CN115137818B - 谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药及其应用 - Google Patents
谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种谷胱甘肽激活的光敏剂‑化疗药一体化分子前药。该分子前药的结构式如式Ⅰ所示,其制备方法如下:S1将亚甲基蓝、碳酸氢钠和连二亚硫酸钠加入到混合溶剂中反应,待反应结束后冷却分液,取有机溶剂层,加入三乙胺,缓慢加入三光气到反应混合物中搅拌,再加入苄羟基碳酸酯和三乙胺反应,待反应结束后萃取,洗涤、干燥,减压浓缩,得到光敏剂小分子前药;S2将偶联有顺铂前药的靶向多肽加入到S1所得的光敏剂小分子前药溶液中,搅拌后透析得到谷胱甘肽激活的光敏剂‑化疗药分子前药。本发明获得的分子前药,可在水溶液中通过自组装形成纳米粒子,可用于精准并且高效的癌症治疗,或用于活体病灶部位可激活的光动力/化疗与成像诊断。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤靶向和光动力/化疗联合疗法技术领域,尤其是涉及一种谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药及其应用。
背景技术
活性氧(ROS)是由所有有氧生物产生的一组高活性小分子,包括过氧化氢,超氧化物和羟基自由基。ROS过量会导致氧化应激,从而造成细胞损伤及器官系统功能下降。在正常细胞中,为了维持ROS稳态以控制ROS水平并克服其潜在的毒性,细胞内抗氧化防御系统发挥了非常重要的作用。然而,异常的肿瘤细胞通常处于强氧化应激状态,其高水平的ROS会通过上调谷胱甘肽(GSH)激活抗氧化系统来适应氧化应激。因此,癌细胞内具有高水平的抗氧化防御系统尤其是GSH用于对抗ROS的破坏作用从而来适应氧化应激。[a) J. Fang,T. Seki, H. Maeda, Adv. Drug Deliv. Rev. 2009, 61, 290-302; b) J. P.Fruehauf, F. L. Meyskens, Clin. Cancer Res. 2007, 13, 789-794; c) W. K. Oh,Y. S. Jeong, S. Kim, J. Jang, Acs Nano 2012, 6, 8516-8524; d) A. Federico, F.Morgillo, C. Tuccillo, F. Ciardiello, C. Loguercio, Int. J. Cancer 2007, 121,2381-2386.]
GSH作为癌细胞内最丰富的巯基抗氧化剂,不仅与肿瘤的氧化还原稳态有关,而且还损害了几种治疗方法的疗效。其中,与传统的手术、化疗等常规治疗手段相比,利用光产生细胞毒性单线态氧(1O2)的光动力疗法(PDT)具有最小的侵入性和巨大的时空准确性,因此受到了广泛的关注。然而,由于肿瘤细胞内高水平的GSH能够消耗光敏剂(PS)产生的单线态氧1O2,单一的PDT在根除实体瘤方面效率较低。而基于PDT的组合疗法已被公认为增强治疗效果的有效解决方法。[a) D. E. J. G. J. Dolmans, D. Fukumura, R. K. Jain,Nat. Rev. Cancer 2003, 3, 380 - 387; b) H. Fan, G. Yan, Z. Zhao, X. Hu, W.Zhang, H. Liu, X. Fu, T. Fu, X. B. Zhang, W. H. Tan, Angew. Chem. 2016, 128,5567 - 5572.]
