CN106029108B - 特异性结合坏死细胞的突破性平台技术 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包括结合坏死细胞的靶向分子的系统；该系统作为药物的用途；该系统在诊断上的应用；在治疗涉及坏死性细胞死亡的疾病中应用的系统，包含该系统的剂量；使用所述系统确定样品内所述组合物的定位的方法；和，使用所述系统用于治疗涉及坏死性细胞死亡的癌症和/或疾病的方法。特别是，本发明涉及靶向坏死细胞的组合物。

Description

特异性结合坏死细胞的突破性平台技术
技术领域
本发明涉及一种包含用于结合坏死细胞的靶向分子的系统；该系统作为药物的用途；该系统在诊断上的应用；在治疗涉及坏死性细胞死亡的疾病中应用的该系统，包含该系统的剂量；使用所述系统确定样品内所述组合物的定位的方法；和，使用所述系统用于治疗涉及坏死性细胞死亡的癌症和/或疾病的方法。特别是，本发明涉及靶向坏死细胞的组合物。
发明背景
现有技术中涉及靶向坏死细胞的系统和方法不是最佳的和/或适用的：
a.坏死性对比凋亡性细胞死亡
坏死的靶向是特异的和独特的，因为坏死只出现在细胞死亡的病理情况下，所述病理情况归因于不充足的血液供应并因此氧气缺乏、创伤或者归因于直接的细胞毒性剂或其它如放射性治疗或光动力疗法的癌症治疗。凋亡性细胞死亡与之相反，其在组织更新过程中连续发生。因此相比于坏死性细胞死亡，凋亡性细胞死亡是不适用于靶向特征为坏死的疾病，所述坏死是例如在肿瘤(快速生长的肿瘤自发性进展坏死核)、创伤、梗塞、骨关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化斑块、烧伤、某些细菌感染等的情况下发现的。
b.抗体对比小分子
我们的化合物是小分子、青色素基染料(cyanine based dyes)，其深深的渗入到坏死组织中。抗体已经被用于靶向坏死(肿瘤坏死靶向)，但是具有抗体太大而不能渗入到坏死组织中的缺点。
c.其它化学试剂对比青色素染料
还有其它化学试剂(例如PDT-试剂)，其已知用于标记坏死细胞(例如金丝桃素，细菌叶绿素衍生物，Gadophrin-2A和bis-DTPA-NI)。这些试剂具有特殊的性质，这使得它们不太适用于上述疾病的成像和治疗，这些试剂是(1.)难以化学制备，这些试剂是(2.)光敏性的(在暴露在光的情况下，该化合物将产生氧自由基并改变它们的性质)，(3.)从体内清除需要更长的时间(长达数天)和(4.)这类化合物相对比较大，这使得它们更难以渗入到坏死组织中。青色素染料是易于化学制造的，是光稳定性的，是快速从体内清除的(3至24小时)以及深深地和容易地渗入到坏死组织中。
在背景技术中更多的细节可以从以前提交的申请PCT/NL2013/050067和PCT/NL2013/050064中获得。
下列文件可以被考虑：
Madhuri Dasari等人，Organic Letters，2010，12(15)，3300-3303，叙述了通过结合胞外DNA而在体内检测坏死组织的成像剂。
本发明不涉及DNA的结合。DNA结合分子通常被认为是不适合用于人类，因为这种分子是致突变/致癌高几率的。
Bryan A Smith等人，URL：http://etd.nd.edu/ETD-db/theses/available/etd- 04132012-141111/unrestricted/SmithBryan042012D.pdf，叙述了在体内细胞死亡的成像，使用荧光合成配位复合物。在一个方面，该文件叙述了与青色素染料偶联的一些凋亡性靶向分子。
在这些复合物中的青色素被仅用作荧光报告剂(fluorescent reporter)。
Epstein A L等人，Cancer Research，1988，48(20)，5842-5848涉及一种用于检测在人类癌症中坏死病灶的方法。其依赖于使用与作为报告剂的染料偶联的作为靶向部分的抗体。
就不利影响的方面而言，抗体的生产、储存和使用是非常困难，昂贵和高风险的。
Vera D等人，核医学和生物学(Nuclear Medicine and Biology)，2005年，32，687-693，涉及一种用于在体内测量受体生物化学的荧光探针。
Uzgiris E E等人，癌症研究和治疗技术(Technology in Cancer Research andTreatment)，2006，5(4)，301-309，涉及一种用于术前MR成像和术中肿瘤边缘界定的多模式造影剂。
Lia T等人，生物有机化学和药物化学杂志(Bioorganic and MedicinalChemistry Letters)，2010年，20，7124-7126，涉及一种用于前列腺癌的低分子量的近红外探针。
Vera D等人，Uzgiris E E等人和Lia T等人都叙述了使用青色素作为偶联各种靶向部分的报告分子。
US 2012/088262 A1涉及青色素化合物，缀合物和它们的使用方法。具体而言，所述文件叙述了胺反应性的青色素。
应当注意的是，所有的蛋白质包含胺。胺反应性分子将结合在亲和性上不具有很大差异的任意蛋白质。在生物样品中，如血液和组织，存在着大量的胞外蛋白。因此不能实现对样品中例如死细胞的选择性。在体内，强共价结合到蛋白质将仅导致从体内非常缓慢的清除，这增加了不利影响的几率。
Fang F等人，光谱化学学报.A部：分子和生物分子光谱学(SpectrochimicaActa.Part A：molecular and biomolecular spectrosocopy)，2006年，64(3)，698-702，涉及使用光散射技术用近红外青色素染料测定核酸。青色素对于DNA和RNA的亲和性是相同的。
