ES2876874T3 - Plataforma innovadora de tecnología para la unión específica de células necróticas - Google Patents

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Abstract

Dosificación para su uso en la detección y/o tratamiento de cánceres y/o enfermedades que impliquen la muerte de células necróticas que comprende una cantidad efectiva de un sistema que comprende una primera entidad que es una molécula marcadora para la unión de células necróticas, siendo la molécula marcadora una cianina que no está activada, y es capaz de unirse de forma no covalente a las proteínas intracelulares cuando se pierde la integridad de la membrana de una célula, y no interactúa con el ADN, en el que el sistema comprende además una segunda entidad, a la que se unen las entidades, por ejemplo, mediante un enlace químico, seleccionado de una o más de ellas: (a) Un agente seleccionado entre un compuesto de imagen, un compuesto terapéutico y un factor de liberación; (b) Un vehículo que sea eficaz para transportar el agente; y (c) Una molécula no reactiva en el cuerpo capaz de interactuar con una contraparte, donde la molécula marcadora es un colorante de cianina no reactivo, según la figura 1 I, II y III, **(Ver fórmula)** donde n es un número entero, como nε [2,10], preferiblemente n ε [4,8], la cadena L tiene hasta n-1 dobles enlaces, preferiblemente n/2 dobles enlaces, en las que las subfamilias II y III pueden comprender respectivamente uno y dos sistemas de anillos aromáticos (A, B) representados por la(s) línea(s) curva(s) C, donde A, B son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de benceno y naftalina, en el que pueden estar presentes otros grupos R5, R6, R7 y R8, R5, R6, R7 y R8, se seleccionan preferentemente cada uno de ellos individualmente a partir del H, y el alquilo, como el metilo, el etilo y el propilo, preferentemente el metilo, en el que los sistemas de anillos aromáticos pueden comprender otros grupos funcionales R1, R2, y/o sustitutos, R1, R2, se seleccionan preferentemente cada uno individualmente a partir del H, el sulfonato y la sulfonamida, en la que la cadena de enlaces simples y dobles alternados L puede ser interrumpida por una o más estructuras de anillos parcial y totalmente saturados, como el ciclopenteno y el ciclohexeno, y combinaciones de ellas, como uno o más anillos de ciclohexeno, en el que la estructura de anillo saturado puede comprender además los grupos funcionales R9, siendo seleccionados de H, AA y BB, en el que R10 es seleccionado de, H, SO3H, Cl, -N-C=O-(CH2)q-Y3 (q=1-6), -(CH2 )r-Y4 (r=1-6), Y3 y Y4 son cada uno independientemente uno de H, COOH, SO3H, y CN, donde los átomos de nitrógeno (N) pueden comprender otros grupos funcionales del lado N, R3, R4, donde R3, R4 son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de -(CH2)mY, donde Y es seleccionado cada uno individualmente de un ácido carboxílico que tiene 1-4 átomos de carbono, un grupo sulfonato, CN, C≡C, y C=C, y sus sales, donde dichos grupos del lado N comprenden m átomos de carbono, como m ε [1,10], preferentemente m ε [2,8], más preferentemente m ε [3,7], más preferentemente m= 4,5, y 6, aún más preferentemente al menos uno de m = 4, 5 y 6, preferiblemente uno m = 6, y el otro m preferiblemente es 4, 5 o 6, donde dichos grupos de lado N- comprenden uno o más grupos funcionales en el final opuesto al N, como un ácido carboxílico habiendo 1-4 átomos de carbono, un grupo sulfónico, y sales del mismo, como sales de sodio y potasio, más preferentemente el grupo funcional en el final comprende uno o más dobles enlaces C-C, preferentemente un carboxilato del mismo, y/o donde la molécula marcadora tiene carga negativa, donde el uso implica la administración de la dosis en una cantidad de 0,1-1000 nMol sistema/kg de peso corporal.

Description

DESCRIPCIÓN
Plataforma innovadora de tecnología para la unión específica de células necróticas
Campo de la Invención
La invención está relacionada con un sistema que comprende una molécula marcadora para la unión a células necróticas; con el sistema para su uso como medicamento; con el uso del sistema para el diagnóstico; con el sistema para su uso en el tratamiento de enfermedades que impliquen la muerte de células necróticas, con una dosis que comprenda el sistema; con un método para determinar la localización de la composición dentro de una muestra utilizando dicho sistema; y, con un método para el tratamiento de cánceres y/o enfermedades que impliquen la muerte de células necróticas utilizando dicho sistema. En particular, la invención se refiere a compuestos que tienen como objetivo las células necróticas.
Antecedentes de la Invención
Los sistemas y métodos previos que implican la selección de células muertas no son óptimos y/o aplicables:
a. Muerte celular necrótica vs. Apoptótica
El marcaje de la necrosis es específico y único porque la necrosis sólo aparece en condiciones patológicas de muerte celular debido a un suministro insuficiente de sangre y, por lo tanto, a la falta de oxígeno, debido a un traumatismo o debido a la acción directa de agentes citotóxicos o a otros tratamientos contra el cáncer como la radioterapia o la terapia fotodinámica. Esto contrasta con la muerte celular apoptótica, que se produce continuamente durante la renovación de los tejidos. Por lo tanto, la muerte celular apoptótica, a diferencia de la muerte celular necrótica, no puede usarse para marcar enfermedades caracterizadas por la necrosis como las que se encuentran, por ejemplo, en el caso de tumores (los tumores de crecimiento rápido desarrollan espontáneamente núcleos necróticos), traumatismos, infartos, osteoartritis, diabetes, placas arterioscleróticas, quemaduras, ciertas infecciones bacterianas, etc.
b. Anticuerpos contra moléculas pequeñas
Nuestros compuestos son pequeñas moléculas, tintes a base de cianina, que penetran profundamente en el tejido necrótico. Los anticuerpos han sido usados para atacar la necrosis (Tumor Necrosis Targeting) pero tienen la desventaja de que son demasiado grandes para penetrar en el tejido necrótico.
c. Otros agentes químicos frente a los tintes de cianina
Hay otros agentes químicos (por ejemplo, los agentes PDT) que son conocidos por etiquetar las células necróticas (por ejemplo, la hipericina, los derivados de la bacterioclorofila, la gadofrina-2A y el bis-DTPA-NI). Estos agentes tienen características específicas que los hacen menos adecuados para la obtención de imágenes y la terapia de las enfermedades mencionadas anteriormente, dado que son (1.) difíciles de producir químicamente, son (2.) fotosensibles (los compuestos generarán radicales de oxígeno y cambiará sus propiedades en caso de exposición a la luz), (3.) la eliminación de estos agentes del cuerpo tarda mucho más tiempo (hasta varios días) y (4.) los compuestos son relativamente grandes, lo que dificulta la penetración en el tejido necrótico. Los tintes de cianina son fáciles de producir químicamente, son fotoestables, se eliminan rápidamente del cuerpo (de 3 a 24 horas) y penetran profunda y fácilmente en el tejido necrótico.
Se pueden obtener más detalles sobre los antecedentes en las solicitudes presentadas anteriormente PCT/NL2013/050067 y PCT/NL2013/050064.
Se pueden considerar los siguientes documentos:
Madhuri Dasari y otros, Organic Letters, 2010, 12(15), 3300-3303, describen un agente para visualizar mediante imágenes, que detecta el tejido necrótico in vivo mediante la unión del ADN extracelular.
El presente invento no se relaciona con la unión del ADN. Las moléculas de unión al ADN se consideran generalmente inadecuadas para su uso en humanos debido a la alta probabilidad de que dichas moléculas sean mutagénicas/cancerígenas.
Bryan A Smith y otros, URL:http://etd.nd.edu/ETD-db/theses/available/etd-04132012-141111/unrestricted/SmithBryan 042012D.pdf, enumera imágenes in vivo de la muerte celular usando complejos de coordinación sintéticos fluorescentes. En una de las figuras, el documento muestra un numeroso grupo de moléculas marcadoras deapoptosis acopladas a un colorante de cianina
La cianina de estos complejos se utiliza únicamente como marcador fluorescente.
Epstein A L y otros, Cancer Research, 1988, 48(20), 5842-5848 se refiere a un método para la detección de lesiones necróticas en cánceres humanos. Este se basa en el uso de anticuerpos como diana de una fracción acoplada a un colorante usado como identificador.
La producción, el almacenamiento y la utilización de anticuerpos es muy difícil, costosa y de alto riesgo en cuanto a los efectos adversos.
