MXPA01010180A - Uso de 13c-nmr para detectar union. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan con la presente, los metodos para la deteccion de union de un ligando putativo a una molecula objetivo enriquecida con 13C, metodos para la seleccion de compuestos que se unen a una molecula objetivo enriquecida con 13C, metodos para calcular la constante de disociacion de un compuesto de ligando que se une a una molecula objetivo enriquecida con 13C y los metodos empleados en la determinacion de los amino acidos especificos en una molecula objetivo enriquecida con 13C afectada por la union de un ligando, asi como tambien los compuestos identificados mediante estos metodos de seleccion.

Description

USO DE 13C-NMR PARA DETECTAR UNION Campo de la Invención La presente invención se refiere al uso de resonancia magnética nuclear para detectar unión entre compuestos y moléculas objetivo enriquecida con 13C.

Referencia Cruzada con las Solicitudes Relacionadas Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud Serie No. 09,241 , 194, presentada el 1o de febrero de 1999, la cual es una continuación de la solicitud Serie No. 08/744,701 , presentada el 31 de Octubre de 1 996, ahora Patente de E. U. No. 5,—,—, la cual es una continuación en parte de la solicitud Serie No. 08/, 678, 903, presentada el 12 de Julio de 1996, ahora abandonada, la cual es una continuación en parte de la solicitud Serie No. 08/558,633, presentada el 14 de Noviembre de 1995, ahora Patente de E. U . No. 5,—, — .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una de las herramientas más poderosas en el descubrimiento de nuevos adelantos en fármacos es la selección aleatoria de bibliotecas de productos naturales y sintéticos para descubrir compuestos que se unen a una molécula objetivo en particular (por ejemplo, la identificación de ligandos para ese objetivo). Mediante el uso de este método, los ligandos pueden identificarse por su habilidad para formar una asociación física con una molécula objetivo o por su habilidad para alterar una función de una molécula objetivo Cuando se busca la unión física , una molécula objetivo se ^)fone épicamente a uno o más compuestos sospechosos de ser ligandos van a cabo ensayos para determinar si se forman complejos entre la molécula objetivo y uno o más de aquellos compuestos. Como se sable bien en la materia, tales ensayos examinan los cambios grandes en la molécula objetivo (por ejemplo, cambios de tamaño, carga, movilidad) que indican la formación de un complejo. Cuando se miden cambios funcionales, se establecen las condiciones de ensayo que permiten la medición de un evento biológico o químico relacionado con la molécula objetivo (por ejemplo, una reacción catalizada por enzima, activación de enzima mediada por receptor y lo similar). Para identificar una alteración, la función de la molécula objetiva se determina antes y después de la exposición a los compuestos de prueba. Los ensayos físicos y funcionales existentes se han utilizado de manera exitosa en la identificación de nuevos adelantos de fármacos para utilizarse en el diseño de compuestos terapéuticos. Sin embargo, existen limitaciones inherentes a aquellos ensayos que comprometen su exactitud, confiabilidad y eficiencia. Un problema principal con los ensayos existentes, por ejemplo, se refiere a la generación de "falsos positivos". En un ensayo funcional típico, se genera un resultado de "falso positivo" para un compuesto que activa el ensayo pero cuyo compuesto no es eficaz en la producción de la respuesta fisiológica deseada. En un ensayo físico típico, un "falso positivo" es un compuesto que, por ejemplo, se sujeta a sí mismo al objetivo pero en una manera no específica (por ejemplo,, unión no específica) Los falsos positivos son particularmente prevalentes y problemáticos cuando se seleccionan concentraciones mayores de ligandos putativos debido a que muchos compuestos tienen efectos no específicos en esas concentraciones. En una manera similar, los ensayos existentes se contagian con frecuencia por el problema de "falsos negativos", los cuales resultan cuando un compuesto da una respuesta negativa en el ensayo pero, según se encuentra subsecuentemente por algún otro método, es en realidad un ligando para el objetivo. Los resultados falsos negativos típicamente ocurren en ensayos que utilizan concentraciones de compuestos de prueba que son ya sea demasiado elevadas (dando como resultado toxicidad) o demasiado bajas, con relación a la constante de unión o disociación del compuesto para el objetivo. Otro problema con los ensayos existentes es la limitada cantidad de información que se proporciona por el ensayo en sí. Aunque el ensayo puede identificar correctamente los compuestos que se unen a o producen una respuesta a la molécula objetivo, aquellos ensayos típicamente no proporcionan ninguna información acerca de sus sitios de unión específicos en la molécula objetivo ni de las relaciones de la actividad estructural entre el compuesto a examinarse y la molécula objetivo. La incapacidad de proporcionar tal información es particularmente problemática cuando el ensayo de selección se utiliza para identificar adelantos para estudio posterior Recientemente se ha sugerido que la cristalografía de rayos X puede utilizarse para identificar los sitios de unión de solventes orgánicos o mtFiffmoléculas Sin embargo, este método no puede determinar las afinidades de unión relativas en diferentes sitios en el objetivo. Ésta solamente es aplicable a proteínas objetivo muy estables que no se desnaturalizan en presencia de concentraciones elevadas de solventes orgánicos. Además, debido al largo tiempo necesario para determinar las estructuras de cristal individuales, este enfoque no es un método adecuado para examinar rápidamente un gran número de compuestos que son qu ímicamente diversos, sino que se limita a la representación de los sitios de unión de solo unos cuantos solventes orgánicos. Los métodos rápidos, eficientes y confiables para determinar la unión a ligando/objetivo y para la representación de sitios de unión en la substancia objetivo, se exponen en las Patentes de E.U . Nos. 5,698,401 y 5,804,390 de Fesik et al. Estas patentes exponen métodos para detectar la unión de un compuesto ligando a una biomolécula objetivo mediante la generación de espectros de correlación de resonancia magnética nuclear, primero y segundo, provenientes de las biomoléculas objetivo que se han enriquecido de manera isotópica con los núcleos 15N detectables por NMR. El primer espectro se genera a partir de los datos recolectados en la substancia objetivo en la ausencia de ligandos y el segundo en la presencia de uno o más ligandos. Una comparación de los dos espectros permite la determinación de cuáles compuestos en la mezcla de ligandos putativos se une a la biomolécula objetivo, así como también información específica acerca del sitio de unión. Ya que los métodos producen información acerca de los sitios de unión en la molécula objetivo, los s, i.?iéiodos