如先前所确定的，DNA结合剂在人类中的应用受限。
Hong Zheng等人，分析生物化学(Analytical Biochemistry)，2003年，318，86-90，涉及一种使用长波吸收青色素探针的染料结合测定法并且描述了染料SHMC与各种蛋白质的相互作用。
只有分析性应用是相同的。
Volkova K D等人，生物化学和生物物理化学杂志(Journal of Biochemical andBiophysical Chemisty)，2007年，70，727-733涉及用于淀粉样蛋白结构的荧光探针，和特别是能够结合淀粉样蛋白-β肽聚集体的青色素。
结合起因于染料与淀粉样蛋白-β聚集体(而不是个别淀粉样蛋白-β肽)特征之间的相互作用。淀粉样蛋白-β聚集体是在细胞外的。
US 2005/014216涉及使用能够结合胞内蛋白的若丹明类(rhodamines)和鬼笔环肽(phalloidin)作为用于肝毒性的探针。
Haibiao Gong等人，PLoS One，2012，7(3)，e34003，XP055093071，涉及用SNAP-Tag的哺乳动物细胞和异种移植肿瘤的近红外荧光成像。
该文件仅描述了(在通过SNAP-Tag的情况下)点击化学(click chemistry)的应用。
本发明的一个目的是克服现有技术中组合物的一个或多个缺点，并且提供替代当前组合物而用于诊断和治疗涉及坏死性细胞死亡的癌症和其它疾病，并且不损害功能和优点。
发明简介
本发明涉及根据权利要求1所述的一种包括结合坏死细胞的靶向分子，和一种或多种试剂，载体和在体内的非反应性分子的系统。
本系统包括至少两个实体，所述实体例如通过化学键而连接，每个实体在系统中起到不同功能。应当注意的是，可以存在一个以上的试剂，和一个以上的载体，和一个以上的非反应性分子。因此例如组合疗法对本发明的系统是可行的。
本发明的靶向分子是非常有选择性的和非常特异的结合坏死细胞。作为结果，本系统非常低浓度c.q.数量可以被用于提供其有益效果。应当注意的是，相比于坏死特异性探针，细胞凋亡的特异性探针也将靶向健康组织，因为细胞凋亡参与正常组织更新。
本发明人在早期的研究中已经发现，靶向分子特异性非共价结合细胞内蛋白质，如(仅当细胞的细胞膜完整性丧失时，即在坏死细胞的情况下，可供给靶向分子的)肌动蛋白。就最佳的靶点而言，坏死细胞优选是在坏死的早期阶段，例如细胞已经死亡小于几天，优选小于半天，如几个小时，如2个小时，如刚刚死亡的细胞。负责本发明中靶向分子的有效靶向性和/或安全性的特征，是它们为细胞膜不可渗透的，即，它们不能(显著的)穿透健康细胞的细胞膜；它们是非激活的；它们能够非共价地结合到细胞内蛋白(它们的靶向分子)；和，它们没有能力/不显著的结合DNA(或RNA)。
假使该系统包括试剂，该试剂可以涉及成像化合物，例如用于在成像技术中，治疗性化合物，以对坏死细胞或有此治疗需求的身体的一部分(包括坏死细胞)提供治疗作用，如癌症，和释放因子，其用于释放进一步化合物，如作为刺激物。
假使该系统包括载体，该载体功能作为传输实体至坏死细胞，或如上述的身体一部分的传输介质。因此少量的实体可以被靶向和输送到身体中所期待的位置。载体可以输送本试剂，它可以输送试剂的相关物，不同的实体，以及它们的组合。
假使该系统包括在体内的非反应性分子，它旨在使该分子与配对物相互作用。相互作用可以(进一步)涉及经由激活剂的一个或多个激活作用，由催化剂支持，基于相互作用产生药物，并基于相互作用释放药物。应当注意的是，从功能点的角度，分子和配对物可以互换。
本系统涉及无毒的小分子，其具有结合坏死细胞和组织的能力。这些分子不与DNA相互作用，即这些分子不是诱变剂。通常的，本系统具有广泛的生物分布，穿透血-脑屏障，不结合到细胞表面蛋白并且是足够稳定的。
在称为
Figure BPA0000215599630000051
的一个实例中，在癌症治疗期间的关键时间被保全。
Figure BPA0000215599630000052
即时提供所给予的化学治疗药物效力的相关数据。本发明系统的一个优点是，在化疗开始之后的24-36小时之内提供该治疗是或否为有效的信息。
Figure BPA0000215599630000053
的使用将防止病人经受没有临床益处的过度治疗，这被认为是在癌症治疗中的一个重要改进。
Figure BPA0000215599630000054
的使用将导致成本节约。
应当注意到，不幸的是对化疗的(正)反应率被限制为20-35％。此外，由于人体的局限，治疗周期的数量通常被限制为最多4次。换而言之，在开始周期之前，从开始就确定合适的治疗方法是至关重要的。通过在治疗的早期阶段的识别，如果治疗被认为是有效的，治疗本身可以进行下去，并且如果治疗被认为是无效的，可以被跳过。在非有效的治疗的情况下，第二种治疗可以类似地启动。这种方法可以被重复额外数量的次数。一旦治疗被认为是有效的，化疗的周期可以启动。应当注意的是，该识别可以被重复用于每个和任何化疗。
Figure BPA0000215599630000055
防止过度治疗，节省了用于防止细胞毒性药物副作用的药物。
使用本系统没有必要培养收集的肿瘤细胞，例如为了进行测试，这可能需要相对较长的时间，例如一周。该坏死细胞在它们的天然环境中被标记，这例如减少了人为错误的风险。
Figure BPA0000215599630000056
可以被用于测量细胞毒性药物在体内对所有实体瘤的效力，这使得它是对于临床的理想系统。这个系统的一个优点是在体内涉及实际特性，而在体外可能从实际特性引入偏差。
Figure BPA0000215599630000057
