CN102226795A

CN102226795A - 高效液相色谱法测定复合维b+双氯芬酸钠片中维生素b12含量的方法

Info

Publication number: CN102226795A
Application number: CN2011100823700A
Authority: CN
Inventors: 艾建高; 孙伟东
Original assignee: NINGBO SHUANGWEI PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: NINGBO SHUANGWEI PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2011-03-31
Publication date: 2011-10-26

Abstract

本发明涉及一种高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂含量的方法，包括(1)在避光条件下制备对照品溶液：(2)在避光条件下将复合维B+双氯芬酸钠片样品除去包衣，研细后加入流动相并用超声波溶解，摇匀后离心沉淀，取上清液，称定重量，加热煮沸后放冷，再滴加流动相至煮沸前的重量，摇匀，过滤，制得供试品溶液：(3)色谱条件：色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以甲醇和0.05mol/l磷酸二氢钾溶液体积比为22∶78作为流动相，磷酸二氢钾溶液的pH值为6.4；柱温为35℃；检测波长为361nm；流速为1.0ml/min；进样量为20μl。本发明测定结果准确、可靠，方法简便、科学，符合中国药典求，检测结果良好。

Description

高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B12含量的方法

技术领域

本发明涉及药物含量测定领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂含量的方法。

背景技术

复合维B+双氯芬酸钠片产品为外贸出口品种，主要市场在非洲大陆尼日利亚等国家，在当地是一国际名牌产品，每年销量5000万片以上，价格上有强劲优势。但由于该产品在国内外均没有现成的法定检验标准，按照外国公司提供的内部标准检验只能检出维生素B₁与维生素B₆及双氯芬酸钠的含量，维生素B₁₂的含量没有方法检测和做鉴别的要求。

由于没有方法检验出复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂的含量，本申请人曾发生过出口产品被尼日利亚国家海关扣封的事件。于是，本申请人痛定思痛，决定对该产品检验技术进行技术攻关，填补该标准上维生素B₁₂检验的空白。

本处方制剂最主要的难点是维生素B₁₂在处方中用量极少(50μg/510mg)，理论上仅有可能做色谱鉴别或者理化辨别。维生素B₁₂及其制剂在CP2005、BP2009、USP31中均收载有检验方法，但均是以单方和规格量较大形式建立的法定标准，且最小单元重量合理，便于检验上样品纯化处理，检验方法相对成熟。上述标准中的方法经过试验结果不好，一是量小检不出，如果加大称样量，样品溶液非常难纯化处理，不符合微量分析思维逻辑；二是虽然客服了操作方法纯化处理好样品溶液，但维生素B₁与维生素B₆及双氯芬酸钠有干扰峰出现，无法给维生素B₁定位和计算含量。试验成功希望渺小。花高价请上级部门药检所和国外药检实验机构做维生素B₁₂鉴别或含量，均检测不出维生素B₁₂。

发明内容

本发明的目的在于，提出一种高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂含量的方法，以准确可靠地测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂的含量。

为了实现上述目的，本发明提出的高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂含量的方法包括：

(1)在避光条件下往维生素B₁₂对照品中加流动相溶解制备对照品溶液：

(2)在避光条件下将复合维B+双氯芬酸钠片样品除去包衣，研细后加入流动相并用超声波溶解，摇匀后离心沉淀，取上清液，称定重量，加热煮沸后放冷，再滴加流动相至煮沸前的重量，摇匀，过滤，制得供试品溶液：

(3)色谱条件：

色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶柱；

以甲醇和0.05moL/L磷酸二氢钾溶液体积比为22∶78作为流动相，磷酸二氢钾溶液的PH值为6.4；

柱温为35℃；

检测波长为361nm；

流速为1.0mL/min；

进样量为20μL。

本发明方法对复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂含量的测定结果准确、可靠，方法简便、科学，试验时间短，无干扰峰，分离度、拖尾因子、不对称度均符合中国药典求，检测结果良好。