Vera D y otros, Nuclear Medicine and Biology, 2005, 32, 687-693, se refiere a una prueba fluorescente para la medición in vivo de la bioquímica de los receptores.
Uzgiris E E y otros, Technology in Cancer Research and Treatment, 2006, 5(4), 301-309, se refiere a un agente de contraste multimodal para la obtención de imagen de RM preoperatoria y la delineación del margen tumoral intraoperatorio.
Lia T et al, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2010, 20, 7124-7126, se describe el uso de una sonda de bajo peso molecular cercana al IR para el cáncer de próstata.
En todos los trabajos de Vera D y otros, Uzgiris E E y otros y Lia T y otros se menciona el uso de cianinas como molécula marcadora acoplada a diversas variedades de objetivos.
US 2012/088262 A1 se refiere a los compuestos de cianina, sus conjugados y los métodos para su uso. Específicamente dicho documento describe las cianinas amino-reactivas.
Se observa que todas las proteínas comprenden aminas. Las moléculas amino-reactivas se unen a cualquier proteína sin grandes diferencias de afinidad. En las muestras biológicas, como la sangre y los tejidos, hay una gran cantidad de proteína extracelular presente. Por lo tanto, no se puede lograrser selectivo para, por ejemplo, las células muertas en la muestra. En vivo, la fuerte unión covalente a las proteínas dará lugar a una eliminación muy lenta del cuerpo, lo que aumenta la posibilidad de que se produzcan efectos adversos.
Fang F et al., Spectrochimica Acta. Parte A: espectroscopia molecular y biomolecular, 2006, 64(3), 698-702, se refiere a la determinación de ácidos nucleicos con tintes de cianina cercanos al IR mediante técnicas de dispersión de la luz. Se identifica la afinidad de las cianinas por el ADN y el ARN.
Los agentes aglutinantes del ADN tienen un uso limitado en los seres humanos, como se ha mencionado anteriormente. Hong Zheng et al., Analytical Biochemistry, 2003, 318, 86-90, describe un ensayo de unión de colorantes utilizando una sonda de cianina de onda larga y describe la interacción del colorante SHMC con varias proteínas.
Sólo se identifican las aplicaciones analíticas.
Volkova K D y otros, Journal of Biochemical and Biophysical Chemisty, 2007, 70, 727-733 se refiere a las sondas fluorescentes para estructuras amiloides y en particular a las cianinas capaces de unir agregados del péptido amiloide-13.
La unión es el resultado de la interacción entre el colorante y las características del agregado amiloide-3, no con péptidos individuales de amiloide-3. Los agregados de amiloide-3 son extracelulares.
US 2005/014216 relata el uso de rodaminas y faloidina capaces de unirse a las proteínas intracelulares como sondas para la hepatotoxicidad.
Haibiao Gong y otros, PLoS One, 2012, 7(3), e34003, XP055093071, se relaciona con la imagen de fluorescencia cercana al IR de células de mamíferos y tumores de xenoinjerto con SNAP-Tag.
Este documento describe sólo las aplicaciones de la química click (en este caso a través de SNAP-Tag).
Un objetivo de la presente invención es superar una o más desventajas de los compuestos del arte previo para así, proporcionar alternativas a los compuestos actuales para el diagnóstico y tratamiento de cánceres y otras enfermedades que impliquen la muerte de células necróticas, sin poner en peligro la funcionalidad y las ventajas.
Resumen de la Invención
La presente invención describe un sistema que comprende una molécula marcadora para la unión de células necróticas, y uno o más de un agente, un vehículo y una molécula no reactiva en el cuerpo según la reivindicación 1.
El sistema actual comprende por lo menos dos entidades, las cuales están unidas, por ejemplo, por un enlace químico, y además cada entidad cumple una función distinta dentro del sistema. Se observa que puede haber más de un agente presente, así como más de un vehículo y más de una molécula no reactiva. Como tal, por ejemplo, una terapia de combinación es factible con el sistema actual.
La molécula marcadora actual es muy selectiva y muy específica en la unión con las células necróticas. Como resultado de ello, pueden utilizarse cantidades muy pequeñas (c.s.) en concentraciones muy bajas. del sistema actual para proporcionar efectos ventajosos del mismo. Cabe señalar que los rastreadores específicos para la apoptosis, a diferencia de los rastreadores específicos para la necrosis, también se dirigen al tejido sano, ya que la apoptosis está implicada en la renovación normal del tejido.
En investigaciones anteriores de los actuales inventores se ha descubierto que la molécula marcadora se une específicamente de forma no covalente a proteínas intracelulares como la actina, que sólo están disponibles para la molécula marcadora cuando se pierde la integridad de la membrana de una célula, es decir, en el caso de una célula necrótica. Para un marcaje óptimo, las células necróticas, están preferentemente en una etapa temprana de necrosis, como las células que han estado muertas durante menos de unos pocos días, preferiblemente menos de medio día, como unas pocas horas, como 2 horas, como sólo las células muertas. Las características de las moléculas marcadoras de la presente invención, responsables de su marcaje efectivo y/o de su seguridad, son que son impermeables a la membrana celular, es decir, no pueden atravesar (significativamente) la membrana celular de las células sanas; no están activadas; son capaces de unirse de forma no covalente a las proteínas intracelulares (sus moléculas diana); y no son capaces/no se unen significativamente al ADN (o ARN).
En caso de que el sistema comprenda un agente, puede relacionarse con un compuesto de imágenes, por ejemplo, para su uso en una técnica de imágenes, un compuesto terapéutico, a fin de proporcionar un efecto terapéutico a las células necróticas o a una parte del cuerpo (que incluya a las células necróticas) que necesiten ese tipo de terapia, como un cáncer, y un factor de liberación, para liberar otro compuesto que actúe, por ejemplo, como un estímulo.
En caso de que el sistema comprenda un vehículo, éste funciona como un medio de transporte para llevar una entidad a las células necróticas, o como se ha mencionado arriba, a una parte del cuerpo. Como tal cantidad diminuta de entidad puede ser marcada y transportada a un lugar deseado en un cuerpo. El vehículo puede transportar el agente actual, puede transportar un compuesto relacionado con el agente, una entidad diferente y combinaciones de ellas.
En caso de que el sistema comprenda una molécula no reactiva en el cuerpo, se pretende que esta molécula interactúe con una contraparte. La interacción puede (además) estar relacionada con una o más de las siguientes acciones: activación por un activador, apoyo mediante un catalizador, generación de un medicamento al interactuar y liberación de un medicamento al interactuar. Cabe señalar que, desde un punto de vista funcional, la molécula y la contraparte pueden intercambiarse.
El sistema se relaciona con pequeñas moléculas no tóxicas, que tienen la capacidad de unirse a células y tejidos necróticos. Estas moléculas no interactúan con el ADN, es decir, no son mutagénicas. Típicamente el sistema actual tiene una amplia biodistribución, cruza la barrera hematoencefálica, no se une a las proteínas de la superficie celular y es suficientemente estable.
En un ejemplo llamado ChemoTrace®, se ahorra un tiempo crucial durante el tratamiento del cáncer. ChemoTrace® proporciona instantáneamente datos relevantes sobre la eficacia del fármaco quimioterapéutico administrado. Una ventaja del sistema actual es que informa en un plazo de 24 a 36 horas después del inicio de la quimioterapia si la terapia es efectiva o no. El uso de ChemoTrace® evitará que los pacientes sufran duros tratamientos sin beneficios clínicos, lo que se considera una mejora importante en la terapia contra el cáncer. El uso de ChemoTrace® resultará en un ahorro de costes.
Se observa que, lamentablemente, la tasa de respuesta (positiva) a la quimioterapia se limita al 20-35 %. Además, el número de ciclos de tratamiento suele limitarse a un máximo de cuatro debido a las limitaciones del cuerpo humano. En otras palabras, es crucial identificar una terapia adecuada desde el principio, antes de iniciar un ciclo. Al identificar en una etapa temprana del tratamiento si éste es eficaz, el tratamiento en sí mismo puede llevarse a cabo si se considera eficaz y puede descartarse si se considera ineficaz. En el caso de un tratamiento no eficaz se puede iniciar un segundo tratamiento de la misma manera. Éste puede repetirse un número de veces más. Una vez que un tratamiento se considera eficaz, puede iniciarse un ciclo de quimioterapia. Se observa que la identificación puede repetirse para todas y cada una de las quimioterapias.
