CN114621317B - 用于前列腺癌早期诊断及体内纵向定量研究的可激活多模态分子探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于可用于前列腺癌早期诊断以及体内定量分析的可激活多模态分子探针P‑125I。该分子探针不仅可以区分检测早期前列腺癌与中晚期前列腺癌，还能够实现体内两种蛋白定量分析，以此来进行前列腺癌的分期及预后的评估。此外，结果显示，分子探针P‑125I具有优异的光学性能，放射性的低背景，使其对于前列腺癌微小肿瘤灶的成像更加敏感。与此同时，该探针具有极好的生物相容性，且可以通过肾清除，具有极高的成像应用前景。本发明还提供了所述分子探针的制备方法及成像应用。

Description

用于前列腺癌早期诊断及体内纵向定量研究的可激活多模态 分子探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及分子探针技术领域，具体涉及一种用于前列腺癌早期诊断及体内纵向定量研究的可激活多模态分子探针及其制备方法与应用。
背景技术
前列腺癌是男性较为常见的恶性肿瘤之一，根据ACS在CA Cancer J.Clin.最新发布的 2020年全球癌症统计的癌症的发病率和死亡率，前列腺癌均排在了所有癌症的前三列，仅次于乳腺癌和肺癌。近几年来，近几年来，由于人们生活水平的提高，诊断技术的飞速发展以及人口老龄化趋势，我国的前列腺癌的新增发病率和死亡率亦呈快速增长趋势5-8。可以预料的是，前列腺癌正逐步成为危及我国男性生命健康安全的重要疾病之一。
然而遗憾的是，由于前列腺癌发病隐匿，早期无明显的临床症状，仅仅少数出现尿频等前列腺炎症表现，因此，前列腺癌“发现即晚期”的现状在很长一段时间内难以解决，而这在很大程度上影响着临床前列腺癌的治疗效果及预后。
临床上用于前列腺癌诊断的方式，除了常规的血清学PSA检查、计算机断层成像(CT)、磁共振成像(MRI)等常规方式外，近几年出现的SPECT-CT成像和PET-CT成像，因为其功能成像的特点，已逐渐成为癌症的诊断方式之一。随着这两种成像方式的不断普及，成像药物也逐渐被发展起来。尤其是PSMA-617药物的出现，关于前列腺癌的PET成像因其良好的特异性而逐渐成为前列腺癌的常见诊断方式。
超声和CT主要显示疾病的解剖学形态，缺少组织器官功能信息；放射性核素成像具有很高的成像灵敏度(10-11～10-12mol/L)，但是组织分辨率较低(1-2mm)、价格昂贵、同时有放射性辐照的危害；磁共振成像具有分辨率高的优势(25～100μm)，但是灵敏度不高(10-3～10-5mol/L)。与它们相比，荧光成像具有高灵敏度(10-9～10-12mol/L)、非侵入性、可实时成像以及价格低廉等优势，因此被广泛地应用于医学诊断研究中。但是荧光成像由于在组织成像过程中存在着光散射、组织吸收和背景荧光，降低了其成像信噪比和组织穿透能力。作为一种新型的与光学成像互补的成像模式，光声成像技术近年来发展迅猛。光声成像是一种利用光学吸收和超声波传播的混合技术，即吸收电磁波与局部热激发引起的光波与声波之间的转换。因此，作为一种非侵入性的成像方式，光声成像具有光学吸收的高对比度，能够对具有特异吸收的光谱组织进行选择性激发，从而实现功能成像并获得分子信息。另外，光声成像检测的是光热转换后形成的超声波，避开了光散射的影响，因此具有超声成像的高分辨率和穿透深度。但是与荧光成像相比，光声成像具有较低的灵敏度。因此，如果能够将荧光成像与光声成像联用进行多模态成像，通过优势互补，既获得较高的成像灵敏度，同时得到深层组织的分子信息，能够提高成像诊断的准确率，降低诊断漏判、误判率。
而新开发药物不同核素标记的PSMA-617，现主要是用来进行前列腺癌的成像，其特异性在基础研究阶段得到了很好的验证，但是，其在进行诊断后，没有进一步的可评价前列腺癌分期、预后以及定量检测蛋白的能力，因此在应用方面受到了一定的限制，仅可作为癌症诊断的辅助方式。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于前列腺癌的多模态成像的可激活小分子探针，该探针属于可激活探针，仅在靶细胞内表现出不同的荧光、光声信号以及放射性信号，且荧光发射波长及光声吸收波长均在650nm以上，远离生物体正常吸收信号，而放射性也在正常人体内无背景信号，故具有较高的信噪比。本发明的分子探针的光学信号稳定，波长较长，穿透性好，能进行深层组织的诊断。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一种可激活光学分子探针，所述分子探针为分子探针P，其具有如下所示的结构式：
Figure BDA0003505536650000031
进一步地，本发明还提供了所述可激活光学分子探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成化合物A
将化合物N-芴甲氧羰酰基-N-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰)-L-精氨酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N'-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下搅拌均匀；将对氨基苯甲醇溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入上述反应液中，反应3-5小时；反应结束后，纯化产物，得到化合物A；
