TARIFNAME FOTOKIMYASAL YÖNTEMLE KÜÇÜK BOYUTLU VE TEKIL DAGILIMLI ALTIN NANOPARÇACIKLARIN SENTEZI, KANSER ILACI YÜKLEMESI VE SITOTOKSIK ETKISININ SAPTANMASI Bulusun Ilgili Oldugu Teknik Aian Mevcut bulus, tibbi amaçla kullanima yönelik küçük boyutlu altin nanoparçaciklar ve bunlarin etken madde ile yüklü oldugu bir ilaç ile ilgilidir. Mevcut bulus ilaveten, küçük boyutlu altin nanoparçaciklar üretimini mümkün kilan bir kimyasal bilesik ve bunun kullanim yöntemine yöneliktir. Mevcut bulus ilaveten, bu tarife uyan nanoparçaciklarin ilaç yüklü hali ve bunun hazirlanmasina yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Teknigin Bilinen Durumu Doksorubisin (kisaca: DOKSO) son yillarda, kanser tedavisinde en çok kullanilan ve çalisan antitümör ilaçlardan biridir. Kanser hücreleri üzerindeki etkinligine ragmen, kardiyotoksisite ve kalp yetmezligi gibi yan etkilerinden dolayi kullanimi sinirlidir. Ek olarak, böbrek, pulmoner, hematolojik ve testis toksisitesi gibi bazi ciddi yan etkilere neden olabilecegi bilinmektedir. Bu yari etkilerden dolayi, sahip olduklari yüksek yüzey alani/hacim orani nedeniyle son yillarda nanoparçaciklar, ilaçlarin yüklenmesi, tümörlü dokulara tasinmasi ve salim yapmasi için kullanilmaya baslanmistir [N. S. Elbialy, M. M. Fathy, and W. M. Khalil, j.ijpharm.2015.05.032)]. Dolayisiyla, bir kanser ilaci olarak doksorubisin örneginde oldugu gibi, çesitli yan etkilere sahip ilaçlarin nanoparçaciklar üzerine yüklenmesi ile söz konusu yan etkilerin kismen ya da tamamen bertaraf edilmesi mümkündür. Buna ek olarak nanoparçacik sentezi için fotokimyasal yöntemi kullanmak; hizli ve çevreci olmasina ilaveten, enerji gereksiniminin düsük olusu ve basitlik gibi birçok avantaja sahip olmasindan dolayi gün geçtikçe ilgi çeken bir yöntem haline gelmektedir [S. Yakut et' al., ci-amino ketone by in-situ photochemical method," Phys. B Condens. Matter, vol. 542, pp. Literatürde özellikle kanser ilaçlarinin yan etkilerinin giderilmesi amaciyla altin nanopartüküllerin (kisaca: AuNp) kullanimina dair çok sayida çalisma mevcuttur. Bu tür çalismalarda genellikle basit indirgenme metodu kullanilarak AuNp'ler sentezlenmekte fakat AuNp'ler fonksiyonlandirilmadigi için istenen etki görülememektedir [R. K. Mohanty, S. Thennarasu, and A. B. Mandal, "Resveratrol stabilized gold nanoparticles enable surface loading of doxorubicin and anticancer activity," Calloids Surfaces B Bib/'nterfaces vol. 114, çalismalarda AuNp'ler sentezlendikten sonra çesitli biyouyumlu moleküllerle ya da polimerlerle fonksiyonlandirilarak ilaç yüklemesi gerçeklestirilmis ve AuNp'lere yüklenmis olan ilacin kanser hücreleri üzerinde daha etkili oldugu ve yan etkilerinin azaldigi bildirilmistir [J. Dennis Curry, Amanda Cameron, Bruce MacDonaId, Collins Nganou, Hope Scheller, James Marsh, Stefanie Beale, Mingsheng Lu, Zhi Shan, Rajandra Kaliaperumal, Heping Xu, and X. Servos, Craig Bennett, Stephanie MacQuarrie, Ken D. Oakes, f, Martin Mkandawire, and Xu Zhang, "Adsorption of Doxorubicin on Citrate-Capped Gold Nanoparticles: Insights into Engineering Potent Chemotherapeutic Delivery Systems," nanoparçaciklarin hazirlanabilmesi genellikle birden çok adim gerektirdigi için, zaman ve verim kaybina yol açmaktadir. Bulusun Amaçlari Bulusun temel amaci, teknigin bilinen durumunda sözü edilen sorunlara çözüm sunulmasidir. Bulusun bir diger amaci, etken maddesinin yan etkileri asgariye indirilmis bir kanser ilacinin sunulmasidir. Bulusun Kisa Açiklamasi Bu çalismada tiyokzanton türevi bir fotobaslatici ile fotokimyasal olarak küçük boyutlu ve hemen hemen monodispers olarak hazirlanan AuNp'Iere ilaç yüklenmesi ve salimi incelenmistir. Bu dogrultuda, (örnegm yukarida ani/an Cur/y i/d. 