提供在上述方面的实时数据，而不需要进行穿刺来收集肿瘤细胞。在这方面应当注意的是通过穿刺仅仅获得肿瘤的一个样品。所获得的样品不一定是肿瘤的真实再现。还应当注意的是肿瘤是形态学上的非均质的。甚至进一步的，肿瘤可能随着时间而在形态特征上进展。其后果是，穿刺的样品至多给出了肿瘤特征的指示。本发明给出了实时和高度可靠的特征。
Figure BPA0000215599630000058
提供以上几点的可靠结论，如通过直接测量，而现有技术只能提供特征的指示。
在一个方面，本发明涉及一种装置，其测量由放射性治疗引起的对肿瘤细胞和健康组织的影响，该装置被称为
Figure BPA0000215599630000061
在一个方面，本发明涉及一种装置，其是为了预防目的而检测在人体内死亡细胞的全身扫描，该装置被称为
Figure BPA0000215599630000062
在一个方面，本发明涉及用于通过靶向肿瘤中的坏死细胞而治疗癌症的递送平台，该平台被成为
Figure BPA0000215599630000063
在一个方面，本发明涉及一种递送活性和再生化合物至由缺血事件所引起的坏死区域的平台，缺血事件如心肌梗死或中风，肝、肾或其它器官缺血，创伤，关节炎或烧伤，该平台被称为
Figure BPA0000215599630000064
在一个方面，本发明涉及一种对乳房摄影扫描仪的非核子的可替代物，其称为
Figure BPA0000215599630000065
在一个方面，本发明涉及一种用于在实体瘤中靶向递送(化)疗药物的装置，该装置被称为
Figure BPA0000215599630000066
在一个方面，本发明涉及一种靶向热疗法(温热疗法)，其被称为
Figure BPA0000215599630000067
除了癌症之外，目前的疾病涉及例如心脏和大脑的梗死组织，骨关节炎，神经系统疾病如阿尔茨海默氏病。
本发明还涉及该组合物作为药物的应用；该系统在诊断方法中的应用，该系统在用于涉及坏死性细胞死亡的疾病治疗中的应用，该组合物在用于在体内和/或体外检测和/或靶向坏死细胞中的应用；涉及包括所述系统的剂量；涉及使用所述组合物确定样品内组合物的定位的方法；和，涉及使用所述组合物用于治疗涉及坏死性细胞死亡的癌症和/或疾病的方法。
本发明的靶向分子已经被发现非常有选择性的结合死亡(坏死)细胞。
如先前所述，本发明人已经发现坏死细胞和/或坏死通常是有吸引力的靶点。这样涉及坏死细胞区域的观测通常是存在于癌症(肿瘤)中，例如由于不充分的血液供应和因此缺乏氧气，并且在(或导致)涉及坏死性细胞死亡的疾病中。应当注意到坏死细胞区域典型地不会在健康组织内发现。涉及坏死性细胞死亡的疾病的实例包括脑梗塞或缺血性损伤(即心肌梗死，中风，肾，肝等)，创伤(如脑，肌肉，骨)感染或炎症(即感染性休克，类风湿性关节炎，骨坏死)，退行性疾病(即阿尔茨海默病，帕金森氏痴呆症)，斑块(动脉粥样硬化，淀粉样蛋白)烧伤，辐射诱导的坏死和糖尿病。
至于癌症，一旦肿瘤已经被识别，进一步的坏死性细胞死亡可以在部分肿瘤上被有意诱导(例如通过局部辐照，光动力或局部热疗法和/或聚焦的超声波)，以提供所述组合物的一个较大靶点。此外，本组合物被用于治疗目的，坏死细胞的数量将随着治疗的不断进展而增加从而导致因时间作用而剂量扩增。
对细胞死亡分类的一个有益讨论可以在Kroemer等人，细胞死亡和差异(CellDeath and Differentiation)，2005年，12，1463中发现。在本申请中，坏死细胞被认为是已经失去细胞膜完整性的细胞。本领域技术人员能够确定细胞膜是否完全，即完整性，如通过使用荧光染料，如使用商业化的胺反应性染料。本发明的组合物对于死亡细胞的选择性，可以在体外试验中被证明，这将在下面的实施例中显示，所述死亡细胞即已经失去细胞膜完整性的细胞。重要的是注意结合于死亡细胞的胺活性染料仅在体外是有用的。在体内，它们会与例如血液中蛋白质或其它化合物的胺反应，并且将不能够用于靶向坏死细胞。
术语选择性表明靶向化合物对坏死细胞比健康细胞具有更高的亲和力(因此靶向分子可以靶向坏死细胞)。这些可以根据所附的每个实施例在体外分析中，或者如通过流式细胞仪而确定；在这两种方法中，可以使用共染色法，例如使用商业的活死细胞染色试剂盒。简而言之，在本发明中选择性结合表示对于包含坏死和健康细胞的给定的细胞群体，结合坏死细胞的靶向分子的数量要比结合健康细胞的靶向分子的数量至少高一个数量级，一般为几个数量级，并且优选为6个或更多个数量级，如9个数量级。
未活化的青色素是对如胺和硫醇非反应性的青色素。未活化的青色素不能通过共价键连接到呈现在细胞内的分子上的胺、硫醇或其它活性官能团而显著的(反应不是热力学有利的)结合死细胞(其分子的官能团)。也就是说，在本发明上下文中的选择性结合坏死细胞是不通过共价键，而是经由青色素核心结构通过非共价键结合，并且不是通过活性基团所连接的侧链而结合。术语活化的青色素是本领域技术人员所公知的，并且包括例如酯类，N-羟基琥珀酰亚胺酯，马来酰亚胺，酰基氯，SDS酯类等激活的羧酸。未活化的青色素包括如包含羧酸功能的青色素，即羧酸没有被激活。
应当注意的是活化的青色素可以在组合物的形成中使用，例如对于连接成像的和/或治疗的化合物至青色素的目的；然而在该组合物中，所述青色素是未活化的，并且通过青色素核心结构仍将结合坏死细胞。
本描述的优点详述在整个说明书中。
发明详述
应当注意的是给出的实施例和实施方案不被认为是限制性的。本发明的范围是由权利要求所限定的。