pueden utilizarse para optimizar la designación de ligandos a un objetivo pre-seleccionado . Debido a que los métodos de NMR de Fesik et al., supra, requieren de substancias objetivo que contienen nitrógeno, debido a la dependencia de aquellos métodos del enriquecimiento isotópico de la molécula objetivo con 15N , sería una contribución valiosa a la materia la proporción de un método alternativo que emplee un tipo diferente de molécula objetivo enriquecida de manera isotópica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para detectar la unión entre uno o más ligandos putativos a una molécula objetivo preseleccionada , enriquecida de manera isotópica . La presente invención proporciona además un método para seleccionar una mezcla de compuestos para unirse a una molécula objetivo pre-seleccionada, enriquecida de manera isotópica. También se proporciona por la presente invención un método para determinar la constante de disociación para un compuesto ligando que se une a una biomolécula objetivo pre-seleccionada, enriquecida de manera isotópica. De manera adicional, en la presente invención se proporcionan métodos empleados en la determinación de los amino ácidos específicos en una molécula objetivo enriquecida con 13C, afectada por la unión de un ligando. Se proporciona además todavía por la presente invención, un compuesto identificado por un método de selección de una mezcla de compuestos para unirse a una molécula objetivo pre-seleccionada, enriquecida de manera isotópica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra un espectro de correlación de 1 "3oC//'1H| de FKBP uniformemente etiquetado con 13C. La figura 2 ilustra las regiones de metilo de espectros de correlación de "C^H de FKBP uniformemente etiquetado con 13C antes (contornos múltiples delgados) y después (contornos individuales gruesos) de la adición de 2-fenilimidazol (0.1 2 mM). La figura 3 ilustra las regiones de metilo de espectros de correlación de 13C/1 H de FKBP selectivamente etiquetado con 13C/15N/2H en residuos de valinilo y leucilo antes (contornos múltiples delgados) y después (contornos individuales gruesos) de la adición de 2-fenilimidazol (0.25 mM). La figura 4 ilustra las regiones de metilo de espectros de correlación de 13C/1 H de FKBP selectivamente etiquetado con 13C en los residuos de alanilo antes (contornos múltiples delgados) y después (contornos individuales gruesos) de la adición de 2-fenil?midazol (0.25 mM) La figura 5 ilustra un dibujo de "modelo de adhesión" de la estructura tridimensional de FKBP DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los términos utilizados a través de toda esta especificación tienen sus significados normalmente aceptados. Los siguientes términos específicos tienen los significados adscritos. "DTT" significa ditiotreitol. "FKBP" se refiere a una proteína de unión a FK. "HEPES" denota ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etilsulfónico. "IPTG" significa isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida . "PMSF" se refiere a fluoruro de a-toluenosulfonilo. "SCD" se refiere al dominio catalítico (residuos 81 -256) de estromelisina. En los métodos de la presente invención puede utilizarse cualquier biomolécula objetivo que da un espectro de NMR de alta resolución y el cual puede enriquecerse de manera uniforme o selectiva con 13C. Estos métodos son aplicables, por lo tanto, a cualquier biomolécula objetivo enriquecida con 13C, incluyendo lipoproteínas, fragmentos de lipoproteína, glicoproteínas, fragmentos de glicoproteína, proteínas, fragmentos de proteína, polipéptidos, ADN y ARN. La abundancia isotópica natural de 1 3C es de 1 .1 1 % . Por lo tanto, la probabilidad de que cualquier átomo de carbono dado dentro de una molécula orgánica sea 13C es normalmente de aproximadamente 0.01 1 1 . Con objeto de incrementar la resistencia de una señal de NMR que manifiesta datos relacionados con el acoplamiento rotacional entre el núcleo de un átomo de carbono de 13C y cualquier átomo de hidrógeno adyacente, es deseable incrementar el contenido natural de 13C de la rifti molécula objetivo a estudiarse. Esto se lleva a cabo al enriquecer, ya sea de manera uniforme o selectiva , f molécula objetivo con 13C. Según se utiliza a través de toda esta especificación y las reivindicaciones anexas, los términos "enriquecimiento uniforme", "enriquecerse uniformemente", "uniformemente enriquecido", "etiquetado uniforme" y "uniformemente etiquetado" significan incrementar a un valor mayor de 0.01 1 1 , por medios sintéticos, la probabilidad de que un átomo de carbono seleccionado de manera aleatoria a través de toda la molécula objetivo, sea 1 3C. Por otro lado, los términos "enriquecimiento específico", "enriquecerse específicamente", "específicamente enriquecido", "específicamente etiquetado" y "etiquetado específicamente" significan incrementa a un valor mayor de 0.01 1 1 , por medios sintéticos, la probabilidad de que los átomos de carbono en uno o más sitios específicos pre-seleccionados dentro de la molécula objetivo sean 13C. Por ejemplo, las biomoléculas expresadas mediante microorganismos genéticamente modificados, desarrollados en un medio nutriente que contiene glucosa uniformemente enriquecida con 13C, se enriquecerán de manera uniforme con 13C. Por otro lado, una proteína expresada mediante un microorganismo genéticamente modificado en un medio nutriente que contiene alanina, es decir, solamente enriquecido con 13C en la cadena lateral de metilo, se enriquecerá de manera específica con 13C en aquellos residuos de alanilo contenidos dentro de la proteína expresada . El método de la presente invención, el cual emplea enriquecimiento isotópico con 3C, es aplicable a cualquier molécula objetivo orgánica, incluyendo aquellas que contienen nitrógeno. El método también permite el análisis de moléculas objetivo en las cuales los sitios de átomo de carbono específicos se han enriquecido (por ejemplo, grupos metilo de residuos de alanilo, leucilo, isoleucilo y valinilo). Los grupos metilo tienen propiedades de relajación favorables en comparación con grupos de amida, lo cual es ventajoso cuando se aplican a biomoléculas objetivo mayores (MW > 30 kDa). Los polipéptidos y proteínas llevan a cabo muchos papeles pivotales en organismos vivientes. Los ejemplos abajo proporcionados emplean polipéptidos para ilustrar el presente método. Los polipéptidos y fragmentos de proteína comprenden clases preferidas de substancias objetivo para el método de la presente invención . Sin embargo, debe entenderse que el método de la presente invención es aplicable a cualquier otra substancia objetivo que pueda enriquecerse con 13C. La preparación de moléculas objetivo de polipéptido, enriquecidas con 3C de manera uniforme y de manera específica, ejemplificativas, se establece a continuación . Un medio para preparar cantidades adecuadas de moléculas objetivo que contienen polipéptido, enriquecidas con 13C, ya sea de manera uniforme o de manera específica, involucra la transformación de una célula huésped