'nin 2015 yaymindak/ sonuç/ar ile k/yas/anab//ir/i'k aç/s/ndan) halihazirda kullanilan kanser ilaçlarindan biri olan DOKSO ilacinin AuNp'Ier üzerine belli miktarda yüklenmesi ve salimi incelenmis, örnek olarak seç/Yen söz konusu ilacin kanser hücreleri üzerindeki toksik etkisinin saptanmasi ve yari etkilerinin ortadan kaldirilmasi amaçlanmistir. Yapilan bu çalismada geçmis yillarda ilaç olarak kullanilmis olan ve kanser hücreleri Üzerinde de etkin oldugu bilinen tiyokzanton ana yapisina sahip, fakat henüz literatürde mevcut olmayan bir tiyokzanton türevi kullanilarak, tek adimda fotokimyasal metotla monodispers AuNp'Iar sentezlenmis ve sentez esnasinda kullanilan tiyokzanton türevinin AuNp'Ierin boyut ve dagiliminda stabilite sagladigi saptanmistir. Ayrica tiyokzanton yapisinin sagladigi avantajin etkisiyle klinikte kanser ilaci olarak kullanilan DOKSO'nun, Au etkinligini arttirdigi görülmektedir. Tüm bu etkilerin sonucunda kanser ilacindan kaynaklanan yan etkilerin azalmasi beklenmektedir. Sekillerin Kisa Açiklamasi Burada kisa açiklamasi sunulan sekiller, yalnizca mevcut bulusun daha iyi anlasilmasini saglamaya yöneliktir; dolayisiyla sekiller ile, hedeflenen koruma kapsami baglaminin, tarifname yoklugunda yorumlanmasi amaçlanmamaktadir. Sekil 1, mevcut bulusa göre sunulan [OH-TX-S-]2 bilesiginin çizimidir. Sekil 2, mevcut bulusa göre sunulan fotokimyasal indirgeme yöntemi ile altin nanopartiküllerinin (AuNp) olusumunun zamanla ilerleyisini gösteren grafiktir. Burada, 535 nm'deki (AuNp yüzey plazmon rezonans bandini gösteren) pikin en yassi oldugu egriden en sivri oldugu egriye dogru her bir egri sirasiyla, fotokimyasal indirgenme tepkimesindeki gelmektedir. Sekil 3, Sekil 2'deki 1100 saniye sonuna karsilik gelen egriden baslayarak, ilave edilen DOKSO çözeltisi miktari arttikça 535 nm'deki (AuNp yüzey plazmon rezonans bandini gösteren) pikin gitgide gözlenemez hale geldigini gösteren bir grafiktir. Söz konusu grafikteki egriler yukaridan asagiya dogru sirasiyla, ilave edilen DOKSO çözelti hacminin 5, gelmektedir. Sekil 4 (a), fotokimyasal indirgeme tepkimesi sonucunda elde edilen AuNp'lerin göründügü SEM görüntüleridir. En soldaki SEM görüntüsünde kadrajdaki AuNp'lerin ölçüleri alinmis olarak isaretlenmistir. Soldan saga dogru SEM görüntülerinin alt kisimlarinda örnek/referans gösterilen uzunluklar sirasiyla 500nm, 1 mikrometre ve 2 mikrometredir. Her bir SEM görüntüsü 15.0 kV gerilim ve 10.5 GTU ile elde edilmistir. Sekil 4(b), AuNp'Ierin kanser ilaci ile (burada: DOKSO) kaplanmis hallerinin göründügü SEM görüntüleridir. En soldaki SEM görüntüsünde kadrajdaki kaplanmis AuNp'Ierin ölçüleri ve 78,0 nm olarak isaretlenmistir. Soldan saga dogru SEM görüntülerinin alt kisimlarinda örnek/referans gösterilen uzunluklar sirasiyla 500nm, 1 mikrometre ve 2 mikrometredir. Her bir SEM görüntüsü 15.0 kV gerilim ve 10.5 GTU ile elde edilmistir. Sekil 5, sadece kanser ilacinin (DOKSO) ve (Örnek 2'ye göre hazirlanmis olan) AuNp'Ier üzerine kaplanmis kanser ilacinin (AuNp+DOKSO), kanser hücrelerinde (burada akut promiyelositik lösemi, HL-60) hücre canliligi üzerinde etkisini yüzde cinsinden zamana bagli olarak kiyaslayan bir grafiktir. Absis ekseni üzerindeki degerler, yapilan örnek çalismada kullanilan DOKSO çözeltisi miktarlarini mikrolitre cinsinden göstermektedir. Absis ekseninin Ordinat ekseniyle kesistigi baslangiç degeri, DOKSO çözeltisinin 5 mikrolitre hacimde ilave edildigi duruma karsilik gelmektedir. Burada en yüksek sitotoksik etkinin, DOKSO çözeltisinin 5 mikrolitre ilave edilmis oldugu haliyle üretilmis olan, DOKSO yüklü AuNp'Ierde elde edildigi görülmektedir. DOKSO çözeltisinin daha yüksek hacimlerde ilave edilmesiyle üretilen DOKSO yüklü AuNp'lerde ise, sitotoksik etkinin dikkate deger ölçüde degisiklik arzetmedigi gözlenmektedir. Serbest haldeki DOKSO'nun benzer ölçüde sitotoksik etki gösterebilmesi için yüksek miktarlarda kullanilmasi gerektigi anlasilmaktadir. Dolayisiyla mevcut bulusla sunulan etken madde (ya da ilaç, burada:: DOKSO) yüklü AuNp'Ierin, ilacin düsük miktarlarda kullanilmasi halinde bile yüksek sitotoksisite gösterdigi, böylelikle yan etkilerden etkin biçimde kaçinilmasini mümkün kildigi anlasilmaktadir. Mevcut bulusa göre sunulan DOKSO