在第一个方面中，本发明涉及包含结合坏死细胞的靶向分子的系统，该靶向分子选自青色素或任意其它荧光染料，包括若丹明类，其特异性的非共价结合于细胞内的蛋白质。用于结合的蛋白质可以涉及纤维蛋白，如40kDa的蛋白质，100kDa的蛋白质，如微管蛋白，如α-微管蛋白，β-微管蛋白，γ-微管蛋白，δ-微管蛋白和ε-微管蛋白，肌动蛋白，如G-肌动蛋白，和F-肌动蛋白，纤维状结构蛋白质，如角蛋白，如中性、碱性或酸性角蛋白，如角蛋白1-角蛋白20，金属酶类，如烯醇化酶，和裂解酶，CDC37，优选是微管蛋白，最优选是肌动蛋白，它们的异构体，它们的复合体，和它们的分解产物。只有当细胞膜完整性丧失时，即在坏死细胞的情况下，这些蛋白质才可用于靶向分子。例如联合使用如下所述的干冰死细胞测定法与荧光显微镜，可以确定结合坏死细胞的选择性。优选的，相比于活细胞，对于坏死细胞至少有2倍高的亲和力，优选至少10倍，最优选至少1000倍，如至少1000000倍。类似的，相比于对DNA的亲和力，靶向分子对一种或多种上述蛋白质的亲和力是至少2倍高，优选至少10倍高，最优选至少1000倍高，如至少1000000倍高，如该靶向分子不和/或不能与DNA结合，即该靶向分子不显著的结合DNA或RNA。
在一个实例中，该靶向分子是根据图1I，II和III的非反应性青色素染料，其中n是整数，如n∈[2，10]，优选n∈[4，8]，链L具有不超过n-1个双键，优选n/2个双键，
其中亚族II和III可以分别包括由曲线C表示的一个和两个芳香环体系(A、B)，
其中A、B优选各自独立的选自苯和萘，
其中其它基团R5、R6、R7和R8可以存在，R5、R6、R7和R8是优选各自独立选自H和烷基，如甲基、乙基、和丙基、优选甲基，
其中芳香环体系可以包括另外的官能团R1、R2和/或取代基，R1、R2是优选各自独立选自H、磺酸基、和磺酰胺，
其中交替单键和双键的链L可以被一个或多个部分的和完全的饱和的环结构(如环戊烯和环己烯以及它们的组合，如一个或更多个环己烯环)中断，其中所述饱和环结构还可以包括官能团R9，其选自H、AA和BB，其中R10选自H、SO3H、Cl、-N-C＝O-(CH2)q-Y3(q＝1-6)、-(CH2)r-Y4(r＝1-6)、Y3和Y4各自独立的是H、COOH、SO3H和CN，
其中氮原子(N)还可以包括功能性N侧基基团R3、R4，其中R3、R4优选各自独立的选自-(CH2)mY，其中Y各自独立地选自具有1-4个碳原子的羧酸、磺酸酯基、CN、C≡C、和C＝C，以及它们的盐，
其中，所述N侧基基团包含m个碳原子，如m∈[1，10]，优选m∈[2，8]，更优选m∈[3，7]，最优选m＝4、5、和6，
甚至更优选至少一个m＝4、5、和6；优选一个m＝6，而另一个m优选是4、5或6，
其中所述N侧基基团包含一个或多个在末端上与N相对的官能团，如具有1-4个碳原子的羧酸，磺酸基，和它们的盐，如钠盐和钾盐，最优选在末端上的官能团包括一个或多个双C-C键，优选是其羧酸盐，和/或
其中所述靶向分子是中性的或带负电荷的。
特别是在测试中上述青色素已经被发现是非常合适的，例如在选择性方面。
有利的是，在如DNA和RNA的其它细胞成分存在下，具有负电荷的本发明的青色素已经被发现优先结合细胞内蛋白质。也就是说，具有负电荷的本发明的青色素通常没有显示出显著地结合DNA或RNA。
靶向分子优选选自：HQ4、HQ5、HQ6、HQ7、ICG、CW 800、ZW800、L4、L7、L11、CY3、CY3b、CY3.5、CY5、CY5.5、CY7、Dy 676、Dy 681、Dy 731、Dy 751和Dy 776；而且，最优选选自HQ4，HQ5，CW800和ZW800。这些化合物在图2中显示。一些这些化合物具有例如非常好的荧光特性。这是相当出乎意料的，因化合物本身可能具有良好的荧光特性，但是其在结合到另一个分子时可能发生变化，所述另一个分子如所存在的蛋白质。
在一个实例中，试剂是(下列(a)、(b)和(c)中的一种或多种)：(a)成像化合物选自下组：发光化合物、放射性示踪剂、MRI造影剂或分光剂、RFA(射频消融)剂、PET剂、SPECT剂、超声微泡或造影剂、光声纳米微粒或造影剂、CT造影剂、拉曼剂或它们的组合。换而言之，一种适宜的成像化合物可以被用于本系统；令人惊奇的是广泛的这类成像化合物可以用于本系统。因此大范围成像技术已经变得可应用。这类成像技术已经被发现是非常敏感的，即，可以检测少量的坏死细胞，非常准确，即包括坏死细胞的非常小的位置可以被识别，非常可靠，并且非常确信，例如关于结论。该试剂还可以是治疗性化合物。作为上述治疗性化合物可以被带到坏死细胞，使用少量的治疗性化合物，而且还提供其在预期位置一种相对高的数量，所述预期位置即坏死细胞。治疗性化合物(或其一种或多种)可以选自下组：化疗剂、光动力学化合物、升温化合物(包括光热剂)、免疫调节剂、蛋白质和多肽、核酸(RNA-或DNA-基)、药物(如抗体)，和/或它们的组合。因此许多疗法和它们的组合可以进行。该试剂也可以是用于刺激组织再生的一个或多个释放因子，如生长因子和干细胞。组织和细胞的这样的修复和/或再生是可能的。
在一个实例中，载体选自下组：脂质体、树状聚合物、可生物降解的颗粒、胶束、纳米微粒、声解离性颗粒、pH解离性颗粒、光解离性颗粒、热解离性颗粒、螯合部分以及它们的组合。取决于本发明的系统，如存在其它组分的情况下，可以选择适宜的载体。同样的，可以选择载体的组合。例如螯合部分可以被用于传输In、F、Ga、Gd和Tc。
可以考虑的载体是用作提高药物的递送和效力的机制的物质。载体可以用于控释以降低药物的代谢、在体内延长药物的作用、和降低药物的毒性。本载体还用于提高药物递送到靶点位置效力，如药理作用的靶点。
在一个实例中，在体内的非反应性分子，其可以被称作点击A，是能够与配对物相互作用的，所述配对物可以被称作点击B。该非反应性分子优选是一种或多种第一点击化学组分，第二点击化学组分(互补于第一点击化学组分)，和自标记蛋白质标签的组分，如Snap-Tag。优选的，点击化学组分“点击”而不需要如铜(I)的催化剂。