con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el polipéptido deseado. La proteína o fragmento de proteína de polipéptido se expresa mediante el cultivo con la línea celular transformada en un medio que contiene fuentes asimilables de 1 3C, bastante conocido en la materia . Una fuente asimilable preferida para el etiquetado uniforme con 13C es la glucosa uniformemente etiquel&da con 13C o la U-13C-glucosa, disponible en Cambridge Isotope Laboratofi¡¡|. Para el etiquetado específico de un sitio, las fuentes asimilables para e etiquetado con 13C de un polipéptido objetivo incluyen amino ácidos etiquetados de manera específica con C, comercialmente disponibles. En una modalidad alternativa para el enriquecimiento específico, las fuentes asimilables de 13C contenidas en el medio nutriente son precursores biosintéticos de amino ácidos, etiquetados con 13C. Por ejemplo, el a-aceto-butirato es el precursor biosintético de isoleucina y un a-aceto-isovalerato es el precursor biosintético tanto de la valina como de la leucina. El esquema I a continuación muestra la manera en que pueden sintetizarse los precursores biosintéticos, enriquecidos de manera específica con 13C, de leucina, isoleucina y valina. El yoduro de metilo enriquecido con 13C (H313CI), comparativamente económico, puede emplearse como la fuente de enriquecimiento isotópico para producir ácido a-aceto-butírico y ácido a-aceto-isovalérico etiquetados de manera terminal con C. El uso de un nutriente uniformemente enriquecido con 13C tal como glucosa enriquecida con 13C es un medio conveniente para la introducción de enriquecimiento con 13C en una substancia objetivo; sin embargo, es muy costoso. Además, una vasta mayoría de los sitios de carbono en los objetivos etiquetados de manera uniforme con 13C tendrá un vecino covalentemente unido que también se etiqueta con 13C, introduciendo un acoplamiento de 1 JC- 3C, lo cual puede impactar negativamente ambas propiedades de relajación de señal a ruido de sitios etiquetados con 1 3C en la biomolécula objetivo. Una ventaja particular se ¿xAát,Aí ^ ^ jj^ ^^^^^^ ^^*A MU*S* &S^á Ém logra mediante el etiquetado de sitio específico del polipéptido objetivo con C. Como se declaró arriba* esto puede llevarse a cabo al incluir amino ácidos etiquetados con 13C, comercialmente disponibles, en el medio nutriente Sin embargo, esto también es una alternativa costosa , pero puede ser deseable en algunas circunstancias cuando se requiere el etiquetado de ciertos tipos de aminoacilos en el polipéptido objetivo. Sin embargo, el método preferido de etiquetado con 13C de una molécula objetivo de polipéptido comprende el desarrollo de una línea celular genéticamente modificada en un medio nutriente que contiene precursores biosintéticos de amino ácidos etiquetados con 13C. En particular, los precursores amino ácidos preferidos que se etiquetan incluyen ácido a- aceto-butírico y ácido a-aceto-isovalérico. Los productos biosintéticos de estos precursores son leucina, isoleucina y valina , en los cuales se enriquecen con 13C los grupos de metilo de cadena lateral en particular. Debido a que los grupos metilo tienen cada uno tres átomos de hidrógeno conectados a un átomo de carbono etiquetado con 13C, las señales de NMR correspondientes son particularmente fuertes y distintivas. La secuencia sintética para el ácido a-aceto-butirico y ácido a- aceto-isovalérico etiquetados involucra la metilación del átomo de carbono terminal en ácido pirúvico con yoduro de metilo enriquecido con 13C. Normalmente, la alquilación de ácidos a-aceto, tales como piruvato, es inherentemente difícil y se acompaña por la descomposición del compuesto intermedio de enolato con la formación de numerosos productos colaterales. Sin embargo, T. Spencer et al., Tetrahedron_Letters, 1975, 3889 y D.R. Williams, et al., ibid, 1990, 5881 , han demostrado que la alquilación de la oxima correspondiente puede llevarse a cabo fácilmente y D. Enders eí al. , Angew. Chem. Int. Eng. Ed. , 1992, 618 y D. Enders et al., Synlett, 1992, 901 han demostrado que la hidrazona también se alquila fácilmente sin descomposición . En el Esquema I, el piruvato de ferf-butilo 1 se convierte en la N,N-dimetilhidrazona correspondiente 2, mediante reacción con N,N- dimetilhidrazina en éter de dietilo a temperatura ambiente. La hidrazona resultante 2 se enfría en solución de tetrahidrofurano a -78°C y se trata con bromuro de litio, seguida por diisopropilamida de litio para formar el enolato intermedio de aza-alilo. Es enolato se alquila con yoduro de metilo etiquetado con 13C para producir hidrazona 3. Un segundo curso de alquilación de 3 produce la hidrazona dimetilada etiquetada 4. El tratamiento de 3 y 4 con ácido trifluoroacético en cloruro de metiieno a 0°C disocia tanto la hidrazina como los grupos de éster para producir los a- acetoácidos etiquetados de manera terminal con 3C, correspondientes 5 y 6 (ácido 4(13C)-butírico y ácido 4-(13C)-3-(13C)-metilbutírico, respectivamente).

Esquema I Síntesis Química d Precursores Marcados í^kS ^.&m i?^t¡Msti¿ui^ Los esquemas de re§cción II, l ll y IV ilustran , respectivamente, la manera en que los a-aceto ácia^ se convierten de manera biosintética en leucina-1 3C, isoleuc?na-13C y valina-13C. En todos los Esquemas, los sitios de enriquecimiento isotópico se indican mediante asteriscos Síntesis Bioquímica «le Isoleucina Marcada 1- Dehidratasa de ácido dihidroxi Cadena Ramificada Transamínasa Acida L-Glutamato 2-Oxoglutamato 10 Isoleucina Esquema lll Síntesis Bioquímica de Leucina Marcada Acetil-CoA CoA 11 H20 Dehidra tasa de 3-lsopropilmalato a O 16 Leucina Síntesis Valina L-Valina Son muy conocidos en la materia los medios para preparar vectores de expresión que contienen secuencias polinucleótidas que codifican polipéptidos específicos y para transformar las células huésped con esos vectores. (Ver, por ejemplo, R.W. Oíd et al., "Techniques of Gene Manipularon", Blackwell Science, Londres, 1994 y tratados similares en el campo). De igual modo, también se conocen muy bien en la materia los métodos para cultivar las células transformadas a fin de expresar el polipéptido codificado y para aislar, purificar y redoblar el polipéptido. Los ejemplos presentados a continuación describen la producción , a partir de E. coli modificado, de muestras enriquecidas con 13C de la región catalítica de 81 -256 amino ácidos de la estromelisina humana y proteína de unión a FK (FKBP), y el uso de estos polipéptidos isotópicamente enriquecidos en los métodos presentes. Cuando el método se emplea para seleccionar más de un compuesto para unirse a la molécula objetivo, por ejemplo, una mezcla o una biblioteca de compuestos, y cuando surge una diferencia entre el -a ta-tHa . t*?. ,au-J a. alJM primer espectro generado a partir de la molécu la sola y aquel generado a partir de la molécula objetivo en presencia de compuesto(s), se llevan a cabo etapas adicionales para identificar cuál compuesto o compuestos específicos contenidos en la mezcla se encuentran realmente