JP4723094B2 - 結合を検出するための13c−nmrの使用 - Google Patents
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Description
発明の技術分野
本発明は化合物と13C集積標的分子の結合を検出するための核磁気共鳴の使用に関する。
【0002】
発明の背景
新規薬剤候補を発見するための最も強力なツールの1つは合成及び天然産物ライブラリーをランダムスクリーニングし、特定標的分子と結合する化合物を発見する方法(例えば、特定標的に対するリガンドの同定)である。この方法を使用すると、標的分子と物理的結合を形成するか否か又は標的分子の機能を変化させるか否かによりリガンドを同定することができる。
【0003】
物理的結合を探査する場合には、一般に標的分子を1種以上のリガンド候補化合物に暴露し、標的分子と前記化合物の1種以上の間に複合体が形成されるか否かを決定するアッセイを実施する。このようなアッセイは当分野で周知の通り、複合体形成の指標となる標的分子の肉眼的変化(例えば、寸法、電荷、移動度の変化)を試験する。
【0004】
機能変化を測定する場合には、標的分子に関する生物又は化学的イベント(例えば、酵素触媒反応、レセプター媒介酵素活性化等)を測定できるようにアッセイ条件を設定する。変化を確認するために、試験化合物に暴露する前後に標的分子の機能を測定する。
【0005】
既存の物理アッセイ及び機能アッセイは治療用化合物の設計に使用する新規薬剤候補の同定に使用され、成果を上げている。しかし、正確さと信頼性と効率を折衷させたこれらのアッセイには自ずと制約がある。既存アッセイの大きな問題の1つは、例えば「偽陽性」の発生に関連している。典型的な機能アッセイでは、所望生理応答を誘導できないにも拘わらずアッセイに反応する化合物が「偽陽性」を生じる。典型的な物理アッセイでは、例えばそれ自体は標的に結合するが非特異的である化合物(例えば非特異的結合)が「偽陽性」である。多くの化合物はリガンド濃度が高いと非特異的効果を生じるので、偽陽性は高濃度の推定リガンドをスクリーニングする場合に特に問題となる。
【0006】
同様に、既存アッセイは「偽陰性」の問題を生じることも多く、アッセイでは陰性応答であった化合物がその後の他の何らかの方法により実際には標的のリガンドであると判明することは多い。アッセイで使用する試験化合物の濃度が化合物の標的結合定数又は解離定数に対して高過ぎる(従って、毒性となる)か又は低過ぎる場合に一般に偽陰性は発生する。
【0007】
既存アッセイには、アッセイ自体により得られる情報量が限られるという問題もある。既存アッセイは標的分子に結合するか又は標的分子から応答を誘導する化合物を正確に同定することができるが、一般にこれらのアッセイでは標的分子上の特定結合部位又は被験化合物と標的分子の構造活性関係に関する情報は得られない。このような情報が得られない点は、後続試験の候補を同定するためにスクリーニングアッセイを使用している場合に特に問題となる。
【0008】
X線結晶解析を使用して高分子上の有機溶媒の結合部位を同定する方法が最近提案されている。しかし、この方法は標的上の種々の部位の相対結合親和性を測定することができない。高濃度の有機溶媒の存在下でも変性しない非常に安定した標的タンパク質にしか適用できない。また、個々の結晶構造を決定するために長時間を要するため、このアプローチは化学的に多様な多数の化合物を迅速に試験するのに適した方法ではなく、ごく少数の有機溶媒の結合部位のマッピングに限られている。
【0009】
Fesikらの米国特許第5,698,401号及び5,804,390号には、リガンド/標的結合を決定し、標的物質上の結合部位をマッピングする迅速、効率的且つ確実な方法が開示されている。これらの特許はNMRで検出可能な同位体15N核を集積した標的生体分子から第1及び第2の核磁気共鳴相関スペクトルを生成することにより、リガンド化合物と標的生体分子の結合を検出する方法を開示している。第1のスペクトルはリガンドの不在下に標的物質で収集したデータから生成し、第2のスペクトルは1種以上のリガンドの存在下に収集したデータから生成する。2つのスペクトルを比較すると、推定リガンドの混合物中のどの化合物が標的生体分子と結合するかを決定することができ、更に結合部位に関する特定情報も決定することができる。これらの方法は標的分子上の結合部位に関する情報が得られるので、予め選択された標的に対するリガンドの設計を最適化するために使用することができる。
【0010】
Fesikら,前出のNMR法は標的分子の15N同位体集積に依存しているため、窒素を含有する標的物質が必要であるが、別の型の同位体集積標的分子を利用した代替方法を提供できるならば当分野に有益であろう。
【0011】
発明の要約
本発明は1種以上の推定リガンドと予め選択された同位体集積標的分子の結合の検出方法を提供する。
【0012】
本発明は更に、予め選択された同位体集積標的分子と結合するか否かについて化合物混合物をスクリーニングする方法を提供する。
【0013】
本発明は更に、予め選択された同位体集積標的生体分子と結合するリガンド化合物の解離定数の決定方法を提供する。
【0014】
本発明は更に、リガンドの結合により変化する13C集積標的分子中の特定アミノ酸の決定に使用する方法を提供する。
【0015】
本発明は更に、予め選択された同位体集積標的分子と結合するか否かについて化合物混合物をスクリーニングする方法により同定した化合物を提供する。
【0016】
図面の簡単な説明
図1は均質に13Cで標識したFKBPの13C/1H相関スペクトルを示す。
図2は2−フェニルイミダゾール(0.12mM)の添加前(細い多重閉曲線)と添加後(太い一重閉曲線)の均質13C標識FKBPの13C/1H相関スペクトルのメチル領域を示す。
