JP3032301B2 - 生体分子の標的用リガンドを同定するための核磁気共鳴の使用 - Google Patents
生体分子の標的用リガンドを同定するための核磁気共鳴の使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、標的生体分子に結合するリガンドを同定及
び設計するために、２次元15N/1H NMR相関スペクトル
分析を用いて生物活性について化合物をスクリーニング
する方法及び結合または解離定数を測定する方法に関す
る。
び設計するために、２次元15N/1H NMR相関スペクトル
分析を用いて生物活性について化合物をスクリーニング
する方法及び結合または解離定数を測定する方法に関す
る。
発明の背景 新規リード薬物を発見するための最も有力な方法のひ
とつは、合成化学物質及び天然物のデータベースを無作
為にスクリーニングして特定の標的物質に結合する化合
物を発見する方法（即ち、前記標的のリガンドの同定）
である。この方法を用いて、標的分子と物理的結合を形
成する能力または標的分子の機能を変更する能力に基づ
いてリガンドを同定することができる。
とつは、合成化学物質及び天然物のデータベースを無作
為にスクリーニングして特定の標的物質に結合する化合
物を発見する方法（即ち、前記標的のリガンドの同定）
である。この方法を用いて、標的分子と物理的結合を形
成する能力または標的分子の機能を変更する能力に基づ
いてリガンドを同定することができる。
物理的結合を求めている場合には、典型的には標的物
質をリガンドであろうと推測される１つまたはそれ以上
の化合物に作用させ、標的物質と前記した１つまたはそ
れ以上の化合物との間で複合体が形成されるかどうか調
べるべくアッセイが行われる。前記アッセイでは、当業
界では公知のように、複合体形成の指標となる標的分子
の概略的変化（例えば、サイズ、電荷及び移動度の変
化）を試験する。
質をリガンドであろうと推測される１つまたはそれ以上
の化合物に作用させ、標的物質と前記した１つまたはそ
れ以上の化合物との間で複合体が形成されるかどうか調
べるべくアッセイが行われる。前記アッセイでは、当業
界では公知のように、複合体形成の指標となる標的分子
の概略的変化（例えば、サイズ、電荷及び移動度の変
化）を試験する。
機能的変化を調べる場合には、標的分子に関連する生
物学的もしくは化学的事象（例えば、酵素触媒反応、受
容体媒介の酵素活性化）を測定することができるアッセ
イ条件を確立する。変化を確認するためには、標的分子
を試験化合物に作用させる前及びその後に標的分子の機
能を調べる。
物学的もしくは化学的事象（例えば、酵素触媒反応、受
容体媒介の酵素活性化）を測定することができるアッセ
イ条件を確立する。変化を確認するためには、標的分子
を試験化合物に作用させる前及びその後に標的分子の機
能を調べる。
既存の物理的及び機能的アッセイは、治療用化合物を
設計するために使用される新規リード薬物を同定するた
めに首尾良く使用されてきた。しかしながら、これらの
アッセイには正確さ、信頼性及び効率を妥協せざるを得
ない固有の限界がある。
設計するために使用される新規リード薬物を同定するた
めに首尾良く使用されてきた。しかしながら、これらの
アッセイには正確さ、信頼性及び効率を妥協せざるを得
ない固有の限界がある。
既存のアッセイの重大な欠点は、「偽陽性」の問題で
ある。典型的な機能的アッセイでは、「偽陽性」は、ア
ッセイを誘発するが所望の生理学的応答を引き出すのに
は有効でない化合物で生ずる。典型的な物理的アッセイ
では、例えば標的に結合するものの非特異的に結合する
（例えば、非特異的結合）化合物で生ずる。偽陽性は、
想定リガンドをより高濃度でスクリーニングしたときに
特に生じやすい問題である。なぜならば、多くの化合物
は前記高濃度では非特異的な影響を受けるからである。
ある。典型的な機能的アッセイでは、「偽陽性」は、ア
ッセイを誘発するが所望の生理学的応答を引き出すのに
は有効でない化合物で生ずる。典型的な物理的アッセイ
では、例えば標的に結合するものの非特異的に結合する
（例えば、非特異的結合）化合物で生ずる。偽陽性は、
想定リガンドをより高濃度でスクリーニングしたときに