近年来,化疗与光动力的联合应用通过其不同的作用机制同时克服耐药性和低1O2产率来提高抗癌功效成为了研究的热点。目前,大部分的PDT/化疗试剂通过将化疗药和光敏剂以物理包埋的方式被共载于纳米载体具有令人满意的治疗效果。最近,已有大量的研究证明了可被特定肿瘤生物标记物(即酶,pH和GSH)激活以进行肿瘤选择性治疗的可激活试剂可提高光疗的准确性。尽管如此,PDT和化疗这种结合方式仍然受到癌细胞内高表达的GSH的挑战。有研究表明,细胞内GSH可以通过与化疗药结合将其排出从而提高肿瘤细胞的耐药性。此外,封装在一个纳米系统中的光敏剂和化疗药通常存在载药量低、稳定性差以及药物泄露等问题。[a) J. Deng, F. Liu, L. Wang, Y. An, M. Gao, Z. Wang, Y.Zhao, Biomater. Sci. 2019, 7, 429-441; b) C. Yao, W. Wang, P. Wang, M. Zhao,X. Li, F. Zhang, Adv. Mater. 2018, 30, 1704833; c) X. Lin, X. Chen, I. A.Riddell, W. Tao, J. Wang, G. Hollett, S. J. Lippard, O. C Farokhzad, J. Shi,J. Wu, Nano Lett. 2018, 18, 4618-4625.]由此可见,发展一种整合了产生化疗药和活性氧的同时多步消除细胞内谷胱甘肽的新型可激活分子前药是非常重要的。
为了提高PDT/化疗的精准性和高效性,我们需要对光敏剂和化疗药进行改进以获得更高的化疗药和活性氧产生而不伤害正常组织。因此,设计一种可激活的分子前药,能够在生物环境下通过自组装形成纳米粒子特异性靶向到肿瘤细胞,并且在光照条件下,产生化疗药和活性氧的同时消除细胞内谷胱甘肽。这一策略对病变组织的临床治疗具有重要的意义。
发明内容
基于此,本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药。
本发明的另一目的在于提供所述谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药的应用。
本发明采用的技术方案如下:
一种谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药,其结构式如式Ⅰ所示:
所述的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药的制备方法,包括如下步骤:
S1:将亚甲基蓝、碳酸氢钠和连二亚硫酸钠加入到混合溶剂中,在40~60℃条件下进行反应,待反应结束后冷却至室温,分液,取有机溶剂层,加入三乙胺,将含有三光气的溶液缓慢加入到反应混合物中,滴加完成后将反应物搅拌0.5~1小时,向溶液中加入苄羟基碳酸酯和三乙胺,室温过夜反应,减压浓缩,加入水和乙酸乙酯萃取,有机相水洗2~5次,收集有机相,干燥,浓缩,纯化得到光敏剂小分子前药;
S2:用溶剂溶解将偶联有顺铂前药的靶向多肽逐滴加入到步骤S1所得的光敏剂小分子前药溶液中,搅拌反应,透析得到谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药分子前药。
进一步地,步骤S1中所述的亚甲基蓝、碳酸氢钠和连二亚硫酸钠的摩尔比为1:(3~4):(2~4),所述的混合溶剂为有机溶剂与水混合得到的溶剂,所述有机溶剂为二氯甲烷和甲苯中的一种或两种;优选为甲苯,所述的混合溶剂的用量优选为按每毫升(ml)混合溶剂配比7.5 mg亚甲基蓝计算;所述的反应的时间为2~4h;在所述有机溶剂层中顺序添加的三乙胺、三光气、苄羟基碳酸酯、三乙胺与亚甲基蓝的摩尔比为1.2:0.32:1:1:1;
步骤S1中所述苄羟基碳酸酯通过如下方法制备得到:将4-硝基苯基2-(2-吡啶基二硫代)乙基碳酸酯(NDEC)溶解在二氯甲烷中,加入三乙胺和对氨基苯甲醇,反应结束后过滤洗涤得到苄羟基碳酸酯;所述的NDEC、三乙胺和对氨基苯甲醇的摩尔比为1:(2~4):1。