yüklü AuNp'Ierin HL-60 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisinin çok yüksek oldugu anlasilmaktadir. Sekil 6, sadece kanser ilacinin (DOKSO) ve (Örnek Z'ye göre hazirlanmis olan) AuNp'Ier üzerine kaplanmis kanser ilacinin (AuNp+DOKSO), kanser hücrelerinde (burada kronik miyeloid lösemi, K562) hücre canliligi üzerinde etkisini yüzde cinsinden zamana bagli olarak kiyaslayan bir grafiktir. Absis ekseni üzerindeki degerler, yapilan örnek çalismada kullanilan DOKSO çözeltisi miktarlarini mikrolitre cinsinden göstermektedir. Absis ekseninin 0rdinat ekseniyle kesistigi baslangiç degeri, DOKSO çözeltisinin 5 mikrolitre hacimde ilave edildigi duruma karsilik gelmektedir. Ilaç (burada: DOKSO) yüklü AuNp'Ierin sitotoksik etkisinin, yüklenmis olan ilaç miktariyla ciddi ölçüde degisiklik göstermedigi görülmektedir. Sekil 7, (Örnek 3'e göre hazirlanmis olan) farkli miktarlarda DOKSO yüklenmis AuNp'Ierle elde edilen ilaç salim hizlarinin kiyaslandigi bir grafiktir. Burada, DOKSO çözeltisinin 5 mikrolitre ilave edilmesi ile elde edilen DOKSO yüklü AuNp ile ulasilan ilaç salim hizinin, DOKSO çözeltisinin 25 mikrolitre ilave edilmesi ile elde edilen DOKSO yüklü AuNp ile ulasilan ilaç salim hizina kiyasla daha yüksek oldugu görülmektedir. Bulusun Ayrintili Açiklamasi Mevcut bulus kapsaminda, Formül (I)'e göre olan [OH-TX-S-]2 bilesigi ve bunun ilaç üretiminde kullanimiyla elde edilen ürünler ve ilgili üretim yöntemleri sunulmaktadir. Söz konusu bilesigin çizimi, Sekil 1'de gösterilmistir. Bu çalismada, son derece basit, hizli, çevreye duyarli ve etkin bir yöntem olan fotokimyasal indirgeme yöntemi kullanilarak boyut kararliligina sahip AuNp'Ierin hazirlanmasinda yeni bir tiyokzanton türevi olan, 3,3'-disülfandiilbis (1-hidroksi-9H-tiyokzanten-9-0n) ([OH-TX-S-]2) bilesigi kullanilmistir. Sentezlenen AuNp'Ierin boyutlari DLS yöntemiyle yaklasik 30 nm olarak ölçülmüstür ve model bir ilaç olarak seçilen ve etkili bir kanser ilaci olan DOKSO farkli miktarlarda bu AuNp'lere yüklenmistir. DOKSO yüklenmis AuNp'Ierin kanser hücreleri üzerindeki etkinliginin belirlenmesi amaciyla standart bir sitotoksisite testi olan M'I'I' testi kullanilarak incelenmistir. Bulus kapsaminda kullanilan tiyokzanton türevi olan [OH-TX-S-]2 bilesigi, Au tuzunun indirgenmesi suretiyle AuNp eldesinde kullanildiginda, bilinen diger tiyokzanton türevlerine kiyasla daha yüksek bir boyut kararliligi saglamakta, AuNp tanecik boyutlarinin kontrol edilebilirligini yükseltmektedir. Böylece, elde edilen AuNp'Ieri monodispers olarak kabul edilebilir kilmaktadir (kisaca PdI olarak anilan polidispersite indisini iyilestirmektedir). AuNp'nin 30 nm haricinde kalan, örn. 60 nm gibi daha büyük boyutlari da islev görecektir; ancak 30 nm gibi daha küçük boyutlu AuNp'ler kadar performans sergilemesi beklenemez. Zira AuNp'lerde tanecik boyutunun küçük olmasi yüzey alanini arttirdigi için, yükleme peiformansi ve salim hizi artmaktadir. AuNp'Ierin boyut kararligini saglamak ve HAuC|4 tuzunun fotoindirgenmesinde birincil göreve sahip fotoindirgeyici ajan olarak kullanilmak üzere [OH-TX-S-]2 bilesiginin sentezi asagida verildigi gibi gerçeklestirilebilir: - Tiyosalisilik asit (örn. 4x10'3 mol) üzerine H2504 (örn. ilave edilip balon içerisinde (örn. 5-10 dk süreyle) karistirildiktan sonra (örn. 10 mL) benzen içinde çözünen 3,3-dihidroksi fenil disülfit (örn. 1x10'3 mol) damla damla ilave edilmis ve (örn. 1 saat oda sicakliginda, ve ardindan örn. 12 saat de 80 °C'de) reflux edilmistir. - Daha sonra (reaksiyon karisimi, örn. oda sicakliginda ve örn. bir gece süre ile bekletildikten sonra) reaksiyon, (reaksiyon karisiminin, örn. yaklasik 200 mL sicak saf suya dökülmesi suretiyle) sonlandirilmistir. Suda çöken ürün süzülerek alinmis ve kati madde, vakum etüvünde kurutulmustur. - Kurutulmus olan kati madde, (örn. petrol eteri ile) yikandiktan sonra, (örn. kolon sisteminde, (örn. hacmen 2:1.5 oranindaki) etanol:etil asetat yürütücü faz esliginde) saflastirilmis, böylelikle