(2)合成化合物B
将化合物A溶于无水四氢呋喃中，氮气保护，0℃下搅拌预冷；取三溴化磷加入上述反应液中，冰水浴反应2-3小时；反应结束后，加入碳酸氢钠水溶液，乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥、将溶剂旋蒸抽干后，再使用冷冻干燥机干燥，得化合物B；
(3)合成化合物C
将化合物B、花菁染料CyN3OH溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入N,N'-二异丙基乙胺，氮气保护，50～60℃下反应3～4小时；待反应结束后，纯化产物，得到化合物C；
(4)合成化合物D
将化合物C溶于含有哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中以发生反应；反应结束后，加入含有三氟乙酸的甲醇和水的混合溶液至无气泡产生，随后纯化产物，得到化合物D；
(5)合成化合物F
将化合物E、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N'-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护，搅拌均匀；将化合物D溶于N,N-二甲基甲酰胺，加入上述反应液中，反应3-5小时；反应结束后，纯化产物，得到化合物F；
(6)合成化合物G
将化合物F溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中，冰水浴下搅拌反应3小时；反应结束后加入二氯甲烷，再缓慢加入碳酸氢钠水溶液至无气泡产生，再使用水萃取，有机相使用无水硫酸钠干燥、旋蒸抽干溶剂，纯化后得到化合物G；
(7)合成分子探针P
取化合物G、CuSO4·5H2O、抗坏血酸钠、化合物H溶于二甲亚砜和水的混合溶液中，氮气保护下，搅拌反应；反应结束后，纯化产物，冷冻干燥后，得到分子探针P；
其中，所述化合物A、化合物B、花菁染料CyN3OH、化合物C、化合物D、化合物E、化合物F、化合物G、化合物H的结构式如下所示：
Figure BDA0003505536650000041
Figure BDA0003505536650000051
进一步地，所述花菁染料CyN3OH的合成方法为：
将NaN3、1-溴-4-氯丁烷溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌，反应液加入水中，乙醚萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙醚后，产物和NaI溶于丙酮中，60℃回流搅拌；反应结束恢复至室温，反应液加入水中，乙醚萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙醚得到产物2；
将2,3,3-三甲基-3H-吲哚、产物2溶于无水乙腈中，88℃下回流搅拌；反应结束后冷却，逐滴加入乙酸乙酯中，超声、离心，去除上层溶液，得黑色油状产物4；
将POCl3溶于二氯甲烷，逐滴加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液中，氮气保护下搅拌均匀；加入环己酮，80℃下回流搅拌；反应结束恢复至室温，倒入冰水混合物中，0℃下密封，抽滤、冷冻干燥后，得黄色产物6；
将产物4、产物6、醋酸钠溶于醋酸酐中，60℃下搅拌，冷却、提纯、旋蒸干燥后，得金绿色产物7；
将4-氯间苯二酚、碳酸钾在氮气保护下搅拌均匀；将产物7溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入到4-氯间苯二酚溶液中，75℃下搅拌反应；反应结束后冷却、提纯、旋蒸至干燥，得墨绿色产物花菁染料CyN3OH；
其中，所述产物2、产物4、产物6、产物7的结构式如下所示：
Figure BDA0003505536650000061
进一步地，所述化合物E的合成方法为：
取Fmoc-L-Leu-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N- 二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入含有树脂的固相反应管中，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，使用含体积比20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Gln-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N- 二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Lys-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N- 二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取乙酸酐、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；以1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液将肽链从树脂上切割下来，经旋蒸浓缩、无水乙醚沉淀和干燥处理，得化合物E。
