 (en) 2018-12-14 2019-01-30 Midatech Ltd Antifolate-carrying nanoparticles and their use in medicine
CN110898223B (zh) * 2019-12-13 2021-03-30 江南大学 一种基于糖基金属框架材料的肝靶向治疗药物及制备方法
EP4121118A4 (en) * 2020-03-15 2024-04-17 Nanocarry Therapeutics Ltd. NANO DELIVERY SYSTEM AND ITS THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC USE
TR202014545A2 (tr) * 2020-09-14 2022-03-21 Univ Yildiz Teknik Fotokimyasal yöntemle küçük boyutlu ve tekil dağılımlı altın nanoparçacıkların sentezi, kanser ilacı yüklemesi ve sitotoksik etkisinin saptanması.
AU2022312222A1 (en) * 2021-07-14 2024-01-25 Nanocarry Therapeutics Ltd. Brain permeable multifunctional system and uses thereof

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100034735A1 (en) * 2008-08-06 2010-02-11 Jie Chen Targeted nanoparticles for cancer diagnosis and treatment
US20100203612A1 (en) * 2009-02-12 2010-08-12 Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Specific peptide binding to glypican-3
WO2011156711A1 (en) * 2010-06-10 2011-12-15 Schobel Alexander M Nanoparticle film delivery systems
CN103002922A (zh) * 2010-06-10 2013-03-27 Mida科技有限公司 携带肽的纳米颗粒
WO2013176468A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Postech Academy-Industry Foundation Liver targeted drug delivery systems using metal nanoparticles and preparing method thereof
WO2014125256A1 (en) * 2013-02-12 2014-08-21 Midatech Limited Nanoparticle delivery compositions

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0025414D0 (en) 2000-10-16 2000-11-29 Consejo Superior Investigacion Nanoparticles
GB0313259D0 (en) 2003-06-09 2003-07-16 Consejo Superior Investigacion Magnetic nanoparticles
ES2242528B1 (es) 2004-03-25 2006-12-01 Consejo Sup. Investig. Cientificas Nanoparticulas magneticas de metales nobles.
EP1756289B1 (en) 2004-05-24 2015-01-14 Midatech Ltd. Nanoparticles comprising rna ligands
CA2582668C (en) 2004-10-01 2013-10-01 Midatech Ltd Nanoparticles comprising antigens and adjuvants, and immunogenic structures
CA2617869C (en) 2005-08-04 2017-02-14 Thomas William Rademacher Nanoparticles comprising antibacterial ligands
US20070087005A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Lazar Gregory A Anti-glypican-3 antibody
WO2007122388A2 (en) 2006-04-13 2007-11-01 Midatech Limited Nanoparticles containing three various ligands for providing immune responses against infectious agents
EP2305310A1 (en) * 2009-09-25 2011-04-06 Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Biomateriales - CIC biomaGUNE Gold -coated magnetic glyconanoparticles functionalised with proteins for use as diagnostic and therapeutic agents
WO2011048503A2 (en) 2009-10-22 2011-04-28 Moro Ricardo J Peptides that bind the alpha-fetoprotein (afp) receptor and uses thereof
BR112014005242B1 (pt) * 2011-09-07 2022-07-26 Midatech Limited Nanopartículas com peptídeos, composição, vacina, usos das mesmas para o tratamento de câncer ou de uma infecção por patógenos e métodos para gerar uma resposta de linfócitos t citotóxicos e para produzir as ditas nanopartículas
CN103784979B (zh) * 2014-01-17 2016-01-06 福州市传染病医院 用于肝癌光热治疗和核磁影像的antiGPC3-PB NPs及其制备和应用
GB201420080D0 (en) 2014-11-11 2014-12-24 Midatech Ltd And Q Chip Ltd Sustained release encapsulated nanoparticles
GB2548084A (en) 2016-02-26 2017-09-13 Midatech Ltd Nanoparticle production