特に生じやすい問題である。なぜならば、多くの化合物
は前記高濃度では非特異的な影響を受けるからである。
同様に、既存のアッセイには、実際には標的に対する
リガンドである化合物がアッセイにおいて陰性の結果を
示す「偽陰性」の問題もある。偽陰性は、典型的には、
試験化合物の標的に対する結合または解離定数に比して
余りにも高いか（毒性が生ずる）または余りにも低い濃
度の試験化合物をアッセイで使用したときに生ずる。
リガンドである化合物がアッセイにおいて陰性の結果を
示す「偽陰性」の問題もある。偽陰性は、典型的には、
試験化合物の標的に対する結合または解離定数に比して
余りにも高いか（毒性が生ずる）または余りにも低い濃
度の試験化合物をアッセイで使用したときに生ずる。
既存のアッセイの別の重大な欠点は、アッセイにより
得られる情報量に限度があることである。既存のアッセ
イは、標的分子に結合するかまたは標的分子から応答を
引き出す化合物を正確に同定できるとしても、標的分子
上の特定結合サイトに関する情報も試験化合物と標的分
子間の構造／活性関係に関する情報も提供しない。上記
した情報を提供できないことは、スクリーニングアッセ
イを更なる研究のためのリードを同定するために使用す
るときに特に問題である。
得られる情報量に限度があることである。既存のアッセ
イは、標的分子に結合するかまたは標的分子から応答を
引き出す化合物を正確に同定できるとしても、標的分子
上の特定結合サイトに関する情報も試験化合物と標的分
子間の構造／活性関係に関する情報も提供しない。上記
した情報を提供できないことは、スクリーニングアッセ
イを更なる研究のためのリードを同定するために使用す
るときに特に問題である。
最近、有機溶媒の巨大分子上の結合サイトを同定する
ためにＸ線結晶学を使用することが示唆された。しかし
ながら、この方法では標的上の異なるサイトの相対結合
アフィニティーを測定することができない。この方法
は、高濃度の有機溶媒の存在下でも変性しない非常に安
定な標的タンパク質に対して使用されるのみである。ま
た、この方法は、化学的に多種多様の化合物を迅速に試
験するためのスクリーニング方法ではなく、個々の結晶
構造を測定するのに長時間を要するためにほんの数種の
有機溶媒の結合サイトをマッピングするためにのみ使用
される。
ためにＸ線結晶学を使用することが示唆された。しかし
ながら、この方法では標的上の異なるサイトの相対結合
アフィニティーを測定することができない。この方法
は、高濃度の有機溶媒の存在下でも変性しない非常に安
定な標的タンパク質に対して使用されるのみである。ま
た、この方法は、化学的に多種多様の化合物を迅速に試
験するためのスクリーニング方法ではなく、個々の結晶
構造を測定するのに長時間を要するためにほんの数種の
有機溶媒の結合サイトをマッピングするためにのみ使用
される。
化合物は、標的生体分子の機能を変える新規薬物の設
計に使用し得るリードを同定するためにスクリーニング
にかけられる。これらの新規化合物は同定されたリード
と構造的に類似しているか、または前記リード化合物の
１つまたはそれ以上の複合体を形成し得る。既存のスク
リーニング方法には固有の諸問題があるために、既存の
方法が新規薬物の設計に殆ど役立たないことが多い。
計に使用し得るリードを同定するためにスクリーニング
にかけられる。これらの新規化合物は同定されたリード
と構造的に類似しているか、または前記リード化合物の
１つまたはそれ以上の複合体を形成し得る。既存のスク
リーニング方法には固有の諸問題があるために、既存の
方法が新規薬物の設計に殆ど役立たないことが多い。
特定の標的に対して特異的に結合するリガンドを同定
及び設計するために化合物をスクンリーニングする新し
い、迅速で、効率的で、正確且つ信頼性ある方法の提供
が常に要望されている。
及び設計するために化合物をスクンリーニングする新し
い、迅速で、効率的で、正確且つ信頼性ある方法の提供
が常に要望されている。
発明の要旨 第１に、本発明は、特定の標的分子に結合するリガン
ドを同定するために生物活性に関して化合物をスクリー
ニングする方法を提供する。本発明の方法は、 ａ）15N−標識標的分子の第１の２次元15N/1H NMR相関