saf [OH-TX-S-]2 elde edilmistir. Örnek 1'de saf halde elde edilen [OH-TX-S-]2 bilesigi, fotokimyasal metodla kararli AuNp'ler sentezlenmesi amaciyla kullanilmistir. Söz konusu bilesigin yapisindaki disülfitten, uygun dalgaboyunda lamba ile aydinlatildiginda (örn. 365 nm) tiyil radikalleri olusmaktadir. Olusan bu radikaller sayesinde Au+3 iyonlari indirgenerek ilk olarak AuÜelde edilir. Ardindan aydinlatmaya bagli olarak metalik altinin çekirdeklenme reaksiyonu baslatmasiyla, AuNp'ler olusmaya baslar. AuNP'lerin etrafi, altin-tiyol etkilesimi sonucunda [OH-TX-S-]2 ile sarilarak kararli AuNp'Ier elde edilir. Fotoindirgenme islemiyle AuNp sentezlemek için asagidaki adimlar sirasiyla uygulanabilir; HAuCl4, (bir yardimci çözücü içerisinde, örn. 10 mL DMSO içerisinde) çözündürülmüs, olacak sekilde) su ile seyreltilmistir (örn. hacimce 99:1 su:DMSO oranina ulasilacak sekilde). Böylelikle, çözelti halinde bir "birinci karisim" elde edilmistir. Bu adimdaki "su ile seyreltme" isleminin amaci, elde edilmesi hedeflenen ilaç yüklü AuNp'nin kanser hücreleri üzerindeki öldürücü etkisinin, [OH-TX-S-]2'yi ve altin tuzunu çözmekte kullanilan yardimci çözücünün (burada DMSO) olasi öldürücü etkisi tarafindan gölgelenmemesi ve böylelikle dogru biçimde gözlemlenebilmesidir. - Birinci karisim, (örn. hacimce , (örn. 365 nm, orta basinçli civa lambasi, (HAMAMATSU LIGHTNINGCURE Spot light source LC8) ile) fotokimyasal indirgeme islemine tabi tutulmus ve AuNp olusumu (örn. UV-Vis spektrofotometresi ile, zamana bagli olarak) takip edilmistir. 300 saniyenin sonunda, AuNp'lerin 535 nm'deki yüzey plazmon rezonans bandinin belirgin hale gelmeye basladigi gözlenmistir - Çözeltinin renginin, aydinlatma zamanina bagli olarak, açik saridan AuNp'Ierin karakteristik rengi olan pembe renge dönüstügü gözlenmistir. Bu gözlemler dogrultusunda, fotokimyasal indirgeme tepkimesinin gerçeklestirildigi ortamin/karisimin baslangiçta renksizken gitgide renklendigini gösteren bir fotograflar dizisi elde edilmistir. Dizideki fotograflar sirasiyla, fotokimyasal indirgenme elde edilen optik görünümlere karsilik gelmektedir. Buradaki optik özellik degisimindeki ilerleyis (tepkime ortaminin renginin koyulasmasi / kirmizilasmasi), altin tuzunun altin nanopartiküllerine dönüstügünü göstermektedir. - Bu islem adiminin sonucunda, AuNp'Ier içeren bir "birinci süspansiyon" elde edilmistir. 1100 saniye aydinlatmanin ardindan olusturulan AuNp'Iere 5 pL'den 200 pL'ye kadar DOKSO [1)(10'4 M] ilave edilmistir. Bu islem adimi ile: -Her bir DOKSO ilavesinden sonra çözelti (örn. 15 dakika boyunca) karistirilarak tamamen homojen hale getirildi ve ayni zamanda DOKSO'Iarin AuNp yüzeyine tutunmasi saglanmistir. DOKSO yükleme miktarina bagli olarak AuNp çözeltisinin renginde meydana gelen degisim bir fotograflar dizisi ile gözlenmistir. Gözlem esnasinda DOKSO eklemeden önce pembe renge sahip olan çözelti 100 pL DOKSO ilavesinin ardindan AuNp'Ier tarafindan adsorplanan DOKSO arasindaki kovalent olmayan etkilesimler sonucu (hidrojen baglari, pi-pi etkilesimleri vs.) AuNp'Ier arasinda aglomerasyon meydana geldigi için mor renge dönmüstür. Eklenen DOKSO miktari 200 pL'ye çikarildiginda ise mor renk tamamen ortadan kaybolmus, ve çözelti renksiz hale gelmistir. Söz konusu gözlemlere eslik eden fotograflar dizisi, altin nanopartiküllerinin kanser ilaci etken madde ile (burada: DOKSO ile) kaplanmak suretiyle görünürlüklerinin gitgide azalmasini, böylelikle kirmizi görünümden gitgide renksiz görünüme ulasilmasini göstermektedir. Dizideki fotograflar sirasiyla, ilave optik görünümlere karsilik gelmektedir. Ilave edilen DOKSO çözelti hacminin 200 mikrolitreyi bulmasi ile, ortamin optik özelliginin kirmizidan tamamen renksize döndügü görülmüstür. -Her ekleme sonrasinda AuNp'Ierin SPR'sindeki degisim UV-Vis spektrofotometresiyle takip edilmistir. 