进一步地，所述化合物H的合成方法为：
取Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入含有树脂的固相反应管中，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，使用含体积比20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取N,N-羰二咪唑、三乙胺、4-二甲氨基吡啶溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺；
取甲基三氟甲烷磺酸甲酯、三乙胺、H-Lys(Fmoc)-OtBu.HCl溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Gly-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N- 二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Tyr(OtBu)-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、 N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N- 二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Pra-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N- 二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；以1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液将肽链从树脂上切割下来，经旋蒸浓缩、无水乙醚沉淀和干燥处理；
取干燥后的产物加入三氟乙酸的二氯溶液中，搅拌，随后纯化，得到产物H。
本发明另一方面提供了一种可激活多模态分子探针，所述分子探针为分子探针P-125I，其具有如下所示的结构式：
Figure BDA0003505536650000081
进一步地，本发明提供了所述可激活多模态分子探针的制备方法，包括以下步骤：
将分子探针P和Na125I溶于水中，加至涂有1,3,4,6-四氯，3α，6α-二苯苷脲的离心管中， 25℃下振荡15分钟，纯化后，得到分子探针P-125I；
其中，所述分子探针P具有如下所示的结构式：
Figure BDA0003505536650000082
本发明还提供了所述分子探针P或分子探针P-125I在hepsin蛋白酶检测中的应用。
本发明还提供了所述分子探针P或分子探针P-125I在hepsin和PSMA两种独立蛋白体内定量检测中的应用。
发明还提供了所述分子探针P或分子探针P-125I在早期前列腺癌检测中、前列腺癌分期及预后评价中及前列腺癌微小肿瘤灶检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明提供了一种用于前列腺癌的多模态成像的可激活小分子探针P-125I，该探针属于可激活探针，仅在靶细胞内表现出不同的荧光、光声信号以及放射性信号，且荧光发射波长及光声吸收波长均在650nm以上，远离生物体正常吸收信号，而放射性也在正常人体内无背景信号，故具有较高的信噪比。
2.本发明的分子探针的光学信号稳定，波长较长，穿透性好，能进行深层组织的诊断。
3.本发明的分子探针具有较好的前列腺癌的成像能力，可鉴别早期前列腺癌与晚期前列腺癌；并且因其光声成像和放射性成像的优良的穿透性，使前列腺癌的深层组织诊断成为可能；可用于评价前列腺癌的分期，可指导临床治疗方案的选择，对评价前列腺癌的预后有指导作用；还可进行微小肿瘤灶的成像。
4.本发明的分子探针可进行活体内的蛋白纵向定量，即合理拟合出检测信号、肿瘤大小以及蛋白表达之间的曲线。
5.本发明的分子探针具有良好的生物相容性，未见明显细胞毒性。且水溶性极好，可以在较短时间内被肾脏清除。
附图说明
图1为本发明分子探针P的合成路线图；
图2：当加入与不加入hepsin(0.5μg/ml)时，在分析缓冲液(50mM,pH＝7.4)中，37℃下 30分钟，P(浓度为10μM)的紫外吸收光谱图(a)和荧光光谱图(b)，激发波长:650nm；(c)当加入与不加入加入hepsin(0.5μg/ml)时，在分析缓冲液(50mM,pH＝7.4)中，37℃下30分钟，P(10 M)的光声(PA)光谱；(d)在加入与不加入加入hepsin(0.5μg/ml)的情况下，HPLC检测P的孵育混合物的谱图，加hepsin的抑制剂以及在水中检测Cy-PSMAI，激发波长：600nm，误差条代表了三个独立测量值的标准偏差；
图3：(a)早期前列腺癌细胞——LNCaP细胞的荧光成像技术在用P(2μM、红色)孵育2h；用P(2μM)孵育晚期前列腺癌细胞PC3和DU145细胞2h；hepsin抑制剂(Hex,100μM)孵育1h后P(2μM)孵育2h以及用前列腺癌膜抗原抑制剂(PSMAI，400μM)；细胞核使用核染料(hoechst 33342，蓝色)孵育20分钟，比例尺:20M；(b)量化细胞各组孵化后的荧光强度，误差条代表了三个独立测量值的标准偏差；(c)细胞悬液(LNCaP、PC3或DU145)经P(2μM) 联合hepsin抑制剂(Hex,100μM)或者前列腺癌膜抗原抑制剂(PSMAI，400μM)处理1h后的PA谱，误差条代表了三个独立测量值的标准偏差，*:p<0.01；