図3は2−フェニルイミダゾール(0.25mM)の添加前(細い多重閉曲線)と添加後(太い一重閉曲線)のバリニル残基とロイシル残基を選択的に13C/15N/2Hで標識したFKBPの13C/1H相関スペクトルのメチル領域を示す。
図4は2−フェニルイミダゾール(0.25mM)の添加前(細い多重閉曲線)と添加後(太い一重閉曲線)のアラニル残基を選択的に13Cで標識したFKBPの13C/1H相関スペクトルのメチル領域を示す。
図5はFKBPの三次元構造の「棒モデル」図を示す。
【0017】
発明の詳細な説明
本明細書全体を通して使用する用語は通常認められている意味をもつ。下記用語は下記に指定する意味をもつ。
【0018】
「DTT」はジチオスレイトールを意味する。
【0019】
「FKBP」はFK結合タンパク質を意味する。
【0020】
「HEPES」はN−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エチルスルホン酸を意味する。
【0021】
「IPTG」はイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドを意味する。
【0022】
「PMSF」はα−トルエンスルホニルフルオリドを意味する。
【0023】
「SCD」はストロメライシンの触媒ドメイン(残基81〜256)を意味する。
【0024】
高解像度NMRスペクトルが得られ、均質又は選択的に13Cを集積できるものであれば任意標的生体分子を本発明の方法で使用することができる。従って、これらの方法はリポタンパク質、リポタンパク質フラグメント、糖タンパク質、糖タンパク質フラグメント、タンパク質、タンパク質フラグメント、ポリペプチド、DNA及びRNA等の任意の所望13C集積標的生体分子に適用可能である。13Cの天然同位体の存在率は1.11%である。従って、有機分子内の任意所与炭素原子が13Cである確率は一般に約0.0111である。
【0025】
13C炭素原子の核と任意隣接水素原子のスピン結合に関するデータを表すNMRシグナルの強度を増すためには、被験標的分子の天然13C含量を増すことが望ましい。これは標的分子に均質又は選択的に13Cを集積することにより達成される。本明細書及び請求の範囲全体を通して使用する「均質集積」、「均質に集積する」、「均質に集積した」、「均質に標識する」及び「均質に標識した」等の用語は、標的分子全体を通してランダムに選択された炭素原子が13Cである確率を合成手段により0.0111よりも大きい値に増すことを意味する。他方、「特異的集積」、「特異的に集積する」、「特異的に集積した」、「特異的に標識する」及び「特異的に標識した」等の用語は、標的分子内の1個以上の予め選択された特異的部位の炭素原子が13Cである確率を合成手段により0.0111よりも大きい値に増すことを意味する。
【0026】
例えば、均質に13Cを集積したグルコースを含む栄養培地で増殖させた遺伝子改変微生物により発現される生体分子は均質に13Cを集積することになる。他方、メチル側鎖のみにC13を集積したアラニンを含む栄養培地で遺伝子改変微生物により発現されるタンパク質は発現されるタンパク質に含まれるこれらのアラニル残基に特異的に13Cを集積することになる。
【0027】
13C同位体集積を利用する本発明の方法は窒素含有分子を含む任意有機標的分子に適用可能である。本方法は特定炭素原子部位(例えば、アラニル、ロイシル、イソロイシル及びバリニル残基のメチル基)に集積した標的分子も分析できる。メチル基はアミド基よりも緩和性に優れているため、大型の標的生体分子(MW>30kDa)に適用する場合に有利である。
【0028】
ポリペプチドとタンパク質は生体で多くの重要な役割を果たす。下記実施例ではポリペプチドを使用して本方法を説明する。ポリペプチドとタンパク質フラグメントは本発明の方法に好ましい類の標的分子である。しかし、本発明の方法は13Cを集積できる他の標的物質にも適用できると理解すべきである。
【0029】
均質及び特異的に13Cを集積した典型的ポリペプチド標的分子の製造を以下に説明する。十分な量の均質又は特異的に13Cを集積したポリペプチドを含む標的分子を製造する手段の1つとして、所望ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する方法が挙げられる。タンパク質又はポリペプチドタンパク質フラグメントは当分野で周知の13C同化性源を含む培地で形質転換細胞系を培養することにより発現される。均質13C標識に好ましい同化性源の1例はCambridge Isotope Laboratoriesから市販されている均質13C標識グルコース即ちU−13C−グルコースである。部位特異的標識で標的ポリペプチドを13C標識するための同化性源としては、市販の特異的13C標識アミノ酸が挙げられる。特異的集積の代替態様では、栄養培地に含まれる13C同化性源はアミノ酸の13C標識生合成前駆物質である。例えば、α−ケト酪酸はイソロイシンの生合成前駆物質であり、α−ケトイソ吉草酸はバリンとロイシンの生合成前駆物質である。下記スキームIはロイシン、イソロイシン及びバリンの特異的13C集積生合成前駆物質の合成方法を示す。比較的廉価な13C集積ヨウ化メチル(H3 13CI)を同位体集積源として使用してC末端標識α−ケト酪酸及びα−ケトイソ吉草酸を生成することができる。
【0030】