スペクトルを発生させするステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を１つまたはそれ以上の化学
化合物に作用させるステップ、 ｃ）ステップｂ）で１つまたはそれ以上の化合物に作用
させた標識標的分子の第２の２次元15N/1H NMR相関ス
ペクトルを発生させるステップ、及び ｄ）第１の２次元15N/1H NMR相関スペクトルと第２の
２次元15N/1H NMR相関スペクトルを比較して第１と第
２のスペクトルの違いを調べ、その違いから標的分子に
結合したリガンドである１つまたはそれ以上の化合物の
存在を同定するステップを含む。
ドを同定するために生物活性に関して化合物をスクリー
ニングする方法を提供する。本発明の方法は、 ａ）15N−標識標的分子の第１の２次元15N/1H NMR相関
スペクトルを発生させするステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を１つまたはそれ以上の化学
化合物に作用させるステップ、 ｃ）ステップｂ）で１つまたはそれ以上の化合物に作用
させた標識標的分子の第２の２次元15N/1H NMR相関ス
ペクトルを発生させるステップ、及び ｄ）第１の２次元15N/1H NMR相関スペクトルと第２の
２次元15N/1H NMR相関スペクトルを比較して第１と第
２のスペクトルの違いを調べ、その違いから標的分子に
結合したリガンドである１つまたはそれ以上の化合物の
存在を同定するステップを含む。
本発明の方法のステップｂ）において２種以上の化合
物、すなわち化合物の混合物をスクリーニングし、標的
分子単独から発生させたスペクトルと混合物の存在下で
の標的分子から発生させたスペクトルの違いを調べる場
合には、前記混合物中に含まれるどの化合物または化合
物の組み合わせが標的分子に結合するかを同定するため
に追加のステップを実施する。これらの追加のステップ
は、 ｅ）15N−標識標的分子を前記混合物中の各化合物に個
別に作用させるステップ、 ｆ）個別に各化合物に作用させた標識標的化合物の２次
元15N/1H NMR相関スペクトルを発生させるステップ、
及び ｇ）ステップｆ）で発生させた各スペクトルと標的分子
単独から発生させた第１スペクトルを比較して第１スペ
クトルと各化合物のスペクトルの違いを調べ、その違い
から標的分子に結合したリガンドである化合物の存在を
同定するステップを含む。
物、すなわち化合物の混合物をスクリーニングし、標的
分子単独から発生させたスペクトルと混合物の存在下で
の標的分子から発生させたスペクトルの違いを調べる場
合には、前記混合物中に含まれるどの化合物または化合
物の組み合わせが標的分子に結合するかを同定するため
に追加のステップを実施する。これらの追加のステップ
は、 ｅ）15N−標識標的分子を前記混合物中の各化合物に個
別に作用させるステップ、 ｆ）個別に各化合物に作用させた標識標的化合物の２次
元15N/1H NMR相関スペクトルを発生させるステップ、
及び ｇ）ステップｆ）で発生させた各スペクトルと標的分子
単独から発生させた第１スペクトルを比較して第１スペ
クトルと各化合物のスペクトルの違いを調べ、その違い
から標的分子に結合したリガンドである化合物の存在を
同定するステップを含む。
２次元相関スペクトルにおける特定の15N/1Hシグナル
の化学シフト値は標的分子中の原子団（例えば、アミド
のＮ−Ｈ原子、またはポリペプチド中の特定のアミノ酸
残基のペプチド結合）の既知の特定位置に対応している
ので、本発明の方法によりどの化合物が特定の標的分子
に結合しているか同定することも、標的分子上のリガン
ドの特定結合サイトを決定することもできる。
の化学シフト値は標的分子中の原子団（例えば、アミド
のＮ−Ｈ原子、またはポリペプチド中の特定のアミノ酸
残基のペプチド結合）の既知の特定位置に対応している
ので、本発明の方法によりどの化合物が特定の標的分子
に結合しているか同定することも、標的分子上のリガン
ドの特定結合サイトを決定することもできる。
第２に、本発明は、所与のリガンド及びその標的分子
の解離定数KDを測定する方法を提供する。この方法は、 ａ）15N−標識標的分子の第１の２次元15N/1H NMR相関