在第二个方面，本发明涉及用作药物的本发明的系统。如上所述的本系统可以包括治疗性化合物。该系统可以因此充当药物。优选使用本药物用于治疗贯穿于本申请中所确定的疾病、病症等。
在第三个方面，本发明涉及本发明的系统在诊断方法中的用途，如MRI、SPECT、RFA(射频消融)、PET、CT、拉曼光谱、超声、光学和光电声。因为本系统具有用于成像的优越特性，优选经由一个或多个上述方法进行诊断。
在第四个方面，本发明涉及本发明的系统用于治疗涉及坏死性细胞死亡的疾病，包括梗塞或缺血性损伤(如心肌梗死、中风和肾)，创伤(如在脑、肌肉、骨中的)，感染或炎症(如感染性休克、类风湿性关节炎、和骨坏死)，退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森氏痴呆症)，斑块(如动脉粥样硬化、和淀粉样蛋白)，和糖尿病。本系统可以用于治疗疾病的额外实例包括在整个说明书中。
在第五个方面，本发明涉及一种用于检测和/或治疗癌症和/或涉及坏死性细胞死亡的疾病的剂量，其包含有效量的本发明的系统。
在一个实例中，该剂量包含0.1-1000纳摩尔系统/kg体重的量，优选0.5-500纳摩尔系统/kg体重，更优选1-250纳摩尔系统/kg体重，甚至更优选2-100纳摩尔系统/kg体重，如5-50纳摩尔系统/kg体重；其可以涉及如0.01-1毫克的剂量。该剂量优选在1-50毫升生理溶液中提供。优选提供包括一些(1-50)剂量的试剂盒。
在第六个方面，本发明涉及一种用于在样品中确定定位的方法，所述样品包含含有坏死细胞的细胞群体，包括：
(a)提供根据本发明的系统；
(b)使用至少第一适宜的成像技术，在样品上进行一个或多个测量，提供一个值或多个值，和；
(c)分析所述测量的一个值或多个值以确定定位，任选的通过与一组参考值进行比较。至少一些上述技术是非常适合于这个方面的。该方法可以在体内和体外进行。
在第七个方面，本发明涉及用于治疗癌症和/或涉及坏死的疾病的方法，包括：
(a)给予本发明的组合物，其中所述组合物包含一种或多种治疗性化合物
(b)在癌症和/或坏死性细胞死亡中确定该组合物的定位
(c)激活从载体中至少所述治疗性化合物的释放和/或激活该治疗性化合物。治疗可以在体内进行。
本发明通过实施例和附图而进一步被详述，实施例和附图本质是示例性和解释性的，并且不限制本发明的范围。对于本领域技术人员是清楚的，许多显而易见的或非显而易见的变体可以被设想落入到保护范围内，该保护范围是由本权利要求书限定的。
附图说明
图1显示本青色素的三个主要亚族的通用结构。青色素是属于聚甲炔类的合成染料家族的非系统名称。参照图1中的中央碳链；n是整数，如n∈[2，10]，优选n∈[4，8]。链L具有不超过n-1个双键，优选n/2个双键。亚族II和III可以分别包括一个和两个由曲线C表示的芳香环体系(A、B)。A、B是优选各自独立的选自苯和萘。可以存在基团R5、R6、R7和R8。R5、R6、R7和R8是优选各自独立选自H和烷基，如甲基、乙基、和丙基，优选甲基。芳香环体系可以包括额外的官能团R1、R2和/或取代基。R1、R2是优选各自独立选自H，磺酸基，和磺酰胺。交替单键和双键的链L可以被一个或多个部分的和完全饱和的环结构中断，如环戊烯和环己烯以及它们的组合，如一个或更多个环己烯环。饱和环结构还可以包括官能团R9，R9选自H、AA和BB。R10选自H、SO3H、Cl、-N-C＝O-(CH2)q-Y3(q＝1-6)、-(CH2)r-Y4(r＝1-6)。Y3和Y4各自独立的是H、COOH、SO3H和CN中的一个。氮原子(N)还可以包括功能性N侧基基团R3、R4。R3、R4优选各自独立的选自-(CH2)mY。Y各自独立地选自具有1-4个碳原子的羧酸、磺酸酯基、CN、C≡C、和C＝C，以及它们的盐。N侧基基团包含m个碳原子，如m∈[1，10]，优选m∈[2，8]，更优选m∈[3，7]，最优选m＝4、5、和6，甚至更优选至少一个m＝4、5、和6，优选一个m＝6，而另一个m优选是4、5或6。N侧基基团包含一个或多个在末端上与N相对的官能团，如具有1-4个碳原子的羧酸，磺酸基，和它们的盐，如钠盐和钾盐。最优选在末端上的官能团包括一个或多个双C-C键。
术语青色素是指其核心结构是亚族I、II或III的任意化合物。在如Cy 3、Cy 5、Cy7等青色素名称中的整数是指在链L中碳原子的数目。在示例性的实施方案中，青色素属于这些家庭中的一个。
图2显示了若丹明类的通用结构；R1至R12可以是氢或官能团，适宜官能团的实例包括磺酸基团、羧酸基、磺酰胺、醇类、胺类、酯类、醚类、硫醇类、硫代酯类以及它们的组合。术语若丹明类是指其核心结构是在图2中所示的任意化合物。
图3(a)-(j)给出了在整个申请中提及的化合物的结构。其中所示的平衡离子可以是例如H+、Na+或K+。
图4-5给出了本靶向分子的优选实施例。
图6-11显示实验的结果；这些结果详述如下。
图12显示NP-CW800的示意图。
图13显示DTPA-CO-NH-PEG-NH2的结构。
图14显示DTPA-CO-NH-PEG-HQ4的结构。
图15显示点击A-HQ4-DTPA的两种变体的结构。
图16显示点击A-ZW800-DTPA的结构。
图17显示点击A-ZW800-NOTA的两种变体的结构。
图18显示点击经A-ZW800(在铵基处)改性的-NOTA的结构。
图19a显示ZW800-连接体-NOTA和点击A的结构
图19b显示HQ4-连接体-NOTA和点击A的结构
参考图6-11：
测量技术
在本次调查中，应用了一些现有的和/或内部开发的技术：
荧光
