CN113827722B - 一种可控制备onoo-的纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

一种可控制备onoo-的纳米粒子及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

一种可控制备ONOO‑的纳米粒子及其制备方法与应用，基于一氧化氮和光动力治疗间的协同作用，设计制备新型光敏剂PEG‑b‑PAA‑g‑SNO@IR780纳米粒子，并基于单一808 nm激光刺激，实现简便、高效、可控释放ONOO‑。在单一808 nm激光的照射下，实现单一近红外光刺激下，简便、高效、可控释放ONOO‑，本发明有望提供简便、高效、可控释放过氧亚硝酸盐的新工具，用于探究原位释放过氧亚硝酸盐与其生理和病理相互作用，以及用于抗菌和抗肿瘤治疗领域。

Description

一种可控制备ONOO-的纳米粒子及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及过氧亚硝酸盐可控释放技术领域，具体涉及一种可控制备ONOO-的纳米粒子及其制备方法与应用。
背景技术
过氧亚硝酸盐是一种短寿命的内源性物质。其在炎症反应、癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等生理和病理过程中，起着至关重要的作用。由于超强的氧化和硝化活性（高于一氧化氮、单线态氧、羟基自由基等），生物体中过表达的过氧亚硝酸盐对蛋白质、核酸、脂质体等生物分子进行着不可逆的破坏。近年来，少量的开创性科研工作表明，外源性释放ONOO—的纳米材料在抗肿瘤治疗和抗菌治疗中均展示出良好的治疗效果。然而，简便、高效、可控释放过氧亚硝酸盐十分困难。
基于一氧化氮和超氧阴离子（O2 ·-）间的偶合反应，是一种产生ONOO─的可行方式。由于一氧化氮(NO)和O2 ·-的寿命低，扩散半衰期短，因此需要在病灶部位同时输送一氧化氮供体和光敏剂，且大量快速一氧化氮的释放和良好的光动力效率是高效产生ONOO─的前提，这限制了可控产生ONOO─生物材料的开发和生物应用。另外，NO释放和O2 ·-产生的刺激源往往不同，因此常需要多种刺激同时作用，才能产生ONOO─。这增加了操作复杂性，且因刺激源不同的先后操作顺序、操作人员的个体差异等因素，会引起ONOO─的产生效率偏差较大。
发明内容
为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种可控制备ONOO-的纳米粒子及其制备方法与应用，有望提供简便、高效、可控释放过氧亚硝酸盐的新工具，用于探究原位释放过氧亚硝酸盐与其生理和病理相互作用，以及用于抗菌和抗肿瘤治疗领域。
本发明采用的技术解决方案是：一种可控制备ONOO-的纳米粒子,所述的纳米粒子为PEG-b-PAA-g-SNO聚合物侧链上负载一氧化氮释放基元，共组装IR780光敏剂获得的PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子。
所述的纳米粒子侧链上负载一氧化氮释放基元为巯基通过亚硝化得到。
一种可控制备ONOO-的纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
（1）将5-10 g聚乙二醇单甲醚溶解于50-100 mL的无水二氯甲烷中，并加入202-400 mg的三乙胺,在冰浴条件下，向混合液中缓慢滴加460-900 mg的溴代异丁酰溴,在快速搅拌下，反应24-48小时,将反应液，用饱和食盐水水洗，二氯甲烷多次萃取，并用正己烷多次沉淀，抽滤，真空干燥，得PEG-Br样品；
（2）取PEG-Br样品2-8 g溶解于10-50 mL的N, N-二甲基甲酰胺（DMF）中，并加入丙烯酸叔丁酯2.5-10 g、五甲基二乙烯三胺（PMDETA）135-550 mg，以及在氮气保护下，加入溴化亚铜112-450 mg,在快速搅拌下，于65℃的油浴中加热24-48小时,过中性氧化铝柱子，除去反应液中的金属铜，随后，用超纯水透析24-48小时，并冻干都到PEG-b-PtBA样品;
（3）取PEG-b-PtBA样品2-6 g溶解于30-50 mL的二氯甲烷中，并加入三氟乙酸5-15mL,随后，在快速搅拌下，反应24-48小时,旋转除去大部分溶剂，后用冰乙醚沉淀三次，得到PEG-b-PAA样品;
（4）取PEG-b-PAA样品0.5-2 g溶解于10-20 mL的DMF中，并取0.836-3.35 g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于5-15 mL的超纯水中，且将所得水溶液加入DMF的溶液中，向上述混合液中继续加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 150-600 mg,常温搅拌2小时后，向反应液中继续加入0.335-1 g的半胱胺,室温下反应24-48小时后，向反应液中继续加入2-4 mL亚硝酸叔丁酯,继续反应2-12小时后，将反应液分别用冰甲醇和乙醚、冰乙醚沉淀2次，获得红色PEG-b-PAA-g-SNO样品;
（5）采用共组装的方法制备PEG-b-PAA-g-SNO@IR780纳米粒子:取20-200 mg PEG-b-PAA-g-SNO样品和2-20 mg的IR780光敏剂，于2-10 mL的四氢呋喃中溶解,将混合液在避光条件下，用冰水多次透析，得PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子。
所述的步骤（1）中聚乙二醇单甲醚的Mn = 5000。
所述的步骤（4）中冰甲醇和乙醚的v/v=1:4。
所述的步骤（5）中透析所用的透析袋的截留分子量为3500。
一种所述的纳米粒子在制备可控释放过氧亚硝酸盐(ONOO—)材料上的应用。
所述的可控释放为单一光响应超效可控释放。
所述的单一光响应为808 nm激光刺激。