ChemoTrace® evita el sobretratamiento, ahorrando los medicamentos utilizados para evitar los efectos secundarios de los fármacos citotóxicos.
Con el sistema actual no es necesario cultivar las células tumorales recogidas, por ejemplo, para realizar pruebas, lo que puede llevar un período de tiempo relativamente largo, por ejemplo, una semana. Las células necróticas se marcan en su entorno natural, lo que, por ejemplo, reduce el riesgo de errores humanos.
ChemoTrace® puede utilizarse para medir la eficacia de los fármacos citotóxicos in vivo para todos los tumores sólidos, lo que lo convierte en un sistema ideal para la clínica. Una de sus ventajas es que in vivo se muestra con las características reales, mientras que in vitro puede introducir desviaciones de las características reales.
ChemoTrace® proporciona datos en tiempo real en el aspecto anterior, sin necesidad de realizar una punción para recoger células tumorales. A este respecto, cabe señalar que mediante la punción sólo se obtiene una muestra de un tumor. La muestra obtenida no es necesariamente una representación real del tumor. Además, se observa que un tumor es morfológicamente heterogéneo. E incluso más aún, el tumor puede desarrollar características morfológicas con el tiempo. La consecuencia de ello es que una muestra obtenida por punción a lo sumo da una indicación de las características del tumor. La presente invención da las características en tiempo real y con un alto grado de certidumbre. ChemoTrace® proporciona conclusiones sólidas sobre los puntos anteriores, por ej., mediante mediciones directas, mientras que las técnicas del arte previo sólo proporcionan una indicación de las características.
En un aspecto, el presente invento describe un dispositivo que mide el efecto en las células tumorales, así como en el tejido sano causado por la radioterapia, llamado Actinotrace®.
En un aspecto, la presente invención describe un dispositivo que es un escáner de cuerpo entero para detectar células muertas en el cuerpo humano con fines de prevención, llamado NC-Scan®.
En un aspecto, el presente invento describe una plataforma de entrega para el tratamiento del cáncer mediante la focalización de células necróticas en un tumor, llamada Ilumicore®.
En un aspecto, el presente invento describe una plataforma para hacer llegar compuestos activos y regenerativos a una zona necrótica causada por un evento isquémico como un infarto de miocardio o un derrame cerebral, isquemia de hígado, riñón u otro órgano, traumatismo, artrosis o heridas por quemaduras, llamada Regenext®.
En un aspecto, el invento describe una alternativa no nuclear para un escáner mamográfico, llamado Mammolight®. En un aspecto, el presente invento describe un dispositivo para la administración selectiva de (quimio)terapia en tumores sólidos, llamado Chemoclick®.
En un aspecto, el invento describe una terapia térmica dirigida (terapia hipertermal), llamada Hyperthermys®.
Las enfermedades actuales se relacionan, entre otras cosas, con el cáncer, el tejido infartado de, por ejemplo, el corazón y el cerebro, la osteoartritis, las enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer.
La presente invención también describe el uso del compuesto como medicamento; para el uso del sistema en un método de diagnóstico, el uso del sistema para el tratamiento de enfermedades que impliquen la muerte de células necróticas, para el uso de la composición para detectar y/o marcar células necróticas in vivo y/o in vitro; para una dosis que comprenda dicho sistema; para un método para determinar la localización del compuesto dentro de una muestra utilizando dicho compuesto; y, para un método para el tratamiento de cánceres y/o enfermedades que impliquen la muerte de células necróticas utilizando dicho compuesto.
Se ha descubierto que las moléculas marcadoras del presente invento se unen a las células muertas (necróticas) de forma muy selectiva.
Como se ha mencionado anteriormente, los actuales inventores han descubierto que las células necróticas y/o la necrosis en general son objetivos atractivos. Esto se relaciona con la observación de que las regiones de las células necróticas suelen estar presentes en los cánceres (tumores), por ejemplo, debido a un suministro insuficiente de sangre y, por lo tanto, a la falta de oxígeno, y en las enfermedades que implican la muerte de las células necróticas (o son el resultado de ellas). Se observa que las regiones de células necróticas no suelen encontrarse en el interior del tejido sano. Entre los ejemplos de enfermedades que entrañan la muerte de células necróticas figuran los infartos o las lesiones isquémicas (por ejemplo, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, riñón, hígado, etc.), los traumatismos (por ejemplo, cerebrales, musculares o óseas) infecciones, o las inflamaciones (por ejemplo, shock séptico, artritis reumatoide, osteonecrosis), enfermedades degenerativas (por ejemplo, Alzheimer, demencia por/asociada a Parkinson), placas (arteriosclerótica, amiloide), heridas por quemaduras, necrosis inducida por radiación y diabetes.
En lo que respecta al cáncer, una vez que se ha identificado un tumor, se puede inducir intencionadamente la muerte de más células necróticas (por ejemplo, mediante irradiación local, terapia fotodinámica o térmica local y/o ultrasonido focalizado) en una parte del tumor para proporcionar un objetivo más amplio para el compuesto. Además, cuando el compuesto actual se utiliza con fines terapéuticos, el número de células necróticas aumentará a medida que avance la terapia, lo que dará lugar a una amplificación de la dosis en función del tiempo.
Una discusión útil sobre la clasificación de la muerte celular puede encontrarse en Kroemer y otros, Cell Death and Differentiation, 2005, 12, 1463. En la presente solicitud, las células necróticas se toman como células cuya membrana plasmática ha perdido su integridad. Una persona con habilidad en la materia es capaz de determinar si una membrana plasmática está intacta, es decir, es íntegra, por ejemplo, mediante el uso de colorantes fluorescentes, como los colorantes comerciales amina reactivos. La selectividad de la composición de la presente invención para las células muertas, es decir, las células cuya membrana plasmática ha perdido la integridad, puede demostrarse en pruebas in vitro, como se verá en los ejemplos que figuran a continuación. Es importante señalar que los colorantes amina reactivos que se unen a las células muertas sólo son útiles in vitro. In vivo, reaccionarían con las aminas, por ejemplo, de las proteínas u otros compuestos de la sangre, y no podrían servir para atacar a las células necróticas.
El término de forma selectiva indica que el compuesto marcador tiene una mayor afinidad con las células necróticas que con las células sanas (por lo tanto, las moléculas marcadoras pueden dirigirse a las células necróticas). Ello puede determinarse en un ensayo in vitro, como en los ejemplos que aquí se presentan, o por ejemplo mediante citometría de flujo; en ambos métodos puede utilizarse la tinción conjunta, por ejemplo, utilizando los equipos comerciales de tinción de células muertas-vivas. En términos sencillos, la unión selectiva en la presente invención indica que para una población determinada de células que comprenden la necrosis y las células sanas, el número de moléculas marcadoras unidas a las células necróticas es al menos un orden de magnitud mayor que el número de moléculas marcadoras unidas a las células sanas, normalmente unos pocos órdenes de magnitud, y preferiblemente 6 o más órdenes de magnitud, como 9 órdenes.
Las cianinas no activadas son cianinas no reactivas, a por ejemplo, las aminas y los tioles. Las cianinas no activadas no pueden unirse significativamente (la reacción es termodinámicamente desfavorable) a las células muertas (a los grupos funcionales de sus moléculas) mediante la unión covalente a aminas, tioles u otros grupos funcionales reactivos presentes en las moléculas que se encuentran dentro de las células. Es decir, que la unión selectiva a las células necróticas en el contexto de la presente invención no se produce mediante la unión covalente, sino más bien mediante la unión no covalente a través de la estructura central de la cianina y no a través de las cadenas laterales a las que se unen los grupos activos. El término cianina activada es conocido por una persona con habilidad en la materia e incluye, por ejemplo, ácidos carboxílicos activados como ésteres, ésteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas, cloruros de acilo, ésteres de SDS, etc. Las cianinas no activadas incluyen, por ejemplo, cianinas que comprenden funciones de ácido carboxílico, es decir, el ácido carboxílico no está activado.
Se observa que las cianinas activadas pueden utilizarse en la formulación del compuesto, por ejemplo, con el fin de unir un compuesto de imagen y/o terapéutico a la cianina; en la composición, sin embargo, la cianina no está activada y seguirá uniéndose a las células necróticas a través de la estructura central de la cianina.
Las ventajas de la presente descripción se detallan a lo largo de la misma.
Descripción Detallada
Se observa que los ejemplos dados, así como las representaciones de los mismos no se consideran limitantes. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones.
