CN109010826A - 一种基于吲哚方酸菁染料的靶向材料及其制备方法和荧光纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于吲哚方酸菁染料的靶向材料及其制备方法和荧光纳米粒子及其制备方法。本发明使用溴、氢或甲基取代吲哚方酸菁与靶向多肽RGD分子或分别与RGD分子及抗癌药物喜树碱相偶联，得到具有两亲性的诊疗分子。该类分子可以在水中自组装形成稳定、尺寸均一的纳米粒子。本发明制备的纳米粒子具有近红外荧光发射，在活体成像过程中可降低背景荧光的干扰并增加信号穿透深度；纳米粒子具有肿瘤靶向性能，可以高效富集在肿瘤组织区域并实现精准活体肿瘤荧光成像；纳米粒子具有光动力性能，可以实现对肿瘤的有效的光动力治疗或光动力‑化疗联合治疗。因此，本发明制备的纳米粒子在癌症的精准诊疗领域具有良好的应用前景。

Description

一种基于吲哚方酸菁染料的靶向材料及其制备方法和荧光纳 米粒子及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医疗技术领域，具体来说，涉及一种基于吲哚方酸菁染料的靶向材料，和基于所述吲哚方酸菁染料通过分子自组装得到的靶向荧光纳米粒子，可用于肿瘤靶向诊疗。
背景技术
20世纪以来，以心脑血管疾病、恶性肿瘤等为代表的重大疾病发病率居高不下，重大疾病的防控是摆在我们面前的一项非常严峻而艰巨的任务。其中，中国每年癌症新增和死亡病例居于世界首位。传统对抗癌症的方法包括手术、化疗及放疗等。这些方法的缺点之一是对肿瘤细胞的选择性差，常会对正常细胞造成额外伤害，癌症病人因此承受了巨大的身心痛苦。近年来，随着纳米技术的发展，人们开发了形态各异、功能丰富的纳米粒子。纳米粒子由于纳米尺寸效应，在生物体内具更长的循环时间，并可通过高通透性和滞留效应(EPR效应)靶向到肿瘤位置。另一方面，纳米粒子表面可以整合靶向基团(例如RGD多肽、叶酸等)，以进一步提升其主动靶向肿瘤的能力。基于自组装技术的纳米药物是一个多功能平台，为制备集多种功能于一身的肿瘤靶向纳米粒子提供了一条行而有效的思路。
基于光学技术的光诊断和光治疗(光诊疗)在近几十年发展迅速，已经成为一类重要的癌症诊断和治疗方法。光诊疗包括荧光成像、光声成像及光动力治疗、光热治疗等，具有原位、无损、高选择性、少副作用等优点。吲哚方酸菁染料是生物荧光标记中常用的光学分子。吲哚方酸菁的紫外吸收和荧光发射位于近红外区，并具有较好的光稳定性、光动力性能及较多的修饰位点。但是，吲哚方酸菁染料由于缺乏特异性的肿瘤靶向能力及癌症治疗能力，在癌症光诊疗领域的应用较为薄弱。因此，为了拓展光诊疗材料，基于吲哚方酸菁染料开发一种能够自组装并且整合肿瘤靶向、成像及治疗功能的试剂具有重要意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于吲哚方酸菁染料的靶向材料，和基于所述吲哚方酸菁染料通过分子自组装得到的靶向荧光纳米粒子，可用于靶向肿瘤荧光成像及光动力或光动力-化疗治疗肿瘤。
本发明的技术方案如下：
本发明使用4号位由溴、氢或甲基取代的苯肼盐酸盐为原料，制备得到带有上述三种取代基且带有马来酰亚胺基团的吲哚方酸菁染料，然后通过“点击化学”反应进一步将RGD多肽(或RGD多肽及喜树碱)偶联至染料分子。由于方酸基团的引入，分子具有较好的光稳定性；RGD多肽提供靶向能力，吲哚方酸菁荧光核提供荧光成像及光动力治疗能力，抗癌药物喜树碱提供化疗能力；另外，分子具有两亲性，在水中可以通过自组装形成尺寸均一、稳定的纳米粒子。
本发明所述的基于吲哚方酸菁染料的靶向材料的结构式为：
其中，R1为H，Br，或CH3；
R2为
本发明所述的基于吲哚方酸菁染料的靶向材料的制备方法，使用溴、氢或甲基取代吲哚方酸菁与靶向多肽RGD分子，或分别与RGD分子和喜树碱相偶联得到所述靶向材料。
进一步的，使用4号位由溴、氢或甲基取代的苯肼盐酸盐制备得到带有溴、氢或甲基且带有马来酰亚胺基团的吲哚方酸菁，进而与靶向多肽RGD分子，或分别与RGD分子和喜树碱相偶联得到所述靶向材料。
进一步的，所述使用4号位由溴、氢或甲基取代的苯肼盐酸盐制备得到带有溴、氢或甲基且带有马来酰亚胺基团的吲哚方酸菁的方法包括以下步骤：