一种可控制备过氧亚硝酸盐(ONOO—)的方法，包括以下步骤：将所述的PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子在808 nm的激光，输出功率为1-2W的照射条件下，照射30-120秒，实现一氧化氮的的快速释放。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种可控制备ONOO-的纳米粒子及其制备方法与应用，基于一氧化氮和光动力治疗间的协同作用，设计制备新型光敏剂PEG-b-PAA-g-SNO@IR780纳米粒子，并基于单一808 nm激光刺激，实现简便、高效、可控释放ONOO-。在单一808 nm激光的照射下，实现单一近红外光刺激下，简便、高效、可控释放ONOO-，本发明有望提供简便、高效、可控释放过氧亚硝酸盐的新工具，用于探究原位释放过氧亚硝酸盐与其生理和病理相互作用，以及用于抗菌和抗肿瘤治疗领域。
与现有技术相比较，有益效果在于：
（1）无需多重刺激，在单一808 nm激光刺激下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子可控释放ONOO─。
（2）与现有技术相比较，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子具有高效和大量释放ONOO─的能力。
（3）与现有技术相比较，在808 nm激光的刺激下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子可以实现可控释放ONOO─。
（4）通过调节PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的浓度，808 nm的激光功率，以及激光照射的时间，调控PEG-b-PAA-g-SNO@IR780纳米粒子释放ONOO─的浓度和效率。
附图说明
图1为PEG-b-PAA-g-SNO聚合物的合成路线。
图2为PEG-Br的核磁共振氢谱图。
图3为PEG-b-PtBA的核磁共振氢谱图。
图4为PEG-b-PAA的核磁共振氢谱图。
图5为PEG-b-PAA-g-SH的核磁共振氢谱图。
图6为PEG-b-PAA-g-SNO的核磁共振氢谱图。
图7为PEG-b-PAA-g-SH和PEG-b-PAA-g-SNO聚合物的紫外可见吸收光谱图。
图8为PEG-OH、PEG-Br、PEG-b-PtBA、PEG-b-PAA、PEG-b-PAA-g-SH、PEG-b-PAA-g-SNO的傅立叶变换红外光谱图。
图9为PEG-Br、PEG-b-PtBA、PEG-b-PAA-g-SNO的凝胶渗透色谱（GPC）图。
图10为PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的透射电镜照片。
图11为PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子和PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子，在808 nm激光刺激下的一氧化氮释放曲线。
图12为PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的一氧化氮可控释放曲线图。
图13为PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子和PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子，在808 nm激光刺激下的DPBF的降解曲线图。
图14为PEG-b-PCL@IR780 NPs纳米粒子、PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子、以及PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的过氧亚硝酸盐释放行为的检测图。
图15为不同浓度的过氧亚硝酸盐待测液（0 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM,4 μM, 6 μM, 8 μM, 10 μM）的荧光检测的发射光谱图（λex = 313 nm）。
图16为不同浓度的过氧亚硝酸盐与荧光强度（λem = 420 nm）间的标准曲线。
图17为不同样品浓度下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的过氧亚硝酸盐释放量的荧光检测曲线图。
图18为不同样品浓度下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的过氧亚硝酸盐释放量的曲线图。
图19为不同光照时间下（间隔30 s），PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的过氧亚硝酸盐释放量的荧光检测曲线图。
图20为不同光照时间下（间隔30 s），PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的过氧亚硝酸盐释放量的曲线图。
图21为不同光照时间下（间隔10 s），PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的过氧亚硝酸盐释放量的荧光检测曲线图。
图22为不同光照时间下（间隔10 s），PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的过氧亚硝酸盐释放量的曲线图。
图23为不同输出功率照射下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的过氧亚硝酸盐释放量的荧光检测曲线图。
