CN104198598B - 一种维生素b12的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种维生素B12的测定方法，样品前处理采用冷冻干燥粉碎，然后再通过维生素B12富集的方法，使维生素B12在低含量的软糖中可检出，而且检出结果准确，检测手段为高效液相色谱与质谱联用。与现有技术相比，本发明的维生素B12的测定方法，可以解决维生素B12在软糖中难富集和准确测定含量的问题，同时可以简化维生素B12利用生物法的间接含量测定方法，简化维生素B12低添加量下的糖果产品含量测定和质量控制方法。
Description
技术领域
本发明涉及维生素测定领域，确切地说是一种维生素B12的测定方法。
背景技术
维生素B12又称钴胺素或氰钴素，是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素，是唯一含金属元素的维生素。自然界中的维生素B12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B12。维生素B12是需要一种肠道分泌物(内源因子)帮助才能被吸收的惟一的一种维生素。有的人由于肠胃异常，缺乏这种内源因子，即使膳食中来源充足也会患恶性贫血。而植物性食物中基本上没有维生素B12。
按照GB/T17819-1999，低含量的维生素B12在植物胶软糖等营养果糖中很难检出。其他的常规检测如微生物法、发酵法，由于维生素B12性质不稳定，易分解，上述常规方法为测定钴元素，并不能确定完整的维生素B12分子式。
发明内容
针对上述缺陷，本发明解决的技术问题在于提供一种对低含量维生素B12的测定方法，可以解决维生素B12在软糖中难富集和准确测定含量的问题，同时可以简化维生素B12利用生物法的间接含量测定方法，简化维生素B12低添加量下的糖果产品含量测定和质量控制方法。
为了解决以上的技术问题，本发明的一种维生素B12的测定方法，包括如下步骤：
1)、取冷冻至硬的含有维生素B12的样品，粉碎；
2)、取粉碎后的样品加热溶解提取，提取液待用；
3)、取固相萃取柱，加醇类活化，再用水进行平衡，取步骤2的提取液加到固相萃取柱上，上样后，用水进行淋洗，完毕后负压抽干，再加入醇类洗脱，洗脱液收集到比色管内，水浴氮吹干，然后加入水漩涡溶解，过滤膜过滤后待上机测定；
4)、进行液相色谱分析，液相色谱的条件如下：
色谱柱：菲罗门KinetexHILIC，100mm×4.6mmID2.6um；
流动相：乙腈+10mM铵盐溶液+酸溶液；
流速：0.4-0.8mL/min；
进样量：2-4uL；
柱温：25-40℃；
5)、进行质谱分析，质谱条件为：
离子源：ESI；
扫描方式：ESI+；
检测方式：MRM；
裂解电压：100-200V；
雾化器压力：45psi；
加热辅助气流速：8-15L/min；
辅助气温度：200-400℃；
定性、定量离子对，碰撞气能量和去簇电压见下表：
6)、吸取1-5ul标准溶液和试样溶液注入高效液相串联质谱仪中，以保留时间和质荷比定性，峰面积定量，用标准曲线法进行测定；
7)、维生素B12含量(ug/100g)
其中：
C1——由标准曲线求得试样溶液中维生素B12的浓度，单位ng/mL；
C0——空白试剂维生素B12的浓度，单位ng/mL；
V1——样品定量体积，单位mL；
V2——试样溶液上样体积，单位mL；
m——样品取样量，单位g。
优选地，步骤2中，取粉碎后样品4.000-6.000g放入100mL烧杯中，加入约25mL纯水，置于50℃-80℃水浴加热溶解，样液转移至50mL容量瓶，再分别两次用10mL润洗烧杯，洗液合并至容量瓶，纯水定容至刻度，样液待用。