图4：P或P-125I、P或P-125I+hepsin抑制剂Hex(提前1小时给药)静脉给药后，不同时间点LNCaP荷瘤小鼠的代表性近红外荧光(a)、PA(b)以及SPECT-CT(c)图像，以及P或 P-125I静脉给药后PC3和DU145荷瘤小鼠的图像；图a、b、c中，710nm处的近红外荧光强度、700nm处的PA强度增量以及肿瘤部位的放射性信号强度随探针注射后时间的变化；(d)、 (e)、(g)为其定量结果；(f)在静脉注射探针后2小时，体内肿瘤实时PA强度增量谱；
图5：(a)建立不同大小肿瘤模型示意图；(b)不同大小肿瘤的光声成像；(c)、(d)、(e) 光声信号、肿瘤大小以及hepsin表达绝对量的拟合曲线；(f)不同大小的肿瘤的SPECT-CT 成像；(g)、(h)、(i)SPECT信号、肿瘤大小以及PSMA表达绝对量的拟合曲线；
图6：(a)尾静脉注射P-125I后，微小肿瘤的小鼠随时间变化的SPECT成像；(b)与图a相对应的定量数据。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：合成化合物A
将化合物N-芴甲氧羰酰基-N-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰)-L-精氨酸1500mg、1-羟基苯并三唑800mg、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐3000mg、N,N'-二异丙基乙胺1200μL溶于10mLN,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护，搅拌均匀；将对氨基苯甲醇800 mg溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺，加入上述反应液中，室温反应3-5小时；反应结束后使用高效液相色谱提纯获得化合物A，结构式如下所示。
Figure BDA0003505536650000111
实施例2：合成化合物B
取化合物A 300mg溶于3mL无水四氢呋喃中，氮气保护，0℃搅拌预冷；取30μL三溴化磷加入上述反应液，冰水浴反应2-3小时；反应结束后，加入3％的碳酸氢钠水溶液，乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥、将溶剂旋蒸抽干后再使用冷冻干燥机干燥，得化合物B，结构式如下所示。
Figure BDA0003505536650000112
实施例3：合成花菁染料CyN3OH
取1g NaN3，1-溴-4-氯丁烷3mL溶于3mL无水N,N-二甲基甲酰胺，搅拌，反应液倒入超纯水中，乙醚萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙醚后，产物和3g NaI溶于5mL丙酮中， 60℃回流搅拌；反应结束恢复至室温，反应液倒入超纯水中，乙醚萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙醚得到产物2；
取2,3,3-三甲基-3H-吲哚600μL，产物2溶于3mL无水乙腈，88℃回流搅拌；反应结束后冷却，逐滴加入乙酸乙酯中，超声，离心，去除上层溶液，得黑色油状产物4；
取600μL POCl3溶于1mL二氯甲烷，逐滴加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液中，氮气保护，搅拌均匀；加入300μL环己酮，80℃回流搅拌；反应结束回复至室温，倒入冰水混合物中，0℃密封保存，抽滤，冷冻干燥机干燥，得黄色产物6；
取产物4 100mg，产物6 50mg，醋酸钠5mg溶于醋酸酐3mL中，60℃搅拌，冷却，提纯，旋蒸干燥后，得金绿色产物7；
取4-氯间苯二酚50mg、碳酸钾40mg，氮气保护，搅拌；取产物7 100mg溶于3mL N,N-二甲基甲酰胺，将产物7加入4-氯间苯二酚中，75℃搅拌；反应结束后冷却，提纯，旋蒸至干燥，得墨绿色产物花菁染料CyN3OH。
其中，所述产物2、产物4、产物6、产物7，花菁染料CyN3OH的结构式如下所示：
Figure BDA0003505536650000121
实施例4：合成化合物C
取化合物B 600mg、花菁染料CyN3OH 100mg溶于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺，加入N,N'-二异丙基乙胺300μL，氮气保护，55℃反应3-4小时；待反应结束后使用高效液相色谱提纯得化合物C，结构式如下所示。
Figure BDA0003505536650000122
实施例5：合成化合物D
取化合物C 500mg溶于3mL 20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温手动摇晃3分钟；反应结束后加入含有1％三氟乙酸的甲醇和水的混合溶液至无气泡产生，随后通过高效液相色谱提纯，得到化合物D，结构式如下所示。