进一步地,步骤S1中所述的亚甲基蓝、碳酸氢钠和连二亚硫酸钠的摩尔比为1:3.48:2.85,所述的混合溶剂为甲苯与水按体积比为4:1混合得到的溶剂,所述NDEC、三乙胺和对氨基苯甲醇的摩尔比为1:2:1。
所述的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药在制备PDT/化疗联合试剂或抗肿瘤药物中的应用。
所述的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药在光声成像或荧光成像中的应用。
一种纳米粒子,包括如上所述的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药。
进一步地,所述的纳米粒子的制备方法,包括如下步骤:将如上所述的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药溶于水中,通过超声混合均匀,离心,得到纳米粒子。
所述的纳米粒子在光声成像或荧光成像中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1、本发明所述的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药,实现光敏剂和化疗药的同步高效缀合,该方法是通过将能够被谷胱甘肽识别的带有二硫键的连接基团NDEC和四价铂部分缀合到临床使用的光敏剂亚甲基蓝上构建而成。NDEC部分通过一个氨基甲酸酯键淬灭光敏剂亚甲基蓝。在谷胱甘肽的作用下,光敏剂亚甲基蓝恢复,同时释放化疗药顺铂和醌甲基化物,多步消除谷胱甘肽,协同增加细胞内氧化应激和化疗效果。
2、本发明谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药分子前药克服了光动力/化疗治疗试剂在活体中选择性差和临床治疗受限的问题,提供的光敏剂-化疗药小分子前药自组装纳米诊疗剂用于活体肿瘤有选择性并且高效的光动力/化疗。该纳米诊疗剂的治疗机理基于谷胱甘肽对带有二硫键的连接基团NDEC和四价铂的特异性识别,NDEC连接基团发生自降解,使光敏剂亚甲基蓝和化疗药顺铂恢复,在近红外光的照射下,产生单线态氧,结合作为副产物的醌甲基化物可以多步消除细胞内谷胱甘肽,增强氧化应激和化疗效果,从而造成细胞毒性,导致肿瘤细胞凋亡。
3、本发明获得的光敏剂-化疗药分子前药特异性好,PDT/化疗效果加强,响应谷胱甘肽后得到临床可用的光敏剂亚甲基蓝、化疗药顺铂以及醌甲基化物,这一过程多步消除了谷胱甘肽。此外,该纳米诊疗剂在PDT/化疗期间还可用于细胞和活体内的荧光和光声成像,达到对癌症治疗过程中还可以进行诊断的目的。
4、本发明获得的光敏剂-化疗药分子前药可应用于有选择性的杀死癌细胞。体内研究已经表明该光敏剂-化疗药分子前药能够有效地降低在小鼠中生长的A549耐药肿瘤(A549cis)。总而言之,谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药分子前药的精准高效光动力/化疗策略和设计因其近红外吸收和荧光允许其在PDT/化疗期间在组织和体内可视化中的应用,可作为PDT/化疗试剂用于精准并且高效的癌症治疗,或作为PDT/化疗剂用于活体病灶部位可激活的PDT/化疗与成像诊断。
为了更好地理解和实施,下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为四价铂与谷胱甘肽还原响应释放药物的机理。
图2本发明实施例1中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药的制备合成路线图。
图3为本发明实施例1中光敏剂小分子前药的核磁共振氢谱图。
图4为本发明实施例1中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药的红外光谱图。
图5发明实施例2中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药与不同浓度谷胱甘肽反应前后的吸收光谱图。