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100034735A1 (en) * 2008-08-06 2010-02-11 Jie Chen Targeted nanoparticles for cancer diagnosis and treatment
US20100203612A1 (en) * 2009-02-12 2010-08-12 Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Specific peptide binding to glypican-3
WO2011156711A1 (en) * 2010-06-10 2011-12-15 Schobel Alexander M Nanoparticle film delivery systems
CN103002922A (zh) * 2010-06-10 2013-03-27 Mida科技有限公司 携带肽的纳米颗粒
WO2013176468A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Postech Academy-Industry Foundation Liver targeted drug delivery systems using metal nanoparticles and preparing method thereof
WO2014125256A1 (en) * 2013-02-12 2014-08-21 Midatech Limited Nanoparticle delivery compositions

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARNAB DE, ET AL.: "Synthesis of a smart nanovehicle for targeting liver", 《METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY》 *
CHRISTIAN K. ADOKOH，ET AL.: "Synthesis and Evaluation of Glycopolymeric Decorated Gold Nanoparticles Functionalized with Gold-Triphenyl Phosphine as AntiCancer Agents", 《BIOMACROMOLECULES》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115109119A (zh) * 2021-03-23 2022-09-27 南京微纳视界医疗科技有限公司 一种近红外荧光探针、制备方法及其应用
CN115109585A (zh) * 2021-03-23 2022-09-27 南京微纳视界医疗科技有限公司 一种近红外荧光探针的制备方法及近红外荧光探针

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017017063A3 (en) 2017-03-16
KR20180031736A (ko) 2018-03-28
JP2018526432A (ja) 2018-09-13
AU2016299336B2 (en) 2021-07-22
AU2016299336A1 (en) 2018-02-01
WO2017017063A2 (en) 2017-02-02
EP3325099A2 (en) 2018-05-30
JP6908605B2 (ja) 2021-07-28
GB2541166A (en) 2017-02-15
US11179474B1 (en) 2021-11-23
CA2993278A1 (en) 2017-02-02
GB201513103D0 (en) 2015-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107921287A (zh) 基于纳米粒子的肝靶向疗法和成像
JP6483780B2 (ja) リガンド−標的指向分子およびその方法
Feng et al. Dual-responsive carbon dots for tumor extracellular microenvironment triggered targeting and enhanced anticancer drug delivery
Ye et al. A novel lactoferrin-modified β-cyclodextrin nanocarrier for brain-targeting drug delivery
Anas et al. Clathrin-mediated endocytosis of quantum dot− peptide conjugates in living cells
Shi et al. VEGFR targeting leads to significantly enhanced tumor uptake of nanographene oxide in vivo
Shukla et al. Biodistribution and clearance of a filamentous plant virus in healthy and tumor-bearing mice
CN110167530A (zh) 基于纳米粒子的肝靶向治疗
Ding et al. Bioconjugated PLGA-4-arm-PEG branched polymeric nanoparticles as novel tumor targeting carriers
Zuber et al. Biocompatible gold nanoclusters: synthetic strategies and biomedical prospects
JP2013527157A (ja) プロドラッグ組成物、プロドラッグナノ粒子およびその使用方法
Shukla et al. To target or not to target: Active vs. passive tumor homing of filamentous nanoparticles based on potato virus X
Zhang et al. In vivo tumor active cancer targeting and CT-fluorescence dual-modal imaging with nanoprobe based on gold nanorods and InP/ZnS quantum dots
Denora et al. TSPO-targeted NIR-fluorescent ultra-small iron oxide nanoparticles for glioblastoma imaging
CN108339124A (zh) 一种双级脑靶向聚合物胶束递药系统的制备方法和应用
CN108164584A (zh) Vap多肽及其在制备靶向诊疗肿瘤药物中的应用
US10688125B2 (en) Nanoparticles and their use in cancer therapy
Wan et al. Robust Strategy for Antibody–Polymer–Drug Conjugation: Significance of Conjugating Orientation and Linker Charge on Targeting Ability
Silva et al. Image-guided nanodelivery of Pt (IV) prodrugs to GRP-receptor positive tumors
JP2011515330A (ja) 改良抗腫瘍治療剤
US11193111B2 (en) Viral nanoparticle multimers
Leopold et al. Surface-engineered nanomaterials: environmental and safety considerations in pharmaceutical and medicinal products
CN105339011A (zh) 纳米颗粒肽组合物
CN114404610B (zh) 透明质酸-香叶醇聚合物前药多生物响应的给药系统HSSG NPs及其制备方法和应用
ElSayed et al. Hybrid protein-inorganic nanoparticles for drug delivery in cancer therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180417