优选地，步骤2中，取粉碎后样品5.000g放入100mL烧杯中，加入约25mL纯水，置于70℃水浴加热溶解，样液转移至50mL容量瓶，再分别两次用10mL润洗烧杯，洗液合并至容量瓶，纯水定容至刻度，样液待用。
优选地，步骤3中，取固相萃取柱，先加2-10mL醇类进行活化，再用2-10倍水进行平衡，速度为1-3滴/s，取步骤2中提取液4.00-6.00mL加到固相萃取柱上，上样后，用4-6mL水进行淋洗，完毕后负压抽干，加入4-10mL醇类洗脱，洗脱液收集至10mL比色管，30-70℃水浴氮吹干，然后再加入0.50-2.00mL水漩涡溶解，过滤膜后待上机测定。
优选地，步骤3中，取固相萃取柱，先加2-10mL醇类进行活化，再用3倍水进行平衡，速度为1滴/s，取步骤2中提取液5.00mL加到固相萃取柱上，上样后，用5mL水进行淋洗，完毕后负压抽干，加入4-10mL醇类洗脱，洗脱液收集至10mL比色管，50℃水浴氮吹干，然后再加入1.00mL水漩涡溶解，过滤膜后待上机测定。
优选地，步骤3中，加醇类进行活化，所述醇类为甲醇，甲醇的量为2.00mL～10.00mL；加入醇类洗脱，所述醇类为甲醇，甲醇的量为5.00～10.00mL。
优选地，步骤3中，固相萃取柱为APELHLB、PhenomenexSTRATA–X或WatersOasisHLB固相萃取柱。
优选地，步骤4中，进行液相色谱分析，液相色谱的条件如下：
色谱柱：菲罗门KinetexHILIC，100mm×4.6mmID2.6um；
流动相：乙腈+10mM乙酸铵溶液+乙酸，其中，乙腈体积为50mL，10mM乙酸铵溶液体积为49.8mL，乙酸体积为0.2mL；
流速：0.5mL/min；
进样量：3uL；
柱温：30℃。
优选地，步骤5中，进行质谱分析，质谱条件为：
离子源：ESI；
扫描方式：ESI+；
检测方式：MRM；
裂解电压：170V；
雾化器压力：45psi；
加热辅助气流速：10L/min；
辅助气温度：300℃。
优选地，技术参数的准确度要求在添加水平在400～600ng的水平下，回收率范围为60％～120％。
本发明提供的一种维生素B12的测定方法，样品前处理采用冷冻干燥粉碎，然后再通过维生素B12富集的方法，使维生素B12在低含量的软糖中可检出，而且检出结果准确，检测手段为高效液相色谱与质谱联用。与现有技术相比，本发明的一种维生素B12的测定方法，可以解决维生素B12在软糖中难提取出的问题，同时也可以防止维生素B12利用生物法只测量钴，维生素B12发生降解而不清楚。
附图说明
图1为维生素B12的标准曲线；
图2为试剂空白色谱图；
图3为阴性样品色谱图；
图4为阳性样品色谱图；
图5为标准溶液色谱图(50.0ng/mL)；
图6为3.00ng/mL标准溶液色谱图；
图7为10.0ng/mL标准溶液色谱图；
图8为PhenomenexKinetexHILIC,100mm×4.6mm图谱；
图9为AgilentXDB-C18,4.6×100mm图谱。
具体实施方式
为了本领域的技术人员能够更好地理解本发明所提供的技术方案，下面结合具体实施例进行阐述。
本案将可由以下的实施例说明而得到充分了解，使得熟习本技艺之人士可以据以完成之，然本案之实施例并非可由下列而被限制其实施型态。
在本实施例中:
样品类型
营养糖果
试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水均为实验室一级用水。
1.乙腈：色谱纯；
2.乙酸铵：优级纯；
3.甲醇：分析纯；
4.维生素B12标准品：纯度≥98％；
仪器和设备
1.液相色谱串联质谱仪(LC-MS/MS)；
2.色谱柱；
3.水浴箱；
4.氮吹仪；
5.烧杯：50mL；
6.固相萃取柱；
7.电子天平：感量1mg；
8.容量瓶：50mL；
9.滤膜：0.2um，水相；
原理