图6发明实施例3中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药与不同浓度谷胱甘肽反应前后的荧光光谱图。
图7发明实施例4中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药与不同浓度谷胱甘肽反应的光声成像和光声信号强度图。
图8发明实施例5中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药在不同处理条件下单线态氧的产生情况。
图9发明实施例6中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药在谷胱甘肽处理下化疗药顺铂的释放图。
图10发明实施例7中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药在癌细胞A549cis内的荧光响应和产生单线态氧的能力结果图。
图11明实施例8中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药在癌细胞A549cis内消除谷胱甘肽能力的荧光成像图和荧光强度统计图;其中图A为荧光成像图,图B为荧光强度统计图。
图12明实施例9中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药在癌细胞A549cis内增强氧化应激能力的荧光成像图和荧光强度统计图;其中图A为荧光成像图,图B为荧光强度统计图。
图13发明实施例10中通过流式细胞术检测谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药处理癌细胞A549cis后细胞的染色情况图。
图14发明实施例11中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药在水溶液中自组装形成纳米粒子的粒径和透射电子显微镜图。
图15发明实施例12中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药在水溶液中自组装形成纳米粒子与谷胱甘肽反应后纳米粒子降解的透射电子显微镜图。
图16发明实施例13中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药自组装纳米诊疗剂在活体内荧光成像图以及荧光信号强度图;其中,图A为荧光成像图;图B为荧光信号强度图。
图17发明实施例14中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药自组装纳米诊疗剂在活体内光声成像图以及光声信号强度图;其中,图A为光声成像图;图B为光声信号强度图。
图18发明实施例15中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药自组装纳米诊疗剂在A549cis肿瘤小鼠各器官的荧光成像图和荧光信号强度图;其中,图A为荧光信号强度图;图B为荧光成像图。
图19发明实施例16中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药自组装纳米诊疗剂的光动力/化疗后A549cis肿瘤小鼠的肿瘤图和肿瘤体积统计图;其中,图A为小鼠光动力治疗后肿瘤图;图B为小鼠光动力治疗后肿瘤体积统计图。
图20发明实施例17中谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药自组装纳米诊疗剂的光动力/化疗对A549cis肿瘤小鼠模型的体重的影响图。
具体实施方式
以下实施例便于理解本发明,但并不限定本发明。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明采用了靶向肽、肿瘤的增强渗透滞留效应和肿瘤微环境等多重靶向给药的思路,通过引入还原环境敏感的自毁式二硫键连接臂和四价铂,在肿瘤细胞内谷胱甘肽提供的还原条件下,分子前药的二硫键和四价铂发生断裂。四价铂可以与谷胱甘肽发生反应从而释放出化疗药顺铂,请参考图1,其为四价铂与谷胱甘肽还原响应释放药物的机理。二硫键断裂后与多肽连接的这一端生成一个自由的巯基,另一端由于受到结构稳定因素的影响,该巯基会亲核进攻临近的酯键,电子发生重排释放光敏剂亚甲基蓝和谷胱甘肽消除佐剂醌甲基化物。
