CN104906593A - 一种酯键偶联纳米钻石阿霉素药物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酯键偶联纳米钻石阿霉素药物及其制备方法和应用。本发明首先用H2N-PEG-COOH修饰纳米钻石，合成ND-PEG-COOH载体，再通过缩水甘油与阿霉素的开环反应，使阿霉素表面富含羟基，最后利用ND-PEG-COOH载体表面的羧基与阿霉素表面的羟基发生酯化反应从而制得目标药物纳米钻石-聚乙二醇-缩水甘油-阿霉素(ND-PEG-GLY-DOX)。通过红外光谱表征和体外释药实验证实了酯键的形成，经过MTT实验和流式细胞仪测定细胞周期和细胞凋亡实验，表明ND-PEG-GLY-DOX可诱导肿瘤细胞凋亡，其可在制备抗肿瘤药物中应用。
Description
技术领域
本发明涉及纳米药物，具体涉及一种对纳米钻石表面修饰后，通过酯键将阿霉素共价偶联到修饰的纳米钻石制备成纳米药物及其制备方法，以及该药物在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
现代生活中的饮食、环境污染，以及久坐不动、吸烟等不良生活习惯使得肿瘤的发病逐年增多。阿霉素是应用最为广泛的小分子化疗药物之一，但由于药物分布的无选择性等缺陷，使阿霉素进入体内后对正常组织产生十分严重的毒副作用。同时，如果长期使用阿霉素，还会诱导肿瘤细胞对其产生很强的耐药性。如何提高阿霉素体内分布的特异性，增强其化疗疗效，同时尽量减少其毒副作用便成为亟待解决的问题。
纳米药物因其特定的尺寸，可利用肿瘤组织的EPR(enhanced permeability and retentioneffect)效应提高药物对肿瘤组织的选择性，在一定程度上实现肿瘤的被动靶向治疗。而通过化学键键合的纳米药物比物理吸附抗癌药物的纳米载药体系在血液循环时更加稳定，能有效避免药物突释。纳米钻石因其尺寸小、比表面积大、表面易于修饰和生物相容性好等物理化学特性，在生物医学应用方面引起了人们广泛的研究兴趣。基于上述理论，我们首先以聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)修饰纳米钻石，然后通过酯键将化疗小分子药物阿霉素负载于其表面制备成纳米药物，并研究了该药物的抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酯键偶联纳米钻石阿霉素药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供的一种酯键偶联纳米钻石阿霉素药物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取真空干燥的羧基化纳米钻石，按每毫克羧基化纳米钻石加入1-1.5mL的浓度为0.1M、pH为5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每毫克羧基化纳米钻石加入0.2mg EDC、0.25mg NHS，室温搅拌反应6h，反应完毕后以15000rpm高速离心5min弃除上清液，从而得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；接着将活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到浓度为0.1M、pH为8.4的硼酸缓冲溶液中，经过短暂超声分散形成悬浊液，再按每毫克活化的羧基化纳米钻石快速加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，继续室温搅拌反应12h，待反应结束，以15000rpm高速离心5min吸除上清液，并用0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液高速离心洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)沉淀物；
(2)取阿霉素(DOX)，按每毫克阿霉素加入1-1.5mL无水乙醇溶解，取5mL体积分数为10％的缩水甘油(GLY)无水乙醇溶液于容器中，在快速搅拌状态下缓慢加入上述阿霉素溶液，再加入几滴三乙胺，使体系pH约为8，室温避光搅拌反应24小时，反应完毕，抽滤收集产物，并用丙酮洗涤5-10次，得到阿霉素-缩水甘油(DOX-GLY)，置于真空干燥箱，避光保存；
