CN112505116A - 一种用于特异性检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器以及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于电化学发光适配体传感器特异性检测卡那霉素的方法，具体属于电化学发光检测领域。包括：(1)银纳米颗粒负载于高发光聚多巴胺纳米球的复合材料(HLPNs@Ag)以及黑磷量子点的制备；(2)电化学发光适配体传感器的制备；(3)利用HLPNs@Ag与黑磷量子点之间的静电吸附结合共同修饰到玻碳电极表面，提高电化学发光的灵敏度和稳定性，随后负载适配体即可获得电化学发光适配体传感器，该传感器可特异性识别卡那霉素，检测范围为1.0×10^‑12mol/L～1.0×10^‑7mol/L，最低检测限为1.7×10^‑13mol/L。本发明检测卡那霉素的灵敏度高、特异性强、操作简单。

Description

一种用于特异性检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器以 及制备方法和应用

技术领域

本发明属于电化学发光检测领域，涉及一种基于电化学发光适配体传感器特异性检测卡那霉素的方法。尤其涉及将适配体分子负载于掺杂黑磷量子点和银纳米颗粒的高发光聚多巴胺纳米球复合材料(HLPNs@Ag/BP)修饰的玻碳电极表面，即以COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE电极为传感元件，定量检测河水中卡那霉素的电化学发光分析方法。

背景技术

随着科学技术的快速发展和人们的物质需求日益增加，一系列的环境问题继而爆发。绝大数的抗生素是水溶性的，抗生素被摄入之后，大多数以代谢产物通过粪便和尿液排放到环境中。由于生活污水对抗生素的处理程度很低，所以抗生素的滥用对水体的污染成为国内外关注的热点。

卡那霉素是水环境中的一类典型的氨基糖苷类抗生素，其对人体和生物均存在一定的危害。由于卡那霉素(Kanamycin，KAN)对大肠杆菌等革兰氏阴性菌有很强的抑制和杀菌作用，并且其价格低廉、抗菌谱广，已广泛用于动物养殖中。目前，我国畜牧业、农业和水产业已将卡那霉素作为常用的兽药之一。然而，卡那霉素具有潜在的毒性，过度使用会对人类和动物机体产生严重的副作用，包括耳毒性、肾毒性和过敏性休克，会影响人们的健康。在动物源性食品中的过量残留会对人体产生严重的副作用，欧盟和日本等国家和地区规定牛奶中卡那霉素最大残留限量为150μg/L。所以建立一种快速、灵敏的卡那霉素残留检测方法具有重要意义。

目前，已有报道的检测卡那霉素的方法包括高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)及电化学法等。但大多数仪器分析方法在昂贵设备产生的成本方面都有局限性，仪器操作专业度高，前处理过程复杂耗时，难以推广到市场中进行现场检测。核酸适配体作为一种新型识别元件，合成简单快速、成本低、选择性好、性质稳定且易于修饰标记，是一种优良的抗体替代识别元件。例如在CN201711280663.3对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器及其制备方法和应用、CN201310489050.6一种检测卡那霉素残留的适配体传感器的制备方法等现有技术中虽然也涉及对卡那霉素的检测，但常用的检测方法多为荧光法、分子印迹法、DPV法。因此，开发一种简单快速、选择性好的电化学发光特异性检测卡那霉素的方法是必要且极其重要的。

电化学发光(ECL)也称为电致化学发光，是化学发光方法与电化学方法相结合的产物，因而它保留了化学发光方法所具有的灵敏度高、线性范围宽、观察方便和仪器简单等优点；同时具有许多化学发光方法无法比拟的优点,如重现性好、试剂稳定、控制容易等优点。并且，无需引入外部光源，在光电倍增管等光学仪器的辅助下采集发光强度图谱，并建立其与待测物关系从而实现微量分析的一种方法。

发明内容

本发明的目的在于针对卡那霉素检测现有技术的不足，电化学发光适配体传感器检测的方法。本发明是基于高发光聚多巴胺纳米球(HLPNs)和黑磷量子点(BPQDs)之间的静电吸附相结合，再将银纳米颗粒修饰在HLPNs上来增强电子传输速率，从而得到HLPNs@Ag/BP纳米复合材料，并将其修饰到玻碳电极表面，使得电化学发光的灵敏度和稳定性显著提高，再通过酰胺键作用负载适配体进而获得电化学发光适配体传感器(简称COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE传感器)，可特异性识别目标分子卡那霉素，提高了对卡那霉素的选择性。