实施例1 :谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药分子前药(多肽(铂)-二硫-亚甲基蓝,MB-NP)的制备
本发明所提供的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药小分子前药自组装纳米诊疗剂的具体合成途径如图2示,具体包括如下步骤:
将亚甲基蓝(MB,373.9mg,1mM),碳酸氢钠(NaHCO3,292.4mg,3.48mM)和连二亚硫酸钠(Na2S2O4,496.2mg,2.85mM)加入到40ml甲苯和10ml水形成的混合溶液中,60℃反应2小时,冷至室温,分液,保留甲苯层;然后在甲苯溶液中,加入三乙胺(Et3N ,170μl,1.2mM),将含有三光气(TPG,120mg,0.32mM)的1ml溶液缓慢加入到反应混合物中。滴加完成后将反应物搅拌0.5小时。向溶液中加入苄羟基碳酸酯(334mg,1 mM)和三乙胺(140μl,1mM)。室温过夜反应,减压浓缩,加入水(100ml)和乙酸乙酯(100ml)萃取,有机相再用水洗3次。收集有机相,加入无水硫酸镁干燥,浓缩,用硅胶色谱柱进行分离纯化可得到光敏剂小分子前药。其中苄羟基碳酸酯的制备如下:
向含有4-硝基苯基2-(2-吡啶基二硫代)乙基碳酸酯(NDEC,352.38mg,1mM)的20ml二氯甲烷溶液中加入三乙胺(350 μl,2.5mM)、对氨基苯甲醇(123.07mg,1mM),过夜搅拌,过滤收集沉淀,得到苄羟基碳酸酯。
用二甲基亚砜溶解偶联有顺铂前药的靶向多肽逐滴加入到溶解有光敏剂小分子前药的二甲基亚砜溶液中,搅拌反应,透析得到谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药分子前药(多肽(铂)-二硫-亚甲基蓝,MB-NP),即为探针Ⅰ。
表征数据:
光敏剂小分子前药的1HNMR(图3) (600 MHz, d6-CDCl3) δ= 7.74 (d, J = 12Hz, 2H), 7.31 (d, J=6 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 6 Hz, 4H), 6.75 (d, J = 12 Hz,2H), 6.52 (d, J = 6 Hz, 2H), 6.47 (d, J = 6 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H),4.70 (d, 12Hz, 2H), 2.81 (s, 12H), 2.56 (d, 12 Hz, 2H)。
光敏剂-化疗药分子前药(探针Ⅰ)的红外光谱(图4) 在四个光谱中,多肽的光谱在2572 cm-1和1530 cm-1, 1631 cm-1具有典型的峰,分别对应于巯基(-SH),氨基(NH2)和酰胺键(-CONH)。多肽连接顺铂前药后,在1530 cm-1(NH2)处的典型峰强度减弱。光敏剂小分子前药在535 cm-1(二硫键,-S-S-)处和1500-1650 cm-1(酰胺键)具有典型峰。探针Ⅰ与前三个光谱相比,酰胺基团的峰强度明显增强,巯基(-SH)2572 cm-1处的峰消失,且在535cm-1处具有与光敏剂小分子前药相同的特征峰。结果表明得到式Ⅰ所示结构。
实施例2:探针Ⅰ与不同浓度谷胱甘肽反应前后的吸收光谱
配制实施例1中获得的探针Ⅰ溶液以及谷胱甘肽水溶液,然后将探针Ⅰ溶液与谷胱甘肽水溶液混合反应2小时后测定其吸收系数;其中,反应体系中探针Ⅰ的浓度为20 μM,谷胱甘肽的浓度为0~10 mM。吸收光谱如图5示,从图中可以看出探针随着谷胱甘肽浓度增加,吸收系数也逐渐增强。
实施例3:探针Ⅰ与不同浓度谷胱甘肽反应前后的荧光光谱