图24为不同输出功率照射下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的过氧亚硝酸盐释放量的曲线图。
图25为PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的过氧亚硝酸盐可控释放的荧光检测曲线图。
图26为PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的过氧亚硝酸盐可控释放的曲线图。
图27为本发明PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 纳米粒子的制备及释放ONOO-原理图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目标聚合物（PEG-b-PAA-g-SNO）的合成路线见图1，具体合成步骤见实施例1-5。
实施例1： 将5 g聚乙二醇单甲醚（Mn = 5000）溶解于50 mL的无水二氯甲烷中，并加入202 mg的三乙胺。在冰浴条件下，向混合液中缓慢滴加460 mg的溴代异丁酰溴。在快速搅拌下，反应24小时。将反应液，用饱和食盐水水洗，二氯甲烷萃取，并用正己烷沉淀(500mL，3次)，抽滤，真空干燥，得PEG-Br样品5.1 g。采用核磁共振波谱仪对所得PEG-Br样品进行测试，测试结果如图2所示。
实施例2：取PEG-Br样品2 g溶解于10 mL的N, N-二甲基甲酰胺（DMF）中，并加入丙烯酸叔丁酯2.5 g、五甲基二乙烯三胺（PMDETA）135 mg，以及在氮气保护下，加入溴化亚铜112 mg。在快速搅拌下，于65℃的油浴中加热24小时。过中性氧化铝柱子三次，除去反应液中的金属铜，随后，用超纯水透析48小时，并冻干都到PEG-b-PtBA样品。采用核磁共振波谱仪对所得PEG-b-PtBA样品进行测试，测试结果如图3所示。
实施例3：取PEG-b-PtBA样品2 g溶解于30 mL的二氯甲烷中，并加入三氟乙酸5mL。随后，在快速搅拌下，反应48小时。旋转除去大部分溶剂，后用冰乙醚沉淀三次，得到PEG-b-PAA样品。采用核磁共振波谱仪对所得PEG-b-PAA样品进行测试，测试结果如图4所示。
实施例4：取PEG-b-PAA样品0.5 g溶解于10 mL的DMF中，并取836 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于5 mL的超纯水中，且将所得水溶液加入DMF的溶液中。此外，向上述混合液中继续加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 150 mg。常温搅拌2小时后，向反应液中继续加入335 mg的半胱胺。室温下反应48小时后，将反应液分别用冰甲醇和乙醚的混合液（v/v=1:4）、冰乙醚沉淀2次，得白色的PEG-b-PAA-g-SH样品。采用核磁共振波谱仪对所得PEG-b-PAA-g-SH样品进行测试，测试结果如图5所示。
实施例5：将实施例4中的所有PEG-b-PAA-g-SH样品溶解于8 mL的DMF中，随后向反应液中继续加入2 mL亚硝酸叔丁酯和1 mL的超纯水。继续反应2小时后，将反应液分别用冰甲醇和乙醚（v/v=1:4）、冰乙醚沉淀2次，获得红色PEG-b-PAA-g-SNO样品。-20℃，避光保存。采用核磁共振波谱仪对所得PEG-b-PAA-g-SNO样品进行测试，测试结果如图6所示。从紫外可见吸收光谱数据可见（如图7），PEG-b-PAA-g-SNO样品在波长为550 nm处附近，出现了S-N键特征性的吸收峰。这也进一步确认PEG-b-PAA-g-SNO样品的成功制备。
将实施例1-5中的聚合物样品，进行傅立叶变换红外光谱仪的测试，测试结果如图8所示。此外，我们对实施例1、2、5中获得的PEG-Br、PEG-b-PtBA、PEG-b-PAA-g-SNO三种聚合物样品进行了凝胶渗透色谱（GPC）测试，所得结果如图9所示。
实施例6：采用自组装的方法制备PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子。取20 mg PEG-b-PAA-g-SNO样品于2 mL的四氢呋喃中溶解，随后，将混合液，在避光条件下，用冰水透析，得PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子。透析袋的截留分子量为3500。
实施例7：采用共组装的方法制备PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子。取20 mgPEG-b-PAA-g-SNO样品和2 mg的IR780光敏剂，于2 mL的四氢呋喃中溶解。随后，将混合液，在避光条件下，用冰水透析，得PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子。透析袋的截留分子量为3500。采用场发射透射电镜对PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的形貌和尺寸进行测试。测试结果如图10所示，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子为球形结构，直径约为94.8 nm。