En un primer aspecto, el presente invento describe un sistema que comprende una molécula marcadora para la unión a células necróticas, siendo la molécula marcadora seleccionada de una cianina o cualquier otro colorante fluorescente, incluyendo las rodaminas, que se unen específicamente de forma no covalente a las proteínas intracelulares. Las proteínas para la unión pueden estar relacionadas con proteínas fibrosas, como las proteínas de 40 kDa, las proteínas de 100 kDa, como las tubulinas, como la a-tubulina, lap-tubulina, la Y-tubulina, la 5-tubulina, yla £-tubulina, actinas, como la G-actina y la F-actina, proteínas estructurales fibrosas, como la queratina, como la queratina neutra, básica o ácida, como la queratina 1 - queratina 20, metaloenzimas, como la enolasa y la liasa, CDC37, preferiblemente tubulina, más preferiblemente actina, sus isómeros, sus complejos y sus productos de descomposición. Estas proteínas sólo están disponibles para la molécula marcadora cuando se pierde la integridad de la membrana, por ejemplo, en el caso de una célula necrótica. La selectividad para la unión a las células necróticas puede determinarse, por ejemplo, utilizando el ensayo de células muertas de hielo seco descrito a continuación, en combinación con la microscopía fluorescente.
Preferiblemente hay una afinidad dos veces mayor para las células necróticas en comparación con las células vivas, preferiblemente al menos 10 veces, más preferiblemente al menos 1.000 veces, como al menos 1.000.000- veces. De forma similar, la afinidad de la molécula marcadora por una o más de las proteínas anteriores comparada con la afinidad por el ADN es al menos 2 veces mayor, preferiblemente al menos 10 veces mayor, preferiblemente al menos 1.000 veces mayor, por ejemplo, al menos 1.000.000 veces mayor, ya que la molécula marcadora no se une y/o no puede unirse al ADN, es decir, la molécula marcadora no se une significativamente al ADN o al ARN.
La molécula marcadora es un colorante de cianina no reactivo, según la figura 1 I, II y III, donde n es un número entero, como ne [2,10], preferiblemente ne [4,8], la cadena L tiene hasta n-1 dobles enlaces, preferiblemente n/2 dobles enlaces, dónde las subfamilias II y III pueden comprender respectivamente uno y dos sistemas de anillos aromáticos (A, B) representados por la(s) línea(s) curva(s) C,
donde A, B son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de benceno y naftalina, donde los grupos adicionales R5 , R6 , R7 , y R8 , pueden estar presentes, R5 , R6 , R7 , y R8 son preferentemente individualmente de H, y alquil, como el metilo, el etilo, y el propilo, preferentemente el metilo,
en el que los sistemas de anillos aromáticos pueden comprender otros grupos funcionales R1 , R2 , y/o sustitutos, R1 , R2 , se seleccionan preferentemente cada uno individualmente a partir del H, el sulfonato y la sulfonamida,
en la que la cadena de enlaces simples y dobles alternados L puede ser interrumpida por una o más estructuras de anillos parcial y totalmente saturados, como el ciclopenteno y el ciclohexeno, y combinaciones de ellas, como uno o más anillos de ciclohexeno, en el que la estructura de anillo saturado puede comprender además los grupos funcionales Rg , siendo seleccionados de H, a A y BB, en el que R10 es seleccionado de, H, SO3H, Cl, -N-C=O-(CH2)q-Y3(q=1-6), -(CH2)r-Y4 (r=1-6), Y3 y Y4 son cada uno independientemente uno de H, COOH, SO3H, y CN,
donde los átomos de nitrógeno (N) pueden comprender otros grupos funcionales del lado N, R3, R4, donde R3 , R4 son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de -(CH2)mY, donde Y es seleccionado cada uno individualmente de un ácido carboxílico que tiene 1-4 átomos de carbono, un grupo de sulfonato, CN, Ce C, y C=C, y sus sales correspondientes,
donde dichos grupos del lado N comprenden m átomos de carbono, como m e[1,10], preferentemente m e[2,8], más preferentemente me [3,7], más preferentemente m= 4, 5, y 6, e incluso aún más preferentemente al menos uno de m = 4, 5, y 6, preferiblemente un m = 6, y el otro m preferiblemente es 4, 5 o 6,
donde dichos grupos N- comprenden uno o más grupos funcionales en el lado terminal opuesto al N, como un ácido carboxílico habiendo 1-4 átomos de carbono, un grupo sulfónico, y sales de este, como sales de sodio y potasio, más preferentemente el grupo funcional del final comprende uno o más dobles enlaces C-C, preferentemente un carboxilato del mismo, y/o en donde la molécula marcadora es neutra o negativamente cargada. Tras realizar pruebas, especialmente con las cianinas mencionadas anteriormente, se ha comprobado que son muy adecuadas, por ejemplo, en términos de selectividad. Ventajosamente, se ha descubierto que las cianinas de la invención que tienen una carga negativa se unen preferentemente a las proteínas intracelulares en presencia de otros componentes celulares como, por ejemplo, el ADN y el ARN. Es decir, las cianinas del invento que tienen una carga negativa no muestran en general ninguna unión significativa al ADN o al ARN.
La molécula marcadora se selecciona preferentemente entre: HQ4, HQ5, HQ6, HQ7, ICG, CW 800, ZW800, L4, L7, L11, CY3, CY3b, CY3.5, CY5, CY5.5, CY7, Dy 676, Dy 681, Dy 731, Dy 751 y Dy 776; y, más preferentemente, se selecciona entre HQ4, HQ5, CW800 y ZW800. Estos compuestos se presentan en la figura 2. Algunos de estos compuestos tienen, por ejemplo, muy buenas propiedades fluorescentes. Esto es bastante inesperado, ya que un compuesto en sí mismo puede tener buenas propiedades fluorescentes, pero éstas pueden cambiar al unirse a otra molécula, como la proteína presente.
En un ejemplo, el agente es (uno o más de los siguientes (a), (b) y (c)): ( a) Un compuesto para obtención de imágenes seleccionado de un grupo que consiste en un compuesto luminiscente, un trazador radioactivo, un agente de contraste para resonancia magnética o agente espectroscópico, un agente RFA (ablación por radiofrecuencia), un agente PET, un agente SPECT, un agente de contraste o microburbujas de ultrasonido, un agente de contraste o nanopartículas optoacústicas, un agente de contraste CT, un agente para espectroscopia Raman o combinaciones de ellos. En otras palabras, con el sistema actual puede utilizarse un compuesto adecuado para la obtención de imágenes; sorprendentemente, una amplia gama de esos compuestos para la obtención de imágenes puede estar añadida al sistema actual. Como tal, se dispone de una amplia gama de técnicas de obtención de imágenes. Se ha comprobado que dichas técnicas de formación de imágenes son muy sensibles, es decir, que pueden detectarse pequeñas cantidades de células necróticas, de forma muy precisa, es decir, que pueden identificarse localizaciones muy pequeñas que comprenden células necróticas, de manera muy fiable y muy segura, por ejemplo, en cuanto a los resultados. El agente también puede ser un compuesto terapéutico. Como en el caso anterior, el compuesto terapéutico puede ser llevado a las células necróticas, utilizando una pequeña cantidad del mismo, pero proporcionando una cantidad relativamente alta del mismo en una ubicación prevista, es decir, las células necróticas. El compuesto terapéutico (o uno o más de ellos) puede ser seleccionado de un grupo que consiste en agentes quimioterapéuticos, compuestos foto dinámicos, compuestos hipertérmicos (incluyendo agentes foto térmicos), agentes inmunomoduladores, proteínas y péptidos, ácidos nucleicos (basados en ARN o ADN), medicamentos (como anticuerpos), y/o combinaciones de ellos. Como tal, se pueden llevar a cabo muchas terapias, así como combinaciones de ellas. El agente también puede ser uno o más factores de liberación para estimular la regeneración de los tejidos, como los factores de crecimiento y las células madre. Es posible la reparación y/o regeneración de tejidos y células.
En un ejemplo, el vehículo se selecciona de un grupo compuesto por: un liposoma, un dendrímero, una partícula biodegradable, una micela, una nanopartícula, una partícula disociable acústica, una partícula disociable por pH, una partícula disociable por luz, una partícula disociable por calor, una fracción quelante y combinaciones de ellas. Dependiendo del sistema actual, por ejemplo, en lo que respecta a la presencia de otros componentes, puede seleccionarse un vehículo adecuado. Asimismo, puede seleccionarse una combinación de vehículos. Por ejemplo, una fracción quelante puede utilizarse para transportar In, F, Ga, Gd y Tc.