样品用水溶解提取后，用固相萃取法对试样提取液中的维生素B12进行富集并除去部分杂质，高效液相质谱联用仪(LC-MS/MS)测定，外标法定量
试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水均为实验室一级用水。
乙腈：色谱纯；
乙酸铵：优级纯；
甲醇：分析纯；
维生素B12标准品：纯度≥98％。
维生素B12标准储备液：称取维生素B12标准品10mg(精确至0.1mg),用5％乙醇溶解，并定容至10mL棕色容量瓶中，混匀，冷藏保存。
维生素B12标准中间液：吸取0.1mL储备液至50mL棕色容量瓶中，用水稀释定容至刻度，冷藏保存。
维生素B12标准系列：分别取0.05mL、0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.50mL的标准中间液于10mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度。
仪器和设备
液相色谱串联质谱仪(LC-MS/MS)；
色谱柱：HILIC，100mm×4.6mm；
水浴箱；
氮吹仪；
烧杯：50mL；
固相萃取柱：HLB，30mg/3mL；
电子天平：感量1mg；
容量瓶：50mL；
滤膜：0.2um，水相。
本发明的一种维生素B12的测定方法，包括如下步骤：
1)、取冷冻至硬的含有维生素B12的样品，粉碎；
2)、取粉碎后样品5.000g放入100mL烧杯中，加入约25mL纯水，置于70℃水浴加热溶解，样液转移至50mL容量瓶，再分别两次用10mL润洗烧杯，洗液合并至容量瓶，纯水定容至刻度，样液待用；
3)、取固相萃取柱，先加3mL甲醇进行活化，再用3倍水进行平衡，速度为1滴/s，取步骤2中提取液5.00mL加到固相萃取柱上，上样后，用5mL水进行淋洗，完毕后负压抽干，加入5mL甲醇洗脱，洗脱液收集至10mL比色管，50℃水浴氮吹干，然后再加入1.00mL水漩涡溶解，过滤膜后待上机测定；
4)、进行液相色谱分析，液相色谱的条件如下：
色谱柱：菲罗门KinetexHILIC，100mm×4.6mmID2.6um；
流动相：乙腈+10mM乙酸铵溶液+乙酸，其中，乙腈体积为50mL，10mM乙酸铵溶液体积为49.8mL，乙酸体积为0.2mL；
流速：0.5mL/min；
进样量：3uL；
柱温：30℃；
5)、进行质谱分析，质谱条件为：
离子源：ESI；
扫描方式：ESI+；
检测方式：MRM；
裂解电压：170V；
雾化器压力：45psi；
加热辅助气流速：10L/min；
辅助气温度：300℃；
定性、定量离子对，碰撞气能量和去簇电压见下表：
6)、吸取3ul标准溶液和试样溶液注入高效液相串联质谱仪中，以保留时间和质荷比定性，峰面积定量，用标准曲线法进行测定；
7)、维生素B12含量(ug/100g)
其中：
C1——由标准曲线求得试样溶液中维生素B12的浓度，单位ng/mL；
C0——空白试剂维生素B12的浓度，单位ng/mL；
V1——样品定量体积，单位mL；
V2——试样溶液上样体积，单位mL；
m——样品取样量，单位g。
优选地，在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％。
优选地，技术参数的准确度要求在添加水平在400～600ng的水平下，回收率范围为60％～120％。
《营养糖果中维生素B12含量的测定》方法验证报告
一、检出限
根据仪分别配置浓度为3.00ng/mL、10.0ng/mL的维生素B12标准溶液，上仪器进行测定，各浓度点重复测定6次，计算信噪比，结果如下表1
数据分析：
3.00ng/mL浓度6次重复测定，信噪比(S/N)均值4.49＞3，满足仪器检出限要求，10.0ng/mL浓度6次重复测定，信噪比(S/N)均值14.3＞10，满足仪器定量限要求。