unidos a la molécula objetivo. Aquellas etapas adicionales incluyen la exposición de manera individual de la molécula objetivo enriquecida con 13C a cada compuesto de la mezcla; la generación de un espectro de correlación de NMR de 13C/1 H bi-dimensional de la molécula objetivo etiquetada que se ha expuesto de manera individual a cada compuesto; y la comparación de cada espectro con el primer espectro generado a partir de la molécula objetivo sola, a fin de determinar diferencias en cualquiera de esos espectros comparados. Las diferencias en el espectro facilitan la identificación de un compuesto que es un ligando. Los valores de desplazamiento químico de las señales particulares de 13C/1 H en los dos espectros de correlación dimensionales corresponden a locaciones específicas conocidas de agrupamiento atómicos en la molécula objetivo (por ejemplo, los átomos de carbono de un residuo amino ácido en particular en la molécula objetivo o, en el caso de un polipéptido etiquetado de manera específica, en los grupos metilo de residuos de alanilo, leucilo, isoleucilo y valinilo). El proceso de selección de esta invención permite por lo tanto no solamente la identificación de cuál(es) compuesto(s) se unen a una molécula objetivo en particular, sino también permite la determinación de los amino ácidos particulares que son afectados por la unión del compuesto a la molécula objetivo. Los valores de desplazamiento químico pueden reflejar un Ir ftÉ- ,aaa , ..*.. M.^.^l.,*, Í At . «fcA, i , cambio en la conformación de la molécula objetivo o pueden reflejar la unión del compuesto ligando en el.sitio que corresponde a esa señal en particular Además, la constante de disociación , KD, para un ligando dado y su molécula objetivo, puede determinarse mediante proceso, si se desea, mediante la generación de un primer espectro de correlación de NMR de 3C/1 H bi-dimensional de una molécula objetivo etiquetada con 13C; la exposición de la molécula objetivo etiquetada a diversas concentraciones de un ligando; la generación de espectros de correlación de NMR de 13C/1 H bi-dimensionales en cada concentración de ligando empleada; la comparación del espectro generado con el primer espectro de la molécula objetivo; y el cálculo de la constante de disociación entre la molécula objetivo y el ligando de esas diferencias mediante el uso de la Ecuación 1 : Kn = (ÍPnl-X) (ÍLnl-X) X donde [P0] es la concentración molar total de la molécula objetivo, [L0] es la concentración molar total del ligando y x es la concentración molar de las especies unidas. El valor de x se determina a partir de los datos de desplazamiento químico de NMR de acuerdo a la Ecuación 2: X — Oobservado ~ "li bre ? donde dobServado es el valor de desplazamiento químico observado, d|l re es el valor de desplazamiento químico para las especies libres y ? es la diferencia entre el valor de desplazamiento químico limitante para la saturación (dsa urac?ón) y el valor de desplazamiento químico de la molécula ^A*J**A? *? .lu*^^?.^. ^a^.,.. ,^^, **tj,».i<*MJí**??tAí*. objetivo libre de ligando unido (d|l bre) La constante de disociación se determina entonces mediante la variación de su valor hasta que se obtiene un mejor ajuste con los datos observados mediante el uso de métodos estadísticos de ajuste de curva estándares. En aquellas situaciones donde el valor de dsaturac?ón no se conoce directamente, KD y dsaturac?ón varían y losa datos resultantes se sujetan al mismo método estadístico de ajuste de curva. Una capacidad ventajosa del método de selección es su capacidad para determinar la constante de disociación de un ligando de la molécula objetivo en presencia de una segunda molécula ya unida al ligando. Esto generalmente no es posible con otros métodos que emplean los métodos analíticos "químicos en húmedo" para determinar la unión de un ligando a un substrato de molécula objetivo. El proceso para determinar la constante de disociación de un ligando puede llevarse a cabo en presencia de un segundo ligando unido. De acuerdo con lo anterior, la molécula objetivo etiquetada con 3C se une a ese segundo ligando antes de la exposición del objetivo a los compuestos de prueba. El método de selección es adicionalmente capaz de proporcionar información con respecto a la unión de un segundo o ligando subsecuente a la molécula objetivo. Este segundo ligando puede enlazarse químicamente al primer ligando unido a la molécula objetivo, proporcionando así una nueva molécula de compuesto para utilizarse al afectar la molécula objetivo. El método de selección de la presente invención comienza con la generación o adquisición de un espectro de correlación de 3C/1 H bi- dimensional de la molécula objetivo isotópicamente enriquecida Como se declaró arriba, la molécula objetivo puede ya sea enriquecerse de manera uniforme con 13C o puede enriquecerse de manera específica mediante la incorporación de grupos metilo con 13C en residuos de alanilo, leucilo, valinilo e isoleucilo. Son muy conocidos en la materia los métodos para la generación de espectros de correlación de 13C/1H bi-dimensionales. Los espectro de NMR que se registran típicamente son espectros de correlación cuántica individuales (HSQC) heteronucleares de 13C/1 H bi-dimensionales, aunque pueden utilizarse otras técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia. Debido a que normalmente se resuelven bien las señales de 13C/1 H correspondientes a la proteína, pueden monitorearse fácilmente los cambios de desplazamiento químico para pares individuales de 13C/1 H. En la figura 1 se muestra un espectro de correlación de 13C/1 H bi-dimensional representativo de un polipéptido objetivo etiquetado con 13C (FKBP). En la figura 3 se muestra un espectro de correlación de 13C/1 H bi-dimensional representativo de un FKBP enriquecido de manera específica con 13C. Después de la exposición de la molécula objetivo etiquetada con 13C a uno o más compuestos de prueba, se genera un segundo espectro de correlación de NMR de 13C/1 H bi-dimensional. El espectro se genera de la misma manera arriba establecida. Los espectros, primero y segundo, se comparan entonces para determinar si existe cualquier diferencia entre los dos espectros. Las diferencias en los dos espectros de correlación de NMR de 13C/1 H bi-dimensionales que indica la presencia de un ligando corresponde a sitios etiquetados con 13C en la molécula -lif f wM ÉÜlBr ^-" i-rrr-rü ift- *^^ - objetivo Aquellas diferencias se determinan mediante el uso de procedimientos estándares muy conocidos en la materia . La figura 2 muestra las regiones de metilo del FKBP etiquetado de manera uniforme con 13C antes (múltiples contornos delgados) y después (contornos gruesos individuales) de la adición de 2-fenilimidazol (0.12 mM). Las señales particulares en un espectro de correlación de 13C/1H bi-dimensional corresponden a átomos de carbono y protón específicos en la molécula objetivo (por ejemplo, grupos de metilo en particular de los residuos amino ácidos en la proteína). A manera de ejemplo, puede verse a partir de la figura 3 que los desplazamientos químicos observados en los espectros de correlación de 13C/1 H bi-dimensionales de FKBP expuestos a un compuesto de prueba ocurrieron en las posiciones de residuo 97 (leucina) y 55 (valina). La región de la proteína que es responsable de la unión a los compuestos individuales se identifica a partir de los pares de átomo de carbono y de protón en particular que cambian después de la adición del compuesto. EJEMPLOS Preparación 1 Preparación De Dominio Catalítico De Estromelisina Humana (SCD) Enriquecido De Manera Uniforme Con 13C El fragmento 81 -256 (SEQ ID NO: 1 ) de estromelisina (SCD) se prepara mediante la inserción de una plásmida que codifica la producción del fragmento de proteína en una cepa de E. coli y el desarrollo de la cepa bacteriana genéticamente modificada en un medio de cultivo adecuado. El fragmento de proteína se aisla del medio de cultivo, se * Attl?tU ^u*d M *??i mii * ¡¡mt*BLi?