13C集積グルコース等の均質に13Cを集積した栄養の使用は標的物質に13C集積を導入する好都合な手段であるが、非常に高価である。更に、均質に13Cで標識した標的中の炭素部位の大半は同様に13Cで標識した共有結合隣接原子をもつため、13C−13C結合を導入し、標的生体分子中の13C標識部位の信号対雑音と緩和性の両者に負の影響を与える恐れがある。標的ポリペプチドを13Cで部位特異的に標識することにより特に利点が得られる。上述のように、これは栄養培地に市販13C標識アミノ酸を加えることにより実施できる。しかし、これも費用がかかるが、標的ポリペプチド中の所定種のアミノアシル残基の標識が必要な状況では望ましい場合もある。他方、ポリペプチド標的分子を13C標識するには、アミノ酸の13C標識生合成前駆物質を含む栄養培地で遺伝子改変細胞系を増殖させる方法が好ましい。特に、標識するアミノ酸前駆物質としてはα−ケト酪酸とα−ケトイソ吉草酸が好ましい。これらの前駆物質の生合成物は特定側鎖メチル基に13Cを集積したロイシン、イソロイシン及びバリンである。メチル基は各々13C標識炭素原子に結合した3個の水素原子をもつため、対応するNMRシグナルは特に強く、明白である。
【0031】
標識α−ケト酪酸及びα−ケトイソ吉草酸の合成配列はピルビン酸中の末端炭素原子を13C集積ヨウ化メチルでメチル化している。一般に、ピルビン酸等のα−ケト酸のアルキル化は元々難しく、エノラート中間体の分解を伴い、多数の副生物を形成する。しかし、T.Spencerら,Tetrahedron Letters,1975,3889とD.R.Williamsら,前出,1990,5881は対応するオキシムのアルキル化を容易に実施できることを示しており、D.Endersら,Angew.Chem.Int.Eng.Ed.,1992,618とD.Endersら,Synlett,1992,901はヒドラゾンも分解を伴わずに容易にアルキル化されることを示している。
【0032】
スキームIでは、tert−ピルビン酸ブチル1を室温でジエチルエーテル中、N,N−ジメチルヒドラジンとの反応により対応するN,N−ジメチルヒドラゾン2に変換する。得られたヒドラゾン2をテトラヒドロフラン溶液中で−78℃まで冷却し、臭化リチウム、次いでリチウムジイソプロピルアミドで処理し、中間体アザアリルエノラートを形成する。エノラートを13C標識ヨウ化メチルでアルキル化し、ヒドラゾン3を生成する。3の2番目のアルキル化過程で標識ジメチル化ヒドラゾン4が生成する。3と4を0℃で塩化メチレン中、トリフルオロ酢酸で処理し、ヒドラジン基とエステル基を開裂し、対応する13C末端標識α−ケト酸5及び6(夫々4−(13C)−酪酸と4−(13C)−3−(13C)−メチル酪酸)を生成する。
【0033】
【化1】
【0034】
反応スキームII、III及びIVは夫々これらのα−ケト酸を13C−ロイシン、13C−イソロイシン及び13C−バリンに生合成変換する方法を示す。全スキーム中、同位体集積部位を星印で示す。
【0035】
【化2】
【0036】
【化3】
【0037】
【化4】
【0038】
特定ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを作製し、このベクターで宿主細胞を形質転換するための手段は当分野で周知である。(例えば、R.W.Oldら,“Techniques of Gene Manipulation,”Blackwell Science,London,1994及び同分野の同様の処理参照。)同様に、形質転換細胞を培養してコード化ポリペプチドを発現させ、ポリペプチドを単離、精製及びリフォールディングするための方法も当分野で周知である。下記実施例ではヒトストロメライシンの81〜256アミノ酸触媒領域とFK結合タンパク質(FKBP)の13C集積サンプルを改変大腸菌から調製する方法と、本発明の方法におけるこれらの同位体集積ポリペプチドの使用について説明する。
【0039】
標的分子と結合するか否かについて2種以上の化合物(例えば化合物の混合物又はライブラリー)をスクリーニングするために本方法を利用する場合や、標的分子単独から生成した第1のスペクトルと化合物の存在下で標的分子から生成したスペクトルが相違する場合には、混合物に含まれるどの特定化合物が実際に標的分子に結合しているかを同定する付加段階を実施する。この付加段階では、混合物の各化合物に13C集積標的分子を個々に暴露し、各化合物に個々に暴露した標識標的分子の二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成し、各スペクトルを標的分子単独から生成した第1のスペクトルと比較し、比較したスペクトル間の相違を調べる。スペクトルの相違からリガンドである化合物を容易に同定することができる。
【0040】
二次元相関スペクトルにおける特定13C/1Hシグナルの化学シフト値は標的分子中の原子団の既知特定位置(例えば、標的分子中の特定アミノ酸残基の炭素原子又は特異的に標識したポリペプチドの場合はアラニル、ロイシル、イソロイシル及びバリニル残基のメチル基)に対応する。従って、本発明のスクリーニング方法はどの化合物が特定標的分子と結合するかを同定できるだけでなく、化合物と標的分子の結合により変化する特定アミノ酸を決定することもできる。化学シフト値は標的分子の配座の変化や、特定シグナルに対応する部位へのリガンド化合物の結合を表す場合もある。
【0041】
更に、所望により、13C標識標的分子の第1の二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成し、標識標的分子を種々の濃度のリガンドに暴露し、使用する各リガンド濃度で二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成し、生成したスペクトルを標的分子の第1のスペクトルと比較し、その差から式1:
KD={([P0]−x)([L0]−x)}/x