Figure BDA0003505536650000131
实施例6：合成化合物E
取Fmoc-L-Leu-OH 600mg、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐1300mg、1-羟基苯并三唑500mg、N,N-二异丙基乙胺600μL溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入含有1g 树脂的固相反应管中，摇床振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，使用含体积比20％哌啶的 N,N-二甲基甲酰胺溶液10mL脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Gln-OH 450mg、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐1300mg、1-羟基苯并三唑500mg、N,N-二异丙基乙胺600μL溶于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，摇床振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液10mL脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Lys-OH 680mg、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐1300mg、1-羟基苯并三唑500mg、N,N-二异丙基乙胺600μL溶于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，摇床振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液10mL脱去Fmoc；
取乙酸酐600μL、N,N-二异丙基乙胺600μL溶于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，摇床振荡；以1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液将肽链从树脂上切割下来，经旋蒸浓缩、无水乙醚沉淀和干燥处理，得化合物E，结构式如下所示。
Figure BDA0003505536650000141
实施例7：合成化合物F
将化合物E 450mg、1-羟基苯并三唑300mg、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐800mg、N,N'-二异丙基乙胺400μL溶于N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护，搅拌均匀；将化合物D 600mg溶于0.5mL N,N-二甲基甲酰胺，加入上述反应液中，室温反应3-5小时；反应结束后使用高效液相色谱提纯获得化合物F，结构式如下所示。
Figure BDA0003505536650000142
实施例8：合成化合物G
取化合物F 300mg溶于二氯甲烷和三氟乙酸混合溶液，冰水浴下搅拌反应3小时；反应结束后加入二氯甲烷，再缓慢加入5％碳酸氢钠水溶液至无气泡产生，再使用去离子水萃取、有机相使用无水硫酸钠干燥、旋蒸抽干溶剂，使用高效液相色谱提纯得化合物G，结构式如下所示。
Figure BDA0003505536650000143
实施例9：合成化合物H
取Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(800mg)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(1300 mg)、1-羟基苯并三唑(500mg)、N,N-二异丙基乙胺(600μL)溶于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入含有1g树脂的固相反应管中，摇床振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，使用含体积比20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液10mL脱去Fmoc；
取N，N-羰二咪唑300mg、三乙胺120μL、4-二甲氨基吡啶120mg溶于5mL无水N,N- 二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，摇床振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺；