Los vehículos pueden considerarse sustancias que sirven como mecanismos para mejorar la entrega y la eficacia de los fármacos. Los vehículos pueden utilizarse para la liberación controlada a fin de disminuir el metabolismo del fármaco, prolongar la acción del fármaco in vivo y reducir su toxicidad. Los vehículos actuales también se utilizan para aumentar la eficacia de la entrega del fármaco en un lugar determinado, por ejemplo, para una acción farmacológica.
En un ejemplo, la molécula no reactiva con el cuerpo, que puede denominarse click A, es capaz de interactuar con una homóloga, que puede denominarse click B. La molécula no reactiva es preferentemente uno o más de un primer componente de Química-Click, un segundo componente de Química-Click (complementario del primer componente de Química-Click) y un componente de un marcador de proteína autoetiquetada como la de "snap-tag". Preferiblemente los componentes de la Química-Click 'click' sin necesidad de un catalizador como el cobre(I).
En un segundo aspecto, el presente invento describe el sistema de la invención para su uso como medicamento. Como se ha mencionado anteriormente, el sistema actual puede comprender un compuesto terapéutico. El sistema puede, por tanto, actuar como un medicamento. Se prefiere utilizar el medicamento actual para tratar enfermedades, dolencias, etc., que se identifican a lo largo de la aplicación.
En un tercer aspecto, el presente invento describe el uso del sistema de la invención como un método de diagnóstico, como la resonancia magnética, SPECT, RFA (ablación por radiofrecuencia), PET, CT, espectroscopia Raman, ultrasonido, óptica y optoacústica. Dado que el sistema actual tiene características superiores para la obtención de imágenes, se prefiere el diagnóstico por uno o más de los métodos mencionados.
En un cuarto aspecto, el presente invento describe el sistema de la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades que implican la muerte de células necróticas, incluyendo infartos o lesiones isquémicas, tales como el infarto de miocardio, el ACV (accidente cerebro vascular) y el renal, el traumatismo, como el traumatismo en el cerebro, en un músculo, un hueso, infecciones o inflamaciones, como el shock séptico, la artritis reumatoide y la osteonecrosis, enfermedades degenerativas como el Alzheimer, la demencia, demencia por/asociada a Parkinson, placas como las arterioscleróticas y amiloides, y la diabetes. Otros ejemplos de enfermedades para las que puede utilizarse el sistema para el tratamiento se incluyen a lo largo de la descripción.
En un aspecto la presente invención se relaciona con la dosis necesaria para la detección y/o tratamiento de cánceres y/o enfermedades que impliquen la muerte de células necróticas, que incluya una cantidad efectiva del sistema de la invención.
La dosis comprende una cantidad de 0,1-1000 nMol sistema/kg de peso corporal, preferentemente 0,5-500 nMol sistema/kg de peso corporal, más preferentemente 1-250 nMol sistema/kg de peso corporal, incluso más preferentemente 2-100 nMol sistema/kg de peso corporal, como 5-50 nMol sistema/kg de peso corporal; esto puede estar relacionado con una dosis de, por ejemplo, 0,01-1 mgramo. La dosis se suministra preferentemente en una solución fisiológica de 1-50 ml. Se proporciona preferentemente un kit que comprende algunas dosis (1-50).
En un sexto aspecto, la presente invención describe un método para determinar la localización dentro de una muestra, dicha muestra comprende una población de células que comprende células necróticas, lo que incluye:
(a) Proporcionar un sistema de acuerdo con la presente invención;
(b) Realizar una o más mediciones de la muestra con al menos una primera técnica de imagen adecuada que proporcione un valor o valores, y
(c) Analizar dicho valor o valores de la medición para determinar la localización, opcionalmente por comparación con un conjunto de valores de referencia. Al menos algunas de las técnicas mencionadas son muy adecuadas en este sentido. El método puede llevarse a cabo in vivo e in vitro.
En un séptimo aspecto la presente invención describe un método para el tratamiento de cánceres y/o enfermedades que implican necrosis que incluye:
(a) Administrar la composición de la presente invención en la que la composición comprende uno o más compuestos terapéuticos.
(b) Determinar la localización de la composición dentro del cáncer y/o la muerte celular necrótica.
(c) Activar la liberación de al menos el/los compuesto/s terapéutico/s del vehículo y/o activar el/los compuesto/s terapéutico/s. El tratamiento puede llevarse a cabo in vivo.
La invención se detalla además por los Ejemplos y figuras acompañantes, que son modelos y exposiciones de la naturaleza y no limitan el alcance de la invención. Para el experto en la materia puede estar claro que muchas variantes, sean obvias o no, pueden concebirse dentro del alcance de la protección, definido por las presentes reivindicaciones.
Figuras
Las figuras 1a-c muestran las estructuras genéricas de tres subfamilias principales de la cianina actual. La cianina es un nombre no sistemático de una familia de colorantes sintéticos que pertenece al grupo de la polimetina. Se refiere a la cadena central de carbono en la figura 1; n es un número entero, como ne [2,10], preferentemente n e[4,8]. La cadena L tiene hasta n-1 dobles enlaces, preferentemente n/2 dobles enlaces. Las subfamilias II y III pueden comprender respectivamente uno y dos sistemas de anillos aromáticos (A, B) representados por la(s) línea(s) curva(s) C. A, B se seleccionan preferentemente cada uno individualmente a partir del benceno y la naftalina. Los grupos R5, R6 , R7 y Rs pueden estar presentes. R5 , R6 , R7 , y Rs , son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de H, y alquilo, como el metilo, el etilo, y el propilo, preferentemente el metilo. Los sistemas de anillos aromáticos pueden comprender otros grupos funcionales R1, R2 , y/o sustitutos. R1, R2 , son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de H, sulfonato, y sulfonamida. La cadena de enlaces simples y dobles alternados L puede ser interrumpida por una o más estructuras de anillos parcial y totalmente saturados, como el ciclopenteno y el ciclohexeno, y sus combinaciones, como uno o más anillos de ciclohexeno. La estructura de anillos saturados puede comprender además los grupos funcionales R9 , seleccionándose R9 entre H, AA y BB. R10 se selecciona entre, H, SO3H, Cl, -N-C=O-(CH2)q-Y3 (q=1-6), -(CH2)r-Y4 (r=1-6). Y3 y Y4 son cada uno de ellos independientemente uno de H, COOH, SO3H, CN. Los átomos de nitrógeno (N) pueden comprender otros grupos funcionales del lado N, R3 , R4. R3 , R4 son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de -(CH2)mY. Y se selecciona cada uno individualmente de un ácido carboxílico que tiene 1-4 átomos de carbono, un grupo de sulfonato, CN, CeC, y C=C, y sus sales. Los grupos del lado N comprenden m átomos de carbono, como me[1,10], preferentemente me [2,8], más preferentemente me [3,7], más preferentemente m= 4,5, y 6, incluso más preferentemente al menos uno de m = 4, 5, y 6, preferentemente uno m = 6, y el otro m preferentemente es 4, 5 o 6. Los grupos del lado N comprenden uno o más grupos funcionales en un extremo opuesto al N, como un ácido carboxílico que tiene 1-4 átomos de carbono, un grupo sulfónico, y sales del mismo, como sales de sodio y potasio. Preferentemente el grupo funcional en el extremo final comprende uno o más dobles enlaces C-C.
El término cianina se refiere a cualquier compuesto cuya estructura central es la de la subfamilia I, II o III. El número entero en los nombres de las cianinas como Cy 3, Cy 5, Cy 7 etc. se refiere al número de átomos de carbono en la cadena L. En un ejemplo de representación, la cianina pertenece a una de estas familias.
La figura 2 muestra una estructura genérica de una Rodamina; R1 a R12 pueden ser hidrógeno o un grupo funcional, ejemplos de grupos funcionales adecuados son los grupos de ácido sulfónico, grupos de ácido carboxílico, sulfonamidas, alcoholes, aminas, ésteres, éteres, tioles, tioésteres y sus combinaciones. El término Rodamina se refiere a cualquier compuesto cuya estructura central sea la que se muestra en la Fig. 2.
En las figuras 3(a)-(j) se muestran las estructuras de los compuestos a los que se hace referencia en toda la aplicación. Cuando se muestra un contraión, éste puede ser por ejemplo H+ , Na+ o K+ .