(式中、[P0]は標的分子の合計モル濃度であり、[L0]はリガンドの合計モル濃度であり、xは結合種のモル濃度である)を使用して標的分子とリガンドの間の解離定数を計算することにより、本方法により所与リガンドとその標的分子の解離定数KDを決定することができる。xの値は式2:
x=(δobserved−δfree)/Δ
[式中、δobservedは実測化学シフト値であり、δfreeは遊離種の化学シフト値であり、Δは飽和限界化学シフト値(δsaturation)と結合リガンドを含まない標的分子の化学シフト値(δfree)の差である]によりNMR化学シフトデータから決定する。
【0042】
次に、標準曲線適合統計法を使用して実測データとの間に最良の適合が得られるまでその値を変化させることにより解離定数を決定する。δsaturationの値が直接不明の場合には、KDとδsaturationを変化させ、得られたデータで同じく曲線適合統計法を実施する。
【0043】
本スクリーニング法の利点の1つはリガンドに既に結合している第2の分子の存在下に標的分子の1種のリガンドの解離定数を決定できるという点である。これは、リガンドと標的分子物質の結合を決定する「ウェット化学」分析法を使用する他の方法では一般に不可能である。
【0044】
リガンドの解離定数を決定する方法は第2の結合リガンドの存在下に実施することができる。従って、13C標識標的分子を試験化合物に暴露する前に第2のリガンドに結合する。本スクリーニング法は更に第2以降のリガンドと標的分子の結合に関する情報も提供することができる。この第2のリガンドを標的分子に結合した第1のリガンドに化学結合すると、標的分子を変化させるのに使用する新規複合分子が得られる。
【0045】
本発明のスクリーニング方法はまず同位体集積標的分子の二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成又は獲得することから開始する。上述のように、標的分子は均質に13Cを集積してもよいし、アラニル、ロイシル、バリニル及びイソロイシル残基に13Cメチル基を取込むことにより特異的に集積してもよい。二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成するための手段は当分野で周知である。通常記録するNMRスペクトルは二次元13C/1H異核単量子相関(HSQC)スペクトルであるが、当業者に公知の他の技術も使用できる。タンパク質に対応する13C/1Hシグナルは通常は十分に分解しているので、個々の13C/1H対の化学シフト変化を容易にモニターすることができる。13C標識標的ポリペプチド(FKBP)の代表的な二次元13C/1H相関スペクトルを図1に示す。特異的に13Cを集積したFKBPの代表的な二次元13C/1H相関スペクトルを図3に示す。
【0046】
13C標識標的分子を1種以上の試験化合物に暴露した後、第2の二次元13C/1H相関スペクトルを生成する。このスペクトルは上述と同様に生成する。次に、第1のスペクトルと第2のスペクトルを比較し、2つのスペクトル間に相違があるか否かを調べる。二次元13C/1H相関スペクトル間の相違がリガンドの存在を示し、標的分子中の13C標識部位に対応する。この相違は当分野で周知の標準手順を使用して測定する。図2は2−フェニルイミダゾール(0.12mM)の添加前(細い多重閉曲線)と添加後(太い一重閉曲線)の均質13C標識FKBPのメチル領域を示す。
【0047】
二次元13C/1H相関スペクトルにおける特定シグナルは標的分子中の特定炭素及びプロトン原子(例えば、タンパク質中のアミノ酸残基の特定メチル基)に対応する。例えば、図3から明らかなように、試験化合物に暴露したFKBPの二次元13C/1H相関スペクトルに観察される化学シフトは残基位置97(ロイシン)及び55(バリン)に生じた。各化合物との結合に関与するタンパク質の領域は化合物添加後に変化する特定炭素及びプロトン原子対から同定される。
【0048】
実施例
調製1:均質に13Cを集積したヒトストロメライシン触媒ドメイン(SCD)の調製
ストロメライシンの81〜256フラグメント(配列番号1)(SCD)はこのタンパク質フラグメントの生産をコードするプラスミドを大腸菌株に挿入し、適当な培地で遺伝子改変細菌株を増殖させることにより調製した。培地からタンパク質フラグメントを単離し、精製した後、本発明の方法により試験化合物に対するその親和性の二次元NMR分析で使用した。調製工程手順を以下に説明する。
【0049】
Clarkら,Archiv.Biochem.and Biophys.241:36(1985)に記載されている手順を使用してヒト皮膚繊維芽細胞(ATCC No.CRL1507)を増殖誘導した。RNAgents(登録商標)全RNA単離システムキット(Promega Corp.)を製造業者の指示に従って使用して細胞1gから全RNAを単離した。RNA1μgを80℃で5分間加熱して変性させた後、GenAmp(登録商標)RNA PCRキット(Applied Biosystems/Perkin−Elmer)を製造業者の指示に従って使用して逆転写酵素PCRを実施した。
【0050】
第1のプライマー(a)GAAATGAAGAGTCTTCAA(配列番号2)及び(b)GCGTCCCAGGTTCTGGAG(配列番号3)を使用し、94℃2分間、45℃2分間及び72℃3分間の35サイクルを使用してネステドPCRを実施した。その後、内部プライマー(c)TACCATGGCCTATCCATTGGATGGAGC(配列番号4)及び(d)ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG(配列番号5)を使用して上記と同一条件下の30サイクルで再増幅させ、ヒトストロメライシンのアミノ酸残基1〜256をコードするDNA配列を生成した。