スペクトルを発生させるステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を濃度の異なるリガンドに作
用させるステップ、 ｃ）ステップｂ）の各濃度のリガンドにおいて２次元15
N/1H NMR相関スペクトルを発生させるステップ、 ｄ）ステップｃ）で発生させた各スペントルをステップ
ａ）で発生させた第１スペクトルと比較するステップ、
及び ｅ）その違いから、式 に従って標的分子とリガンド間の解離定数を算出するス
テップを含む。
の解離定数KDを測定する方法を提供する。この方法は、 ａ）15N−標識標的分子の第１の２次元15N/1H NMR相関
スペクトルを発生させるステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を濃度の異なるリガンドに作
用させるステップ、 ｃ）ステップｂ）の各濃度のリガンドにおいて２次元15
N/1H NMR相関スペクトルを発生させるステップ、 ｄ）ステップｃ）で発生させた各スペントルをステップ
ａ）で発生させた第１スペクトルと比較するステップ、
及び ｅ）その違いから、式 に従って標的分子とリガンド間の解離定数を算出するス
テップを含む。
本発明の利点は、本発明の方法により、すでにリガン
ドに結合している第２分子の存在下で標的分子と１つの
リガンド間の解離定数を測定することができることであ
る。このことは、リガンドの標的分子基質への結合を測
定する「ウエットケミカル」分析法を用いる従来方法で
は通常不可能である。
ドに結合している第２分子の存在下で標的分子と１つの
リガンド間の解離定数を測定することができることであ
る。このことは、リガンドの標的分子基質への結合を測
定する「ウエットケミカル」分析法を用いる従来方法で
は通常不可能である。
この好ましい実施態様では、リガンドの解離定数を測
定する方法は第２の結合リガンドの存在下で実施され得
る。この実施態様によれば、15N標識標的物質は、標的
が試験化合物に作用する前に第２リガンドに結合してい
る。
定する方法は第２の結合リガンドの存在下で実施され得
る。この実施態様によれば、15N標識標的物質は、標的
が試験化合物に作用する前に第２リガンドに結合してい
る。
本発明の方法によれば１つのリガンドと標的分子間の
結合の存在も第２の結合リガンドの存在下での特定の結
合サイトも調べることができるので、リガンドから構成
される２つ以上の結合部分を含む薬物を本発明の方法に
より設計することができる。
結合の存在も第２の結合リガンドの存在下での特定の結
合サイトも調べることができるので、リガンドから構成
される２つ以上の結合部分を含む薬物を本発明の方法に
より設計することができる。
本発明の方法は、標的分子に結合する第１及び次のリ
ガンドを同定するために、上記した２次元15N/1H NMR
相関スペクトルによるスクリーニング方法を使用する。
標的分子と２個以上のリガンドの複合体を形成し、この
複合体の３次元構造を好ましくはNMR分光分析法及びＸ
線結晶学を用いて測定する。３次元構造は、リガンドの
他のリガンドに対する及び標的分子に対する立体配向を
調べるために使用される。
ガンドを同定するために、上記した２次元15N/1H NMR
相関スペクトルによるスクリーニング方法を使用する。
標的分子と２個以上のリガンドの複合体を形成し、この
複合体の３次元構造を好ましくはNMR分光分析法及びＸ
線結晶学を用いて測定する。３次元構造は、リガンドの
他のリガンドに対する及び標的分子に対する立体配向を
調べるために使用される。
立体配向に基づいて、リガンドを相互に結合して薬物
を形成する。有機化学分野で公知の結合角及び結合長の
情報の原理に基づいてリガンドの立体配向を別のリガン
ド及び標的分子に対して維持することにより、適切な結
合基を選択する。
を形成する。有機化学分野で公知の結合角及び結合長の
情報の原理に基づいてリガンドの立体配向を別のリガン
ド及び標的分子に対して維持することにより、適切な結
合基を選択する。
従って、分子設計方法は、標的分子に対する第１のリ
ガンド部分を２次元15N/1H NMR相関分光分析法を用い