实施例8：采用经典的Griess assay法，对PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子，以及PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的一氧化氮释放行为进行检测。分别取400 μL的PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子和PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的组装液，并分别加入400 μL的Griess Ⅰ和400 μL Griess Ⅱ，以及分别加入2 mL的超纯水，并均匀混合。随后，在808 nm的激光（输出功率为1 W）照射下，分别考察不同照射时间下（分别为10 s, 20s, 30 s, 40 s, 50 s, 60 s, 70 s, 80 s, 90 s, 100 s, 120 s, 140 s, 160 s, 190s, 220 s），PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子和PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的一氧化氮释放行为。测试结果如图11所示，在808 nm的激光刺激下，PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子在220 s内的一氧化氮释放浓度小于3 μM，而PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子实现了一氧化氮的快速释放，并于100 s内，一氧化氮的释放量接近70 μM。
实施例9：此外，本发明对PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的可控一氧化氮释放行为也进行了检测。取400 μL PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的组装液，并加入400 μL的Griess Ⅰ和400 μL Griess Ⅱ，以及分别加入2 mL的超纯水，并均匀混合。随后，在808 nm的激光（输出功率为1 W）照射下，照射15 s，并间歇20 s，随后再照射15 s，并再次间歇20 s，最后再照射15 s。其可控一氧化氮释放行为如图12所示，在808 nm激光刺激的15 s内，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子实现一氧化氮的突释，而随后关闭808 nm激光后，一氧化氮仅有微量的缓释，在后续的激光照射和无激光照射下，展示出相似的规律。这表明PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的一氧化氮释放呈现出可控性。
实施例10：本发明对PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子，以及PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的活性氧产生行为也进行了检测。1, 3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）被用于检测PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子，以及PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的活性氧（ROS）的产生行为。DPBF在ROS的作用下，引起化学结构的破坏，使得其位于420 nm处的紫外可见吸收峰的强度下降。向PBS溶液、PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子组装液、以及PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子组装液中，调节DPBF的加入量，使DPBF位于420 nm处的最大吸收峰的吸光度值均约为1。随后，在808 nm的激光（输出功率为1 W）照射下，分别考察不同照射时间下（分别为0 s, 5 s, 10 s, 15 s, 20 s, 25 s, 30 s），Control组、PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子组、以及PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子组的ROS产生行为。测试结果如图13所示，在808 nm激光的刺激下，Control组和PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子组中，DPBF在420 nm处的吸光度值无明显的下降。然而，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子组中，DPBF在420 nm处的吸光度值伴随光照时间的延长，快速下降。这表明，在808 nm激光的刺激下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子相对于PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子，具有良好的ROS产生行为。
实施例11：本发明对PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的过氧亚硝酸盐产生行为进行了检测。在弱碱性环境中，并有CO2存在的条件下，L-酪氨酸可作为ONOO─的检测探针，其会被ONOO─氧化为二聚体（Dityr），并在313 nm光的刺激下，于420 nm附近展现出荧光。具体实验如下，首先，在室温下制备4 mL含有PBS（0.10 M，pH = 8.2），NaHCO3（0.015 M）和L-酪氨酸（5.0×10-4 M）的溶液。然后将0.25 mg PEG-b-PAA-g-SNO NPs纳米粒子、PEG-b-PCL@IR780 NPs纳米粒子、PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子、加入溶液中，并使用荧光分光光度计检测各组待测液在808 nm激光（1 W, 1分钟）照射，或者无808 nm激光刺激后的荧光信号，将激发波长设定为313 nm。