¿¡>í? ?A i purifica y subsecuentemente se utiliza en el análisis de NMR bi-dimensional de su afinidad con compuestos de prueba de acuerdo con el método de esta invención. A continuación se describen los procedimientos para los procesos de preparación . Se desarrollan fibroblastos de piel humana (ATCC No. CRL 1507) y se inducen mediante el uso del procedimiento descrito por Clark et al., Archiv. Biochem. and Biophys. 241 : 36 (1 985). El ARN total se aisla de 1 g de células mediante el uso del Equipo de Sistema de Aislamiento de ARN Total de RNAgents® (Promega Corp.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Una porción de 1 µg del ARN se desnaturaliza mediante calentamiento a 80°C durante cinco minutos y después se sujeta a PCR de transcriptasa inversa mediante el uso de un equipo de PCR de ARN GenAmp® (Applied Biosystems/Perkin-Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante. El PCR simple se lleva a cabo mediante el uso de primeras cargas de inicio (a) GAAATGAAGAGTCTTCAA (SEO ID NO: 2) y (b) GCGTCCCAGGTTCTGGAG (SEQ ID NO: 3) y treinta y cinco ciclos de 94°C, dos minutos; 45°C, dos minutos; y 72°C, tres minutos. Esto se sigue por la re-amplificación con cargas de inicio internas (c) TACCATGGCCTATCCATTGGATGGAGC (SEQ ID NO: 4) y (d) ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG (SEQ ID NO: 5) mediante el uso de treinta ciclos bajo las mismas condiciones descritas inmediatamente arriba para generar una secuencia de ADN que codifica los residuos amino ácidos 1 -256 de estromelisina humana . El fragmento de PCR se clona entonces en un vector de clonación de PCR pT7Blue® (Novagen , Inc ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La plásmida resultante se corta con Ncol y BamHI y el fragmento de estromelisina se subclona en el vector de expresión pET3d (Novagen , Inc.). Se genera una construcción de expresión de estromelisina madura que codifica residuos ammo ácidos 81 -256 más un residuo de aminoacilo de metionina de inicio a partir de la construcción de expresión de 1 -256 mediante amplificación de PCR. El fragmento de PCR resultante se clona primero en el vector pT7Blue® (NOvagen, Inc.) y después se subclona en el vector pET3d (Novagen, Inc.), mediante el uso de las instrucciones del fabricante en la manera arriba descrita, a fin de producir la plásmida pETST-83-256. Esta plásmida final es idéntica a la descritas por Qi-Zhuang et al., Biochemistry, 31 : 1 1231 (1 992) a excepción de que la presente plásmida codifica una secuencia péptida que comienza dos amino ácidos antes, en la posición 81 , en la secuencia de estromelisina humana. La plásmida pETST-83-256 se transforma en la cepa E. coli BL21 (DE3) /pl.ysS (Novagen, Inc.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante a fin de generar una cepa de expresión , BL21 (DE3) /pLysS /pETST-255-1 . Se prepara un medio de pre-cultivo mediante la disolución de 1 .698 g de NaH2PO4-7H2O, 0.45 g de KH2PO4, 0.075 g de NaCI, 0. 1 50 g de NH4CI, 0.3 g de U-13C-glucosa, 300 µl de 1 M de solución acuosa de MgSO , y 1 5 mL de solución acuosa de CaCI2 en 1 50 mi de agua desionizada. La solución resultante del medio de pre-cultivo se esteriliza y transfiere a un matraz desviador estéril de 500 mi Inmediatamente MJ.Jt ^-Jah1j|t. |||¡ . ^ir¡^a *Ai?Bm *AÍí*?zi* ??-*>'**~ ^^? ^^^jm^?^?Ass^.?í^^á^ß^á antes de la inoculación del edio de pre-cultivo con la cepa bacteriana , se agrega al contenido del matraz 1|ID mi de una solución que contiene 34 mg/ml de cloranfenicol en etanol al 1 00% y 1 .5 mi de una solución que contiene 20 mg/ml de ampicilina. El contenido del matraz se inocula entonces con 1 mi de depósito de glicerol de cepa de E. coli genéticamente modificada BL21 (DE3) /pLysS /pETST-255-1 . El contenido del matraz se agita (225 rpm) a 37°C hasta que se observa una densidad óptica de 0.65. Se prepara un medio nutriente de fermentación mediante la disolución de 1 1 3.28 g de Na2HPO4-7H2O, 30 g de KH2PO4, 5 g de NaCI y 10 mL de agente antiespuma DF-60 al 1 % en 9604 mL de agua desionizada. Esta solución se coloca en un Micro Fermentador Científico New Brunswick y se esteriliza a 121 °C durante 40 minutos. Inmediatamente antes de la inoculación del medio de fermentación , se agregan los siguientes componentes pre-esterilizados al contenido del recipiente de fermentación: 100 mi de una solución acuosa al 100% de NH4CI, 1 5 g de glucosa enriquecida de manera uniforme con 13C, 20 mi de 1 M de solución acuosa de MgSO4, 1 mi de 1 M de solución acuosa de CaCI2, 5 mi de una solución acuosa de hidrocloruro de tiamina (1 0 mg/ml), 10 mi de una solución que contiene 34 mg/ml de cloranfenicol en etanol al 100% y 1 .9 g de ampicilina disuelta en la solución de cloranfenicol. El pH de la solución resultante se ajusta a pH 7.00 mediante la adición de una solución acuosa de 4N de H2SO4. El pre-cultivo de la cepa de E. coli BL21 (DE3) /pLysS / pETST- 255-1 del procedimiento a escala de agitación del matraz arriba descrito se agrega al contenido del fermentador y se permite proceder el desarrollo celular hasta que se logra una densidad óptica de 0.48. Durante este proceso, el contenido del fermentador se mantiene automáticamente a un pH 7.0 mediante la adición de 4N de H2SO4 o 4N de KOH, según sea necesario. El contenido de oxígeno disuelto del contenido del fermentador se mantiene por encima de una saturación al 55% de aire a través de un ciclo en cascada cuya velocidad de agitación se incrementa cuando el contenido de oxígeno disuelto cae por debajo de 55%. Se alimenta aire al contenido del fermentador a 7 litros estándar por minuto (SLPM) y la temperatura del cultivo se mantiene a 37°C a través de todo el proceso. Las células se recolectan mediante centrifugación a 1 7,000 x g durante 1 0 minutos a 4°C y las pelotillas celulares resultantes se recolectan y almacenan a -85°C. La producción celular en húmedo es de 3.5 g/L. El análisis de las fracciones solubles e insolubles de los Usados celulares mediante electroforesis de gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sodio (SDS-PAGE) revela que aproximadamente 50% de