[维基百科：]“荧光是由已经吸收光或特定波长的其它电磁辐射的物质发射的光。在大多数情况下，所发射的光具有更长的波长，因此比所吸收的辐射具有较低能量。”
用荧光测量，所以也是体内荧光，很难被量化。在活的生物或细胞组织中所测量的强度是-除了荧光化合物本身的固有亮度和其浓度-也依赖该化合物的物理性质，即与它周围蛋白质的结合比和与它们相互作用的类型和贯穿组织的该物质的分布。
最后，测量的灵敏度和特异性是非常强烈的依赖于实验方案的。
干冰死细胞分析
在乙醇中的固态二氧化碳(-80℃)被用于冻结具有活细胞培养基(和可能还有其它组分)的24孔板的孔中心。已经通过使用具有针脚的冷却块而优化该步骤，所述冷却块被保持至24孔板的底部一定时间(大多约15秒)。其结果是冷冻和随之发生被仍然存活的细胞包围的孔中心的细胞死亡，从而能进行死细胞和活细胞之间的比较研究。
含有能区分活细胞和死细胞的化合物的介质被施加到培养孔中。温育后，洗涤细胞层并且成像。
冷冻损伤小鼠模型
一个3mm直径的小金属圆柱体在液氮中预冷并且施加到麻醉小鼠头的顶骨区20或60秒。在一定时间之后在尾静脉注射染料(以一定浓度)。注射3-24小时之后，小鼠可以被成像。
本发明用于坏死细胞(即细胞膜失去完整性的细胞)的组合物的选择性在体外试验中被证明，如将在下面的实施例中显示。
基质胶
基质胶是由特定的小鼠肉瘤细胞分泌的一种凝胶状蛋白混合物。在本发明中，基质胶被用作死细胞的内源性基质，其被植入到小鼠皮肤下。如果这些细胞也被标记，可以确认染料和构建体被分布在全身，所以也分布在血流之外。
MSOT
多光谱光声断层成像技术是一种用于在小动物中生物化学标记物的全身成像技术。光的吸收导致可以产生声波的一个小的热膨胀。这些可以被检测并且转换在一个三维图像中。
概念验证
图6
在用细胞毒性剂星孢素处理或未处理的粘附(4T1)细胞和非粘附(JURKAT)细胞上使用HQ5的流式细胞仪数据。探针仅染色星孢素处理的细胞，其已经失去膜的完整性。
图7
共焦显微镜：a：藤黄酸(一种坏死诱导剂)处理的细胞和b：活细胞。C-D：使用鬼笔环肽的F-肌动蛋白的共染色与标示结合肌动蛋白的HQ5的HQ5来共定位。(c：藤黄酸处理的细胞和d：星孢素处理的细胞)。
图8
为了显示HQ5在体内结合坏死细胞的容量，在注射HQ5之前诱导脑的局部冷冻损伤。此外，有或没有坏死细胞的基质胶被进行皮下移植。HQ5特异性的积聚在冷冻部位和具有坏死细胞的基质胶中，而不是积聚在无坏死细胞的基质胶中。
图9
为了显示HQ5体内结合坏死细胞的容量以更好的生理模式相比于冷冻损伤。含有放射性In-111的HQ 4-DTPA被注射到具有坏死核心的患瘤小鼠中。A.在探针注射后24小时观察到肿瘤特异性HQ4荧光，持续至少72小时。B.在探针注射后24小时检测到一个特定的放射性SPECT信号，持续至少72小时。C.观察到荧光信号和放射性信号与坏死核心在体外共定位。
图10
为了研究使用青色素染料递送PLGA纳米微粒到坏死区域的可能性，有或没有CW800包被的PLGA纳米微粒被注射到脑部具有冷冻损伤的动物中。低浓度(稀释2倍或更多)的CW800包被的PLGA纳米微粒选择性积聚在坏死区域中，而没有包被的对照组PLGA纳米微粒没有选择性积聚在坏死区域中。
图11
光动力疗法是公知的能够导致坏死。在该动物左侧的4T1肿瘤的光动力治疗后6小时，注射CW800包被的PLGA纳米微粒。在右侧的第二个肿瘤未作治疗。CW800包被的PLGA纳米微粒仅积聚在所治疗肿瘤的位点。
本发明的示例性系统
实施例1-参考图12
PLGA纳米微粒的制备。使用O/W乳液和溶剂蒸发-提取法制备具有包埋近红外荧光标记的PLGA纳米微粒。简而言之，在3mL DCM中的90mg PLGA含有近红外(NIR)700nm(680R从LI-COR)(3mg)被逐滴加入到25mL含2％(w/v)PVA的蒸馏水中，并且使用超声波仪乳化90秒(Branson，sonofier 250)。脂类(DSPE-PEG(2000)胺(8mg)和mPEG 2000PE(8mg))的组合溶解在DCM中，并且加入到小瓶中。经由氮气流除去DCM。随后，该乳液被迅速加入到含有脂类的小瓶中，并且使用超声波仪将溶液均质30秒。在4℃下溶剂蒸发过夜之后，经由在60000g下超速离心30分钟收集所述PLGA纳米微粒，用蒸馏水洗涤三次，并且冻干。
共轭CW800-NHS至PLGA纳米微粒。CW800-NHS共轭到含DSPE-PEG(2000)-胺的PLGA纳米微粒制剂上。随后，微粒(50mg)溶解在0.5mL的碳酸缓冲液(pH 8.5)中，并且该激活的CW800-NHS(1mg)在室温下1小时期间内加入到颗粒中。通过离心(10000g，在10分钟内)除去未结合的CW800-NHS并且用PBS洗涤PLGA纳米微粒-CW800四次。通过Odyssey扫描确定在微粒表面的CW800的数量(表1)。
动态光散射和Z电位。在所有纳米微粒上的动态光散射(DLS)测量是在一个ALV光散射仪器上进行的，该光散射仪器配备有ALV5000/60X0多头相关器和在532nm的波长下操作的Oxxius SLIM-532 150mW DPSS激光器。折射率与包围圆柱形散射池的过滤的顺式萘烷浴相匹配，并且使用Haake F3-K恒温器控制温度在21.5±0.3℃。对于各样品的自相关函数，g2(τ)，以90°检测角记录10次。对于每个测量的扩散系数，D，使用2阶累积而测量，并且假定粒子是球形的而计算出相应的粒径(参见表1)。在Malvern ZetaSizer 2000(英国)上测定所有纳米微粒的Z电位。
Figure BPA0000215599630000171
实施例2-参考图13
DTPA-PEG-NH2的合成