(3)取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)沉淀物，按每毫克ND-PEG-COOH加入0.5-1mL的灭菌双蒸水中，超声分散30min形成悬浊液，然后逐滴滴入溶有0.2-0.3mg阿霉素-缩水甘油(DOX-GLY)的灭菌双蒸水中，接着再按每毫克ND-PEG-COOH加入0.2mg EDC、0.25mg NHS，随后加入几滴三乙胺，使体系pH约为8，然后于37℃水浴锅避光搅拌反应24小时，待反应结束，以15000rpm高速离心5min收集上清液，用灭菌双蒸水洗涤5次，再用丙酮洗涤至上清液无色，制得纳米钻石-聚乙二醇-缩水甘油-阿霉素ND-PEG-GLY-DOX(NPGD)纳米药物，真空干燥，避光保存，其粒径大小为293.6±0.75nm。
与现有技术相比本发明的有益效果：本发明选用的纳米钻石材料具有生物相容性好、无毒、化学性质稳定、表面易修饰等诸多优点；PEG因其在水溶液和一些溶剂中具有极好的溶解性、无毒且具有低的免疫原性等优势，使制备过程具有灵活性。通过纳米载体ND-PEG与人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(Hela)、人乳腺癌细胞(MCF-7)作用，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；将纳米载体纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG)和阿霉素-缩水甘油(DOX-GLY)通过酯键连接，制备得到NPGD纳米药物，经MTT实验检测药物对细胞的活性，表明该药物对癌细胞具有一定的杀伤力；通过流式细胞仪测试凋亡实验，表明NPGD能够诱导肿瘤细胞凋亡，其可在制备抗肿瘤药物中应用。
附图说明
图1 纳米药物NPGD(右侧)和ND-DOX(左侧)的紫外灯照射下的照片。
图2 各种纳米颗粒的红外光谱图
图3 不同pH对纳米药物NPGD体外释药的影响
图4A 不同浓度的纳米药物NPGD对体外培养HepG2细胞活性的影响
图4B 不同浓度的纳米药物NPGD对体外培养HeLa细胞活性的影响
图4C 不同浓度的纳米药物NPGD对体外培养MCF-7细胞活性的影响
图5A 纳米药物NPGD对体外培养不同时间HepG2细胞活性的影响
图5B 纳米药物NPGD对体外培养不同时间HeLa细胞活性的影响
图5C 纳米药物NPGD对体外培养不同时间MCF-7细胞活性的影响
图6A 用流式细胞仪检测MCF-7细胞凋亡的结果
图6B 用流式细胞仪检测纳米载体ND-PEG影响MCF-7细胞凋亡的结果
图6C 用流式细胞仪检测纳米药物NPGD影响MCF-7细胞凋亡的结果
图6D 用流式细胞仪检测阿霉素DOX影响MCF-7细胞凋亡的结果
图6E 图6A-D细胞凋亡各实验组比较的柱状图
具体实施方式
以下为实施例中使用的材料：
纳米钻石(ND，元素六，直径大约140nm,Ireland)。
阿霉素(DOX)是盐酸多柔比星，分子式为C27H29NO11·HCl，分子量为579.99，深圳万乐药业有限公司生产，规格按C27H29NO11·HCl计算为10mg。
缩水甘油(GLY，分子量74.08)为Sigma公司生产。
聚乙二醇二胺(H2N-PEG-COOH，分子量为2000)为上海西宝生物有限公司生产。
实施例1：
(1)纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG)纳米粒子的制备
准确称取10mg羧基化纳米钻石，分别经过二甲基亚砜(DMSO)、无水乙醇(C2H5OH)、灭菌水(H2O)洗涤后，置于10mL MES(0.1M、pH5.8)缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，接着加入2mg EDC、2.5mg NHS，室温搅拌反应6h，待反应结束后以15000rpm高速离心5min，除去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；