la estromelisina se encuentra en la fase soluble. El fragmento de estromelisina preparado como se describe arriba se purifica mediante el empleo de una modificación de la técnica descrita por Ye, et al., Biochemistry, 31 : 1 1 231 (1992). Las células recolectadas se suspenden en 20 mM de regulador de Tris-HCI (pH 8.0), solución de azida de sodio que contiene 1 mM de MhCI2, 0.5 mM de ZnCI2, 25 unidades/ml de enzima de Benzonasa® (Benzon Pharma) y una mezcla inhibidora hecha de fluoruro de 4-(2-aminoetil)benzenosulfonilo ("AEBSF"), Leupeptin®, Aprotinin® y Pepstatin® (todos a concentraciones de 1 mg/ml). AEBSF, Leupeptin®, Aprotinin® y Pepstatin® se encuentran todos disponibles en American International Chemical. La mezcla resultante se agita suavemente durante una hora y después se enfría a 4°C. Las células se interrumpen sónicamente mediante el uso de un factor de utilización al 50%. El lisado resultante se centrifuga a 14,000 rpm durante 30 minutos y la pelotilla de la fracción insoluble se congela a -80°C para su procesamiento subsecuente. Se agrega sulfato de amoniaco de sodio al sobrenadante hasta el punto de 20% de saturación y la solución resultante se carga en una columna de flujo rápido de 700 mi de Sefarosa de fenilo ("Q-Sepharose FF) (Pharmacia Biotech.). Antes de la carga, la columna de Sepharose se equilibra con 50 mM de regulador de Tris-HCI (pH 7.6 a 4°C), 5 mM de CaCI2 y 1 M de (NH4)2SO4. La columna cargada se leviga con una gradiente lineal de concentraciones decrecientes de (NH )2SO4 acuoso (desde 5 mM hasta 20 mM) en regulador de Tris-HCI a pH 7.6. las fracciones activas de levigado se recolectan y concentran en una célula agitada Amicon (Amicon, Inc.). La muestra concentrada se dializa durante la noche en el regulador de inicio utilizado con la columna de Q-Sepharose FF, 50 mM de Tris-HCI (pH 8.2 a 4°C) con 1 0 mM de CaCI2. La muestra dializada se carga entonces en la columna de Q-Sepharose FF y se leviga con una gradiente lineal que comprende el regulador de inicio y 200 nM de NaCl. La fracción soluble purificada del fragmento de estromelisina se concentra y almacena a 4°C. La pelotilla se solubiliza en 8M de guanidina-HCI. La solución se centrifuga durante 20 minutos a 20,000 rpm y el sobrenadante se agrega gota a gota a un regulador de repliegue que comprende 50 mM de Tris-HCI (pH 7.6), 10 mM ^^.¿ ......^^^.^..^ .» -...„». ,-a,.. de CaCI2, 0.5 mM de ZnCI2 y el cocktail inhibidor de AEBSF, Leupeptin®, Aprotinin® y Pepstatin® (todos a concentraciones de 1 µg/ml). El volumen del regulador de repliegue es diez- veces el del sobrenadante. La mezcla de sobrenadante y regulador de repliegue se centrifuga a 20,000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante de esta centrifugación se almacena a 4°C y la pelotilla se sujeta dos veces a las etapas arriba descritas de solubilización en guanidina-HCI, repliegue en regulador y centrifugación.

Los sobrenadantes finales de >cada una de las tres centrifugaciones se combinan y se agrega sulfato de amoniaco sólido al punto de 20% de saturación. La solución resultante derivada así de la fracción insoluble se sujeta a purificación en Sepharose de fenilo y Q-Sepharose como se describe arriba para la fracción soluble. Las fracciones solubles e insolubles purificadas se combinan para producir aproximadamente 1 .8 mg de fragmento 81 -256 de estromelisina purificada (SCD) por gramo de pasta celular original, uniformemente enriquecida con 13C. Preparación 2 Preparación De Dominio Catalítico Específicamente Enriquecido Con 13C De Estromelisina Humana (SCD) La SCD se expresa mediante el cultivo de cepa de E. coli modificada BL21 (DE3) /pLysS / pETST-255-1 en un medio que comprende ácido a-acetobutírico y a-acetoisovalérico enriquecidos con 13C. Los métodos utilizados para la preparación de la cepa genéticamente diseñada de E. coli y para expresar aislamiento y purificar el fragmento de proteína, son como se describe arriba, excepto para el uso de U-12C-glucosa en lugar de U-13C-glucosa.

Preparación 3 1 3 a Preparación De FKBP Específica y Uniformemente Enriquecido Con C A. Preparación de FKBP de Val/Leu Específicamente Enriquecido con 13C Las células transformadas cdn una plásmida que codifica FKBP humana (como se describe en Egan et al., Biochemistry 32: 1 920-1927 (1 993)) se desarrollaron en un medio de cultivo de D2O al 1 00% que contiene 15NH4CI (Isótopos de Cambridge) como la única fuente de nitrógeno (1 .0 g/L) y glucosa perdeuterizada (1 .5 g/L) como la fuente de carbono (Isótopos Cambridge). Las células se desarrollaron a 37°C y el contenido del matraz se agitó hasta que se obtuvo una densidad óptica de 1 .0. Una hora antes de la inducción, se agregaron 80 mg de L-valina-U-13C5-15N-2,3-d2 (Isótopos de Cambridge) con 1 mM de IPTG durante 12 horas. Las células se recolectaron mediante centrifugación a 17,000 x g durante 1 0 minutos a 4°C y las pelotillas celulares resultantes se suspendieron en 50 mM de regulador de fosfato (pH 7.4) que contiene 5 mM de DTT y 1 mM de PMSF y experimenta lisis mecánicamente mediante el uso de prensa Francesa . El Usado resultante se centrifugó a 25,000 rpm durante 30 minutos. El sulfato de amoniaco sólido se agregó al sobrenadante hasta el punto de 40% de saturación y se centrifugó a 18,000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se dializó en 1 0 mM de HEPES (pH 8.0) durante 1 2 horas a 4°C. La solución resultante se cargó entonces en una columna de flujo rápido de Q-Sepharose de 1 0 mL (Sigma), pre-equilibrada en el regulador de diálisis. Las fracciones se , **** * süJkátkA. recolectaron , depositaron y concentraron mediante el uso de una célula de flujo Amicon La solución se dializó entonces en 20 mM de regulador de fosfato (pH 6.5) que contiene 1 0 mM de DTT y 0.01 % de azida de sodio. B. Preparación de FKBP Val/Leu/lle Específicamente Enriquecido con 1 3C Las células transformadas con una plásmida que codifica FKBP humana (como se describe en Egan et al., Biochemistry 32: 1 920-1 927 (1 993)) se desarrollan en un medio de cultivo que contiene NH4CI como la única fuente de nitrógeno (1 0 g/L) y glucosa (1 .5 g/L) como la fuente de carbono. Las células se desarrollan a 37°C y el contenido del matraz se agita hasta que se obtiene una densidad óptica de 1 .0. una hora antes de la inducción, se agregan al medio de cultivo 1 00 mg de ácido a-acetobutírico y ácido a-aceto-isovalérico. El cultivo se induce con 1 mM de IPTG durante 1 2 horas. La expresión , aislamiento e purificación de la proteína expresada son como se describe arriba. C. Preparación de FKBP Uniformemente Enriquecido con 1 3 ,-x Las células transformadas con una plásmida que codifica FKBP humana (como se describe en Egan et al., Biochemistry 32: 1 920-1927 (1993)) se desarrollan en un medio de cultivo que contiene 15NH CI (Isótopos Cambridge) como la única fuente de nitrógeno (1 0 g/L) y glucosa uniformemente enriquecida con 3C (1 .5 g/L) como la fuente de carbono (Isótopos Cambridge) La expresión, aislamiento e purificación de la proteína expresada son como se describe arriba. Ejemplo 1 i***^..