1)将12-24mmol 4-R基苯肼盐酸盐及12-24mmol 3-甲基-2-丁酮加入到 15-30mL的冰醋酸中，回流反应18-20小时，悬蒸除去溶剂后，用二氯甲烷溶解，并用饱和NaHCO3水溶液洗涤至水相中性，分离有机相并蒸除去溶剂，得到5-R 基-2，3，3-三甲-3H-基吲哚；
2)将5-12mmol的5-R基-2，3，3-三甲-3H-基吲哚与5-12mmol的对卞溴基苯甲酸加入15-20mL乙腈中，回流反应12-20小时，旋蒸除去溶剂，乙醚沉淀并洗涤，干燥后得到中间产物吲哚啉衍生物；
3)将1-5mmol步骤2)合成的吲哚啉衍生物与1-5mmol的3,4-二羟基-3- 环丁烯-1,2-二酮加入10-20mL甲苯和正丁醇的混合溶剂中，甲苯和正丁醇的体积比为1:0.8-1.5，并加入5-10mL吡啶；在氮气保护下，缓慢升温至100-120℃并继续反应15-30小时，用乙醚沉淀并洗涤，得到中间产物吲哚方酸菁衍生物；
4)将0.5-1mmol步骤3)合成的吲哚方酸菁衍生物、2-4mmol的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和2-4mmol二异丙基乙胺加入5-10mmol N,N-二甲基甲酰胺中，室温下反应15-30分钟后加入N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺4-5mmol，继续室温下反应2-8小时后用乙醚沉淀得到带有溴、氢或甲基且带有马来酰亚胺基团的吲哚方酸菁；
步骤1)和2)中的R为H，Br，或CH3。
优选的，与靶向多肽RGD分子，或分别与RGD分子和喜树碱相偶联的方法如下：
依次将0.1-1mmol马来酰亚胺取代的吲哚方酸菁衍生物与0.2-2mmol RGDfc多肽，或0.1-1mmol巯基化喜树碱与0.1-1mmol RGDfc多肽加入至10-15 mL二氯甲烷中并在室温下反应2-10小时，随后旋蒸除去溶剂并用乙醚沉淀，将沉淀干燥后溶于水中并透析一天，最后冷冻干燥得到基于吲哚方酸菁染料的靶向材料。
一种靶向荧光纳米粒子，通过上述基于吲哚方酸菁染料的靶向材料自组装得到。
所述靶向荧光纳米粒子的制备方法，将上述基于吲哚方酸菁染料的靶向材料溶于1×10-3M的DMSO中，然后滴入40-60℃的水中，快速搅拌，随后通过透析法除去DMSO，即得到靶向荧光纳米粒子的水溶液。
上述纳米粒子可用于肿瘤靶向荧光成像材料的制备、肿瘤靶向光动力治疗药物或光动力-化疗联合治疗药物的制备。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明设计合成的吲哚方酸菁染料紫外吸收和荧光发射均位于近红外区，在生物成像过程中可大大降低背景荧光的干扰；
2、本发明设计合成的吲哚方酸菁染料具有两亲性，可以在水中自组装得到尺寸均一、稳定的球形纳米粒子；
3、本发明通过自组装制备的纳米粒子具有主动靶向及被动靶向双重靶向功能，能够高效特异性在肿瘤区域富集；
4、本发明通过自组装制备的纳米粒子可以实现肿瘤靶向的荧光成像，肿瘤区域的荧光信号可以持续24小时以上；
5、本发明通过自组装制备的纳米粒子可以实现肿瘤靶向的光动力治疗或光动力-化疗联合治疗，肿瘤抑制率高；
6、本发明提供的吲哚方酸菁染料及纳米粒子制备工艺成熟，产品稳定性好，生物安全性高。
附图说明
图1合成靶向诊疗吲哚方酸菁染料的反应流程图。
图2实施例1中产物的核磁氢谱表征。
图3实施例1中产物的质谱表征。
图4实施例2中纳米粒子的扫描及透射(插图)电子显微镜图像。
图5动态光散射法测量实施例2中纳米粒子在水、DMEM培养基及牛血清蛋白(FBS)溶液中的(a)粒径及(b)保存过程中的粒径变化。
图6实施例2中纳米粒子的吸收及发射光谱图。
图7实施例2纳米粒子用于靶向肿瘤荧光成像。(a)肿瘤区域相对荧光强度随时间的变化曲线。(b)24小时后纳米粒子在肿瘤，心脏，肝，脾，肺，肾的荧光强度。
图8不同治疗组的荷瘤小鼠肿瘤体积随治疗时间的变化曲线。
图9是本发明的基本构思示意图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明所述的一种基于吲哚方酸菁染料的靶向材料，和基于所述吲哚方酸菁染料通过分子自组装得到的靶向荧光纳米粒子做进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：靶向诊疗吲哚方酸菁染料ICy5-CPT-RGD的合成