具体实施方式

1.仪器与试药

采用LC-10ATvp日本岛津高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外检测器，美国制造P/N(7725i)手动进样器，浙江大学N-2000数据工作站，柱温箱，电子天平为十万分之一分析天平，DD80型超声脱气机，800型离心机。维生素B₁₂对照品从中国药物生物制品检定所购买(批号：100248-200802，供HPLC法含量测定，含量95.5％)，复合维B+双氯芬酸钠片样品自产(批号为091011)，甲醇为一级色谱纯(产地：天津四友精细化学品有限公司出品)，水为双蒸馏水(自制)，其他试剂为分析级试剂。

2.色谱条件

色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶柱，尺寸为4.60mm×250mm，填料为Hypersi1 ODS2，填料的粒径为5μm。以甲醇和0.05moL/L磷酸二氢钾溶液体积比为22∶78作为流动相，用10％磷酸溶液或者2moL/L氢氧化钾溶液把磷酸二氢钾溶液的PH调为6.4，流动相使用前先用超声脱气机超声脱气处理30分钟，以去除流动相中的气泡，柱温为35℃，紫外检测器的检测波长为361nm，流速为1.0mL/min，进样量为20μL。

对于流动相的选择，进行了几次摸索试验，先以甲醇和0.028mol/L磷酸氢二钠溶液的体积比为26∶74作为流动相，用磷酸把磷酸氢二钠溶液的PH值调为3.5，维生素B₁₂的出峰时间提前在10分钟左右，而且不能和同类水溶性维生素B₁与B₆有效分离开，结果不是很理想。后选择以甲醇和0.05mol/L磷酸氢二钾溶液的体积比为35∶65作为流动相，用10％磷酸溶液或2mol/L氢氧化钾溶液把磷酸氢二钾溶液的PH值调为6.4，维生素B₁₂的出峰时间仍在前面，有类似干扰。最后再把流动相中甲醇和0.05mol/L磷酸氢二钾溶液的体积比调为22∶78，用10％磷酸溶液或2mol/L氢氧化钾溶液把磷酸氢二钾溶液的PH值调为6.4，能够有效分开干扰峰，试验结果满意。

对于紫外检测器的检测波长选择，用线性项下3mL置20mL量瓶中的溶液用紫外分光光度计在200-400nm波长段扫描，发现在361nm波长处均有最大的吸收值，故选择该波长为检测波长。

3.样品含量测定

对照品溶液的制备：精密称取维生素B₁₂对照品2.5mg置100mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为25μg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的制备：取复合维B+双氯芬酸钠片样品20片除去包衣，研细，精密称取细粉5.0849g置50mL量瓶中，精密加20mL流动相用超声波溶解，摇匀后用离心机离心沉淀，取上清液置50mL干燥烧杯中，称定重量，加热煮沸后放冷，再滴加流动相至煮沸前的重量，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

对照品溶液和供试品溶液均在避光条件下制备。

在上述色谱条件下，取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，再经分析计算得出维生素B₁₂的含量，结果测得复合维B+双氯芬酸钠片样品中的维生素B₁₂含量95.49％。

本方法测定复合维B+双氯芬酸钠片样品中的维生素B₁₂含量方法简单且科学，含量测定准确可靠。

4.专属性试验

供试品溶液的制备：取复合维B+双氯芬酸钠片样品20片除去包衣，研细，精密称取细粉5.000g(相当于B₁₂0.5mg)置50mL量瓶中，精密加20mL流动相用超声波溶解，摇匀后用离心机离心沉淀，取上清液置50mL干燥烧杯中，称重，加热煮沸后放冷，再滴加流动相至煮沸前的重量，摇匀，过滤，即得浓度为25μg/mL的供试品溶液。

对照品溶液和供试品溶液均在避光条件下制备。

按复合维B+双氯芬酸钠片处方制得不含维生素B₁₂的阴性样品颗粒，按上述供试品溶液的制备方法制成空白样品溶液，按上述色谱条件，精密吸取对照品溶液、供试品溶液及空白样品溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果表明空白样品溶液不干扰供试品的含量测定。

5.线性考察

储备溶液的制备：精密称取维生素B₁₂对照品7.5mg置100mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得到储备溶液。避光操作制备储备溶液。

分别精密吸取储备溶液0.5mL、1.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL、9.0mL置20mL量瓶中，加流动相至刻度摇匀，得到各浓度溶液。分别精密吸取20μL，注入高效液相色谱仪，测定。每一浓度溶液分别各进样二次，求峰面积平均值，再以系列峰面积进行线性考察。以维生素B₁₂的浓度C(mg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，结果表明维生素B₁₂进样量在1.875～33.75μg范围内呈现良线性关系，回归方程为Y＝202404X-99700，相关系数r＝0.9994。