【0051】
次に、PCRフラグメントを製造業者の指示に従ってPCRクローニングベクターpT7BIue(登録商標)(Novagen,Inc.)にクローニングした。得られたプラスミドをNcoIとBamHIで切断し、ストロメライシンフラグメントを発現ベクターpET3d(Novagen,Inc.)にサブクローニングした。
【0052】
アミノ酸残基81〜256と開始メチオニンアミノアシル残基をコードする成熟ストロメライシン発現構築物を1〜256発現構築物からPCR増幅により生成した。得られたPCRフラグメントを上述のように製造業者の指示に従ってまずpT7BIue(登録商標)ベクター(Novagen,Inc.)にクローニングした後、pET3dベクター(Novagen,Inc.)にサブクローニングし、プラスミドpETST−83−256を生成した。この最終プラスミドはヒトストロメライシン配列で2アミノ酸だけ前の81位から開始するペプチド配列をコードする以外はQi−Zhuangら,Biochemistry,31:11231(1992)に記載されているプラスミドと同一である。プラスミドpETST−83−256を製造業者の指示に従って大腸菌株BL21(DE3)/pLysS(Novagen,Inc.)に形質転換し、発現株BL21(DE3)/pLysS/pETST−255−1を生成した。
【0053】
NaH2PO4・7H2O 1.698g、KH2PO4 0.45g、NaCl 0.075g、NH4Cl 0.150g、U−13C−グルコース0.3g、1M MgSO4水溶液300μl及びCaCl2水溶液15mLを脱イオン水150mlに溶かすことにより予備培地を調製した。得られた予備培地溶液を滅菌し、滅菌500mlバッフルフラスコに移した。予備培地に細菌株を接種する直前に100%エタノール中に34mg/mlクロラムフェニコールを含有する溶液150mlと、アンピシリン20mg/mlを含有する溶液1.5mlをフラスコ内容物に加えた。次に、遺伝子改変大腸菌株BL21(DE3)/pLysS/pETST−255−1のグリセロールストック1mlをフラスコ内容物に接種した。光学密度0.65が観察されるまでフラスコ内容物を37℃で振盪した(225rpm)。
【0054】
NaH2PO4・7H2O 113.28g、KH2PO4 30g、NaCl 5g及び1%DF−60消泡剤10mLを脱イオン水9604mLに溶かすことにより発酵栄養培地を調製した。この溶液をNew Brunswick Scientific Micros Fermenterに入れ、121℃で40分間滅菌した。発酵培地を接種する直前に、10%NH4Cl水溶液100mlと、均質13C集積グルコース15gと、1M MgSO4水溶液20mlと、1M CaCl2水溶液1mlと、塩酸チアミン(10mg/ml)水溶液5mlと、100%エタノール中に34mg/mlクロラムフェニコールを含有する溶液10mlと、クロラムフェニコール溶液に溶かしたアンピシリン1.9gからなる予備滅菌成分を発酵槽内容物に加えた。4N H2SO4水溶液を加えることにより、得られた溶液のpHをpH7.00に調整した。
【0055】
上記振盪フラスコ規模手順からの大腸菌株BL21(DE3)/pLysS/pETST−255−1の予備培養物を発酵槽内容物に加え、光学密度0.48に達するまで細胞増殖させた。この工程中は、必要に応じて4N H2SO4又は4N KOHを加えることにより発酵槽内容物をpH7.0に自動的に維持した。溶存酸素濃度が55%よりも低下すると撹拌速度を増すカスケードループにより、発酵槽内容物の溶存酸素濃度を空気飽和率55%以上に維持した。発酵槽内容物に7標準リットル/分(SLPM)で空気を供給し、工程を通して培養温度を37℃に維持した。
【0056】
4℃、17,000×gで10分間遠心分離により細胞を回収し、得られた細胞ペレットを集め、−85℃で保存した。湿潤細胞収率は3.5g/Lであった。細胞溶解液の可溶性フラクションと不溶性フラクションをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により分析した処、ストロメライシンの約50%が可溶性相に存在することが判明した。
【0057】
上述のように調製したストロメライシンフラグメントをYeら,Biochemistry,31:11231(1992)に記載されている方法の変法により精製した。1mM MgCl2、0.5mM ZnCl2、25単位/ml Benzonase(登録商標)(Benzon Pharma)、及び4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド(AEBSF)とLeupeptin(登録商標)とAprotinin(登録商標)とPepstain(登録商標)(いずれも濃度1mg/ml)からなる阻害剤混合物を含有する20mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)ナトリウムアジド溶液に回収した細胞を懸濁した。AEBSF、Leupeptin(登録商標)、Aprotinin(登録商標)及びPepstain(登録商標)はAmerican International Chemicalの市販品である。得られた混合物を1時間温和に撹拌した後、4℃まで冷却した。次に、50%デューティーサイクルを使用して細胞を音波処理により破壊した。得られた溶解液を14,000rpmで30分間遠心分離し、不溶性フラクションのペレットを後期処理に備えて−80℃で凍結した。
【0058】