二、线性范围
根据仪器的检出限和定量限，以及样品中维生素B12的含量，制定标准曲线范围。标准曲线范围：10.0μg/mL～300.0μg/mL。标准曲线浓度点分别为：0、10.0、20.0、50.0、100.0、300.0ng/mL。按照验证方法的仪器条件进样测定。标准曲线如图1所示。
由图1表明，标准曲线在10.0μg/mL～300.0μg/mL浓度范围线性良好，R＝0.9999，满足方法要求。
(1)专属性实验
选取空白试剂、阴性样品、阳性样品和标准溶液，做专属性试验，结果如图2～5所示：
数据分析：
由以上图2～5谱图说明，阳性样品和标准品有相同的定性离子对(z/m678.8/359.1)和定量离子对(z/m678.8/146.9)，且保留时间一致，空白试剂和阴性样品不存在干扰，本方法专属性符合要求。
(2)检测限与定量限
1.仪器检出限与方法检出限
如图6所示，将浓度为3.00ng/mL的样品溶液，以3ul注入液相色谱仪，重复6次，平均信噪比(S/N)为4.49大于3，得仪器检出限量为1ng。以方法取样5.0g，定容50mL计，取5.00mL过固相萃取柱，定容1.00mL带入公式计算，得出方法检出限为0.6ug/100g。
2.仪器定量限与方法定量限
如图7所示，将浓度为10.0ng/mL的样品溶液，以3ul注入液相色谱仪，重复6次，平均信噪比(S/N)为14.3大于10，得仪器检出限量为3ng。以方法取样5.0g，定容50mL计，取5.00mL过固相萃取柱，定容1.00mL带入公式计算，得出方法检出限为2ug/100g。
(3)精密度
1.称样量的范
根据标准溶液线性范围，以及样品中维生素B12的含量，分别称样2.5、5.0、7.5g(精确至1mg，下同)按方法进行处理，上机测定，检测结果如下表。
表2营养糖果中维生素B12含量测定称样量的范围
如图表可以看出，所有取样量所测结果相近，相对标准偏差RSD＝5.8％，但考虑到曲线最低点10.0ng/mL，当取样量为2.5g时，检出浓度仅为最低点的两倍，可能存在定量误差较大，当取样量为7.5g时，样品溶解时间较长，而且样品杂质多，粘度大，过柱困难且杂质残留多，可能影响上机测定，因此本实验按5.0g取样量进行。
2.重复性试验
由同一操作人员，同一时间，相同仪器进行9次平行测试，数据如下表2：
表3.营养糖果中维生素B12含量测定重复性试验结果
以上数据表明，营养糖果中维生素B12含量测定结果均值为8.82ug/100g，RSD＝5.4％，小于15％，符合方法要求。
3.中间精密度试验
由不同操作人员，不同时间，不同仪器分别进行试验，数据如下表3：
表4.营养糖果中维生素B12含量测定中间精密度结果
以上数据表明，中间精密度试验，营养糖果中维生素B12含量测定精密度小于15％，均符合方法要求。
(4)准确度
对样品分别进行低(0.8倍)、中(1.0倍)、高(1.2倍)三个浓度水平加标，各水平浓度做3次平行，依据重复性实验结果样品平均值含量8.82ug/100g与实际取样量计算出本底值，依据本底值、测定量和加标量计算其回收率。数据如下表5
表5.营养糖果中维生素B12含量测定加标回收结果
以上数据表明，低、中、高三个浓度水平加标，回收率范围为：88.0％～104％，满足方法75％～110％回收率要求。
(5)耐用性
1.色谱柱的影响
按照验证方法中的仪器条件，对样品中维生素B12进行稳定性试验。样品经前处理后，经两种不同的色谱柱进样分析，两种色谱柱分别为：②AgilentXDB-C18,4.6×100mm；③PhenomenexKinetexHILIC,100mm×4.6mm。比较不同色谱柱进样的测定结果，计算RSD。实验结果如下：
表6.不同色谱柱对营养糖果中维生素B12含量的测定结果
色谱图请参见图8和图9.