测试结果如图14所示，Control组、PEG-b-PAA-g-SNONPs纳米粒子组、以及PEG-b-PCL@IR780 NPs纳米粒子组，在808 nm激光的刺激下，或者无激光的刺激下，均在420 nm处，无明显的荧光信号增强。此外，在无808 nm 激光的刺激下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子组也无明显的荧光信号增强。仅在808 nm 激光的刺激下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子组于420 nm处，出现了明显的荧光信号。这表明：单一的一氧化氮释放，以及单一的PDT过程，均无法产生明显的过氧亚硝酸盐，但是基于光动力和一氧化氮间的协同作用，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子可以产生大量的ONOO─。
实施例12：为定量检测PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的ONOO─释放行为。本发明利用过氧亚硝酸盐的标准样，构建过氧亚硝酸盐的浓度与检测试剂L-酪氨酸的荧光发射强度间的线性关系。首先，在室温下制备含有PBS（0.10 M，pH = 8.2），NaHCO3（0.015M）和L-酪氨酸（5.0×10-4 M）的混合溶液。随后，向上述混合液中，加入过氧亚硝酸盐的标样，制备成不同浓度的过氧亚硝酸盐的待测液（0 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 6 μM, 8 μM, 10 μM）。然后，利用荧光分光光度计（λex = 313 nm）测试不同过氧亚硝酸盐浓度待测液的荧光发射光谱（如图15），并基于过氧亚硝酸盐浓度与荧光发射强度（λem =420 nm）构建线性关系。如图16所示，过氧亚硝酸盐浓度与检测试剂的荧光发射强度具有良好的线性相关性（R2 = 0.999）。
实施例13：在不同实验条件下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子释放ONOO─的定量检测。考察PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的浓度不同，对ONOO─释放行为的影响。取 PBS（0.10 M，pH = 8.2），NaHCO3（0.015 M）和L-酪氨酸（5.0×10-4 M）的混合溶液4mL，向其中分别加入PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子组装液0 μL, 25 μL, 50 μL,75 μL, 100 μL, 125 μL。随后，将不同浓度的组装液，分别在808 nm激光（2 W, 30 s）照射后，使用荧光分光光度计检测各组待测液的荧光信号（λex = 313 nm）。各组样品的的荧光发射光谱如图17所示。根据标准曲线，计算出不同样品浓度下ONOO─释放行为。如图18所示，随着样品浓度的增加，ONOO─的释放量不断增大。当样品的加入量为125 μL时，ONOO─的释放量达到最大值为1.83 μM，ONOO─的释放效率也达到最大值0.0609 μM/s。
实施例14：考察不同光照时间下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的ONOO─释放行为。取 PBS（0.10 M，pH = 8.2），NaHCO3（0.015 M）和L-酪氨酸（5.0×10-4 M）的混合溶液4 mL，向其中分别加入PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子组装液100 μL。随后，将上述混合液，用808 nm激光（1 W）照射不同的时间，分别为0 s, 30 s, 60 s, 90 s, 120s。使用荧光分光光度计检测各组待测液的荧光信号（λex = 313 nm），所得各组样品的的荧光发射光谱如图19所示。根据标准曲线，计算出不同光照时间下ONOO─释放行为。如图20所示，随着光照时间的延长，ONOO─的释放量不断增大。当样品的光照时间为120 s，ONOO─的释放量达到最大值为6.73 μM。当样品的光照时间为90 s，ONOO─的释放效率达到最大值0.0593 μM/s。
实施例15：考察不同光照时间下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的ONOO─释放行为。取 PBS（0.10 M，pH = 8.2），NaHCO3（0.015 M）和L-酪氨酸（5.0×10-4 M）的混合溶液4 mL，向其中分别加入PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子组装液100 μL。随后，将上述混合液，用808 nm激光（1 W）照射不同的时间，分别为0 s, 10 s, 20 s, 30 s, 40 s,50 s, 60 s。使用荧光分光光度计检测各组待测液的荧光信号（λex = 313 nm），所得各组样品的的荧光发射光谱如图21所示。根据标准曲线，计算出不同光照时间下ONOO─释放行为。如图22所示，随着光照时间的延长，ONOO─的释放量不断增大。当样品的光照时间为60 s，ONOO─的释放量达到最大值为3.63 μM。当样品的光照时间为60 s，ONOO─的释放效率达到最大值0.0605 μM/s。