在Cl-TrtCl树脂上合成含有PEG胺连接的DTPA(4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，在式(DTPA-PEG-NH2)中表示为PEG-NH2)。因此，在含6当量DIEA的DCM存在下，通过在室温下3当量Fmoc-PEG胺反应过夜，Fmoc-PEG胺被并入到Cl-TrtCl树脂(CTC树脂)上。通过Fmoc定量而测定最终负荷：所得的值是约0.8毫摩尔/克。用哌啶-DMF(1∶5)(1×1分钟，2×10分钟)除去Fmoc基。接着，使用DIPCDI(2当量)和HOBt(2当量)使DTPA-(四-叔丁基酯)-COOH(2当量)在DMF中过夜偶联。在偶联过夜之后，茚三酮测试呈阴性，随后，在两个步骤中实施DTPA-(四-叔丁基酯)-CO-NH-PEG-CTC-树脂裂解和脱保护。用含1％三氟乙酸(TFA)的DCM处理DTPA-(四-叔丁基酯)-CO-NH-PEG-CTC-树脂10次，每次1分钟。使用真空除去过量的DCM，并且使用95％TFA，2.5％三异丙基硅烷(TIS)和2.5％的水除去侧链保护基团。除去TFA后，在N2气流中用冷的MTBE沉淀DTPA-CO-NH-PEG-NH2。在水中溶解DTPA-CO-NH-PEG-NH2并且冻干以获得最终产品。通过HPLC(保留时间(tR)是2.28分钟)进行分析，所期望的DTPA-CO-NH-PEG-NH2产率为85.0％，纯度为90.6％。HPLC-MS，m/z计算值：对于C20H37N5O11为523.25，实测值：524.5.28[M+1]+和MALDI-TOF实测值524.2[M+1]+546.3[M+Na]。
实施例3-参考图14
DTPA-CO-NH-PEG-NH2-HQ4的合成。
将溶解于50μL二甲基亚砜(DMSO)的HQ4-NHS(8.3x10-4毫摩尔，1毫克)添加到溶解于含有5μL DIEA的200μL DMSO中的DTPA-CO-NH-PEG-NH2(2.8×10-3毫摩尔，2毫克)，并且在室温下搅拌过夜。随后，通过RP-HPLC纯化该复合的DTPA-CO-NH-PEG-HQ4。通过HPLC(tR5.34)进行分析，所期望的Dota-PEG-HQ5的产率为50.5％，纯度为98％。HPLC-MS，m/z计算值：对于C66H90N8O17S2为1331.59，实测值：1332.0[M+1]+和MALDI-TOF实测值1331.9[M+1]+1353.9[M+Na]。
根据本发明的系统的进一步实例显示在附图15-19中。
图15a和15b-点击A-HQ4-DTPA的变体
点击A＝2-氰基苯并噻唑
载体＝二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)
图16-点击A-ZW800-DTPA
点击A＝2-氰基苯并噻唑
载体＝二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)
图17a和17b-点击A-ZW800-NOTA的变体
点击A＝2-氰基苯并噻唑
载体＝2，2，2-(1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三基)-三乙酸(NOTA)
图18-点击A-ZW800-改性的(在铵基处)-NOTA
点击A＝2-氰基苯并噻唑
载体＝2，2，2-(1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三基)-三乙酸(NOTA)
应当注意的是，虽然在实施例16-18中R＝SO3 -(即该青色素是化合物ZW800)，R也可以是另一个部分，如例如H、烷基等，如果所得到的青色素落入到一个或多个权利要求的范围之内。
图19a-ZW800-连接体-NOTA和点击A
点击A＝2-氰基苯并噻唑
载体＝2，2，2-(1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三基)-三乙酸(NOTA)
图19b-HQ4-连接体-NOTA和点击A
点击A＝2-氰基苯并噻唑
载体＝2，2，2-(1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三基)-三乙酸(NOTA)
作为权利要求15-18中系统的替代，其中所述载体和点击A(在体内能够与配对物相互作用的非反应性分子)设置在青色素的不同的第一和第二官能团上，使用双功能连接物可以连接载体和点击A(在体内能够与配对物相互作用的非反应性分子)至青色素的单一官能团上，如在图19中显示的通过赖氨酸。在图19a中，点击A和NOTA通过ZW800的羧酸基而连接。经由一个侧臂，类似的策略可以应用于通过侧臂而连接，该侧臂即铵基团中的氮。
本领域技术人员将认识到靶向分子和：(a)试剂，(b)载体和/或(c)在体内能够与配对物相互作用的非反应性分子的其它组合是可能的，例如点击A-HQ4-NOTA，点击A-HQ5-NOTA/DTPA，点击A-CW800-NOTA/DTPA，点击A-ZW800-NOTA/DTPA等。NOTA和DTPA是适用于传递试剂(如金属离子)的螯合配体的实例。
名词解释
4T1-细胞 源自鼠类的乳腺癌细胞。
4T1-luc2 相同的细胞，但遗传修饰以具有荧光素酶-2，伴随光的照射而可以转换荧光素(luc)的酶。所以在给予荧光素之后，可以检测到这些细胞。
BSA 胎牛血清白蛋白，来自牛血清的水溶性蛋白质，其除了用于研究物质结合至蛋白质，还用于所有类型的生物应用中。
CRO 合同研究组织
FACS 荧光激活的细胞分选，一种可以测量单个细胞流动的荧光的技术。