固体硫酸アンモニウムを20%飽和点まで上清に加え、得られた溶液を700mlフェニルセファロース高流速(”Q−セファロースFF)カラム(Pharmacia Biotech.)にロードした。ロードする前に、セファロースカラムを50mM Tris−HCl緩衝液(4℃でpH7.6)、5mM CaCl2及び1M (NH4)2SO4で平衡化しておいた。ロードしたカラムをTris−HCl緩衝液(pH7.6)中に減少濃度の水性(NH4)2SO4(1M→0M)と増加濃度の水性CaCl2(5mM→20mM)を含む直線勾配で溶離した。溶離液の活性フラクションを集め、Amicon撹拌セル(Amicon,Inc.)で濃縮した。Q−セファロースFFカラムで使用した出発緩衝液である50mM Tris−HCl(4℃でpH8.2)に10mM CaCl2を加え、濃縮サンプルを一晩透析した。
【0059】
次に、透析したサンプルをQ−セファロースFFカラムにロードし、出発緩衝液と200nM NaClを含む直線勾配で溶離した。ストロメライシンフラグメントの精製可溶性フラクションを濃縮し、4℃で保存した。ペレットを8Mグアニジン−HClで可溶化した。溶液を20分間20,000rpmで遠心分離し、50mM Tris−HCl(pH7.6)、10mM CaCl2、0.5mM ZnCl2及びAEBSFとLeupeptin(登録商標)とAprotinin(登録商標)とPepstain(登録商標)(いずれも濃度1mg/ml)からなる阻害剤カクテルを含むフォールディング緩衝液に上清を滴下した。フォールディング緩衝液の容量は上清の10倍とした。上清とフォールディング緩衝液の混合物を20,000rpmで30分間遠心分離した。この遠心分離からの上清を4℃で保存し、グアニジン−HClで可溶化し、緩衝液中でリフォールディングし、遠心分離する上記工程をペレットに2回実施した。3回の遠心分離の各々からの最終上清を合わせ、固体硫酸アンモニウムを20%飽和点まで加えた。こうして不溶性フラクションから誘導された溶液を可溶性フラクションについて上述したようにフェニルセファロース及びQ−セファロース上で精製した。精製した可溶性フラクションと不溶性フラクションを合わせると、元の細胞ペースト1g当たり約1.8mgの均質に13Cを集積した精製ストロメライシン81〜256フラグメント(SCD)が得られた。
【0060】
調製2:特異的に13Cを集積したヒトストロメライシン触媒ドメイン(SCD)の調製
13C集積α−ケト酪酸及びα−ケトイソ吉草酸を含む培地でBL21(DE3)/pLysS/pETST−255−1改変大腸菌株を培養することによりSCDを発現させた。遺伝子改変大腸菌株の作製と、タンパク質フラグメントの発現、単離及び精製に使用する方法は、U−13C−グルコースの代わりに−U−12C−グルコースを使用する以外は上述の通りである。
【0061】
調製3:均質及び特異的に13Cを集積したFKBPの調製
A.特異的に13Cを集積したVal/LeuFKBPの調製
単一窒素源(1.0g/L)として15NH4Cl(Cambridge Isotopes)と炭素源(Cambridge Isotopes)として過重水素化グルコース(1.5g/L)を含む100%D2O培地で(Eganら,Biochemistry 32:1920−1927(1993)に記載されているように)ヒトFKBPをコードするプラスミドで形質転換した細胞を増殖させた。細胞を37℃で増殖させ、1.0の光学密度が得られるまでフラスコ内容物を振盪した。誘導の1時間前にL−バリン−U−13C5−15N−2,3−d2(Cambridge Isotopes)80mgを培地に加えた。1mM IPTGで12時間培養を誘導した。
【0062】
4℃、17,000×gで10分間遠心分離して細胞を回収し、5mM DTTと1mM PMSFを加えた50mMリン酸緩衝液(pH7.4)に得られた細胞ペレットを懸濁し、フレンチプレスを使用して機械的に溶解させた。得られた溶解液を25,000rpmで30分間遠心分離した。固体硫酸アンモニウムを40%飽和点まで上清に加え、18,000rpmで5分間遠心分離した。上清を10mM GEPES(pH8.0)で12時間4℃で透析した。得られた溶液を次に透析緩衝液で予め平衡化しておいた10mL Q−セファロース高流速カラム(Sigma)にロードした。フラクションを集め、プールし、Amiconフローセルを使用して濃縮した。次に、10mM DTTと0.01%ナトリウムアジドを加えた20mMリン酸緩衝液(pH6.5)で溶液を透析した。
【0063】
B.特異的に13Cを集積したVal/Leu/IleFKBPの調製
単一窒素源(1.0g/L)としてNH4Clと炭素源としてグルコース(1.5g/L)を含む培地で(Eganら,Biochemistry 32:1920−1927(1993)に記載されているように)ヒトFKBPをコードするプラスミドで形質転換した細胞を増殖させた。細胞を37℃で増殖させ、1.0の光学密度が得られるまでフラスコ内容物を振盪した。誘導の1時間前にα−ケト酪酸とα−ケトイソ吉草酸100mgを培地に加えた。1mM IPTGで12時間培養を誘導した。発現、単離及び発現したタンパク質の精製は上述の通りである。
【0064】
C.均質に13Cを集積したFKBPの調製
単一窒素源(1.0g/L)として15NH4Cl(Cambridge Isotopes)と炭素源(Cambridge Isotopes)として均質13C集積グルコース(1.5g/L)を含む培地で(Eganら,Biochemistry 32:1920−1927(1993)に記載されているように)ヒトFKBPをコードするプラスミドで形質転換した細胞を増殖させた。発現、単離及び発現したタンパク質の精製は上述の通りである。
【0065】
実施例1:均質に13Cを集積したFKBPによる13C/1H NMR相関スペクトルを使用したリガンドのスクリーニング