以上数据及色谱图表明，两种不同色谱柱对同一样液进行测定，测定结果的R长，避免死体积时间出峰，同时与杂峰分离效果较好，故选择色谱柱PhenomenexKinetexHILIC,100mm×4.6mm为本方法验证的色谱柱。
2.样品溶解温度的影响
按照样品前处理，对样品进行常温溶解及70℃水浴溶解两种方式的结果对比。
表7.样品溶解温度影响实验结果
数据分析：
以上述实验数据结果的精密度小于15％，说明样品溶解温度室温(25℃)、超声(40℃)和水浴(75℃)对检测结果无影响，维生素B12在75℃温度下稳定，为使样品溶解更快更完全，本实验采用水浴(75℃)溶解提取条件。
3.样液的放置时间影响
按照验证方法中的仪器条件，对样品中维生素B12进行放置时间的稳定性试验。时间点分别为0h、2h、4h、8h、12h、24h，检测结果如下表。
表8.样液不同放置时间实验结果
数据分析：
处理完后样液放置时间24h内无影响，满足处理批量样品要求。
4.不同上样量的结果影响
按照验证方法中的净化富集步骤，分别量取2.50mL、5.00mL、7.50mL样液过固相萃取小柱，用5mL甲醇洗脱，比较不同上样量对样品中维生素B12测定结果的影响。
表9.样液上样量的实验结果
数据分析：
不同上样体积，2.50mL、5.00mL、7.50mL样液过固相萃取小柱，用5mL甲醇洗脱，对样品中维生素B12测定结果无影响，但考虑到曲线最低点10.0ng/mL，当取样量为2.50mL时，检出浓度仅为最低点的两倍，可能存在定量误差较大，当取样量为7.5mL时，过柱时间长，且杂质残留多，可能影响上机测定及回收率。因此本实验按5.0mL上样量进行。
5.不同甲醇洗脱量的结果影响
按照验证方法中的净化富集步骤，上样5.00mL，分别用5.00mL、7.50mL、10.00mL甲醇溶液进行洗脱，比较不同甲醇量对样品中维生素B12测定结果的影响。
表10.样液上样量的实验结果
数据分析：
按照验证方法中的净化富集步骤，上样5.00mL，分别用5.00mL、7.50mL、10.00mL甲醇溶液进行洗脱，3种不同甲醇量洗脱对样品中维生素B12测定结果无影响，说明5.00mL甲醇洗脱已完全，本实验采用5.00mL作为洗脱量。
6.不同固相萃取小柱净化富集对结果的影响
按照验证方法中的净化富集步骤，上样5.00mL，分别采用APELHLB、PhenomenexSTRATA-X、WatersOasisHLB三种固相萃取小柱进行净化富集，比较不同柱对样品中维生素B12测定结果的影响。
表11.固相萃取小柱的实验结果影响
数据分析：
按照验证方法中的净化富集步骤，上样5.00mL，分别用APELHLB、PhenomenexSTRATA-X、WatersOasisHLB三种固相萃取小柱进行净化富集对样品中维生素B12测定结果无影响，考虑到耗材成本，本实验采用APELHLB作为方法的固相萃取小柱。
根据《营养糖果中维生素B12含量测定》方法对送检的5个样品进行测定，实验结果如下所示：
表12.营养糖果中维生素B12含量测定结果
根据上表所示，《营养糖果中维生素B12含量测定》方法测定样品中的维生素B12含量，相对相差在3.35％-9.83％，小于15％，符合本发明方法要求。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (9)
1.一种维生素B12的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、取冷冻至硬的含有维生素B12的软糖或营养糖果，粉碎；
2)、取粉碎后的样品加热溶解提取，提取液待用；
3)、取固相萃取柱，加醇类活化，再用水进行平衡，取步骤2的提取液加到固相萃取柱上，上样后，用水进行淋洗，完毕后负压抽干，再加入醇类洗脱，洗脱液收集到比色管内，水浴氮吹干，然后加入1mL水漩涡溶解，过滤膜过滤后待上机测定；