配制实施例1中获得的探针Ⅰ溶液以及谷胱甘肽水溶液,然后将探针Ⅰ溶液与谷胱甘肽水溶液混合反应2小时后测定其荧光强度;其中,反应体系中探针Ⅰ的浓度为20 μM,谷胱甘肽的浓度为0~10 mM。荧光光谱如图6示,从图中可以看出探针随着谷胱甘肽浓度增加,荧光强度也逐渐增强。
实施例4:探针Ⅰ与不同浓度谷胱甘肽反应前后的荧光光谱
配制浓度为20 μM的实施例1所制备的探针Ⅰ溶液共6组,以及浓度为0,2,4,6,8,10mM的谷胱甘肽水溶液,然后将探针Ⅰ溶液与谷胱甘肽水溶液混合后进行反应(探针Ⅰ溶液的用量为40 μl,谷胱甘肽水溶液的用量分别为2,4,6,8,10 μl),每组各自反应2小时后 ,用光声计算机断层扫描仪测定6组溶液的光声信号,以及光声二维图(图7)。从图中可以看出光声信号随浓度的增加665 nm的光声信号强度逐渐增强。表明探针Ⅰ可以作为响应谷胱甘肽的前药。
实施例5:探针Ⅰ在不同处理条件下单线态氧的产生情况
配制浓度为20 μM的实施例1所制备的探针Ⅰ溶液共2组,第一组只加光照,第二组加谷胱甘肽水溶液和680nm光照。向这两组溶液中加入单线态氧检测探针SOSG(单线态氧检测探针SOSG购买自赛默飞世尔科技有限公司(中国);加入量为5μM),检测SOSG在545 nm处的荧光。SOSG作为对照组。结果如图8所示,从图中可以看出探针Ⅰ在谷胱甘肽和680 nm光照的条件,SOSG荧光明显增强。表明谷胱甘肽可激活的前药有很好的光动力效应。
实施例6: 探针Ⅰ在谷胱甘肽处理下化疗药顺铂的释放情况
配制浓度为20 μM的实施例1所制备的探针Ⅰ溶液共2组,第一组只加缓冲液,第二组加10mM谷胱甘肽水溶液,放入容器中透析。在不同时间间隔内,从容器中提取2ml外部缓冲液,通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析,然后加入2ml新鲜缓冲液,以保持介质体积不变。结果如图9所示,从图中可以看出探针Ⅰ在谷胱甘肽的条件下,释放出顺铂的含量随反应时间增加。表明谷胱甘肽可激活探针Ⅰ释放化疗药顺铂。
实施例7: 探针Ⅰ在癌细胞A549cis内的荧光响应和产生单线态氧的能力结果图
配制浓度为20 μM的实施例1所制备的探针Ⅰ溶液,将癌细胞A549cis(北京北纳创联生物技术研究院提供)孵育在共聚焦内,分为3组,第一组不作处理(作为对照),第二组加入探针Ⅰ溶液(40 μl,MB-NP),第三组加入探针Ⅰ溶液(40 μl)以及谷胱甘肽清除剂NMM(N-甲基马来酰亚胺,用量是1mM)(MB-PB+NMM)。向这三组细胞内加入单线态氧探针SOSG(5μM)后,分别用680 nm激光照射,用共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。结果如图10所示,从图中可以看出谷胱甘肽激活的前药可以在癌细胞内谷胱甘肽的作用下,释放光敏剂亚甲基蓝,恢复荧光,并且在光照条件下产生单线态氧,有很好的光动力效应。说明探针Ⅰ可以对细胞内谷胱甘肽进行响应。
实施例8: 探针Ⅰ在癌细胞A549cis内消除谷胱甘肽的能力
配制浓度为20 μM的实施例1所制备的探针Ⅰ溶液,将癌细胞A549cis孵育在共聚焦,分为5组,第一组不作处理(作为对照),第二组加入四价铂溶液(制备方法同实施例1,其浓度为20 μM,用量为40 μl),第三组加入亚甲基蓝溶液(制备方法同实施例1,其浓度为20μM,用量为40 μl)和光照,第四组加入探针Ⅰ溶液(溶液的用量为40 μl,MB-NP),第五组加探针Ⅰ溶液(40 μl)和光照。向这五组细胞内加入谷胱甘肽检测探针谷胱甘肽敏感探针 (TCG,0.5 mM)后,用共聚焦检测谷胱甘肽探针的荧光。结果如图11所示,从图中可以看出探针Ⅰ能够消除癌细胞内谷胱甘肽。
实施例9: 探针Ⅰ在癌细胞A549cis内增强氧化应激的能力