て同定し、標的分子に対する次のリガンド部分を２次元
15N/1H NMR相関分光分析法を用いて同定し、標的分子
に対して第１及び次のリガンド部分の複合体を形成し、
前記複合体の３次元構造、よって標的分子上の第１及び
次のリガンド部分の立体配向を調べ、リガンド部分の立
体配向を維持すべく第１及び次のリガンド部分を結合し
て薬物を形成することからなる。
ガンド部分を２次元15N/1H NMR相関分光分析法を用い
て同定し、標的分子に対する次のリガンド部分を２次元
15N/1H NMR相関分光分析法を用いて同定し、標的分子
に対して第１及び次のリガンド部分の複合体を形成し、
前記複合体の３次元構造、よって標的分子上の第１及び
次のリガンド部分の立体配向を調べ、リガンド部分の立
体配向を維持すべく第１及び次のリガンド部分を結合し
て薬物を形成することからなる。
次のリガンド部分の同定は、第１リガンドの存在また
は不在下で実施され得る（例えば、第２リガンドを同定
するために、標的分子は試験化合物に作用させる前に第
１リガンドに結合され得る）。
は不在下で実施され得る（例えば、第２リガンドを同定
するために、標的分子は試験化合物に作用させる前に第
１リガンドに結合され得る）。
好ましい実施態様では、スクリーニング方法または設
計方法において使用される標的分子はポリペプチドであ
る。ポリペプチドは好ましくは、ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質
転換された宿主細胞を、組換え産生されたポリペプチド
が15Nで標識されるように15Nの同化可能源を含む培地中
で培養することにより、該宿主細胞から組換え型で産生
される。
計方法において使用される標的分子はポリペプチドであ
る。ポリペプチドは好ましくは、ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質
転換された宿主細胞を、組換え産生されたポリペプチド
が15Nで標識されるように15Nの同化可能源を含む培地中
で培養することにより、該宿主細胞から組換え型で産生
される。
図面の簡単な説明 本明細書の一部をなす図面において、 図１は、均一に15N−標識されたヒトパピローマウィ
ルスE2のDNA結合ドメインの15N/1H相関スペクトルを示
す。スペクトル（80複合ポイント（complex point
s）、４スキャン/fid）は、20mMホスフェート（pH6.
5）、10mMジチオトレイトール（DTT）及び10％酸化ジュ
ウテリウム（D2O）中に0.5mMのE2を含むサンプルで得た
ものである。
ルスE2のDNA結合ドメインの15N/1H相関スペクトルを示
す。スペクトル（80複合ポイント（complex point
s）、４スキャン/fid）は、20mMホスフェート（pH6.
5）、10mMジチオトレイトール（DTT）及び10％酸化ジュ
ウテリウム（D2O）中に0.5mMのE2を含むサンプルで得た
ものである。
図２は、最終試験化合物を添加前（薄い複数の等高
線）及び添加後（濃い単一等高線）の、均一に15N−標
識されたヒトパピローマウィルスE2のDNA結合ドメイン
の15N/1H相関スペクトルを示す。化合物の最終濃度は1.
0mMであった。他の条件はすべて図１に記載の通りであ
る。結合時に有意な変化を示す特定残基を図示する。
線）及び添加後（濃い単一等高線）の、均一に15N−標
識されたヒトパピローマウィルスE2のDNA結合ドメイン
の15N/1H相関スペクトルを示す。化合物の最終濃度は1.
0mMであった。他の条件はすべて図１に記載の通りであ
る。結合時に有意な変化を示す特定残基を図示する。
図３は、第２の試験化合物を添加前（薄い複数の等高
線）及び添加後（濃い単一等高線）の、均一に15N−標
識されたヒトパピローマウィルスE2のDNA結合ドメイン
の15N/1H相関スペクトルを示す。化合物の最終濃度は1.
0mMであった。他の条件はすべて図１に記載の通りであ
る。結合時に有意な変化を示す特定残基を図示する。
線）及び添加後（濃い単一等高線）の、均一に15N−標
識されたヒトパピローマウィルスE2のDNA結合ドメイン
の15N/1H相関スペクトルを示す。化合物の最終濃度は1.