200 pL DOKSO eklenmesinin ardindan AuNp'Ierin SPR'sinin tamamen sönümlendigi gözlenmistir (Sekil 3). Tablo 1'de DOKSO yüklenmemis AuNp'Ierin ve çesitli konsantrasyonlarda DOKSO yüklenmis AuNp'Ierin DLS sonuçlari görülmektedir. Bu sonuçlara göre [OH-TX-S-]2 kullanilarak hazirlanmis olan AuNp'Ierin amaca uygun olarak 30 nm gibi gayet düsük boyutlarda ve boyut kararliligina sahip oldugu görülmektedir. Buna ek olarak DOKSO yüklenme miktarina bagli AuNp'Ierin boyutlarinda büyüme meydana gelmektedir ki bu da açikça, yukarida bahsedildigi gibi AuNp'lere yüklenmis olan dokrosubisinler arasindaki kovalent olmayan etkilesimlerin bir sonucudur. Yapilan SEM analizi de, DLS sonuçlarini destekler niteliktedir. Sekil 4'da görüldügü gibi DOKSO eklemeden önce AuNp'Ierin boyutlari 30 nm civarindayken (a) 5 i.iL DOKSO ilavesinden sonra boyutlarin 60-70 nm'Iere ulastigi görülmüstür (b). Tablo 1. Örnek 3'te ilave edilen DOKSO çözeltisi miktarina göre elde edilen kaplanmis AuNp'lerin ortalama tanecik çaplari ve bunlara karsilik gelen polidispersite indis degerleri (DOKSO çözeltisi ilave edilmesinden önceki, Örnek 2*ye göre elde edilmis AuNp çekirdeklerin çaplari ve PdI degerleri, DOKSO çözeltisi ilave miktarinin "0" oldugu sütunda gösterilmistir). mol /L derisiminde DOKSO içeren, DOKSO çözeltisi miktari (iiL) AuNp çaplari: Z-Ave (nm) (varsa, kaplama dahil) Dolayisiyla mevcut bulus ile, (farkli miktarlarda) DOKSO içeren bir kaplama katmani ile kaplanmis altin çekirdege sahip altin nanopartikülleri (AuNp) elde edilmis olup; altin çekirdek çapinin, PdI degeri 0.45±0.01 olmak üzere, 30±1 nm araliginda olmasi temin edilmistir. Bu kapsam dahilinde, asagidakilerin mümkün olmasi saglanmistir: altin çekirdek üzerine 5 mikrolite DOKSO yüklenmis oldugu durumda AuNp çapinin, altin çekirdek üzerine 25 mikrolite DOKSO yüklenmis oldugu durumda AuNp çapinin, olmasi; ve altin çekirdek üzerine 50 mikrolite DOKSO yüklenmis oldugu durumda AuNp çapinin, olmasi. AuNp'Iere yüklenen DOKSO miktarini tespit edebilmek için farkli konsantrasyonlarda DOKSO kullanilarak, floresans emisyon siddetleri araciligiyla kalibrasyon dogrusu çizilerek, hesaplamalar gerçeklestirilmistir. AuNp'Iere her DOKSO ilavesinden sonra floresans emisyon siddetleri ölçülerek, serbest DOKSO miktari kontrol edilmistir. Hesaplanan deger, baslangiçta eklenen miktardan çikarilarak AuNp'Ierin yüzeyine kovalent olmayan etkilesimle adsorplanan DOKSO miktari bulunmustur. Yapilan hesaplamalar sonucu, Örnek-3'te adsorplanan (azami) DOKSO miktari 10.67 ug olarak bulunmustur (floresans ölçümlerinde DOKSO için Auy=480 nm seçilmistir). Sonuç olarak ilave edilen 10.87 ug DOKSO'nun sadece 0.2 ug'lik bir kisminin adsorplanmadigi tespit edilmistir. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yI)-2,5- diphenyI-ZH-tetrazolium bromide) kolorimetrik testi, kültür ortaminda mitokondriyal aktivitesi devam eden canli hücrelerin kantitasyonunu saglamaktadir. M'I'l' kolorimetrik testi, asagidaki prosedüre göre uygulanmistir: Hücre kültürü sartlarindaki standart prosedüre göre hücreler %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin içeren RPMI-1640 kültür ortaminda idame ettirilmistir. Hücre sayimlari için tripan mavisi testi kullanilmistir. Sitotoksisitenin degerlendirilmesi için hücreler 96 kuyucuklu düz dipli plakalarda i.il örnek ve 90 ul hücre süspansiyonu uygulanmistir. Hücre ekimi yapilan plakalar inkübatöre alinmis ve 72 saat 37 °C'de %5 COZ ortaminda inkübe edilmistir. Süre sonunda her bir kuyucuga 10 |JL MTI' çözeltisi(5 mg/mL PBS içerisinde) eklenip 3.5 saat inkübasyona birakilmistir. Mikroskopta formazan kristallerinin kontrolü sonrasi kuyucuklardaki sivinin 50 ul'si uzaklastirilmistir. Olusan kristaller kuyucuklara 200 ul DMSO ilavesi ile çözündürülmüstür. Kuyucuklardaki kolorimetrik degisimi gösteren optik yogunluk, mikroplaka okuyucuda 620 nm referans dalga boyunda 560 nm dalga boyunda ölçülmüstür. Elde edilen absorbans degerleri kontrole göre karsilastirilmis ve yüzde canlilik verileri olusturularak eslesmemis t testi ile istatistiksel olarak Graphpad Prism 5.04 yazilimi kullanilarak