4)、进行液相色谱分析，液相色谱的条件如下：
色谱柱：菲罗门KinetexHILIC，100mm×4.6mmID2.6um；
流动相：乙腈+10mM乙酸铵溶液+乙酸，其中，乙腈体积为50mL，10mM乙酸铵溶液体积为49.8mL，乙酸体积为0.2mL；
流速：0.4-0.8mL/min；
进样量：2-4uL；
柱温：25-40℃；
5)、进行质谱分析，质谱条件为：
离子源：ESI；
扫描方式：ESI+；
检测方式：MRM；
裂解电压：100-200V；
雾化器压力：45psi；
加热辅助气流速：8-15L/min；
辅助气温度：200-400℃；
定性、定量离子对，碰撞气能量和去簇电压见下表：
6)、吸取2-4ul标准溶液和试样溶液注入高效液相串联质谱仪中，以保留时间和质荷比定性，峰面积定量，用标准曲线法进行测定；
7)、维生素B12含量
其中：
C1——由标准曲线求得试样溶液中维生素B12的浓度，单位ng/mL；
C0——空白试剂维生素B12的浓度，单位ng/mL；
V1——样品定量体积，单位mL；
V2——试样溶液上样体积，单位mL；
m——样品取样量，单位g。
2.根据权利要求1所述的一种维生素B12的测定方法，其特征在于，步骤2中，取粉碎后样品4.000-6.000g放入100mL烧杯中，加入约25mL纯水，置于50℃-80℃水浴加热溶解，样液转移至50mL容量瓶，再分别两次用10mL润洗烧杯，洗液合并至容量瓶，纯水定容至刻度，样液待用。
3.根据权利要求2所述的一种维生素B12的测定方法，其特征在于，步骤2中，取粉碎后样品5.000g放入100mL烧杯中，加入约25mL纯水，置于70℃水浴加热溶解，样液转移至50mL容量瓶，再分别两次用10mL润洗烧杯，洗液合并至容量瓶，纯水定容至刻度，样液待用。
4.根据权利要求1所述的一种维生素B12的测定方法，其特征在于，步骤3中，取固相萃取柱，先加2-10mL醇类进行活化，再用3倍水进行平衡，速度为1滴/s，取步骤2中提取液5.00mL加到固相萃取柱上，上样后，用5mL水进行淋洗，完毕后负压抽干，加入4-10mL醇类洗脱，洗脱液收集至10mL比色管，50℃水浴氮吹干，然后再加入1.00mL水漩涡溶解，过滤膜后待上机测定。
5.根据权利要求4所述的一种维生素B12的测定方法，其特征在于，步骤3中，加醇类进行活化，所述醇类为甲醇，甲醇的量为2.00～10.00mL；加入醇类洗脱，所述醇类为甲醇，甲醇的量为5.00～10.00mL。
6.根据权利要求1所述的一种维生素B12的测定方法，其特征在于，步骤3中，固相萃取柱为APELHLB、PhenomenexSTRATA–X或WatersOasisHLB固相萃取柱。
7.根据权利要求1所述的一种维生素B12的测定方法，其特征在于，步骤4中，进行液相色谱分析，液相色谱的条件如下：
色谱柱：菲罗门KinetexHILIC，100mm×4.6mmID2.6um；
流动相：乙腈+10mM乙酸铵溶液+乙酸，其中，乙腈体积为50mL，10mM乙酸铵溶液体积为49.8mL，乙酸体积为0.2mL；
流速：0.5mL/min；
进样量：3uL；
柱温：30℃。
8.根据权利要求1所述的一种维生素B12的测定方法，其特征在于，步骤5中，进行质谱分析，质谱条件为：
离子源：ESI；
扫描方式：ESI+；
检测方式：MRM；
裂解电压：170V；
雾化器压力：45psi；
加热辅助气流速：10L/min；
辅助气温度：300℃。
9.根据权利要求1所述的一种维生素B12的测定方法，其特征在于，技术参数的准确度要求在添加水平在400～600ng的水平下，回收率范围为60％～120％。
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