实施例16：考察不同激光功率照射下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的ONOO─释放行为。取 PBS（0.10 M，pH = 8.2），NaHCO3（0.015 M）和L-酪氨酸（5.0×10-4 M）的混合溶液4 mL，向其中分别加入PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子组装液100μL。随后，分别用不同输出功率的（0 W, 0.5 W, 1W, 1.5 W, 2W）的808 nm激光照射上述各混合液30s。使用荧光分光光度计检测各组待测液的荧光信号（λex = 313 nm），所得各组样品的的荧光发射光谱如图23所示。根据标准曲线，计算出不同光照时间下ONOO─释放行为。如图24所示，随着输出功率的增强，ONOO─的释放量不断增大。当输出功率为2 W时，ONOO─的释放量达到最大值为2.94 μM。当输出功率为2 W时，ONOO─的释放效率达到最大值0.0981 μM/s。
实施例17：考察PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的可控ONOO─释放行为。取PBS（0.10 M，pH = 8.2），NaHCO3（0.015 M）和L-酪氨酸（5.0×10-4 M）的混合溶液4 mL，向其中加入PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子组装液100 μL。随后，用808 nm激光（1W）的照射上述混合液，照射20 s后，测样品的荧光信号（λex = 313 nm），随后避光保存20 s，再次测样品的荧光信号（λex = 313 nm），随后继续进行激光照射、避光保存，共循环测试4次，同时不断监测样品的荧光信号，所得荧光光谱如图25所示。根据标准曲线，计算出对应测试条件下的ONOO─可控释放行为。如图26所示，在808 nm激光的刺激下，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780NPs纳米粒子可以实现ONOO─的突释。然而，当关闭808 nm激光后，ONOO─的浓度几乎没有增加。这表明，PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子的ONOO─释放行为具有良好的可控释放行为。
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种可控制备过氧亚硝酸盐ONOO-的纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将5-10 g聚乙二醇单甲醚溶解于50-100 mL的无水二氯甲烷中，并加入202-400 mg的三乙胺,在冰浴条件下，向混合液中缓慢滴加460-900 mg的溴代异丁酰溴,在快速搅拌下，反应24-48小时,将反应液，用饱和食盐水水洗，二氯甲烷多次萃取，并用正己烷多次沉淀，抽滤，真空干燥，得PEG-Br样品；
（2）取PEG-Br样品2-8 g溶解于10-50 mL的N, N-二甲基甲酰胺DMF中，并加入丙烯酸叔丁酯2.5-10 g、五甲基二乙烯三胺PMDETA135-550 mg，以及在氮气保护下，加入溴化亚铜112-450 mg,在快速搅拌下，于65℃的油浴中加热24-48小时,过中性氧化铝柱子，除去反应液中的金属铜，随后，用超纯水透析24-48小时，并冻干得到PEG-b-PtBA样品;
（3）取PEG-b-PtBA样品2-6 g溶解于30-50 mL的二氯甲烷中，并加入三氟乙酸5-15 mL,随后，在快速搅拌下，反应24-48小时,旋转除去大部分溶剂，后用冰乙醚沉淀三次，得到PEG-b-PAA样品;
（4）取PEG-b-PAA样品0.5-2 g溶解于10-20 mL的DMF中，并取0.836-3.35 g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于5-15 mL的超纯水中，且将所得水溶液加入DMF的溶液中，向上述混合液中继续加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS 150-600 mg,常温搅拌2小时后，向反应液中继续加入0.335-1 g的半胱胺,室温下反应24-48小时后，向反应液中继续加入2-4 mL亚硝酸叔丁酯,继续反应2-12小时后，将反应液分别用冰甲醇和乙醚、冰乙醚沉淀2次，获得红色PEG-b-PAA-g-SNO样品;
（5）采用共组装的方法制备PEG-b-PAA-g-SNO@IR780纳米粒子:取20-200 mg PEG-b-PAA-g-SNO样品和2-20 mg的IR780光敏剂，于2-10 mL的四氢呋喃中溶解,将混合液在避光条件下，用冰水多次透析，得PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中聚乙二醇单甲醚的Mn = 5000。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（4）中冰甲醇和乙醚的v/v=1:4。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（5）中透析所用的透析袋的截留分子量为3500。
5.一种权利要求1所述的制备方法制备的可控制备ONOO-的纳米粒子在制备可控释放ONOO—材料上的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的可控释放为单一光响应超效可控释放。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的单一光响应为808 nm激光刺激。
8.一种可控制备过氧亚硝酸盐ONOO—的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1制备的所述的PEG-b-PAA-g-SNO@IR780 NPs纳米粒子在808 nm的激光，输出功率为1-2W的照射条件下，照射30-120秒，实现ONOO—的快速释放。
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