把活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到10mL BBS(0.1M、pH8.4)缓冲溶液中，超声分散10min形成悬浊液，接着加入3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，继续室温搅拌反应12h，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用蒸馏水继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)纳米粒子，置于真空干燥箱中保存备用。把未反应的H2N-PEG-COOH上清液小心移取到干净的烧杯中静置，待测定ND-PEG-COOH纳米颗粒上偶联H2N-PEG-COOH的质量。
精确称取1mg H2N-PEG-COOH，用BBS(0.1M、pH8.4)溶解并定容于10ml的比色管中，分别量取0.8ml、0.56mL、0.4ml、0.16ml、0.08mL置入2ml的EP管中，按摩尔比向其中入相应体积的荧光胺，再加入一定体积使溶液总体积为2mL，立即涡流10秒，放置5分钟,采用荧光分光光度法设激发波长为385nm，测485nm处的荧光强度，以H2N-PEG-COOH摩尔浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制H2N-PEG-COOH标准曲线。据标准曲线公式，用反应前加入H2N-PEG-COOH的总量减去反应后上清液中H2N-PEG-COOH质量，即得到每毫克ND纳米颗粒偶联H2N-PEG-COOH的量为0.15mg。
(2)称取纯阿霉素盐酸盐(DOX)10mg，加入10mL无水乙醇溶解，取50mL体积分数为10％的缩水甘油(GLY)无水乙醇溶液于圆底烧瓶中，在快速搅拌状态下缓慢加入上述阿霉素溶液，再加入几滴三乙胺，使体系pH约为8，室温避光搅拌反应24小时，反应完毕，抽滤收集产物，并用丙酮洗涤8次，得到富含羟基的阿霉素-缩水甘油(DOX-GLY)，置于真空干燥箱避光保存。
(3)准确称取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)10mg，接着加入10mL的灭菌双蒸水，超声分散30min形成悬浊液，然后逐滴滴入溶有3mg阿霉素-缩水甘油(DOX-GLY)的灭菌双蒸水中，接着再加入2.0mg EDC、2.5mg NHS，随后加入几滴三乙胺，使体系pH约为8，然后于37℃水浴锅避光搅拌反应24小时，待反应结束，以15000rpm高速离心5min收集上清液，用灭菌双蒸水洗涤5次，再用丙酮洗涤至上清液无色，将制得的纳米钻石-聚乙二醇-缩水甘油-阿霉素(NPGD)纳米药物，真空干燥，避光保存。
当阿霉素以酯键连接到纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG)表面时，阿霉素的荧光发生猝灭，图1(右侧)为纳米药物NPGD以及纳米钻石物理吸附DOX的ND-DOX体系(左侧)在紫外照射下的样品示意图,由图可见ND-DOX体系发橙红色荧光，而纳米药物NPGD不发荧光，表明共价偶联。收集所有的上清液并记录体积，待测定未反应的阿霉素。用紫外可见光分光光谱法检测阿霉素490nm峰位处的吸光度，计算DOX的连接量，经计算可知每毫克ND-PEG连接阿霉素质量约(150±1.75)微克。
实施例2：
(1)～(2)的制备同实施例1
(3)准确称取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)10mg，接着加入10mL的灭菌双蒸水，超声分散30min形成悬浊液，然后逐滴滴入溶有2mg阿霉素-缩水甘油(DOX-GLY)的灭菌双蒸水中，接着再加入2.0mg EDC、2.5mg NHS，随后加入几滴三乙胺，使体系pH约为8，然后于37℃水浴锅避光搅拌反应24小时，待反应结束，以15000rpm高速离心5min收集上清液，用灭菌双蒸水洗涤5次，再用丙酮洗涤至上清液无色，将制得的纳米钻石-聚乙二醇-缩水甘油-阿霉素(NPGD)纳米药物，真空干燥，避光保存。收集所有的上清液并记录体积，待测定未反应的阿霉素。用紫外可见光分光光谱法检测阿霉素490nm峰位处的吸光度，计算DOX的连接量，经计算可知每毫克ND-PEG连接阿霉素质量约(145±2.35)微克。