上記手順に従って均質に13Cを集積したFKBPを調製した。スクリーニングアッセイに使用したタンパク質溶液はH2O/D2O(9/1)リン酸緩衝液溶液(20mM,pH6.5)中に均質13C集積FKBP(0.2mM)とナトリウムアジド(0.05%)を含むものとした。
【0066】
三重共鳴プローブとBrukerサンプルチェンジャーを備えるBruker DRX500 NMRスペクトロメーターで30℃で二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成した。13C/1H HSQCスペクトルは掃引幅3771Hz(13C,t1)及び8333Hz(1H,t1)を使用して64×1024個の複素点として獲得した。走査間遅延1秒と自由誘導減衰(fid)当たり8走査をデータ収集に使用した。全NMRスペクトルはSilicon Graphisコンピューターで処理及び分析した。
【0067】
上述のように13C標識FKBP標的分子で第1の二次元13C/1H NMR相関スペクトルを獲得した。次にFKBP標的を試験化合物のライブラリー混合物に暴露した。100mMと1Mの化合物のストック溶液を調製した。更に、サンプル当たり8〜10種の化合物を各化合物100mMの濃度で含有する組合せライブラリーを調製した。
【0068】
1Mストック溶液のpHは酢酸とエタノールアミンで調節し、100mMリン酸緩衝液(pH7.0)で10倍希釈後にpH変化が認められないようにした。pHが少しでも変化すると生体分子の化学シフトが変化し、NMRデータの解釈が混乱する恐れがあるのでpH調節は重要である。
【0069】
ライブラリー内の化合物はサイズ(分子量=100〜300)と分子ダイバーシティに基づいて選択した。ライブラリーの分子は多様な結合部位と相互作用する化合物を発見する可能性が最大限になるように、種々の形状(例えば、平坦芳香環、折れ曲がった脂肪族環、単結合、二重結合又は三重結合をもつ直鎖及び分枝鎖脂肪族)と多様な官能基(例えばカルボン酸、エステル、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン及び種々の複素環)をもつように選択した。
【0070】
NMRサンプルは均質13C標識タンパク質のH2O/D2O(9/1)緩衝溶液0.5mlに各化合物を100mMの濃度で含有する化合物混合物のジメスルスルホキシドストック溶液1.25μlを加えることにより調製した。NMRサンプル中の各化合物の最終濃度は約0.25mMとした。
【0071】
スクリーニング実験では、1種の化合物2−フェニルイミダゾールがFKBPに結合することが判明した。図1は均質に13Cで標識したFKBPの13C/1H相関スペクトルを示す。スペクトル(128複素点、4走査/fid)は20mMリン酸(pH6.5)、0.01%ナトリウムアジド及び10%酸化ジューテリウム(D2O)中0.1mM FKBPサンプルで獲得した。
【0072】
図2は2−フェニルイミダゾール(0.25mM)の添加前(細い多重閉曲線)と添加後(太い一重閉曲線)の均質13C標識FKBP(0.2mM)の13C/1H相関スペクトル(64複素点、8走査/fid)のメチル領域を示す。アミノアシル残基Leu97、Val55、Ile56及びIle90に化学シフトの変化が認められる。
【0073】
図3は2−フェニルイミダゾール(0.25mM)の添加前(細い多重閉曲線)と添加後(太い一重閉曲線)のバリニル残基とロイシル残基を選択的に13C/15N/2Hで標識したFKBPの13C/1H相関スペクトル(48複素点、8走査/fid)を示す。他の全条件は図1に示すスペクトルの生成に使用した条件と同一である。選択残基は結合後に有意変化を示すことが認められる。この場合も、化学シフト値が変化しており、Leu97及びVal55残基又はその近傍に結合が生じていると判断される。
【0074】
図4は2−フェニルイミダゾール(0.25mM)の添加前(細い多重閉曲線)と添加後(太い一重閉曲線)のアラニル残基を選択的に13Cで標識したFKBPの13C/1H相関スペクトルを示す。リガンドの添加前(細い多重閉曲線)と添加後(太い一重閉曲線)の化学シフト値は重なっており、アラニル残基は結合に関与していないと判断される。
【0075】
図5はFKBPの三次元構造の「棒モデル」図を示す。分かり易くするために選択残基の番号を示す。タンパク質の結合部位に含まれるアミノアシル残基は太線で示した。
【図面の簡単な説明】
【図1】 均質に13Cで標識したFKBPの13C/1H相関スペクトルを示す。
【図2】 2−フェニルイミダゾール(0.12mM)の添加前(細い多重閉曲線)と添加後(太い一重閉曲線)の均質13C標識FKBPの13C/1H相関スペクトルのメチル領域を示す。
【図3】 2−フェニルイミダゾール(0.25mM)の添加前(細い多重閉曲線)と添加後(太い一重閉曲線)のバリニル残基とロイシル残基を選択的に13C/15N/2Hで標識したFKBPの13C/1H相関スペクトルのメチル領域を示す。
【図4】 2−フェニルイミダゾール(0.25mM)の添加前(細い多重閉曲線)と添加後(太い一重閉曲線)のアラニル残基を選択的に13Cで標識したFKBPの13C/1H相関スペクトルのメチル領域を示す。
【図5】 FKBPの三次元構造の「棒モデル」図を示す。
【配列表】
Claims (12)
- 推定リガンドと予め選択された13C集積標的分子の結合の検出方法であって、
a)前記標的分子の第1の二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成する段階と、
b)前記標的分子と少なくとも1種の推定リガンド化合物の混合物を形成する段階と、