1.将2.23g(10mmol)4-溴苯肼盐酸盐及0.86g(10mmol)3-甲基-2-丁酮加入到10mL的冰醋酸中，回流反应12小时，悬蒸除去溶剂后，用二氯甲烷溶解，并用饱和NaHCO3水溶液反复洗涤至水相无色、pH中性，取有机相旋蒸除去溶剂，得到5-溴-2，3，3-三甲-3H-基吲哚1.88g(7.9mmol)，产率79％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40(s,3H),2.27(s,3H),1.30(s,6H).
2.将1.19g(5mmol)5-溴-2，3，3-三甲-3H-基吲哚与1.08g(5mmol)的对卞溴基苯甲酸加入15mL乙腈，回流反应20小时，旋蒸除去溶剂后用乙醚沉淀并多次洗涤，干燥后得到中间产物吲哚啉衍生物1.72g(3.8mmol)，产率76％；
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.10(s,3H),7.76(s,1H),7.67(s,1H),7.49(s, 2H),5.93(s,2H),1.72(s,6H).
3.将1.35g(3mmol)吲哚啉衍生物与171mg(1.59mmol)的3,4-二羟基 -3-环丁烯-1,2-二酮(方酸)加入10mL甲苯正丁醇(体积比为1：1)混合溶剂中，并加入5mL吡啶，在氮气保护下，缓慢升温至115℃，24小时后用乙醚沉淀得到中间产物吲哚方酸菁衍生物805mg(0.98mmol)，产率65％；
HRMS(ESI-TOF):Calcd for[M+H]+,821.08,Found,821.07.
4.将206mg(0.25mmol)的吲哚方酸菁中间产物溶解于10mL DMF中，加入HATU(190mg,0.5mmol)和DIPEA(0.3mL)。随后搅拌1小时，向反应液中加入N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺0.54mmol。将混合液室温搅拌5小时后用乙醚沉淀得到马来酰亚胺取代的吲哚方酸菁衍生物230mg，产率为86％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.53(t,J＝5.9Hz,2H),7.85(d,J＝1.5Hz, 2H),7.70(d,J＝8.1Hz,4H),7.51(d,J＝8.4Hz,2H),7.26(t,J＝9.0Hz,6H),7.00(s, 3H),5.77(s,2H),5.43(s,4H),3.56(t,J＝5.5Hz,4H),3.38(q,J＝5.7Hz,4H),1.72 (s,12H).；
HRMS(ESI-TOF):m/z calcd for[M+H]+,1105.30；found,1105.3121；[M+Na]+,1127.30；found,1127.2941.
5.将80mg(0.075mmol)马来酰亚胺取代的吲哚方酸菁衍生物溶解于5mL 二氯甲烷中。随后将30mg(0.069mmol)的巯基化喜树碱加入5mL二氯甲烷中在1小时内滴加入上述溶液中。将该混合物在室温搅拌5小时后加入溶解于5mL 甲醇中的c(RGDfc)多肽30mg(0.052mmol)。将混合物在室温搅拌5小时，随后用乙醚沉淀得到ICy5-CPT-RGD。将ICy5-CPT-RGD溶于水中并透析一天。最后冷冻干燥得到蓝色粉末92mg，产率为84.5％。其结构式为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.62-8.23(m,5H),8.13(dd,J＝13.6,8.5Hz, 2H),7.92-7.60(m,10H),7.54-7.43(m,2H),7.32-7.04(m,15H),5.76(t,J＝3.3Hz, 2H),5.56-5.25(m,8H),4.57(d,J＝57.5Hz,3H),3.66-3.36(m,10H),3.10(s,5H), 2.14(d,J＝13.2Hz,2H),2.00(s,5H),1.70(d,J＝7.0Hz,12H),1.51(s,2H),0.92 (td,J＝7.4,4.1Hz,3H).MS(MALDI-TOF,m/z)m/z[M+H]+calcd for C101H100Br2N16O20S2:2082.3264.found:2082.4404.