取甲基三氟甲烷磺酸甲酯90mg、三乙胺120μL、H-Lys(Fmoc)-OtBu.HCl 650mg溶于5mL 无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，摇床振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以 20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液10mL脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Gly-OH840 mg、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐1300mg、1-羟基苯并三唑500mg、N,N-二异丙基乙胺600μL溶于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，摇床振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液10mL脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Tyr(OtBu)-OH980 mg、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐1300mg、 1-羟基苯并三唑500mg、N,N-二异丙基乙胺600μL溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，摇床振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液 10mL脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Pra-OH630 mg、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐1300mg、1-羟基苯并三唑500mg、N,N-二异丙基乙胺600μL溶于5mL无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，摇床振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液10mL脱去Fmoc；以1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液将肽链从树脂上切割下来，经旋蒸浓缩、无水乙醚沉淀和干燥处理。
取干燥后的产物加入三氟乙酸的二氯溶液，室温搅拌，随后高效液相色谱仪提纯得到产物H，结构式如下所示。
Figure BDA0003505536650000161
实施例10：合成分子探针P
取化合物G 20mg，CuSO4·5H2O 6mg，抗坏血酸钠3mg，化合物H10mg溶于二甲亚砜和水的混合溶液中，氮气保护，搅拌反应；反应结束后，高效液相色谱仪提纯，冷冻干燥机干燥，得分子探针P，结构式如下所示。
Figure BDA0003505536650000162
实施例11：合成分子探针P-125I
取分子探针P 0.5mg和Na125I 1mCi溶液溶于水中，加至涂有1,3,4,6-四氯，3α，6α-二苯苷脲的离心管，25℃振荡15分钟，高效液相色谱仪得分子探针P-125I，结构式如下所示。
Figure BDA0003505536650000163
实施例12：体外酶切实验
图2(a)是P的紫外吸收光谱图，从图中可以发现，P在hepsin存在的条件下，发生了紫外吸收的改变。
图2(b)是通过荧光光谱仪测得P的荧光信号，从图中可以发现，P在hepsin存在的条件下，在720nm波长的荧光强度明显增高。
图2(c)为酶切反应体外光声结果。从图中可以发现，在加入hepsin后，P在680～720nm 范围的吸收明显增加。
图2(d)为HPLC(高效液相色谱仪)分析，从图中可以发现，随着P加入hepsin后， P被hepsin酶切成Cy-PSMAI，即P与hepsin反应的终产物。
图a～d均为体外酶切分析，结果说明hepsin的确与底物P发生酶切反应，随着酶切反应的进行，紫外吸收改变，荧光强度增加；图(c)说明P在被hepsin酶切后，光声信号在680～720nm 范围内明显增高。
实施例13：细胞实验
图3(a)为细胞在经过P处理后的共聚焦显微镜拍下的结果，蓝色为细胞核，红色为P 以及它们的融合(merge)图像，纵向比较可以发现，P对于hepsin高表达的LNCAP为代表的早期前列腺癌细胞有较高的靶向性，而加入了hepsin抑制剂(Hex)后，摄取明显降低；对于hepsin不高表达的PC3和DU145为代表的晚期前列腺癌细胞未见明显摄取，而加了 PSMA抑制剂组，荧光强度明显减弱，但亦有部分增强。
图3(b)为不同种类的细胞不同处理手段后共聚焦定量测得的荧光强度。
图3(c)为不同细胞不同处理手段后细胞悬液测得的光声信号，从图中可以发现，其结果与(a)、(b)吻合。
以上结果表明，P对于hepsin高表达的早期前列腺癌细胞靶向能力强。
实施例14：动物实验
图4(a)为LNCaP细胞、PC3和DU145细胞的荷瘤小鼠不同处理方式后的ivis(小动物活体成像)结果。从图中可以发现，由于良好的靶向性，P在LNCaP肿瘤的富集异常明显，而P-PC3、P-DU145以及P+Hex组在肿瘤内未见明显富集，更加验证了其靶向性好。与此同时，P+PSMAI组的信号得到明显降低，说明其被hepsin酶切后，因其无法特异性结合，故其总信号低于P-LNCaP组。
图4(b)与a图对应的生物体内光声成像，其结果与ivis结果吻合。
图4(c)上述小鼠的SPECT成像，其结果与前者一致。
图4(d)、(e)、(g)分别是a、b、c图成像的定量数据，与成像结果一致。
图4(f)不同荷瘤小鼠不同处理手段后肿瘤区域的光声信号，从图中可以发现，其结果与b吻合。
实施例15：体内纵向定量成像