0mMであった。他の条件はすべて図１に記載の通りであ
る。結合時に有意な変化を示す特定残基を図示する。
図４は、試験化合物を添加前（薄い複数の等高線）及
び添加後（濃い単一等高線）の、均一に15N−標識され
たストロメライシンの触媒ドメインの15N/1H相関スペク
トルを示す。化合物の最終濃度は1.0mMであった。スペ
クトル（80複合ポイント、８スキャン/fid）は、20mMTR
IS（pH7.0）、20mMCaCl2及び10％D2O中に0.3mMのSCDを
含むサンプルで得たものである。結合時に有意な変化を
示す特定残基を図示する。
び添加後（濃い単一等高線）の、均一に15N−標識され
たストロメライシンの触媒ドメインの15N/1H相関スペク
トルを示す。化合物の最終濃度は1.0mMであった。スペ
クトル（80複合ポイント、８スキャン/fid）は、20mMTR
IS（pH7.0）、20mMCaCl2及び10％D2O中に0.3mMのSCDを
含むサンプルで得たものである。結合時に有意な変化を
示す特定残基を図示する。
図５は、試験化合物を添加前（薄い複数の等高線）及
び添加後（濃い単一等高線）の、均一に15N−標識され
たRAFペプチド（残基55−132）のRas結合ドメインの15N
/1H相関スペクトルを示す。化合物の最終濃度は1.0mMで
あった。スペクトル（80複合ポイント、８スキャン/fi
d）は、20mMホスフェート（pH7.0）、10mMDTT及び10％D
2O中に0.3mMのRAF断片を含むサンプルで得たものであ
る。結合時に有意な変化を示す特定残基を図示する。
び添加後（濃い単一等高線）の、均一に15N−標識され
たRAFペプチド（残基55−132）のRas結合ドメインの15N
/1H相関スペクトルを示す。化合物の最終濃度は1.0mMで
あった。スペクトル（80複合ポイント、８スキャン/fi
d）は、20mMホスフェート（pH7.0）、10mMDTT及び10％D
2O中に0.3mMのRAF断片を含むサンプルで得たものであ
る。結合時に有意な変化を示す特定残基を図示する。
図６は、試験化合物を添加前（薄い複数の等高線）及
び添加後（濃い単一等高線）の、均一に15N−標識され
たFKBPの15N/1H相関スペクトルを示す。化合物の最終濃
度は1.0mMであった。スペクトル（80複合ポイント、４
スキャン/fid）は、50mMホスフェート（pH6.5）、100mN
aCl及び10％D2O中に0.3mMのFKBPを含むサンプルで得た
ものである。結合時に有意な変化を示す特定残基を図示
する。
び添加後（濃い単一等高線）の、均一に15N−標識され
たFKBPの15N/1H相関スペクトルを示す。化合物の最終濃
度は1.0mMであった。スペクトル（80複合ポイント、４
スキャン/fid）は、50mMホスフェート（pH6.5）、100mN
aCl及び10％D2O中に0.3mMのFKBPを含むサンプルで得た
ものである。結合時に有意な変化を示す特定残基を図示
する。
図７は、E2のDNA結合ドメインのNMR誘導構造の第１描
写を示す。対称ダイマーの２つのモノマーは頭−尾様式
で配向しており、各モノマーのＮ−及びＣ−末端（１つ
のモノマーについてはＮ及びＣ、他方のモノマーについ
てはＮ＊及びＣ＊）を図示する。リボンには、第１の試
験化合物に結合したときに有意な化学シフト変化（Δδ
（1H）＞0.04ppm、Δδ（15N）＞0.1ppm）を示す残基を
示す。これらの残基はE2のDNA認識へリックスに対応す
る。わかりやすくするために特定残基に番号を付した。
写を示す。対称ダイマーの２つのモノマーは頭−尾様式
で配向しており、各モノマーのＮ−及びＣ−末端（１つ
のモノマーについてはＮ及びＣ、他方のモノマーについ
てはＮ＊及びＣ＊）を図示する。リボンには、第１の試
験化合物に結合したときに有意な化学シフト変化（Δδ
（1H）＞0.04ppm、Δδ（15N）＞0.1ppm）を示す残基を
示す。これらの残基はE2のDNA認識へリックスに対応す
る。わかりやすくするために特定残基に番号を付した。
図８は、E2のDNA結合ドメインのNMR誘導構造の第２描
写を示す。対称ダイマーの２つのモノマーは頭−尾様式