实施例2：ICy5-CPT-RGD通过自组装方法制备纳米粒子PTN
将2.1mg吲哚方酸菁染料ICy5-CPT-RGD溶于1mL的DMSO中(1×10-3M)，取其中0.1mL的染料溶液滴入10mL水中(50℃)，快速搅拌5-10分钟，随后通过透析法除去DMSO，即得到PTN的水溶液。
实施例3：PTN纳米粒子用于活体肿瘤靶向荧光成像
建立Balb/c裸鼠的人体肝癌体外细胞(BEL-7402)肿瘤模型用于评价PTN 在活体内的靶向成像能力及抗肿瘤效果。将培养好的BEL-7402细胞以3×106细胞/100μL的密度接种在裸鼠背部的右下方皮下处，培养至长出肿瘤体积(0.5×长×宽2)为100mm3左右。通过尾静脉对荷瘤小鼠注射200μL的PTN(1mg/mL) 溶液，对照组注射200μL的生理盐水。将小鼠置于IVIS遮光培养箱中，随后用 2.5％的异氟烷将小鼠麻醉，并采用的IVIS小动物活体成像系统(PerkinElmer Co.) 采集图像。采集图像的时间点为0，0.5，1，3，6，12，18，24小时。24小时后处死小鼠，对其肿瘤，心，肝，脾，肺以及肾等组织器官进行解剖并成像。主要器官的平均信号强度通过Maestra image software进行分析。
如图7所示为通过尾静脉注射不同时间点小鼠活体成像后肿瘤部位荧光强度情况。实验进行30分钟后，我们在肿瘤处观察到了吲哚方酸菁染料的荧光信号，表明PTN能够在肿瘤处有效富集。注射后6小时，肿瘤处的荧光信号一直在增强，直到24小时信号都能保持较高强度(图7a)，表明PTN具有良好的活体荧光成像能力及较强的肿瘤靶向性。注射后24小时，将小鼠处死并解剖其主要器官测试其荧光强度(图7b)。结果表明，大部分PTN能够在肿瘤中有效富集，而在其他主要器官如心肝脾肺肾等部位富集较少。PTN在肿瘤部位的有效富集是被动靶向(增强的渗透和滞流效应)和主动靶向共同导致的。
实施例4：
用BEL-7402荷瘤小鼠对PTN的靶向肿瘤治疗效果进行评价。当小鼠肿瘤体积到达100mm3后，通过尾静脉对小鼠注射不同的试剂并且分成六组(每组四只小鼠)：(1)PBS对照组(2)PTN组(喜树碱当量1.5mg/kg)(3)喜树碱组 (1.5mg/kg)(4)PBS+光照组(5)水溶性花菁(Cy-PEG)+光照组(6)PTN+ 光照组(喜树碱当量1.5mg/kg)。其中光照组在注射药品后20小时采用功率为 50mW·cm-2的660nm的激光对肿瘤部位照射10分钟。每两天使用游标卡尺测试肿瘤的尺寸并计算其体积，得到肿瘤体积随时间的变化曲线。
肿瘤治疗结果如图8所示，在20天的治疗过程中，PTN+光照组中的小鼠肿瘤生长明显得到抑制，而其他对照组中小鼠肿瘤体积持续增长。这表明纳米粒子的光动力-化疗联合治疗可以有效抑制疗恶性肿瘤生长。
本发明使用溴、氢或甲基取代吲哚方酸菁与靶向多肽RGD分子或分别与 RGD分子及抗癌药物喜树碱相偶联，得到具有两亲性的诊疗分子。该类分子可以在水中自组装形成稳定、尺寸均一的纳米粒子。本发明制备的纳米粒子具有近红外荧光发射，在活体成像过程中可降低背景荧光的干扰并增加信号穿透深度；纳米粒子具有肿瘤靶向性能，可以高效富集在肿瘤组织区域并实现精准活体肿瘤荧光成像；纳米粒子具有光动力性能，可以实现对肿瘤的有效的光动力治疗或光动力-化疗联合治疗。因此，本发明制备的纳米粒子在癌症的精准诊疗领域具有良好的应用前景。
以上实施例结合附图本发明的实施方式做了说明。尽管只对本发明的一些具体实施方式和技术要点做出了描述，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明的宗旨前提下做出各种变化。因此，所展示的例子与实施方式被视为示意性的而非限制性的，在不脱离如所附各权利要求所定义的本发明精神及范围的情况下，本发明可能涵盖各种的修改与替换。