从图5的结果可知，本实施例把采集的信号、肿瘤大小、分别与预后和分期相关的hepsin 和PSMA两种蛋白联系起来，为前列腺癌的精准诊断，评价分期、评估预后提供了理论依据。
实施例16：微小肿瘤灶成像
将P-125I(200μCi)尾静脉注射至肿瘤直径小于2mm(一般认为小于2mm的肿瘤属于微小肿瘤)的LNCaP荷瘤小鼠体内，在不同时间点进行SPECT成像，结果如图6所示。
从图中可以看出，P-125I对于微小肿瘤灶也有比较明显的检出的能力。
综上，本发明以前列腺癌早期诊断为导向，设计了智能响应型双靶向多功能探针P及 P-125I，实现了集近红外荧光、光声以及放射性成像的一体化。利用前列腺癌早期高表达Hepsin 酶和前列腺癌特异性膜抗原(PSMA)协同调控激活探针并根据特异性结合使探针在肿瘤内部长时间的滞留来实现肿瘤细胞的精准靶向。利用激活后的诊疗分子开启近红外荧光成像，高灵敏检测前列腺癌病灶；利用光声成像获取前列腺癌深层组织信息，利用放射性信号监测 PSMA的表达情况。联合荧光、光声以及放射性成像进行精准诊断、定位。
除此之外，本发明的分子探针对多种模态的成像方式，从各个方面进行前列腺癌的成像，在诊断的同时，赋予了本发明的多重意义，包括但不限于早晚期的鉴别诊断、分期和预后评价、体内蛋白纵向定量以及微小肿瘤成像，而这是其他所有探针所缺失的。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种可激活光学分子探针，其特征在于，所述分子探针为分子探针P，其结构式如下所示：
Figure FDA0003934572250000011
2.根据权利要求1所述的一种可激活光学分子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成化合物A
将化合物N-芴甲氧羰酰基-N-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰)-L-精氨酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N'-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下搅拌均匀，得到N,N-二甲基甲酰胺溶液；将对氨基苯甲醇溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入到N,N-二甲基甲酰胺溶液中，反应3-5小时；反应结束后，纯化产物，得到化合物A；
(2)合成化合物B
将化合物A溶于无水四氢呋喃中，氮气保护，0℃下搅拌预冷，得到四氢呋喃溶液；取三溴化磷加入到四氢呋喃溶液中，冰水浴反应；反应结束后，加入碳酸氢钠水溶液，乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥、将溶剂旋蒸抽干后，再使用冷冻干燥机干燥，得化合物B；
(3)合成化合物C
将化合物B、花菁染料CyN3OH溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入N,N'-二异丙基乙胺，氮气保护，50～60℃下反应；待反应结束后，纯化产物，得到化合物C；
(4)合成化合物D
将化合物C溶于含有哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中以发生反应；反应结束后，加入含有三氟乙酸的甲醇和水的混合溶液至无气泡产生，随后纯化产物，得到化合物D；
(5)合成化合物F
将化合物E、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N'-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下搅拌均匀，得到N,N-二甲基甲酰胺溶液；将化合物D溶于N,N-二甲基甲酰胺，加入到N,N-二甲基甲酰胺溶液中进行反应；反应结束后，纯化产物，得到化合物F；
(6)合成化合物G
将化合物F溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中，冰水浴下搅拌反应；反应结束后，加入二氯甲烷，再加入碳酸氢钠水溶液至无气泡产生；接着使用水萃取，有机相使用无水硫酸钠干燥、旋蒸抽干溶剂，纯化后得到化合物G；
(7)合成分子探针P
取化合物G、CuSO4·5H2O、抗坏血酸钠、化合物H溶于二甲亚砜和水的混合溶液中，氮气保护下，搅拌反应；反应结束后，纯化产物，冷冻干燥后，得到分子探针P；
其中，所述化合物A、化合物B、花菁染料CyN3OH、化合物C、化合物D、化合物E、化合物F、化合物G、化合物H的结构式如下所示：
Figure FDA0003934572250000021
Figure FDA0003934572250000031
3.根据权利要求2所述的一种可激活光学分子探针的制备方法，其特征在于，所述花菁染料CyN3OH的合成方法为：
将NaN3、1-溴-4-氯丁烷溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌，反应液加入水中，乙醚萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙醚后，产物和NaI溶于丙酮中，60℃回流搅拌；反应结束恢复至室温，反应液加入水中，乙醚萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去乙醚后得到产物2；