degerlendirilmistir. P<0.05 anlamli olarak kabul edilmistir. MTT deneylerine göre 72 saat inkübasyon sonrasi, AuNp üzerine yüklenmemis serbest haldeki DOKSO ile, DOKSO yüklü AuNp'nin etkisi akut promiyelositik lösemi (HL-60) kronik miyeloid lösemi (K562) hücreleri için arastirilmis olup, elde edilen sonuçlar sirasiyla Sekil 5 ve Sekil 6'da verilmistir. K562 hücreleri için bakildiginda Sekil 5'de görüldügü üzere; 5, 25 ve 50 uL DOKSO yüklü AuNp'Ierin sadece DOKSO ile karsilastirildiginda daha etkili oldugu tespit edilmistir. Ayni durumun HL-60 hücreleri için de geçerli oldugu belirlenmis olup 5 ve 25 uL DOKSO yüklü AuNp'Ier ayni miktarda uygulanan sadece DOKSO etkisine kiyasla daha fazla sitotoksik etki göstermistir (Sekil 6). Ilaç saliminin incelenmesi için, en etkili formülasyonlar olduklari gözlenmis olan 5 ve 25 uL DOKSO yüklenmis olan AuNp'Ier seçilmistir. Salim için DOKSO yüklü çözeltiler fosfat tamponunun içerisine ilave edilmis (pH=7.3), ardindan 37°C sicaklikta 200 RPM' de yaklasik 140 saat boyunca çalkalanmistir. Belli araliklarla alinan örneklerin floresans ölçümleri gerçeklestirilmis ve salinan DOKSO miktari, kalibrasyon egrisi araciligiyla hesaplanmistir. Ilk 67 saatin sonunda 5 uL yüklenmis olan örnekteki salim orani %40 olarak bulunurken, 25 uL yüklenmis olan örnekteki salim orani %7 olarak hesaplanmistir. Süre 140 saate uzatildiginda, iki örnegin salim miktarinda da, 67 saate kiyasla ciddi bir degisikligin meydana gelmedigi görülmüstür (Sekil 7). Tablo 2. Örneklerde kullanilan terkipler ÖRNEK Z'den: ÖRNEK 3'ten: ORNEK 3'teki islemler Au indirgeme asamasindaki Baslangiç çözeltisinde Au içeriginin sonunda elde edilen baslangiç çözeltisi (Karisim-1) indirgenmesini takiben; toplam hacim (Karisim- Indirgenmis Au (bu durumda 2: AuNp içeren AuNp) yüzeyindeki fotobaslatici ile süspansiyon) yer degistirmek üzere (AuNp'nin ilaç ile kaplanmasi amaciyla) ilave Numune HAuCI4 ( ilavesi Toplam Miktar 0 2,7 mL - 2,700 mL 3* 2,7 mL 50 uL 2,750 mL *) etken madde ( ya da Haç, burada.' .DO/(50) içeren çözeltinin terC/h edien ilave miktar/ari **J etken madde (ya da ilaç, burada.' 00/60) içeren çözeltinin daha çok tercih edilen i/a ve miktar/an Tercih edilen, monodispers ve boyut kararliligina sahip AuNp eldesi için en uygun görülen araligi önerilebilir). Bu yaklasimin geçerli sayildigi Au tuzu derisim araligi olarak 3,50x10'6 mol/litre ila 4,00x10'6 mol/litre önerilebilir. Altin pikinin görünmez olmasi (yani AuNp'nin tamamen kaplanmasinin temini) için, mol/litre DOKSO çözeltisinden 200 mikrolitre (0,2x10'3 litre) ilave edilesi yeterli olmustur. Sekil 5 ve Sekil 6'den hareketle; DOKSO çözeltisinin 5 mikrolitre, 25 mikrolitre ve 50 mikrolitre ilave eidlmesi hallerinde de tatmin edici ölçekte sitotoksisite elde edilebilmesi, söz konusu hallerde AuNp üzerindeki kaplama katmaninda yer alan [OH-TX-S-]2 bilesiginin kendisinin de (özellikle de HL-60 üzerinde) sitotoksisite etkisi gösterdigi yönünde yorumlanmistir. Tablo 2'den hareketle etken madde (ya da ilaç, burada::DOKSO) ilave edilmis haliyle karisimda tercih edilebilecek molar derisimler asagidaki gibi hesaplanabilir: - 5 ila 200 mikrolitre DOKSO çözeltisi ilavesine karsilik gelen durumda ikinci süspansiyon içerisindeki Au derisimi su aralikta olabilir: tercihen tam olarak) araligi. - 5 ila 50 mikrolitre DOKSO çözeltisi ilavesine karsilik gelen durumda ikinci süspansiyon içerisindeki Au derisimi su aralikta olabilir: da tercihen tam olarak) araligi. - 5 ila 25 mikrolitre DOKSO çözeltisi ilavesine karsilik gelen durumda ikinci süspansiyon içerisindeki Au derisimi su aralikta olabilir: da tercihen tam olarak) araligi. - 5 ila 200 mikrolitre DOKSO çözeltisi ilavesine karsilik gelen durumda ikinci süspansiyon içerisindeki DOKSO derisimi su aralikta olabilir: tercihen tam olarak) araligi. - 5 ila 50 mikrolitre DOKSO çözeltisi ilavesine karsilik gelen durumda ikinci süspansiyon içerisindeki DOKSO derisimi su aralikta olabilir: ya da tercihen tam olarak) araligi. - 5 ila 25 