En las Fig. 4-5 se dan ejemplos preferidos de las actuales moléculas marcadoras.
Las Fig. 6-11 muestra los resultados de los experimentos, que se detallan a continuación.
La figura 12 muestra una representación esquemática del NP-CW800.
La figura 13 muestra la estructura del DTPA-CO-NH-PEG-NH2.
La Fig. 14 muestra la estructura del DTPA-CO-NH-PEG-HQ4.
Las Fig. 15 a, b muestra las estructuras de dos variantes de Click A-HQ4-DTPA.
La Fig. 16 muestra la estructura del Click A-ZW800-DTPA.
Las figuras 17a, b muestra las estructuras de dos variantes de Click A-ZW800-NOTA.
La figura 18 muestra la estructura del ClickA-ZW800 modificado (en grupos de amonio)-NOTA.
La Fig. 19a muestra la estructura del ZW800-linker-NOTA y el Click A
La figura 19b muestra la estructura del HQ4-linker-NOTA y el Click A
Con referencia a las figuras 6-11:
Tecnología de medición
En esta investigación se han aplicado varias técnicas existentes y/o desarrolladas internamente:
Fluorescencia
[Wikipedia:]” La fluorescencia es la emisión de luz por una sustancia que ha absorbido luz u otra radiación electromagnética de cierta longitud de onda. En la mayoría de los casos, la luz emitida tiene una longitud de onda mayor, y por lo tanto menor energía, que la radiación absorbida."
Las mediciones con fluorescencia, así como la fluorescencia in vivo, son difíciles de cuantificar. La intensidad medida en un ser vivo o en un tejido celular depende -además del brillo intrínseco del propio compuesto fluorescente y su concentración- también de las propiedades físicas del compuesto químico, es decir, la relación de unión con las proteínas que lo rodean y el tipo de interacciones con ellas y la distribución de la sustancia a través del tejido.
Por último, la sensibilidad y la especificidad de las mediciones dependen en gran medida del protocolo del experimento. Ensayo de células muertas por hielo seco
El dióxido de carbono sólido en el etanol (-80 °C) se utiliza para congelar el centro de un pozo de una placa de 24 pocillos con un cultivo de células vivas (y posiblemente otros componentes). El procedimiento se ha optimizado utilizando un bloque enfriado con clavijas que se mantiene durante un cierto período de tiempo (la mayor parte de las veces unos aprox. 15 seg.) en el fondo de la placa de 24 pocillos. El resultado es la congelación y la consiguiente muerte de las células del centro rodeadas de células aún vivas, lo que permite realizar estudios comparativos entre las células muertas y las vivas.
En los pozos de cultivo se aplica un medio que contiene compuestos que pueden discriminar entre células vivas y muertas. Después de la incubación, la capa de células es lavada y visualizada.
Modelo de ratón con Crio lesión
Un pequeño cilindro de metal de 3 mm de diámetro se preenfría en nitrógeno líquido y se aplica a la región parietal de la cabeza de un ratón anestesiado durante 20 o 60 segundos. Después de un cierto período de tiempo se inyecta el colorante (en una cierta concentración) en la vena de la cola. Pasadas 3 - 24 horas tras la inyección pueden ser obtenidas imágenes de los ratones.
La selectividad de la composición de la presente invención para las células necróticas, es decir, las células cuya membrana plasmática ha perdido integridad, se demuestra en pruebas in vitro como se mostrará en los ejemplos siguientes.
Matrigel
Matrigel es una mezcla de proteínas gelatinosas secretadas por células específicas de sarcoma de ratón. En este invento se utiliza como una matriz endógena para las células muertas que se implanta bajo la piel de un ratón. Si estas células también son etiquetadas se confirma que los colorantes y las estructuras se distribuyen por todo el cuerpo, por lo que también fuera del flujo sanguíneo.
MSOT
La Tomografía Optoacústica Multiespectral es una técnica para la obtención de imágenes de cuerpo entero de marcadores bioquímicos en pequeños animales. La absorción de la luz causa una pequeña expansión térmica que genera ondas acústicas. Éstas pueden ser detectadas y convertidas en una imagen tridimensional.
Prueba de Concepto
Figura 6
Datos de citometría de flujo usando HQ5 en células adherentes (4T1) y no adherentes (JURKAT) tratadas o no con el agente citotóxico Estaurosporina. La sonda sólo tiñe las células tratadas con estaurosporina, que han perdido la integridad de su membrana celular.
Figura 7
Microscopía confocal de: a: células tratadas con ácido gambógico (un agente inductor de necrosis) y b: células viables. C-D: Tinción conjunta de una F-actina usando faloidina co-localizada con HQ5 indicando la unión de actina con HQ5. (c: Células tratadas con ácido Gambógico d: Células tratadas con estaurosporina).
Figura 8
Para mostrar la capacidad del HQ5 de unirse a células necróticas in vivo se indujo una criolesión local del cerebro previo a la inyección del HQ5. Además, el Matrigel con o sin células necróticas fue trasplantado subcutáneamente. E1HQ5 se acumula específicamente tanto en la crio-lesión como en el matrigel con células necróticas, pero no en el matrigel sin células necróticas.
Figura 9
Para mostrar la capacidad del HQ5 de unirse a células necróticas in vivo en un modelo más fisiológico que las criolesiones, se inyectó el HQ 4-DTPA que contiene In-111 radioactivo en ratones portadores de tumores con un núcleo necrótico. A. Se observó una fluorescencia específica del tumor HQ4 24 horas después de la inyección del producto marcador que duró por lo menos hasta 72 horas. B. Se detectó una señal SPECT radioactiva específica 24 horas después de la inyección del marcador que duró por lo menos hasta 72 horas. C. Se observó la co-localización ex vivo de la señal fluorescente y la señal radiactiva con el núcleo necrótico.
Figura 10
Con el fin de investigar la posibilidad de utilizar tintes de cianina para llevar nanopartículas PLGA a las zonas necróticas, se inyectaron nanopartículas PLGA recubiertas con o sin CW800 en animales con una criolesión del cerebro. A bajas concentraciones (diluidas 2 veces o más) las nanopartículas PLGA recubiertas con CW800 se acumularon selectivamente en la zona necrótica, mientras que las nanopartículas PLGA de control no recubiertas no lo hicieron. Figura 11
Se sabe que la terapia fotodinámica causa necrosis. Las nanopartículas PLGA recubiertas de CW800 fueron inyectadas 6 horas después del tratamiento fotodinámico de un tumor 4T1 en el lado izquierdo del animal. Un segundo tumor en el lado derecho permaneció sin tratar. Las nanopartículas de PLGA recubiertas por el CW800 sólo se acumularon en el lugar del tumor tratado.
Sistemas complementarios de la invención
Ejemplo 1 - Con referencia a la figura 12
Preparación de PLGA NP. La PLGA NP con un marcador fluorescente de infrarrojo cercano retenido se preparó utilizando una emulsión o/w y método de evaporación-extracción del solvente. En resumen, se añadieron 90 mg de PLGA en 3 ml de DCM que contenían el marcador de infrarrojo cercano (NIR) 700 nm (680R de LI-COR) (3 mg) en forma de gota a gota a 25 mL de PVA acuoso al 2% (w/s) en agua destilada y se emulsionaron durante 90 segundos utilizando un sonicador (Branson, sonofier 250). Una combinación de lípidos (DSPE-PEG(2000) amina (8 mg) y mPEG 2000 PE (8 mg)) se disolvieron en DCM y se añadieron al vial. El DCM fue eliminado por una corriente de gas nitrógeno. Posteriormente, la emulsión se añadió rápidamente al vial que contenía los lípidos y la solución se homogeneizó durante 30 segundos utilizando un sonicador. Tras la evaporación nocturna del disolvente a 4°C, los NP de la PLGA se recogieron por ultra centrifugación a 60000 g durante 30 min, se lavaron tres veces con agua destilada y se liofilizaron.
Conjugando el CW800-NHS con los NP de la PLGA. Los CW800-NHS fueron conjugados con la preparación de NPs de PLGA que contienen aminas DSPE-PEG (2000). Posteriormente, las partículas (50 mg) se disolvieron en 0,5 mL de tampón carbonatado (pH 8,5) y el CW800-NHS activado (1 mg) se añadió a las partículas durante 1 h a temperatura ambiente. El CW800-NHS sin aglutinar se eliminó por centrifugación (10000 g, durante 10 min) y el PLGA NPs-CW800 se lavó cuatro veces con PBS. La cantidad de CW800 en la superficie de las partículas se determinó mediante el escaneo Odyssey (tabla 1).