配制浓度为20 μM的实施例1所制备的探针Ⅰ溶液,将癌细胞A549cis孵育在共聚焦,分为5组,第一组不作处理(作为对照),第二组加入四价铂溶液(制备方法同实施例1,其浓度为20 μM,用量为40 μl),第三组加入亚甲基蓝溶液(制备方法同实施例1,其浓度为20μM,用量为40 μl)和光照,第四组加入实施例1所制备的探针Ⅰ溶液(溶液的用量为40 μl,MB-NP),第五组加探针Ⅰ溶液(40 μl)和光照。向这五组细胞内加入活性氧检测探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA,0.5 mM)后,用共聚焦检测活性氧探针的荧光。结果如图12所示,从图中可以看出探针Ⅰ能够增强癌细胞内氧化应激。
实施例10: 探针Ⅰ在癌细胞A549cis内的光动力/化疗能力
配制浓度为20 μM的实施例1所制备的探针Ⅰ溶液,将癌细胞A549cis孵育在六孔板内,分为6组,第一组不作处理(作为对照),第二组只加光照,第三组加入四价铂溶液(制备方法同实施例1,其浓度为20 μM,用量为40 μl),第四组加入亚甲基蓝溶液(制备方法同实施例1,其浓度为20 μM,用量为40 μl)和光照,第五组加入实施例1所制备的探针Ⅰ溶液(溶液的用量为40 μl,MB-NP),第六组加探针Ⅰ溶液(40 μl)和光照。向这六组细胞内分别加入死/活工作溶液(碘化丙啶/异硫氰酸荧光素,购买自Sigma)来替换细胞培养基,在15 min染色后,用流式细胞仪检测死/活细胞的染色情况。
结果如图13所示,从图中可以看出探针Ⅰ在细胞内谷胱甘肽的作用下能够产生明显的细胞毒性。
实施例11: 探针Ⅰ自组装的纳米粒子的粒径和透射电子显微镜图
配制浓度为20 μM的实施例1所制备的探针Ⅰ溶于水中,通过超声混合均匀,离心,得到探针Ⅰ自组装纳米粒子,然后测定水溶液的电镜图。电镜如图14所示,探针Ⅰ在水溶液中可以通过自组装形成纳米粒子。
实施例12: 探针Ⅰ自组装的纳米粒子与谷胱甘肽反应后纳米粒子降解的透射电子显微镜图
配制实施例11中所述的探针Ⅰ自组装的纳米粒子以及谷胱甘肽水溶液,然后将纳米粒子水溶液与谷胱甘肽水溶液混合反应0,2,4小时后测定水溶液的电镜图;其中,反应体系中纳米粒子的浓度为20 μM,谷胱甘肽的浓度为10 mM。电镜如图15所示,从图中可以看出纳米粒子在与谷胱甘肽反应后会发生降解。
实施例13: 探针Ⅰ自组装的纳米粒子在活体内的荧光成像以及荧光信号强度
将实施例11所述的探针Ⅰ自组装的纳米粒子(100 μM)尾静脉注射到小鼠(3~4周BALB/c鼠,平均体重20g,购买于南方医科大学)体内后1,4,8,12,24 h后利用双色红外激光成像系统进行荧光成像。结果如图16所示,结果表明随着纳米粒子在小鼠体内代谢到肿瘤部位后对内源性谷胱甘肽的荧光成像。
实施例14: 探针Ⅰ自组装的纳米粒子在活体内的光声成像以及光声信号强度
将实施例11所述的探针Ⅰ自组装的纳米粒子(100 μM)尾静脉注射到小鼠(3~4周BALB/c鼠,平均体重20g, 购买于南方医科大学)体内后1,4,8,12,24 h后利用光声计算机断层扫描仪对小鼠肿瘤部位进行成像。结果如图17所示,结果表明随着纳米粒子在小鼠体内代谢到肿瘤部位后对内源性谷胱甘肽的光声成像。
实施例15:探针Ⅰ自组装的纳米粒子在活体各组织内的荧光成像图和荧光信号强度图
将实施例11所述的探针Ⅰ自组装的纳米粒子(100 μM)尾静脉注射到小鼠(3~4周BALB/c鼠,平均体重20g, 购买于南方医科大学)体内8 h后,利用双色红外激光成像系统,对小鼠各主要器官包括心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤部位进行荧光成像。结果如图18所示,结果表明随着纳米粒子在小鼠体内代谢可靶向到肿瘤部位,响应谷胱甘肽进行荧光成像。
实施例16:探针Ⅰ自组装的纳米粒子对肿瘤小鼠的光动力/化疗效应
将小鼠(3~4周BALB/c鼠,平均体重20g,购买于南方医科大学)分为六组做不同处理,第一组不作处理(作为对照),第二组只加光照,第三组加入四价铂溶液(制备方法同实施例1,其浓度为100 μM,用量为40 μl),第四组加入亚甲基蓝溶液(制备方法同实施例1,其浓度为100 μM,用量为40 μl)和光照,第五组加入实施例1所制备的探针Ⅰ自组装的纳米粒子溶液(溶液的用量为40 μl,MB-NP),第六组加探针Ⅰ自组装的纳米粒子溶液(40 μl)和光照。统计小鼠肿瘤部位的体积。