将2，3，3-三甲基-3H-吲哚、产物2溶于无水乙腈中，88℃下回流搅拌；反应结束后冷却，逐滴加入乙酸乙酯中，超声、离心，去除上层溶液，得黑色油状产物4；
将POCl3溶于二氯甲烷，逐滴加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液中，氮气保护下搅拌均匀；加入环己酮，80℃下回流搅拌；反应结束恢复至室温，倒入冰水混合物中，0℃下密封，抽滤、冷冻干燥后，得黄色产物6；
将产物4、产物6、醋酸钠溶于醋酸酐中，60℃下搅拌，冷却、提纯、旋蒸干燥后，得金绿色产物7；
将4-氯间苯二酚、碳酸钾在氮气保护下搅拌均匀；将产物7溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入到4-氯间苯二酚溶液中，75℃下搅拌反应；反应结束后冷却、提纯、旋蒸至干燥，得墨绿色产物花菁染料CyN3OH；
其中，所述产物2、产物4、产物6、产物7的结构式如下所示：
Figure FDA0003934572250000041
4.根据权利要求2所述的一种可激活光学分子探针的制备方法，其特征在于，所述化合物E的合成方法为：
取Fmoc-L-Leu-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入含有树脂的固相反应管中，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，使用含体积比20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Gln-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Lys-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取乙酸酐、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；以1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液将肽链从树脂上切割下来，经旋蒸浓缩、无水乙醚沉淀和干燥处理，得化合物E。
5.根据权利要求2所述的一种可激活光学分子探针的制备方法，其特征在于，所述化合物H的合成方法为：
取Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入含有树脂的固相反应管中，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，使用含体积比20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取N,N-羰二咪唑、三乙胺、4-二甲氨基吡啶溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺；
取甲基三氟甲烷磺酸甲酯、三乙胺、H-Lys(Fmoc)-OtBu.HCl溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Gly-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Tyr(OtBu)-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；
取Fmoc-L-Pra-OH、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，加入所述固相反应管，振荡；随后排出N,N-二甲基甲酰胺，以20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc；以1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液将肽链从树脂上切割下来，经旋蒸浓缩、无水乙醚沉淀和干燥处理；
取干燥后的产物加入三氟乙酸的二氯溶液中，搅拌，随后纯化，得到产物H。
6.一种可激活多模态分子探针，其特征在于，所述分子探针为分子探针P-125I，其结构式如下所示：
Figure FDA0003934572250000061
7.根据权利要求6所述的一种可激活多模态分子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将分子探针P和Na125I溶于水中，加至涂有1,3,4,6-四氯，3α，6α-二苯苷脲的离心管中，振荡反应，产物经纯化后，得到分子探针P-125I；
其中，所述分子探针P具有如下所示的结构式：
Figure FDA0003934572250000062
8.权利要求1所述的分子探针P或权利要求6所述的分子探针P-125I在制备hepsin蛋白酶检测试剂盒中的应用。
9.权利要求1所述的分子探针P或权利要求6所述的分子探针P-125I在制备hepsin和PSMA两种独立蛋白体内定量检测试剂盒中的应用。
10.权利要求1所述的分子探针P或权利要求6所述的分子探针P-125I在制备早期前列腺癌检测中及前列腺癌微小肿瘤灶检测中的成像药物的应用。
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