Dispersión dinámica de la luz y potencial Zeta. Las mediciones de la dispersión dinámica de la luz (DLS) en todas las nanopartículas se realizaron en un instrumento de dispersión de luz ALV equipado con una Correlación de Tau Múltiple ALV5000/60X0 y un láser Oxxius SLIM-532 de 150 mW DPSS operado a una longitud de onda de 532 nm. Un baño de correspondencia del índice de refracción de cis-decalina filtrada rodeaba la célula de dispersión cilíndrica, y la temperatura se controlaba a 21,5 ± 0,3°C con un termostato Haake F3-K. Para cada muestra se registró diez veces la función de autocorrelación, g2(t), con un ángulo de detección de 90°. Para cada medición se determinó el coeficiente de difusión, D, utilizando el acumulador de segundo orden y se calculó el diámetro de la partícula correspondiente suponiendo que las partículas tenían forma esférica (véase la tabla 1). El potencial zeta de todas las nanopartículas se determinó en un Malvern ZetaSizer 2000 (Reino Unido).
Figure imgf000011_0001
Ejemplo 2 - con referencia a la figura 13
Síntesis de DTPA-PEG-NH2.
El DTPA que contiene el enlace amínico PEG (4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamina, indicado como PEG-NH2 en la fórmula (DTPA-PEG-NH2) fue sintetizado en la resina Cl-TrtCl. Así, la amina Fmoc-PEG fue incorporada sobre la resina Cl-TrtCl (resina CTC) al reaccionar 3 eq. de la amina Fmoc-PEG en presencia de 6 eq. DIEA en DCM durante la noche a temperatura ambiente. La carga final se midió por cuantificación de Fmoc: el valor obtenido fue de alrededor de 0,8 mmol/g. La eliminación del grupo Fmoc se llevó a cabo con piperidina-DMF (1:5) (1 x 1 min, 2 x 10 min). A continuación, se acopló el DTPA-(éster tetra-tBu)-COOH (2 eq.) utilizando DIPCDI (2 eq.) y HOBt (2 eq.) en Dm F durante toda la noche. Después de acoplar durante la noche la prueba de ninhidrina fue negativa. Más tarde, la separación y desprotección de la resina DTPA-(tetra-tBu éster)-CO-NH-PEG-CTC se realizó en dos pasos. La resina DTPA-(tetratBu éster)-CO-NH-PEG-CTC fue tratada con 1% de TFA en DCM durante 10 veces a razón de 1 min cada vez. El exceso de DCM se eliminó usando vacío y los grupos de protección de cadena lateral se eliminaron usando 95% TFA, 2,5% TIS y 2,5% de agua. El DTPA-CO-NH-PEG-NH2 se precipitó con MTBE frío después de la eliminación de TFA bajo una corriente de N2. El DTPA-CO-NH-PEG-NH2 fue disuelto en agua y liofilizado para obtener el producto final. El DTPA-CO-NH-PEG-NH2 deseado tenía un rendimiento del 85,0% con una pureza del 90,6% según el análisis de HPLC (tR 2,28 min). HPLC-MS, m/z calc.: 523.25 para C20H37N5O11, Encontrados: 524.5.28 [M+1]+ y MALDI-TOF Encontrados 524.2 [M+1 ]+ 546.3 [M+Na].
Ejemplo 3 - con referencia a la figura 14
Síntesis de DTPA-CO-NH-PEG-NH2 -HQ4
El HQ4-NHS (8.3x10-4 mmol, 1 mg) disuelto en 50 pL de DMSO fue agregado al DTPA-CO-NH-PEG-NH2 (2.8 x 10-3 mmol, 2 mg) disuelto en 200 pL de DMSO que contiene 5 pL de DIEA y agitado durante la noche a temperatura ambiente. Más tarde, el complejo DTPA-CO-NH-PEG-HQ4 fue purificado por RP-HPLC. El Dota-PEG-HQ5 deseado tenía un rendimiento del 50,5% con una pureza del 98% según el análisis de la HPLC (tR 5,34). HPLC-MS, m/z calc.: 1331.59 para C66H90N8O17S2, Encontrados: 1332.0[M+1]+ y MALDI-TOF Encontrados 1331.9 [M+1]+ 1353.9 [M+Na]. Se muestran otros ejemplos de sistemas según la invención en las figuras 15 a 19.
Figuras 15a y 15b - variantes de Click A-HQ4-DTPA
Click A = 2-cianobenzotiazol
Vehículo = Ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA)
Figura 16 - ClickA-ZW800-DTPA
Click A = 2-cianobenzotiazol
Vehículo = Ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA)
Figuras 17a y 17b - variantes de ClickA-ZW800-NOTA
Click A = 2-cianobenzotiazol
Vehículo = 2,2,2-(1,4,7-triazanonano-1,4,7-triil)-triacetato (NOTA)
Figura 18 - ClickA-ZW800-modificado (en los grupos de amonio)-NOTA
Click A = 2-cianobenzotiazol
Vehículo = 2,2,2-(1,4,7-triazanonano-1,4,7-triil)-triacetato (NOTA)
Se observa que mientras que en los ejemplos 16-18, R=SO3-(es decir, la cianina es el compuesto ZW800), R puede ser también otra fracción, como por ejemplo H, alquilo, etc., siempre que la cianina resultante esté comprendida en el ámbito de una o más de las reivindicaciones.
Figura 19a - ZW800-linker-NOTA y Click A
Click A = 2-cianobenzotiazol
Vehículo = 2,2,2-(1,4,7-triazanonano-1,4,7-triil)-triacetato (NOTA)
Figura 19b - HQ4-linker-NOTA y Click A
Click A = 2-cianobenzotiazol
Vehículo = 2,2,2-(1,4,7-triazanonano-1,4,7-triil)-triacetato (NOTA)
Como alternativa a los sistemas de las reivindicaciones 15-18, en los que el vehículo y el click A (en la molécula no reactiva del cuerpo que es capaz de interactuar con una contraparte) se proporcionan en los grupos funcionales primero y segundo distintos de la cianina, tanto el vehículo como el click A (en la molécula no reactiva del cuerpo que es capaz de interactuar con una contraparte) pueden estar vinculados a un único grupo funcional de la cianina utilizando un enlazador bifuncional, como por ejemplo a través de la lisina, como se muestra en la figura 19. En la figura 19a, el click A y el NOTA están vinculados a través del grupo de ácido carboxílico del ZW800. Se puede aplicar una estrategia similar para enlazar a través de un brazo lateral, es decir, el nitrógeno de un grupo de amonio.
Un experto en la materia se dará cuenta de que existen otras combinaciones de molécula marcadoras y: (a) agente, (b) vehículo y/o (c) molécula no reactiva en el cuerpo siendo capaz de interactuar con una contraparte, son posibles, por ejemplo, Click A-HQ4-NOTA, Click A-HQ5-NOTA/DTPA, Click A-CW800-NOTA/DTPA, Click A-ZW800-NOTA/DTPA etc. NOTA y DTPA son ejemplos de ligandos quelantes adecuados para transportar un agente, como un ion metálico.
Glosario
Células 4T1 Células de cáncer de mama de origen murino.
4T1-luc2 Las mismas células, pero modificadas genéticamente para tener luciferasa-2, una enzima que puede convertir la luciferina (luc) acompañada de la radiación de la luz. Así, después de la administración de luc estas células pueden ser detectadas.
BSA Albúmina de suero bovino, una proteína soluble en agua del suero bovino que se utiliza para todo tipo de aplicaciones biológicas, entre otras para estudiar la unión de una sustancia a las proteínas.
CRO Organización de Investigación por Contrato
FACS Clasificación de células activadas por fluorescencia, una técnica en la que se puede medir la fluorescencia de un flujo de células individuales.
fCs Suero Fetal de Ternero, un suero de origen mencionado, con una aplicación comparable al líquido BSA Lysate A que contiene células que se descomponen y donde la integridad y la organización han desaparecido.
MALDI-TOF La ionización MALDI Desorción/ionización mediante láser asistido por Matriz acoplada a un analizador TOF (Tiempo-de-Vuelo) es una técnica de química analítica de espectrometría de masas que se usa para determinar la masa molecular de una entidad química; permitiendo así el análisis de biomoléculas y moléculas orgánicas grandes MALDI es una técnica de ionización "suave", mientras que TOF es una tecnología de detección particularmente adecuada para moléculas grandes (pesadas).