mikrolitre DOKSO çözeltisi ilavesine karsilik gelen durumda ikinci süspansiyon içerisindeki DOKSO derisimi su aralikta olabilir: ya da tercihen tam olarak) araligi. Mevcut bulusu ortaya koyan çalisma ile: - Fotokimyasal olarak hazirlanan AuNp'Ierin boyut ve dagilim kararliligini saglayabilecek bir fotoindirgeyici ajanin sentezlenmesi gerçeklestirilmistir: bu çalismada sentezlenen ve kullanilan fotoindirgeyici ajan [OH-TX-S-]2 AuNp'Ierin sentezinde ilk kez kullanilmistir; - Fotobaslatici varliginda çözeltide sentezlenen AuNp'Ierin boyutlarinin 30 nm civarinda olmasi, söz konusu AuNp'Ierin ilaç tasinim sisteminde kullanilmasina olanak tanimistir. - Fotoindirgeme islemini gerçeklestiren [OH-TX-S-]2 yapisindaki -S-S- baglarinin ve/veya tiyil radikallerinin, AuNp'Ierin boyutsal stabilizasyonunu mümkün kildigi degerlendirilmistir. - Model kanser ilaci olarak seçilen DOKSO'Iarin AuNp'Iere farkli oranlarda yüklenmesi gerçeklestirilmis ve yüklenen miktarlar, spektrofotometrik yöntemlerle hesaplanmistir. - Akut ve kronik lösemi hücrelerindeki etkinlikleri sirasiyla AuNp için ve DOKSO yüklü AuNp'ler için M'I'I' yöntemiyle incelenmis, özellikle düsük konsantrasyonda DOKSO içeren AuNp'Ierin kanser hücreleri üzerinde etkin oldugu saptanmistir. - Ilaveten, Formül (I)'e göre olan [OH-TX-S-]2 bilesigi içeren bir kaplama katmanina sahip AuNp'lerin de kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisinin yüksek oldugu gözlenmistir. Özellikle de, söz konusu Formül (I)'e göre olan bilesigin etkisiyle altin çekirdek çapinin küçük olmasinin temin edilmesi sayesinde, kaplanmis AuNp'Ierde tanecik çapinin küçük olmasi ve böylelikle bunlarin yüzey/hacim oraninin büyük olmasi temin edilmistir. Bu sayede, gerek DOKSO, gerek Formül (I)'e göre olan [OH-TX-S-]2 bilesigi, gerekse bunlarin her ikisini birden içeren taneciklerin kanser hücreleri üzerinde yüksek bir sitotoksisite sergilemesi mümkün olmustur. Etken maddenin, düsük partikül büyüklügüne sahip AuNp'Ier üzerine yüklenmesi, etken maddenin vücuda düsük miktarlarla sunulmasina izin veren bulus, etken böylelikle yari etkilerden kaçinilmasini mümkün kilmistir. - AuNp'Ierden ilaç salim zamanlari incelenerek, etkinlige dair kiyaslama yapilmasina olanak taninmistir. - Ilk kez sentezlenen ve AuNp hazirlanmasinda ilk kez kullanilan fotobaslaticinin etkinliginin diger önemli bir nedeninin, yapisindaki tiyokzanton ünitesini içeren bazi türevlerinin daha önce lösemi tedavisinde kullanilmasi ve bu fotobaslaticinin beraberinde hazirlanan AuNp'Ierin [OH-TX-S-]2 ile çevrili olmasinin getirdigi katkinin gözardi edilemeyecegi görülmüstür. Kanser veya baska bir ilacin (nörolojik vs.) saliminda da kullanilmak üzere son derece etkin ve ucuz bir yöntemle 30 nm boyutunda ve monodispers olarak sentezlenen AuNp'lere bu çalismada, model olarak seçilen kanser ilacinin basarili yüklenmesi ve saliminin sonucunda üzerinde saptanan olumlu etkisi, ilaçlarin etkinligini artiran tasiyici AuNp'Ierin ticari olarak sentezlenmesinin ve ilaç sanayiinde kullanim olasiliginin yüksek oldugunu göstermektedir. Yukaridaki içerikten yola çikilarak: Mevcut bulus kapsaminda, Formül (I)'e göre olan [OH-TX-S-]2 bilesigi sunulmaktadir. Mevcut bulus kapsaminda ilaveten, Formül (I)'e göre olan [OH-TX-S-]2 bilesigini içeren bir kaplama katmani ile kaplanmis altin nanopartikülleri (AuNp) sunulmaktadir. Mevcut bulus kapsaminda ilaveten, bir kanser ilaci (örnegin DOKSO) içeren bir kaplama katmani ile kaplanmis altin çekirdege sahip altin nanopartikülleri (AuNp) sunulmakta olup; söz konusu AuNp'Ierde PdI degeri 0.45±0.01 olmak üzere altin çekirdek çapinin 30±1 nm olmasi mümkün kilinmistir. Söz konusu AuNp'kerde PdI degeri 0.169 ila 0,482 araliginda olmak üzere, kapli AuNp çapinin 36,33 ila 384,4 nm araliginda olmasi mümkün kilinmistir. Bulusun tercih edilen bir yapilandirmasinda, söz konusu AuNp'kerde PdI degeri 0.221 ila mümkün kilinmistir (bu durum, örneklerdeki 5 ila 50 mikrolitre DOKSO çözeltisi ilavesine karsilik