一种电化学发光适配体传感器，该电化学发光适配体传感器是由含有5'-HOOC-AGA TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3'碱基序列的适配体负载于HLPNs@Ag/BP纳米复合材料修饰的玻碳电极表面而成。

进一步的，电化学发光适配体传感器由如下方法制得：

(1)银纳米颗粒(AgNPs)负载于高发光聚多巴胺纳米球(HLPNs)复合材料的制备：

将0.0378g多巴胺盐酸盐溶解在12mL磷酸缓冲溶液(pH 10)中，并加入8mLH₂O₂，在黑暗室温条件下反应6h，反应结束后，将所得溶液转移至渗析膜中，在超纯水中透析4h，最后将袋中溶液取出冻干，得到淡黄色固体，即在60℃下干燥，得到黄色粉末，即HLPNs。

将4mg HLPNs分散在10mL超纯水中，称取556mg柠檬酸钠溶解于40mL新制的AgNO₃(0.025M)中，将两者混合，置于氮气中室温下搅拌3h，通过离心、洗涤、干燥，得到红棕色固体，即HLPNs@Ag。

(2)黑磷量子点的制备：

将5mg黑磷块状固体分散到1mL NMP中，研磨20min，将混合物分散在含有4mL NMP的小玻璃瓶中。仔细密封后，将该小瓶在100W的功率下在冰浴中超声处理8h，随后将所得分散体在7000rpm下离心20min，取上清液，最后以12000rpm离心20min，最后获得BPQDs，并将其分散在水中置于冰箱中备用。

将上述所制备的HLPNs@Ag(5mg)和黑磷(500μg)加入1mL的水中，室温搅拌24h。通过离心、干燥，得到产物，即HLPNs@Ag/BP。并将50mg复合材料分散在10mL水中，得到浓度为5.0mg/mL的HLPNs@Ag/BP，备用。

(3)修饰电极COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE的制备：

将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，用10μL微量进样器移取6μLHLPNs@Ag/BP的溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，即得到HLPNs@Ag/BP修饰的玻碳电极。接着，将6μL 10μmol/L的识别分子COOH-apt滴加到HLPNs@Ag/BP/GCE的表面，适配体和HLPNs通过酰胺键结合，得到COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE。最后，将COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE修饰电极在4℃的冰箱中放置6h，即得到ECL适配体传感器。

(4)含过硫酸钾(K₂S₂O₈)的磷酸盐(PBS)缓冲溶液的配制：

用pH 7.4的0.1mol/L PBS缓冲溶液配制含0.1mol/L K₂S₂O₈的PBS缓冲溶液。

(5)不同浓度卡那霉素标准溶液的配制

准确称取一定量的卡那霉素，用水配制1.0×10^-4mol/L溶液，将一定量卡那霉素溶液加入含0.1mol/L K₂S₂O₈的0.1mol/L pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，得到一系列不同浓度的卡那霉素标准溶液，浓度范围为1.0×10^-12mol/L～1.0×10^-7mol/L。

(6)标准曲线的绘制

将修饰电极COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述含一系列不同浓度卡那霉素和0.1mol/L K₂S₂O₈的0.1mol/L pH＝7.4的PBS缓冲溶液溶液中浸泡20min，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(E-ECL)，建立加入卡那霉素前后的发光强度差值与卡那霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；

(7)样品检测

实际样品先经过前处理，按照与上述步骤(4)同样的电化学发光测试条件进行测试，记录发光强度，所得发光强度，用步骤(4)所得标准曲线所对应的线性回归方程计算出待测样品中卡那霉素的浓度。

本发明的显著优点是开发了一种检测卡那霉素的电化学发光传感器及其制备方法，与普通的电化学发光传感器相比，具有以下两方面的显著优点：高发光聚多巴胺纳米球第一次被用来作为载体，它不仅拥有普通聚多巴胺纳米球的高比表面积、强吸附能力，自身还具有电化学发光性能；黑磷量子点因其易被氧化所以应用受限，但本发明采用聚多巴胺纳米球上负载黑磷量子点，可以有效防止黑磷量子点被氧化。以黑磷纳米材料制备的优异电化学性能的修饰电极上孵育适配体后对卡那霉素的选择上具有协同作用，使得到的复合电极具有高度的敏感性，重复性和特异性识别卡那霉素的作用。本发明对推广适配体传感器在环境及食品安全等方面的实际应用具有重要的意义。