MRI Imagen por Resonancia Magnética, una técnica de imagen médica, que utiliza el principio de la RMN.
Ensayo-MTS Es un ensayo calorimétrico que mide la viabilidad de la célula. Cuanto más alta es la señal, más viables son las células.
MSOT Tomografía Optoacústica Multiespectral, véase el párrafo 3.2.
NIRF Fluorescencia de infrarrojo cercano.
RMN Resonancia magnética nuclear, un fenómeno físico en el que los átomos con propiedades específicas (es decir, ser magnéticos, tener un spin) pueden absorber y reemitir radiación de una longitud de onda específica del átomo. PDT Terapia fotodinámica es una forma de fototerapia que utiliza compuestos no tóxicos sensibles a la luz, los cuales, cuando se exponen selectivamente a la luz, se vuelven tóxicos para las células malignas seleccionadas y otras células enfermas.
TEP Tomografía de emisión de positrones
PKPD Farmacocinética y Farmacodinámica estudian cómo se comporta la sustancia en un cuerpo vivo (biodisponibilidad, distribución, metabolismo) y cómo interactúa con el objetivo biológico (unión, tiempo de permanencia) SDS-PAGE La electroforesis en gel de poliacrilamida con Dodecil Sulfato de Sodio es una técnica para separar mezclas de proteínas en proteínas individuales (o mezclas con menos componentes)
SPECT La tomografía computarizada de emisión de un solo fotón es una técnica de imágenes que utiliza rayos gamma. Es capaz de proporcionar verdadera información en 3D. Esta información se presenta típicamente como cortes transversales a través del paciente, pero puede ser libremente reformateada o manipulada según se requiera.
[Wikipedia]
TUNEL El marcado del final de corte dedUTP de Terminal desoxinucleotidil transferasa (TUNEL por sus siglas en inglés) es un método para detectar la fragmentación del ADN mediante el etiquetado del extremo terminal de los ácidos nucleicos [Wikipedia]. Se utiliza como una herramienta de etiquetado de tejido necrótico.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Dosificación para su uso en la detección y/o tratamiento de cánceres y/o enfermedades que impliquen la muerte de células necróticas que comprende una cantidad efectiva de un sistema que comprende una primera entidad que es una molécula marcadora para la unión de células necróticas, siendo la molécula marcadora una cianina que no está activada, y es capaz de unirse de forma no covalente a las proteínas intracelulares cuando se pierde la integridad de la membrana de una célula, y no interactúa con el ADN, en el que el sistema comprende además una segunda entidad, a la que se unen las entidades, por ejemplo, mediante un enlace químico, seleccionado de una o más de ellas:
(a) Un agente seleccionado entre un compuesto de imagen, un compuesto terapéutico y un factor de liberación;
(b) Un vehículo que sea eficaz para transportar el agente; y
(c) Una molécula no reactiva en el cuerpo capaz de interactuar con una contraparte, donde la molécula marcadora es un colorante de cianina no reactivo, según la figura 1 I, II y III,
Figure imgf000014_0001
donde n es un numero entero, como n e [2,10], preferiblemente n e [4,8], la cadena L tiene hasta n-1 dobles enlaces, preferiblemente n/2 dobles enlaces,
en las que las subfamilias II y III pueden comprender respectivamente uno y dos sistemas de anillos aromáticos (A, B) representados por la(s) línea(s) curva(s) C,
donde A, B son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de benceno y naftalina,
en el que pueden estar presentes otros grupos R5, R6, R7 y R8, R5, R6, R7 y R8 , se seleccionan preferentemente cada uno de ellos individualmente a partir del H, y el alquilo, como el metilo, el etilo y el propilo, preferentemente el metilo, en el que los sistemas de anillos aromáticos pueden comprender otros grupos funcionales R1, R2 , y/o sustitutos, R1, R2 , se seleccionan preferentemente cada uno individualmente a partir del H, el sulfonato y la sulfonamida, en la que la cadena de enlaces simples y dobles alternados L puede ser interrumpida por una o más estructuras de anillos parcial y totalmente saturados, como el ciclopenteno y el ciclohexeno, y combinaciones de ellas, como uno o más anillos de ciclohexeno, en el que la estructura de anillo saturado puede comprender además los grupos funcionales R9 , siendo seleccionados de H, AA y BB, en el que R10 es seleccionado de, H, SO3H, Cl, -N-C=O-(CH2)q-Y3 (q=1-6), -(CH2 )r-Y4 (r=1-6), Y3 y Y4 son cada uno independientemente uno de H, COOH, SO3H, y CN,
donde los átomos de nitrógeno (N) pueden comprender otros grupos funcionales del lado N, R3, R4, donde R3 , R4 son preferentemente seleccionados cada uno individualmente de -(CH2)mY, donde Y es seleccionado cada uno individualmente de un ácido carboxílico que tiene 1-4 átomos de carbono, un grupo sulfonato, CN, C=C, y C=C, y sus sales,
donde dichos grupos del lado N comprenden m átomos de carbono, como m e [1,10], preferentemente m e [2,8], más preferentemente m e [3,7], más preferentemente m= 4,5, y 6,
aún más preferentemente al menos uno de m = 4, 5 y 6, preferiblemente uno m = 6, y el otro m preferiblemente es 4, 5 o 6, donde dichos grupos de lado N- comprenden uno o más grupos funcionales en el final opuesto al N, como un ácido carboxílico habiendo 1-4 átomos de carbono, un grupo sulfónico, y sales del mismo, como sales de sodio y potasio, más preferentemente el grupo funcional en el final comprende uno o más dobles enlaces C-C, preferentemente un carboxilato del mismo,
y/o donde la molécula marcadora tiene carga negativa,
donde el uso implica la administración de la dosis en una cantidad de 0,1-1000 nMol sistema/kg de peso corporal.
2. Dosificación para un uso según la reivindicación 1, donde la dosis se proporciona en una solución fisiológica de 1-50 ml.
3. Dosificación para un uso según la reivindicación 1 y/o 2, donde la molécula marcadora se selecciona de: HQ4, HQ5, HQ6, HQ7, ICG, CW 800, ZW800, L4, L7, L11, CY3, CY3b, CY3. 5, CY5, CY5.5, CY7, Dy 676, Dy 681, Dy 731, Dy 751 y Dy 776; y, se selecciona preferentemente entre HQ4, HQ5, CW800 y ZW800.
4. Una dosis para un uso de acuerdo con una o más de las reivindicaciones anteriores, en la que el agente es:
(a) Un compuesto de imagen seleccionado de un grupo que consiste en un compuesto luminiscente, un trazador radioactivo, un agente de contraste o espectroscópico para IRM, un agente PET, un agente RFA (Ablación por radiofrecuencia), un agente SPECT, un agente de contraste o microburbujas de ultrasonido, nanopartículas optoacústicas o agente de contraste, un agente de contraste CT, un agente Raman y combinaciones de estos; y/o (b) Un compuesto terapéutico seleccionado de un grupo formado por agentes quimioterapéuticos, compuestos fotodinámicos, compuestos hipertérmicos (incluidos los fototérmicos), agentes inmunomoduladores, proteínas y péptidos, ácidos nucleicos (basados en ARN o ADN), medicamentos (como los anticuerpos) y combinaciones de ellos; y/o
(c) Un factor de liberación para estimular la regeneración de los tejidos, como los factores de crecimiento y las células madre.
5. Una dosis para un uso de acuerdo con una o más de las afirmaciones anteriores, en la que el vehículo se selecciona de un grupo que consiste en: un liposoma, un dendrímero, una partícula biodegradable, una micela, una nanopartícula, una partícula disociable acústica, una partícula disociable de pH, una partícula disociable de luz, una partícula disociable por calor, una fracción quelante y combinaciones de ellas.
6. Una dosis para su uso de acuerdo con una o más de las reivindicaciones anteriores, en la que la molécula no reactiva con el cuerpo que es capaz de interactuar con una contraparte se selecciona de: un primer componente de la Química Click, un segundo componente de la Química Click que es complementario al primer componente de la Química Click, y un componente de un etiquetador de proteína auto-etiquetable como la de Snap-Tag.
7. Dosificación para un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la dosis comprende 0,5-500 nMol sistema/kg de peso corporal, preferentemente 1-250 nMol sistema/kg de peso corporal, más preferentemente 2­ 100 nMol sistema/kg de peso corporal, como 5-50 nMol sistema/kg de peso corporal.
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