实施例3：
纳米粒子的红外光谱图表征
为了确认纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)与缩水甘油-阿霉素(GLY-DOX)之间是否形成酯键，分别取微量纳米颗粒与溴化钾按质量比为1:100混合研磨压片，测定其红外光谱。
图2为所制备纳米颗粒的红外光谱图。阿霉素(DOX)与缩水甘油-阿霉素(GLY-DOX)的吸收峰相比较，由3422cm-1红移到3339cm-1，且吸收峰变宽，表明缩水甘油成功连接在了阿霉素表面，纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)与纳米钻石(ND)相比，出现了1621cm-1和1656cm-1的双峰，而这为酰胺键的特征吸收峰，表明聚乙二醇以酰胺键连接到了钻石表面，纳米钻石-聚乙二醇-缩水甘油-阿霉素(NPGD)的红外谱图中1286cm-1和1120cm-1为酯键中C-O键的特征吸收峰，1622cm-1为酯键和酰胺键中C＝O的重叠吸收峰。表明纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)和缩水甘油-阿霉素(GLY-DOX)之间确实以酯键相连。
实施例4
不同pH对纳米药物NPGD体外释药的影响
纳米药物NPGD的体外释放实验在37℃下HAc-NaAc(0.01M，pH 4.5)、HAc-NaAc(0.01M，pH 4.5)+Lysozyme(1mg/mL)、PBS(0.01M，pH 7.4)三种条件下进行。分别取三分等量纳米药物NPGD悬浊分散于相应介质溶剂中并放入释放用透析袋中，透析袋分别浸入9mL上述三种缓冲溶液介质中，置于37℃恒温震荡仪中，在每个取样时间点，取走2mL溶液用于紫外测试，另外补加2mL对应的新鲜透析溶剂。取出的2mL溶液通过阿霉素(DOX)在480nm处的吸光度从而测定其含量。
图3为纳米药物NPGD在不同pH下体外释药曲线，结果可以看出，在生理条件(PBS，pH 7.4)下，纳米药物NPGD很稳定，经过长达约110个小时后累计释药率才为8％左右，而在酸性条件下HAc-NaAc(0.01M，pH 4.5)，纳米药物NPGD的释放率大于正常生理条件下，但由于酯键在酸性条件下断裂慢，所以释放率也不是很大，相反在模拟细胞内溶酶体环境的条件下HAc-NaAc(0.01M，pH 4.5)+Lysozyme(1mg/mL)，释药率达到了约70％，表明溶菌酶的存在可以使酯键很好的断裂从而释放出阿霉素，达到杀死肿瘤细胞的目的。
实施例5：
不同浓度NPGD纳米药物对人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(Hela)、人乳腺癌细胞(MCF-7)活性的影响
将处于对数生长期的人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(Hela)、人乳腺癌细胞(MCF-7)细胞(10％FBS/DMEM培养基，5％CO2，37℃)按每孔5×103个接种于96孔培养板，细胞贴壁后，换200μL 10％FBS/DMEM培养基配制的各实验组(A：ND-PEG 6.67μg/mL、NPGD6.67μg/mL(含DOX 1μg/mL)；B:ND-PEG 20μg/mL、NPGD 20μg/mL(含DOX 3μg/mL)；C：ND-PEG 33.33μg/mL、NPGD 33.33μg/mL(含DOX 5μg/mL)；D：ND-PEG 46.67μg/mL、NPGD 46.67μg/mL(含DOX 7μg/mL)；E：ND-PEG 60μg/mL、NPGD 60μg/mL(含DOX 9μg/mL)，每组均以未处理的HepG2、HeLa、MCF-7细胞为空白对照组，每组设置6个复孔，培养72h后每孔加入20μL 5mg/mL MTT的PBS溶液，继续培养4h，然后弃除孔内旧培养液，每孔加入150μL DMSO，均匀振摇10min，进行酶标仪上机检测。