附图说明

图1是该发明中的传感器的制备以及对卡那霉素的检测的简要流程图。

图2是不同浓度卡那霉素的ECL-电位曲线图。

其中卡那霉素的浓度按曲线峰值高低从前到后依次为：1.0×10^-12mol/L、1.0×10^-11mol/L、1.0×10^-10mol/L、1.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L。图3是加入卡那霉素前后发光强度的差值和卡那霉素浓度对数的标准曲线。图4是HLPNs@Ag(A)、BPQDs(B)的透射电镜图。图4(A)中的TEM显示合成的HLPNs@Ag复合物平均直径大约为150～200nm，且Ag很好的负载于HLPNs上。图4(B)中的TEM显示所制备的BPQDs大小均一、分布均匀，直径在20nm左右。

图5为实施例1传感器对卡那霉素的特异性检测。

具体实施例

本发明下面结合实施例作进一步详述：

实施例1：

(1)银纳米颗粒(AgNPs)负载于高发光聚多巴胺纳米球(HLPNs)复合材料的制备：

将0.0378g多巴胺盐酸盐溶解在12mL磷酸缓冲溶液(pH 10)中，并加入8mLH₂O₂，在黑暗室温条件下反应6h，反应结束后，将所得溶液转移至渗析膜中，在超纯水中透析4h，最后将袋中溶液取出冻干，得到淡黄色固体，即在60℃下干燥，得到黄色粉末，即HLPNs。

将4mg HLPNs分散在10mL超纯水中，称取556mg柠檬酸钠溶解于40mL新制的AgNO₃(0.025M)中，将两者混合，置于氮气中室温下搅拌3h，通过离心、洗涤、干燥，得到红棕色固体，即HLPNs@Ag。

(2)黑磷量子点的制备：

将5mg黑磷块状固体分散到1mL NMP中，研磨20min，将混合物分散在含有4mL NMP的小玻璃瓶中。仔细密封后，将该小瓶在100W的功率下在冰浴中超声处理8h，随后将所得分散体在7000rpm下离心20min，取上清液，最后以12000rpm离心20min，最后获得BPQDs，并将其分散在水中置于冰箱中备用。

将上述所制备的HLPNs@Ag(5mg)和黑磷(500μg)加入1mL的水中，室温搅拌24h。通过离心、干燥，得到产物，即HLPNs@Ag/BP。并将50mg复合材料分散在10mL水中以备使用。

(3)修饰电极COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE的制备：

将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，用10μL微量进样器移取6μLHLPNs@Ag/BP的溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，即得到HLPNs@Ag/BP修饰的玻碳电极。接着，将6μL 10μmol/L的识别分子COOH-apt滴加到HLPNs@Ag/BP/GCE的表面，适配体和HLPNs通过酰胺键结合，得到COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE。最后，将COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE修饰电极在4℃的冰箱中放置6h，即得到ECL适配体传感器。

识别分子COOH-apt序列为：apt:5'-HOOC-AGA TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3'(厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司)

(4)标准曲线的绘制

将修饰电极COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于一系列卡那霉素浓度(1.0×10^{- 12}mol/L、1.0×10^-11mol/L、1.0×10^-10mol/L、1.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L和1.0×10^{- 7}mol/L)含有0.1mol/L的K₂S₂O₈的pH 7.4的0.1mol/L PBS的缓冲溶液中，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(E-ECL)，建立加入卡那霉素前后的发光强度差值与卡那霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程为：△I_ECL＝5538.80125+1746.81372LogC(mol/L)，相关系数(R)为0.9985。线性回归方程的检测范围为1.0×10^-12～1.0×10^-7mol/L，最低检测限为1.7×10^-13mol/L。

(5)样品的检测

取某河水水样，自然静置一段时间后，离心分离吸取上层溶液，通过0.22μm滤膜过滤收集滤液，加入含有0.1mol/LK₂S₂O₈的0.1mol/L的PBS缓冲溶液调pH至7.4，取25mL所得溶液用于电化学发光分析，按照步骤(3)同样的电化学发光测试条件进行测试，记录发光强度，按步骤(4)所得的线性回归方程计算出待检测样品中卡那霉素的浓度，其结果列于表1中。