^** ****. »*>»* ?I ?.* Selección de Ligandos Mediani©.©! Uso de Espectro de Correlación de NMR de 13C/1H que Utiliza FK^^I^ifor emente Enriquecido con 13C Se preparó FKBP uniformemente enriquecido con C de acuerdo con los procedimientos arriba detallados. Las soluciones de proteína utilizadas en el ensayo de selección contuvieron el FKBP uniformemente enriquecido con 13C (0.2 mM) y azida de sodio (0.05%) en una solución regulada con fosfato de H2O/D2O (9/1 ) (20 mM, pH 6.5). Se generó un espectro de NMR de 13C/1 H a 30°C en un espectrómetro de NMR de DRX500 Bruker equipado con una sonda de triple resonancia y un cambiador de muestra Bruker. El espectro de HSQC de 13C/1 H se adquirió como 64 x 1024 puntos de complejo mediante el uso de amplitudes de 3771 Hz (13C, t.) y 8333 Hz (1H, t2). Un retraso de 1 segundo entre las exploraciones y 8 exploraciones por arrastre de inducción libre (fid) se emplearon en la recolección de datos. Todos los espectros de NMR se procesaron y analizaron en computadoras de Silicon Graphics. Se adquirió un primer espectro de correlación de NMR de "C^H bi-dimensional para la molécula objetivo de FKBP etiquetada con 13C, como se describió arriba . El objetivo de FKBP se expuso entonces a una mezcla de biblioteca de compuestos de prueba. Las soluciones en depósito de los compuestos se hicieron a 100 mM y 1 M. Además, se preparó una biblioteca de combinación que contuvo 8-10 compuestos por muestra a una concentración de 1 00 mM para cada compuesto. El pH de la solución en depósito de 1 M se ajustó con ácido acético y etanolamina a fin de que no se observara ningún cambio de pH después de una dilución al 1 /10 con una solución regulada con fosfato de 1 00 mM (pH 7.0). Es importante ajustar el pH, debido a que pequeños cambios en el pH pueden alterar los desplazamientos químicos de las biomoléculas y complicar la interpretación de los datos de NMR. Los compuestos en la biblioteca se seleccionan sobre la base del tamaño (peso molecular = 100-300) y diversidad molecular. Las moléculas en la recolección tuvieron diferentes formas (por ejemplo, anillo(s) aromático(s) plano(s), anillo(s) alifático(s) fruncido(s), alifáticos de cadena recta y ramificada con uniones individuales, dobles o triples) y diversos grupos funcionales (por ejemplo, ácidos carboxílicos, esteres, éteres, aminas, aldehidos, acetonas, y diversos anillos heterocíclicos) para maximizar la posibilidad de descubrir compuestos que interactúan con sitios de unión ampliamente diversos. Las muestras de NMR se prepararon mediante la adición de 1 .25 µl de la solución en depósito de sulfóxido de dimetilo de las mezclas de compuesto que contuvieron cada compuesto a una concentración de 100 mM a 0.5 mi de solución regulada con H2O/D2O (9/1 ) de la proteína uniformemente etiquetada con 13C. La concentración final de cada uno de los compuestos en la muestra de NMR fue de aproximadamente 0.25 mM. En el experimento de selección, se encontró que un compuesto, 2-fenilimidazol, se une a FKBP. La figura 1 muestra el espectro de correlación de 13C/1 H de FKBP uniformemente etiquetado con 13C. El espectro (128 puntos de complejo, 1 exploraciones/fid) se adquirió en una muestra de 0.1 mM de FKBP en 20 mM de fosfato (pH 6.5), 0.01 % de azida de sodio y 10% de óxido de deuterio (D2O).

A? ^t^íM^^ ^,r^.^.^.£!^*^^!?^M^s^t. *?A La figura 1 muestra un espectro de correlación de 13C/1 H de FKBP uniformemente etiquetado con 13C. El espectro (128 puntos de complejo, 4 exploraciones/fid) se adquirió en una muestra de 0. 1 mM de FKBP en 20 mM de fosfato (pH 6.5), 0.01 % de azida de sodio y 10% de óxido de deuterio (D2O). La figura 2 muestra las regiones de metilo del espectro de correlación de 13C/1H (64 puntos de complejo, 8 exploraciones/fid) de FKBP uniformemente etiquetado con 13C (0.2 mM) antes (múltiples contornos delgados) y después (contornos individuales gruesos) de la adición de 2-fenilimidazol (0.25 mM). Los cambios en los desplazamientos químicos en residuos de aminoacilo Leu97, Val55, lie56 e lie90 se indican. La figura 3 muestra el espectro de correlación de 13C/1 H (48 puntos de complejo, 8 exploraciones/fid) de FKBP selectivamente etiquetado con 13C/15H/2H en los residuos de valinilo y leucilo antes (múltiples contornos delgados) y después (contornos individuales gruesos) de la adición de 2-fenilimidazol (0.25 mM). Todas las otras condiciones son iguales a aquellas empleadas en la generación del espectro ilustrado en la Figura 1 . Se indican los residuos seleccionados que muestran cambios significativos en la unión. Nuevamente, los cambios en los valores de desplazamiento químico indican que la unión ocurre en o cerca de los residuos de Leu97 y Val55. La figura 4 muestra el espectro de correlación de 13C/1 H de FKBP selectivamente etiquetado con 13C en los residuos de alanilo antes (múltiples contornos delgados) y después (contornos individuales gruesos) de la adición de 2-fenilimidazol (0.25 mM). La sobre-posición de los ' ^**>-?a..a 3AJ*a3a** at i valores de desplazamiento químico antes (múltiples contornos ligeros) y después (contorno individual pesado) de la adición del ligando, indica que ninguno de los residuos de alanilo se involucra en la unión. La figura 5 muestra una ilustración de "modelo de adhesión" de la estructura tridimensional de FKBP. Los residuos seleccionados se enumeran para ayudar en la visualización. Los residuos de aminoacilo involucrados en el sitio de unión en la proteína se han mostrado en negritas. ÚA AAAjfet ^^^*, LISTADO OE SECUENCIAS <no> Abbott Laboratories Feeik, S . W. H jduk, P . J . <120> USO DE 13C-NMR PARA DETECTAR UNIÓN <130> 5816.ss -P3 <140> US 09/288,924 <141> 1999-04 -09 <150> US 09/241,184 <151> 1999-02 -01 <150> US 08/744,701 <151> 1996-10--31 <150> US 08/678,903 <151> 1996-07--12 <150> US 08/558,633 <151> 1995-11--04 <160> 5 <170> FastSEQ for Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Región Catalítica de Estromelisima Humana <400> 1 Phe Arg Thr Phe Pro Gly He Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu Thr 1 5 10 15 Tyr Arg He Val Asp Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Lys Asp Ala Val Asp 20 25 30 Ser Ala Val Glu Lys Ala Leu Lys Val Trp Glu Glu Val Thr Pro Leu 35 40 45 Thr Phe Ser Arg Leu Tyr Glu Gly Glu Ala Asp He Met He Ser Phe 50 55 60 Ala Val Arg Glu Has Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Gly Asn 65 70 75 80 Val Leu JU.a His Ala Tyr Ala Pro Gly Pro Gly He Asn Gly Asp Ala 85 90 95 His Phe Asp Asp Asp Glu Gln Trp Thr Lys Asp Thr Thr Gly Thr Asn 100 105 110 Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu He Gly His Ser Leu Gly Leu Phe 115 120 125 iSmtefcal. -~ff- H?**l*?.l His Ser Ala Asn Thr Glu Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr His Ser Leu 130 135 140 Thr Asp Leu Thr Arg Phe Arg Leu Ser Gln Asp Asp He Asn Gly He 145 150 155 160 Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Pro Pro A=p Ser Pro Glu Thr Pro 165 170 <210> 2 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223 > Carga de Inicio <400> 2 gaaatgaaga gtcttcaa 18 <210=> 3 <211> 18 <212> ADN <213 > Secuencia Artificial <220> <223> Carga de Inicio <400> 3 gcgtcccagg ttctggag 18 <210> 4 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Carga de Inicio <400> 4 taccatggcc tatccattgg atggagc 27 <210> 5 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Carga de Inicio <400> 5 ataggatcct taggtctcag gggagtcagg 30 tS^^j^m^AAMá^^A^^^^^^A^^^.,^^^ * *«.,