c)段階(b)の混合物の第2の二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成する段階と、
d)第1のスペクトルと第2のスペクトルを比較する段階を含み、
ここで、前記標的分子が、4−( 13 C)−α−ケト酪酸及び4−( 13 C)−3−( 13 C)−α−ケトメチル酪酸から構成される群から選択されるアミノ酸生合成前駆物質を含む培地で、前記標的分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む形質転換細胞系を培養することにより調製される、前記方法。 - 前記標的分子がリポタンパク質、リポタンパク質フラグメント、糖タンパク質、糖タンパク質フラグメント、タンパク質、タンパク質フラグメント、及びポリペプチドから構成される群から選択される請求項1に記載の方法。
- 前記標的分子がタンパク質、タンパク質フラグメント及びポリペプチドから構成される群から選択される請求項1に記載の方法。
- 培地が前記4−( 13 C)−α−ケト酪酸又は前記4−( 13 C)−3−( 13 C)−α−ケトメチル酪酸の塩を含む請求項3に記載の方法。
- 予め選択された13C集積標的分子と結合するか否かについて化合物混合物をスクリーニングする方法であって、
a)前記標的分子の第1の二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成する段階と、
b)前記標的分子を前記化合物混合物と接触させる段階と、
c)段階(b)の混合物の第2の二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成する段階と、
d)第1のスペクトルと第2のスペクトルを比較する段階を含み、
ここで、前記標的分子が、4−( 13 C)−α−ケト酪酸及び4−( 13 C)−3−( 13 C)−α−ケトメチル酪酸から構成される群から選択されるアミノ酸生合成前駆物質を含む培地で、前記標的分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む形質転換細胞系を培養することにより調製される、前記方法。 - 前記方法が更に、
e)段階d)で第1のスペクトルと第2のスペクトルの相違が検出された場合には前記混合物中の各化合物に前記標的分子を個々に暴露する段階と、
f)各化合物に暴露した前記標的分子の二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成する段階と、
g)段階f)で生成した各スペクトルを標的分子単独から生成した第1のスペクトルと比較する段階を含む請求項5に記載の方法。 - 前記標的分子がリポタンパク質、リポタンパク質フラグメント、糖タンパク質、糖タンパク質フラグメント、タンパク質、タンパク質フラグメント及びポリペプチドから構成される群から選択される請求項6に記載の方法。
- 前記標的分子がタンパク質、タンパク質フラグメント及びポリペプチドから構成される群から選択される請求項7に記載の方法。
- 予め選択された13C集積標的分子と結合するリガンドの解離定数の決定方法であって、
a)前記標的分子の第1の二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成する段階と、
b)前記標的分子を種々の濃度の前記リガンドに暴露する段階と、
c)段階b)の各リガンド濃度で二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成する段階と、
d)段階(c)からの各スペクトルを段階(a)からの前記第1のスペクトルと比較する段階と、
e)解離定数を計算する段階を含み、
ここで、前記標的分子が、4−( 13 C)−α−ケト酪酸及び4−( 13 C)−3−( 13 C)−α−ケトメチル酪酸から構成される群から選択されるアミノ酸生合成前駆物質を含む培地で、前記標的分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む形質転換細胞系を培養することにより調製される、前記方法。 - 前記標的分子がリポタンパク質、リポタンパク質フラグメント、糖タンパク質、糖タンパク質フラグメント、タンパク質、タンパク質フラグメント及びポリペプチドから構成される群から選択される請求項9に記載の方法。
- 前記標的分子がタンパク質、タンパク質フラグメント及びポリペプチドから構成される群から選択される請求項10に記載の方法。
- リガンドと予め選択された13C集積標的分子の結合により影響を受ける前記標的分子中の特定アミノ酸残基の決定方法であって、
a)二次元相関スペクトルにおける13C/1Hシグナルの化学シフト値が前記標的分子中の原子団の少なくとも1個の既知特定位置に対応するように前記標的分子の第1の二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成する段階と、
b)前記標的分子と既知リガンド化合物の混合物を形成する段階と、
c)段階(b)の混合物の第2の二次元13C/1H NMR相関スペクトルを生成する段階と、
d)第1のスペクトルと第2のスペクトルを比較する段階を含み、
ここで、前記標的分子が、4−( 13 C)−α−ケト酪酸及び4−( 13 C)−3−( 13 C)−α−ケトメチル酪酸から構成される群から選択されるアミノ酸生合成前駆物質を含む培地で、前記標的分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む形質転換細胞系を培養することにより調製される、前記方法。
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