图4A为各药物组对体外HepG2细胞增殖的影响，图4B为各药物组对体外HeLa细胞增殖的影响，图4C为各药物组对体外MCF-7细胞增殖的影响。与空白细胞组对照，发现纳米材料载体ND-PEG在不同浓度条件下，对HepG2、HeLa、MCF-7三种细胞活性几乎没有影响，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；而纳米药物NPGD对HepG2、HeLa、MCF-7三种细胞均表现出不同程度的杀伤作用，且随着药物浓度的增大，杀伤力逐渐增强。表明NPGD药物可以有效杀死肿瘤细胞，且对不同的肿瘤细胞具有不同的杀伤力，表现为对HeLa细胞杀伤力最弱，MCF-7细胞杀伤力最强。
实施例6：
NPGD纳米药物对人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(Hela)、人乳腺癌细胞(MCF-7)培养不同时间活性的影响
将处于对数生长期的人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(Hela)、人乳腺癌细胞(MCF-7)细胞(10％FBS/DMEM培养基，5％CO2，37℃)按每孔5×103个接种于96孔培养板，细胞贴壁后，换200μL 10％FBS/DMEM培养基配制的各实验组(A：ND组，33.33μg/ml；B:ND-PEG组，33.33μg/ml；C：NPGD组，33.33μg/ml ND-PEG+5μg/ml DOX；D：DOX组，5μg/ml DOX)，每组均以未处理的HepG2、HeLa、MCF-7细胞为空白对照组，分别培养24h、48h和72h后每孔加入20μl 5mg/ml MTT溶液，继续培养4h，然后弃除孔内旧培养液，接着每孔加入150μLDMSO，振摇10min，进行MTT检测。
图5A为各药物组对体外HepG2细胞增殖的影响，图5B为各药物组对体外HeLa细胞增殖的影响，图5C为各药物组对体外MCF-7细胞增殖的影响。与空白细胞组对照，A和B药物组在选定浓度条件下，对HepG2、HeLa、MCF-7细胞增值基本没有影响，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；加药24h后，C组对细胞活性的影响与对照组相比基本上没有明显差异，但随着时间的延长，C组对细胞的毒性明显大于对照组，表明NPGD药物能够有效杀死肿瘤细胞，且对MCF-7细胞效果最为明显。
实施例5：
NPGD纳米药物诱导MCF-7细胞凋亡实验
为了进一步研究纳米药物NPGD对肿瘤细胞的活性影响，我们采用流式细胞仪检测了其对MCF-7细胞凋亡率的变化。将对数生长期的HeLa细胞以2.0×105/dish的密度接种于35mm培养皿中，细胞贴壁后分别用DOX(5μg/mL)、ND-PEG(33.33μg/mL)、NPGD(33.33μg/mL，含DOX 5μg/mL)进行处理，培养48h后，弃去旧液，冷PBS洗涤3次，用无EDTA的胰酶将贴壁细胞解离后收集于新鲜培养液中，上机前用PBS洗涤，洗涤后加入含Ca2+的缓冲溶液(Binding buffer)，向其中加入新混匀的双染料(PI+Annexin-V)染色15min后上机测试。
图6表示实验组细胞凋亡的情况，图6A为未做任何处理的MCF-7细胞的流式测试结果图，图6B为以纳米载体ND-PEG处理MCF-7细胞后的流式测试结果图，图6C为以纳米药物ND-PEG-GLY-DOX处理MCF-7细胞后的流式测试结果图，图6D为以游离药物DOX处理MCF-7细胞后的流式测试结果图，图6A-D中四个象限按顺时针方向(左上角开始)分别代表死亡细胞(UL)、中晚凋细胞(UR)、早凋细胞(LR)和正常细胞(LL)所占的比例。本文选择早凋和晚凋细胞百分数的总和作为细胞凋亡的分析数据，图6E为各组细胞的凋亡比较分析图，由图可发现，纳米载体ND-PEG处理组的细胞凋亡与对照组相差不大，凋亡百分数均约为10％，说明材料具有良好的生物相容性；而纳米药物NPGD和游离药物DOX与对照组相比，凋亡百分数分别达到了约25％和35％，说明纳米药物NPGD和游离药物DOX均能引起细胞凋亡，这一现象表明我们所制备的纳米药物能对肿瘤细胞有一定的抑制作用。
综上所述，通过MTT测试NPGD对HepG2、HeLa、MCF-7三种癌细胞的作用，以及流式细胞仪测定不同处理组细胞周期和凋亡的实验，都充分表明了纳米载体ND-PEG通过酯键偶联化疗药物阿霉素DOX制备成的NPGD纳米药物可以有效杀死肿瘤细胞。因此该纳米药物NPGD可在制备抗肿瘤药物中应用。
Claims (3)