FCS 胎牛血清，来自提及的来源的血清，与作为包含细胞内容物的BSA裂解物A流体应用相适应的，所述细胞已经被分解并且细胞的完整性和组织全部失去。
MALDI-TOF 基质辅助激光解吸/电离飞行时间是确定化学实体分子量的一种化学分析技术。MALDI是一种“软”电离技术，而TOF是一种特别适用于大(重)分子的检测技术。
MRI 磁共振成像，利用核磁共振原则的一种医学成像技术。
MTS-测定法 一种热量测定法，其测量细胞的活力。所述信号越高，细胞的活力越大。
MSOT 多光谱光声断层成像技术，参见第3.2.段。
NIRF 近红外荧光
NMR 核磁共振，一种物理现象，其中具有特殊性质的(即是磁性的，具有自旋的)原子可以吸收和重新发射具有特定波长的原子辐射。
PDT 光动力疗法是一种使用无毒的光敏性化合物的光治疗形式，所述光敏性化合物被选择性地暴露于光，于是它们变得对靶向的恶性细胞和其它病变细胞有毒。
PET 正电子发射断层扫描
PKPD 药代动力学和药效学，研究物质在生物体内如何表现的(生物利用度、分布、代谢)，以及它如何与生物靶点相互作用(结合、停留时间)
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种分离蛋白质混合物为单独蛋白质(或具有较少组分的混合物)的技术
SPECT 单光子发射计算机断层显像是一种使用γ(gamma)射线的成像技术。它能够提供真实的3D信息。此信息通常呈现为贯穿患者的截面切片，但可以根据需要而自由的重建或操纵。[维基百科]
TUNEL 末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记是一种通过标记核酸的末端而检测DNA片段的方法[维基百科]。它被用作坏死组织的标记工具。

Claims (9)

1.靶向分子在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于检测和/或治疗癌症和/或涉及坏死性细胞死亡的疾病，所述药物组合物包含有效量的包括作为结合坏死细胞的靶向分子的第一实体的系统，其中该靶向分子是未活化的、当细胞的细胞膜完整性丧失时能够非共价地结合到细胞内蛋白质并且不与DNA相互作用的青色素，
其中该系统还包括第二实体，所述第二实体包含以下中的一种或多种：
(a)选自成像化合物、治疗性化合物、和释放因子的试剂；
(b)有效用于传递试剂的载体；和
(c)在体内能够与配对物相互作用的非反应性分子，
其中该靶向分子是根据图1I、II和III的非反应性青色素染料，
Figure FDA0002311925180000011
其中n是整数，链L具有不超过n-1个双键，
其中亚族II和III可以分别包括由曲线C表示的一个和两个芳香环体系(A、B)，
其中A、B各自独立选自苯和萘，
其中其它基团R5、R6、R7和R8可以存在，R5、R6、R7和R8各自独立选自H和烷基，
其中芳香环体系可以包括另外的官能团R1、R2和/或取代基，R1、R2各自独立选自H、磺酸酯基、和磺酰胺，
其中交替单键和双键的链L可以被一个或多个部分的和完全的饱和的环结构以及它们的组合中断，其中所述饱和环结构还可以包括官能团R9，其选自H、AA和BB，其中R10选自H、SO3H、Cl、-N-C＝O-(CH2)q-Y3、-(CH2)r-Y4，其中，q＝1-6，r＝1-6，Y3和Y4各自独立为H、COOH、SO3H和CN中的一种，
其中氮原子还可以包括功能性N侧基基团R3、R4，其中R3、R4各自独立选自-(CH2)mY，其中Y各自独立选自具有1-4个碳原子的羧酸、磺酸酯基、CN、C≡C、和C＝C，以及它们的盐，
其中，所述N侧基基团包含m个碳原子，
m是4、5和6中的至少一个，
其中所述N侧基基团包含一个或多个在末端上与N相对的官能团，和/或
其中所述靶向分子是中性的或带负电荷的，并且选自HQ4、HQ5、HQ6、HQ7、ICG、CW 800、ZW800、L4、L7、L11、CY3、CY3b、CY3.5、CY5、Dy 676、Dy 681、Dy 731、Dy 751和Dy 776，
其中该药物组合物的剂量包含0.1-1000纳摩尔系统/kg体重的量。
2.根据权利要求1的用途，其中该药物组合物的剂量在1-50毫升生理溶液中提供。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述靶向分子选自HQ4、HQ5、CW800和ZW800。
4.根据权利要求1的用途，其中所述试剂是：
(a)选自下组的成像化合物：发光化合物、放射性示踪剂、MRI造影剂、PET剂、SPECT剂、超声微泡或造影剂、光声纳米微粒或造影剂、CT造影剂、拉曼剂，和它们的组合；和/或
(b)选自下组的治疗性化合物：化疗剂、光动力学化合物、升温化合物、免疫调节剂、蛋白质和肽、核酸，和它们的组合；和/或
(c)用于刺激组织再生的释放因子。
5.根据权利要求1的用途，其中所述载体选自下组：脂质体、树状聚合物、可生物降解的颗粒、胶束、纳米微粒、声解离性颗粒、pH解离性颗粒、光解离性颗粒、热解离性颗粒、螯合部分，和它们的组合。
6.根据权利要求1的用途，其中在体内能与配对物相互作用的非反应性分子选自：第一点击化学组分、互补于第一点击化学组分的第二点击化学组分、和自标记蛋白质标签的组分。
7.根据权利要求1的用途，其中该药物组合物的剂量包括0.5-500纳摩尔系统/kg体重。
8.根据权利要求1的用途，其中该药物组合物的剂量包括1-250纳摩尔系统/kg体重。
9.根据权利要求1的用途，其中该药物组合物的剂量包括2-100纳摩尔系统/kg体重。
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