gelmektedir). Bulusun tercih edilen bir diger yapilandirmasinda ise, söz konusu 40,29 nm araliginda olmasi mümkün kilinmistir (bu durum, örneklerdeki 5 ila 25 mikrolitre DOKSO çözeltisi ilavesine karsilik gelmektedir). Mevcut bulus kapsaminda ilaveten, Formül (I)'e göre olan [OH-TX-S-]2 bilesiginin üretimine yönelik bir yöntem sunulmus olup, söz konusu yöntem sirasiyla asagidaki adimlari içermektedir: tiyosalisilik asit üzerine HzSO4 ilave edilerek karistirilmasi suretiyle bir tiyosalisilik asit - H2504 karisimi elde edilmesi; söz konusu tiyosalisilik asit - HzSO4 karisiminin üzerine, benzen içinde 3,3-dihidroksi fenil disülfit çözündürülerek elde edilen bir 3,3-dihidroksi fenil disülfit çözeltisinin damla damla ilave edilmesi; böylelikle tiyosalisilik asit, HzSO4 ve 3,3-dihidroksi fenil disülfit içeren bir karisimin elde edilmesi; tiyosalisilik asit, H2504 ve 3,3-dihidr0ksi fenil disülfit içeren karisimin reflux edilmesi; söz konusu, reflux edilmis tiyosalisilik asit, H2504 ve 3,3-dihidroksi fenil disülfit içeren karisim içerisinde tepkime gerçeklestirilmesi; (iv) adimindaki tepkimenin sonlanmasi ile bir ürün karisiminin elde edilmesi; (v) adiminda elde edilen ürün karisiminin süzülmesi, kurutulmasi, yikanmasi ve saflastirilmasi. Söz konusu yöntem asagidakileden bir ya da daha fazlasini içerebilir: m) (i) adiminda elde edilen tiyosalisilik asit - H2504 karisimi içerisindeki tiyosalisilik asit olmasi; (ii) adiminda benzen içinde 3,3-dihidr0ksi fenil disülfit çözündürülerek elde edilen 3,3-dihidr0ksi fenil disülfit çözeltisindeki 3,3-dihidroksi fenil disülfit derisiminin, (iii) adimindaki reflux isleminin önce oda sicakliginda en az 30 dakika, ardindan 75- 85°C araligindaki bir sicaklikta en az 6 saat süreyle uygulanmasi; (v) adimindaki tepkime sonlanmasinin, (iv) adiminda tepkimeye tabi tutulmus olan reflux edilmis tiyosalisilik asit, H2504 ve 3,3-dihidr0ksi fenil disülfit içeren karisiminin, sicak su içerisinde çöktürme yoluyla gerçeklestirilmesi; (vi) adimindaki kurutma isleminin vakum etüvünde gerçeklestirilmesi; (vi) adimindaki yikama isleminin petrol eteri kullanilarak gerçeklestirilmesi; t) (vi) adimindaki saflastirma isleminin etanol:etil asetat yürütücü faz esliginde, bir kolon sistemi kullanilarak gerçeklestirilmesi. Mevcut bulus kapsaminda ilaveten, Formül (I)'e göre olan [OH-TX-S-]2 bilesiginin, fotokimyasal indirgeme yoluyla altin nanopartikülleri (AuNp) üretiminde kullanimi önerilmekte olup, söz konusu kullanim yöntemi asagidaki adimlari içermektedir: a) bir altin tuzu ile birlikte [OH-TX-S-]2 bilesigini çözelti halinde içeren bir birinci karisimin hazirlanmasi; b) birinci karisimin fotokimyasal indirgeme islemine tabi tutulmasi suretiyle AuNp içeren bir birinci süspansiyonun elde edilmesi. Söz konusu kullanim yönteminin olasi bir varyasyonunda; birinci karisim içerisinde altin tuzu olarak, bir yardimci çözücü içerisinde çözündürülerek sonrasinda 3 x 10*6 ila 4 x 106 mol/litre derisim araligina getirilecek sekilde su ile seyreltilmis HAuCI4 ve bunun yani sira, söz konusu derisimin 1/80'i ila 1/120'sine karsilik gelen bir derisim araliginda [OH-TX-S-]2 yer alabilir. Söz konusu kullanim yönteminde, fotokimyasal indirgeme islemi, birinci karisimin 300 saniyeden uzun bir süre boyunca 365 nm'de orta basinçli civa Iambasinin sagladigina karsilik gelen bir radyasyona tabi tutulmasi suretiyle gerçeklestirilebilir; 535 nm'de AuNp yüzey plazmon rezonans bandinin gözlenmesi bu sekilde temin edilebilir. Söz konusu kullanim yöntemi, (b) adimini takiben birinci süspansiyon ile bir kanser ilacinin çözeltisi ile karistirilmasi suretiyle bir ikinci süspansiyon elde edilmesine yönelik bir (c) adimini içerebilir. Söz konusu kanser ilaci (etken madde) DOKSO olabilir. Bu durumda, ikinci süspansiyon (bu durum, örneklerdeki 5 ila 25 mikrolitre DOKSO çözeltisi ilavesine karsilik gelmektedir). araliginda olabilir (bu durum, örneklerdeki 5 ila 50 mikrolitre DOKSO çözeltisi ilavesine karsilik gelmektedir). TR TR TR TR