本发明的显著优点是开发了一种检测卡那霉素的电化学发光传感器及其制备方法，与普通的电化学发光传感器相比，具有以下两方面的显著优点：在材料上，高发光聚多巴胺纳米球第一次被用来作为载体，它不仅拥有普通聚多巴胺纳米球的高比表面积、强吸附能力，自身还具有电化学发光性能，AgNPs具有提高电子传输速率的作用，BPQDs作为一种新型的半导体量子点，具有可控的带隙，丰富的表面活性位点以及优异的光电性能，将三种材料结合协同，从而实现进一步的信号放大，加入适配体，使得该传感器可以特异性检测卡那霉素。

并将实施例1制备的用于检测卡那霉素的电化学发光传感器进步抗干扰检测，其中将适配体孵育后的工作电极分别在10^-6M四环素(TE)、链霉素(SM)及金霉素(AM)干扰物，以及在10^-8M的卡那霉素(KAN)标准液中测试，并再将工作电极在上述物质的混合液中检测，检测结果见图5。

从图5可知，具有优异电化学性能的修饰电极上孵育适配体后对卡那霉素起到选择性识别效果，混合后100倍浓度的干扰物对卡那霉素的检测影响也很微小。因此该工作电极可以实现卡那霉素抗干扰的选择性检测。

比较例1：

(1)apt/HLPNs@Ag/BP/GCE修饰电极的制备

将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取6.0μL 5.0mg/mL HLPNs@Ag/BP材料的水溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到HLPNs@Ag/BP/GCE修饰电极；在HLPNs@Ag/BP/GCE修饰电极表面再滴涂6.0μL10μM适配体(同实施例1)，自然晾干10h，得到apt/HLPNs@Ag/BP/GCE传感器，作为电化学发光测试的工作电极。

(2)标准曲线的绘制

以apt/HLPNs@Ag/BP/GCE修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.1mol/L的K₂S₂O₈的pH＝7.4的0.1mol/L PBS缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列卡那霉素浓度(1.0×10^-12mol/L、1.0×10^-11mol/L、1.0×10^-10mol/L、1.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L和1.0×10^-7mol/L)含有0.1mol/L的K₂S₂O₈的pH 7.4的0.1mol/L PBS的缓冲溶液中，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录E-ECL曲线，建立加入卡那霉素前后的发光强度差值与卡那霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。

(3)样品的检测

取25mL经处理后的河水加入到含有0.1mol/L的K₂S₂O₈的pH 7.4的0.1mol/L PBS的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中卡那霉素的浓度，其结果列于表1中。

比较例2：

(1)COOH-apt/HLPNs@Ag/GCE修饰电极的制备

将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取6.0μL 5.0mg/mL HLPNs@Ag材料的水溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到HLPNs@Ag/GCE修饰电极；在HLPNs@Ag/GCE修饰电极表面再滴涂6.0μL 10μM适配体(同实施例1)，自然晾干10h，得到COOH-apt/HLPNs@Ag/GCE传感器，作为电化学发光测试的工作电极。

(2)标准曲线的绘制

以COOH-apt/HLPNs@Ag/GCE修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.1mol/L的K₂S₂O₈的pH＝7.4的0.1mol/LPBS缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列卡那霉素浓度(1.0×10^{- 12}mol/L、1.0×10^-11mol/L、1.0×10^-10mol/L、1.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L和1.0×10^{- 7}mol/L)含有0.1mol/L的K₂S₂O₈的pH 7.4的0.1mol/L PBS的缓冲溶液中，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录E-ECL曲线，建立加入卡那霉素前后的发光强度差值与卡那霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。

(3)样品的检测

取25mL经处理后的河水加入到含有0.1mol/L的K₂S₂O₈的pH 7.4的0.1mol/L PBS的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中卡那霉素的浓度，其结果列于表1中。

比较例3：

(1)COOH-apt/BPQDs/GCE修饰电极的制备

将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用微量进样器移取6.0μL BPQDs水溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到BPQDs/GCE修饰电极；在BPQDs/GCE修饰电极表面再滴涂6.0μL 10μM适配体(同实施例1)，自然晾干10h，得到COOH-apt/BPQDs/GCE传感器，作为电化学发光测试的工作电极。