结果如图19所示,结果表明随着纳米粒子在小鼠体内代谢可靶向到肿瘤部位,在光照条件下,响应谷胱甘肽后得到的光敏剂亚甲基蓝可以产生单线态氧,结合化疗药顺铂、副产物醌甲基化物对谷胱甘肽的消除,增强氧化应激,抑制了肿瘤的生长。
实施例17: 探针Ⅰ对肿瘤小鼠的光动力/化疗的安全性
将小鼠(3~4周BALB/c鼠,平均体重20g,购买于南方医科大学)分为六组做不同处理,第一组不作处理(作为对照),第二组只加光照,第三组加入四价铂溶液(制备方法同实施例1,其浓度为100μM,用量为40 μl),第四组加入亚甲基蓝溶液(制备方法同实施例1,其浓度为100 μM,用量为40 μl)和光照,第五组加入实施例1所制备的探针Ⅰ自组装的纳米粒子溶液(溶液的用量为40 μl,MB-NP),第六组加探针Ⅰ自组装的纳米粒子溶液(40 μl)和光照。对三周内小鼠的体重变化进行统计。
结果如图20所示,结果表明随着纳米粒子在小鼠肿瘤部位的光动力治疗效应,对小鼠的体重并无影响。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
2.如权利要求1所述的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1:将亚甲基蓝、碳酸氢钠和连二亚硫酸钠按摩尔比1:(3~4):(2~4)加入到甲苯与水混合得到的混合溶剂中,所述混合溶剂的用量按每毫升混合溶剂配比7.5 mg亚甲基蓝计算,在40~60℃条件下反应2~4h,待反应结束后冷却至室温,分液,取有机溶剂层,加入三乙胺,将含有三光气的溶液缓慢加入到反应混合物中,滴加完成后将反应物搅拌0.5~1小时,向溶液中加入苄羟基碳酸酯和三乙胺,室温过夜反应,减压浓缩,加入水和乙酸乙酯萃取,有机相水洗2~5次,收集有机相,干燥,浓缩,纯化得到光敏剂小分子前药,其中在所述有机溶剂层中顺序添加的三乙胺、三光气、苄羟基碳酸酯、三乙胺与亚甲基蓝的摩尔比为1.2:0.32:1:1:1;
S2:用溶剂溶解偶联有顺铂前药的靶向多肽,然后逐滴加入到步骤S1所得的光敏剂小分子前药溶液中,搅拌反应,透析得到谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药分子前药;
步骤S1中所述苄羟基碳酸酯通过如下方法制备得到:将4-硝基苯基2-(2-吡啶基二硫代)乙基碳酸酯溶解在二氯甲烷中,加入三乙胺和对氨基苯甲醇,反应结束后过滤洗涤得到苄羟基碳酸酯;所述的4-硝基苯基2-(2-吡啶基二硫代)乙基碳酸酯、三乙胺和对氨基苯甲醇的摩尔比为1:(2~4):1。
3.根据权利要求2所述的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药的制备方法,其特征在于:
步骤S1中所述的亚甲基蓝、碳酸氢钠和连二亚硫酸钠的摩尔比为1:3.48:2.85,所述的混合溶剂为甲苯与水按体积比为4:1混合得到的溶剂,所述4-硝基苯基2-(2-吡啶基二硫代)乙基碳酸酯、三乙胺和对氨基苯甲醇的摩尔比为1:2:1。
4.如权利要求1所述的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药在制备PDT/化疗联合试剂或制备抗肺癌药物中的应用。
5.如权利要求1所述的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药在制备光声成像产品或制备荧光成像产品中的应用。
6.一种纳米粒子,其特征在于:包括权利要求1所述的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药。
7.根据权利要求6所述的纳米粒子的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将如权利要求1所述的谷胱甘肽激活的光敏剂-化疗药一体化分子前药溶于水中,通过超声混合均匀,离心,得到纳米粒子。
8.如权利要求6所述的纳米粒子在制备光声成像产品或制备荧光成像产品中的应用。
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