1.一种酯键偶联纳米钻石阿霉素药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取真空干燥的羧基化纳米钻石，按每毫克羧基化纳米钻石加入1-1.5mL的浓度为0.1M、pH为5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每毫克羧基化纳米钻石加入0.2mg EDC、0.25mg NHS，室温搅拌反应6h，反应完毕后以15000rpm高速离心5min弃除上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；接着将活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到浓度为0.1M、pH为8.4的硼酸缓冲溶液中，经过短暂超声分散形成悬浊液，再按每毫克活化的羧基化纳米钻石沉淀物快速加入0.3mg H2N-PEG-COOH，继续室温搅拌反应12h，待反应结束，以15000rpm高速离心5min吸除上清液，并用0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液高速离心洗涤三次，获得ND-PEG-COOH沉淀物；
(2)取阿霉素，按每毫克阿霉素加入1-1.5mL无水乙醇溶解，取5mL体积分数为10％的缩水甘油无水乙醇溶液于容器中，在快速搅拌状态下缓慢加入上述阿霉素溶液，再加入几滴三乙胺，使体系pH约为8，室温避光搅拌反应24小时，反应完毕，抽滤收集产物，并用丙酮洗涤5-10次，得到阿霉素-缩水甘油，置于真空干燥箱，避光保存；
(3)称取真空干燥的ND-PEG-COOH沉淀物，按每毫克ND-PEG-COOH加入0.5-1mL的灭菌双蒸水中，超声分散30min形成悬浊液，然后逐滴滴入溶有0.2-0.3mg阿霉素-缩水甘油的灭菌双蒸水中，接着再按每毫克ND-PEG-COOH加入0.2mg EDC、0.25mg NHS，随后加入几滴三乙胺，使体系pH约为8，然后于37℃水浴锅避光搅拌反应24小时，以15000rpm高速离心5min收集上清液，用灭菌双蒸水洗涤5次，再用丙酮洗涤至上清液无色，即制得纳米钻石-聚乙二醇-缩水甘油-阿霉素纳米药物，真空干燥，避光保存。
2.如权利要求1所述方法制备得到的酯键偶联纳米钻石阿霉素药物。
3.如权利要求2所述的酯键偶联纳米钻石阿霉素药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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| CN103203024A (zh) * | 2013-04-11 | 2013-07-17 | 山西大学 | 一种靶向纳米钻石载体和靶向药物及其制备方法和应用 |
| CN103705944A (zh) * | 2014-01-07 | 2014-04-09 | 山西大学 | 叶酸修饰的纳米钻石靶向药物的制备方法和应用 |
| CN104524594A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-04-22 | 山西大学 | 纳米钻石表面修饰负载甲氨蝶呤的药物及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111544596A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-08-18 | 山西大学 | 一种gsh响应型纳米钻石靶向药物及其制备方法和应用 |
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| CN112353783A (zh) * | 2020-11-18 | 2021-02-12 | 湖北医药学院 | 一种利用血小板高效装载化疗药物阿霉素的方法 |
Also Published As
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|---|---|
| CN104906593B (zh) | 2017-10-17 |
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