(2)标准曲线的绘制

以COOH-apt/BPQDs/GCE修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.1mol/L的K₂S₂O₈的pH＝7.4的0.1mol/L PBS缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列卡那霉素浓度(1.0×10^-12mol/L、1.0×10^-11mol/L、1.0×10^-10mol/L、1.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L和1.0×10^-6mol/L)的标准液中浸泡20min，取出后淋洗，作为工作电极，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s,进行循环伏安扫描，记录E-ECL曲线，建立加入卡那霉素前后的发光强度差值与卡那霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。

(3)样品的检测

取25mL的处理后的河水加入到含有0.1mol/L的K₂S₂O₈的pH 7.4的0.1mol/L PBS的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中卡那霉素的浓度，其结果列于表1中。

表1河水中卡那霉素的测定结果

备注：a为三次测定的平均值

如表1所示，样品平行检测3次，相对标准偏差小于5％，加标回收率范围为95％～101％。以上结果表明，不用HLPNs@Ag/BP复合材料修饰而单独用HLPNs@Ag或是BPQDs修饰的玻碳电极后进一步组装传感元件难以检测出卡那霉素，本发明的复合电极材料用于检测河水中的卡那霉素是可行的。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种用于特异性检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器，其特征在于：所述的电化学发光适配体传感器由适配体负载于复合材料HLPNs@Ag/BPQDs修饰到玻碳电极表面，得到COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE，用于电化学发光检测卡那霉素。

2.根据权利要求1所述的用于特异性检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器，其特征在于：所述卡那霉素适配体核苷酸序列如下所示：

apt:5'-HOOC-AGA TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3'。

3.根据权利要求1所述用于特异性检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：所述COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE的制备方法如下：

将玻碳电极(GCE)抛光、清洗后滴加HLPNs@Ag/BP的水分散液于GCE表面，自然晾干，得到HLPNs@Ag/BP/GCE修饰电极，然后，再涂滴适配体得到COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE修饰电极，低温储存备用，得到ECL适配体传感器。

4.根据权利要求3所述用于特异性检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于：所述HLPNs@Ag/BP的制备方法为：

(1)HLPNs@Ag复合材料的制备：将HLPNs分散在超纯水中，依次加入柠檬酸钠和新制的AgNO₃，在氮气中室温搅拌，然后通过离心、干燥，制得红棕色固体，即HLPNs@Ag；

(2)通过液相剥离法制备得到黑磷量子点(BPQDs)；

(3)HLPNs@Ag/BP复合材料的制备：将HLPNs@Ag和黑磷量子点溶解在水中，室温搅拌，通过离心、干燥，得到产物，即HLPNs@Ag/BP。

5.根据权利要求1所述的基于电化学发光适配体传感器特异性检测卡那霉素的方法，其特征在于，电化学发光检测方法具体步骤如下：

(1)含过硫酸钾(K₂S₂O₈)的磷酸盐(PBS)缓冲溶液的配制；

(2)含不同浓度卡那霉素和0.1mol/L K₂S₂O₈的PBS缓冲溶液的配制；

准确称取一定量的卡那霉素，用去离子水配制1.0×10^-4mol/L溶液，将一定量卡那霉素溶液加入含0.1mol/L K₂S₂O₈的0.1mol/L pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，得到一系列不同浓度的卡那霉素标准溶液，浓度范围为1.0×10^-12mol/L～1.0×10^-7mol/L；

(3)标准曲线的绘制

将修饰电极COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述含一系列不同浓度卡那霉素和0.1mol/L K₂S₂O₈的PBS缓冲溶液溶液中浸泡一定时间，并以含有0.1mol/L的K₂S₂O₈的pH＝7.4的0.1mol/L PBS缓冲液作为空白溶液检测发光强度；在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(E-ECL)，建立加入卡那霉素前后的发光强度差值与卡那霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；

(4)实际样品检测

实际样品检测先作前处理再调节pH，按照上述步骤(3)中的线性回归方程进行计算。

6.根据权利要求5所述的基于电化学发光适配体传感器特异性检测卡那霉素的方法，其特征在于：步骤(1)所述的PBS缓冲溶液含0.1mol/L K₂S₂O₈，PBS缓冲溶液的pH为7.4，其浓度为0.1mol/L，修饰电极COOH-apt/HLPNs@Ag/BP/GCE浸泡时间为20min。

7.根据权利要求5所述的基于电化学发光适配体传感器特异性检测卡那霉素的方法，其特征在于：最低检测限为1.7×10^-13mol/L。

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