Claims (1)

1. -M* REIVINDICACIONES 1 . Un método para detectar la unión entre un ligando putativo y una molécula objetivo, pre-seleccionada, enriquecida con 1 C, caracterizado porque comprende: a) generar un primer espectro de correlación de NMR de 13C/ H bi-dimensional de dicha molécula objetivo; b) formar una mezcla dicha molécula objetivo con al menos un compuesto ligando putativo; c) generar un segundo espectro de correlación de NMR de 13C/1 H bi-dimensional de la mezcla de la etapa (b); y d) comparar los espectros, primero y segundo. 2. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha molécula objetivo se selecciona a partir del grupo que consiste en lipoproteínas, fragmentos de lipoproteína, glicoproteínas, fragmentos de glicoproteína, proteínas, fragmentos de proteína, polipéptidos, ADN y ARN. 3. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha molécula objetivo se selecciona a partir del grupo que consiste en proteínas, fragmentos de proteína y polipéptidos. 4. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha molécula objetivo se prepara mediante el cultivo de una línea celular transformada que contiene un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica dicha molécula objetivo en un medio que contiene fuentes asimilables de 13C. 5. El método según la reivindicación 4, caracterizado porque dichas fuentes asimilables de 13C se enriquecen de manera uniforme con 13C. 6. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque la glucosa etiquetada de manera uniforme con 13C (U-13C-glucosa) se emplea para producir dichas fuentes asimilables de 13C. 7. El método según la reivindicación 4, caracterizado porque dichas fuentes asimilables de 13C se enriquecen de manera específica con 13C. 8. El método según la reivindicación 7, caracterizado porque el yoduro de metilo enriquecido con 13C se emplea para producir dichas fuentes asimilables de 13C. 9. El método según la reivindicación 7, caracterizado porque dichas fuentes asimilables de 13C son amino ácidos y sales de los mismos. 10. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho amino ácido se selecciona a partir del grupo que consiste en alanina , leucina, isoleucina y valina. 1 1 . El método según la reivindicación 8, caracterizado porque dichas fuentes asimilables de 13C son precursores biosintéticos de amino ácidos y sales de los mismos. 12. El método según la reivindicación 1 1 , caracterizado porque dichos precursores biosintéticos de amino ácidos se seleccionan a partir del grupo que consiste en ácido 4(13C)-butírico y ácido 4-(13C)-3-(13C)-metilbutírico. 1 3. Un método para seleccionar una mezcla de compuestos ... „**»* ~a*L*ai~e» * *~ «t?,i¡ para unirse a una molécula objetivo pre-seleccionada, enriquecida con C, caracterizado porque comprende: a) generar un primer espectro de correlación de NMR de 13C/1 H bi-dimensional de dicha molécula objetivo; b) contactar dicha molécula objetivo con dicha mezcla de compuestos; c) generar un segundo espectro de correlación de NMR de 13C/1H bi-dimensional de la mezcla de la etapa (b); y d) comparar los espectros, primero y segundo. 14. El método según la reivindicación 1 3, caracterizado porque dicho método comprende adicionalmente: e) exponer dicha molécula objetivo de manera individual a cada compuesto en dicha mezcla cuando la etapa d) revele diferencias en los espectros, primero y segundo; f) generar un espectro de correlación de NMR de 13C/1 H bi-dimensional de dicha molécula objetivo que se ha expuesto a cada compuesto; y g) comparar cada espectro generado en la etapa f) con el primer espectro generado a partir de la molécula objetivo sola. 1 5. El método según la reivindicación 14, caracterizado porque dicha molécula objetivo se selecciona a partir del grupo q ue consiste en lipoproteínas, fragmentos de lipoproteína, glicoproteínas, fragmentos de glicoproteína, proteínas, fragmentos de proteína, polipéptidos, ADN y ARN . 16. El método según la reivindicación 1 5, caracterizado ^¡¿ j^^ jü&i porque dicha molécula objetivo se selecciona a partir de proteínas, fragmentos de proteína y polipéptidos. 1 7. El método según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha molécula objetivo se enriquece de manera uniforme con 1 C. 1 8. El método según la reivindicación 1 3, caracterizado porque dicha molécula objetivo se enriquece de manera específica con 13C. 1 9. Un método para determinar la constante de disociación para un ligando que se une a una molécula objetivo enriquecida con 13-C pre-seleccionada, caracterizado porque comprende: a) generar un primer espectro de correlación de NMR de 13C/1H bi-dimensional de dicha molécula objetivo; b) exponer dicha molécula objetivo a diversas concentraciones de dicho ligando; c) generar un espectro de correlación de NMR de 13C/1H bi- dimensional en cada concentración de ligando de la etapa b); y d) comparar cada espectro de la etapa (c) con dicho primer espectro de la etapa (a); y e) calcular la constante de disociación. 20. El método según la reivindicación 1 9, caracterizado porque dicha molécula objetivo se selecciona a partir del grupo que consiste en lipoproteínas, fragmentos de lipoproteína, glicoproteínas, fragmentos de glicoproteína, proteínas, fragmentos de proteína, polipéptidos, ADN y ARN. 21 . El método según la reivindicación 20, caracterizado porque dicha molécula objetivo se selecciona a partir de proteínas, fragmentos de proteína y polipéptidos. 22. El método según la reivindicación 20, caracterizado porque dicha molécula objetivo se enriquece de manera uniforme con 1 C. 23. El método según la reivindicación 20, caracterizado porque dicha molécula objetivo se enriquece de manera uniforme con 13C. 24. Un compuesto identificado mediante el método de selección según la reivindicación 1 3. 25. Un método para determinar los residuos amino ácidos específicos en una molécula objetivo pre-seleccionada, enriquecida con 13C, afectada por la unión de un ligando a dicha molécula objetivo, caracterizado porque comprende: a) generar un primer espectro de correlación de NMR de 13C/1H bi-dimensional de dicha molécula objetivo, caracterizado porque dichos valores de desplazamiento químico de las señales de 13C/ H en dicho espectro de correlación bidimensional corresponden a al menos una ubicación específica conocida de agrupamientos atómicos en dicha molécula objetivo; b) formar una mezcla de dicha molécula con un compuesto ligando conocido; c) generar un segundo espectro de correlación de NMR de 13C/1H bi-dimensional de la mezcla de la etapa (b); y d) comparar los espectros, primero y segundo