6.检测限及最低检测浓度

精密吸取线性关系试验项下0.5mL置20mL量瓶中的溶液1mL，置10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，为样品溶液，进样量为20μL。当峰信号噪音与基线噪音比约为3∶1时得最小检测浓度为0.1875μg/mL，最小检测量为3.75ng。

7.精密度试验(避光操作)

以线性关系项下7.0mL到20mL量瓶中的溶液为样品溶液，连续进样6次，求取峰值面积，计算RSD＝0.57％(n＝6)，表明该方法精密度良好。

8.重现性试验(避光操作)

对照品溶液的制备：精密称取维生素B₁₂对照品2.5mg置100mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取复合维B+双氯芬酸钠片样品20片除去包衣，研细，精密称取细粉5.000g(相当于B₁₂0.5mg)置50mL量瓶中，精密加20mL流动相用超声波溶解，摇匀后用离心机离心沉淀，取上清液置50mL干燥烧杯中，称重，加热煮沸后放冷，再滴加流动相至煮沸前的重量，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

取对照品溶液和供试品溶液，按色谱条件各进样20μL，测定维生素B₁₂的含量，RSD＝0.9％(n＝5)。表明本发明方法测定维生素B₁₂的含量能达到真实、准确的分析要求。

9.稳定性试验(避光操作)

取照品溶液和供试品溶液，按色谱条件项下方法操作，每隔2h进样检测，分别求取面积值，RSD为1.3％(n＝5)。表明供试品溶液在8h内稳定性良好。

10.回收率试验

精密称取维生素B₁₂对照品6份，分别精密加入一定量处方中混合均匀的空白辅料颗粒，按含量方法测定，按外表一法计算回收率。结果表明维生素B₁₂回收率平均为99.80％，RSD为1.84％，回收率良好。结果如表1所示。

表1回收率试验结果(n＝6)

上述4-10项试验结果表明，本发明方法具有良好的专属性，结果表明维生素B₁₂进样量在1.875～33.75μg范围内呈现良线性关系，回归方程为Y＝202404X-99700，相关系数r＝0.9994，精密度、稳定性、回收性良好，平均回收率为99.80％，方法简单，含量测定准确可靠，试验时间短，无干扰峰，分离度、拖尾因子、不对称度均符合中国药典求，检测结果良好，能够用于该含量项目的检验控制。

本申请人在每次试验操作中发现一个相同的现象，配制出的样品溶液很稠带粘性，极难滤过，加热一定时间后有析出白色物沉淀在烧杯底部，说明此溶液流动性很好不粘稠，溶液过滤比不加热之前更容易过滤。经过冷却后进行再滤过一次，取滤液进行色谱鉴别和理化鉴别，结果仍然不很明显，重现性比较差。申请人在此基础上改用高效液相色谱法重新进行，结果还是受维生素B₁与维生素B₆及双氯芬酸钠干扰峰的影响。经过重新设计调整有机流动相比例之后，使维生素B₁₂延后时间出峰看，保留时间约在20分钟左右，这样避免了其他成份的干扰。经与对照品溶液进样结果对比，保留时间、分离度、拖尾因子、不对称度、理论塔板数各项评价指标符合药典规定要求，测定结果能反映出的维生素B₁₂含量。本发明方法填补了国际医药领域技术上的空白，理论上采用西药分析思路，操作细节中吸纳中药分析的优点，得于完成。

Claims

1.高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂含量的方法，包括：

(3)色谱条件：

色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶柱；

柱温为35℃；

检测波长为361nm；

流速为1.0mL/min；

进样量为20μL。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于，用10％磷酸溶液或者2moL/L氢氧化钾溶液调节磷酸二氢钾溶液的PH值。

3.根据权利要求2所述的高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于，所述色谱柱的尺寸为4.60mm×250mm，填料粒径为5μm。

4.根据权利要求3所述的高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于，所述流动相在使用前先超声脱气处理。

5.根据权利要求4所述的高效液相色谱法测定复合维B+双氯芬酸钠片中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于，所述水为双蒸馏水。