Claims (9)

1.一种基于吲哚方酸菁染料的靶向材料，其特征在于，其结构式为：
其中，R1为H，Br，或CH3；
R2为
2.一种基于吲哚方酸菁染料的靶向材料的制备方法，其特征在于，使用溴、氢或甲基取代吲哚方酸菁与靶向多肽RGD分子，或分别与RGD分子和喜树碱相偶联得到所述靶向材料。
3.根据权利要求2所述的基于吲哚方酸菁染料的靶向材料的制备方法，其特征在于，使用4号位由溴、氢或甲基取代的苯肼盐酸盐制备得到带有溴、氢或甲基且带有马来酰亚胺基团的吲哚方酸菁，进而与靶向多肽RGD分子，或分别与RGD分子和喜树碱相偶联得到所述靶向材料。
4.根据权利要求3所述的基于吲哚方酸菁染料的靶向材料的制备方法，其特征在于，所述使用4号位由溴、氢或甲基取代的苯肼盐酸盐制备得到带有溴、氢或甲基且带有马来酰亚胺基团的吲哚方酸菁的方法包括以下步骤：
1)将12-24mmol 4-R基苯肼盐酸盐及12-24mmol 3-甲基-2-丁酮加入到15-30mL的冰醋酸中，回流反应18-20小时，悬蒸除去溶剂后，用二氯甲烷溶解，并用饱和NaHCO3水溶液洗涤至水相中性，分离有机相并蒸除去溶剂，得到5-R基-2，3，3-三甲-3H-基吲哚；
2)将5-12mmol的5-R基-2，3，3-三甲-3H-基吲哚与5-12mmol的对卞溴基苯甲酸加入15-20mL乙腈中，回流反应12-20小时，旋蒸除去溶剂，乙醚沉淀并洗涤，干燥后得到中间产物吲哚啉衍生物；
3)将1-5mmol步骤2)合成的吲哚啉衍生物与1-5mmol的3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮加入10-20mL甲苯和正丁醇的混合溶剂中，甲苯和正丁醇的体积比为1:0.8-1.5，并加入5-10mL吡啶；在氮气保护下，缓慢升温至100-120℃并继续反应15-30小时，用乙醚沉淀并洗涤，得到中间产物吲哚方酸菁衍生物；
4)将0.5-1mmol步骤3)合成的吲哚方酸菁衍生物、2-4mmol的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和2-4mmol二异丙基乙胺加入5-10mmol N,N-二甲基甲酰胺中，室温下反应15-30分钟后加入N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺4-5mmol，继续室温下反应2-8小时后用乙醚沉淀得到带有溴、氢或甲基且带有马来酰亚胺基团的吲哚方酸菁；
步骤1)和2)中的R为H，Br，或CH3。
5.根据权利要求4所述的基于吲哚方酸菁染料的靶向材料的制备方法，其特征在于，与靶向多肽RGD分子，或分别与RGD分子和喜树碱相偶联的方法如下：
依次将0.1-1mmol马来酰亚胺取代的吲哚方酸菁衍生物与0.2-2mmol RGDfc多肽，或0.1-1mmol巯基化喜树碱与0.1-1mmol RGDfc多肽加入至10-15mL二氯甲烷中并在室温下反应2-10小时，随后旋蒸除去溶剂并用乙醚沉淀，将沉淀干燥后溶于水中并透析一天，最后冷冻干燥得到基于吲哚方酸菁染料的靶向材料。
6.一种靶向荧光纳米粒子，其特征在于，通过权利要求1所述的基于吲哚方酸菁染料的靶向材料自组装得到。
7.一种靶向荧光纳米粒子的制备方法，将权利要求1所述的基于吲哚方酸菁染料的靶向材料1-5mg溶于1mL的1×10-3M的DMSO中，然后滴入40-60℃的水中，快速搅拌，随后通过透析法除去DMSO，即得到靶向荧光纳米粒子的水溶液。
8.根据权利要求6所述的靶向荧光纳米粒子作为制备肿瘤的荧光成像材料的应用。
9.根据权利要求6所述的靶向荧光纳米粒子作为制备肿瘤的光动力治疗药物或光动力-化疗联合治疗药物的应用。
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