で配向しており、各モノマーのＮ−及びＣ−末端（１つ
のモノマーについてはＮ及びＣ、他方のモノマーについ
てはＮ＊及びＣ＊）を図示する。リボンには、第２の試
験化合物に結合したときに有意な化学シフト変化（Δδ
（1H）＞0.04ppm、Δδ（15N）＞0.1ppm）を示す残基を
示す。これらの残基は主にダイマー界面領域に位置す
る。わかりやすくするために特定残基に番号を付した。
写を示す。対称ダイマーの２つのモノマーは頭−尾様式
で配向しており、各モノマーのＮ−及びＣ−末端（１つ
のモノマーについてはＮ及びＣ、他方のモノマーについ
てはＮ＊及びＣ＊）を図示する。リボンには、第２の試
験化合物に結合したときに有意な化学シフト変化（Δδ
（1H）＞0.04ppm、Δδ（15N）＞0.1ppm）を示す残基を
示す。これらの残基は主にダイマー界面領域に位置す
る。わかりやすくするために特定残基に番号を付した。
図９は、ストロメライシンの触媒ドメインのNMR誘導
構造の描写を示す。Ｎ−及びＣ−末端を図示する。リボ
ンには、試験化合物に結合したときに有意な化学シフト
変化（Δδ（1H）＞0.04ppm、Δδ（15N）＞0.1ppm）を
示す残基を示す。これらの残基はS1′結合サイトの一部
を形成するか、または空間的にこのサイトに近接してい
る。わかりやすくするために特定残基に番号を付した。
構造の描写を示す。Ｎ−及びＣ−末端を図示する。リボ
ンには、試験化合物に結合したときに有意な化学シフト
変化（Δδ（1H）＞0.04ppm、Δδ（15N）＞0.1ppm）を
示す残基を示す。これらの残基はS1′結合サイトの一部
を形成するか、または空間的にこのサイトに近接してい
る。わかりやすくするために特定残基に番号を付した。
図10は、ストロメライシンの作用ドメインに結合した
第１及び第２リガンドの３元複合体のリボンプロットを
示す。
第１及び第２リガンドの３元複合体のリボンプロットを
示す。
発明の詳細な説明 本発明は、治療目的の標的分子に結合するリガンドを
同定するための迅速且つ効率的なスクリーニング方法を
提供する。
同定するための迅速且つ効率的なスクリーニング方法を
提供する。
リガンドは、核磁気共鳴（NMR）分光分析法を用いて
データベース中のリガンド化合物を添加したときの標的
分子の化学シフトの変化を追跡して、標的分子（例え
ば、タンパク質、核酸等）に対する分子の結合を試験す
ることにより同定される。
データベース中のリガンド化合物を添加したときの標的
分子の化学シフトの変化を追跡して、標的分子（例え
ば、タンパク質、核酸等）に対する分子の結合を試験す
ることにより同定される。
標的分子の化学シフトの変化をリガンド濃度の関数と
して分析すると、リガンドの生体分子に対する結合アフ
ィニティーも測定される。
して分析すると、リガンドの生体分子に対する結合アフ
ィニティーも測定される。
各リガンドに対する結合サイトの位置は、リガンドを
添加したときに変化する生体分子の化学シフトの分析と
リガンドと生体分子間の核オーバーハウザー効果（NO
E）から決定される。
添加したときに変化する生体分子の化学シフトの分析と
リガンドと生体分子間の核オーバーハウザー効果（NO
E）から決定される。
上記した方法により同定されるリガンド間の構造／活
性の関係についての情報を利用して、標的分子に対する
リガンドとして使用される新規薬物を設計することがで
きる。例えば、所与の標的分子に対して２つ以上のリガ
ンドが同定された場合、これらのリガンドと標的分子と
の複合体が形成される。リガンドの他のリガンドに対す
る及び標的分子に対する立体配向は３次元構造から誘導
される。立体配向は、２つのリガンドの結合サイト間の
距離とこれらのサイトに対する各リガンドの配向を規定
する。
性の関係についての情報を利用して、標的分子に対する
リガンドとして使用される新規薬物を設計することがで
きる。例えば、所与の標的分子に対して２つ以上のリガ
ンドが同定された場合、これらのリガンドと標的分子と
の複合体が形成される。リガンドの他のリガンドに対す
る及び標的分子に対する立体配向は３次元構造から誘導
される。立体配向は、２つのリガンドの結合サイト間の
距離とこれらのサイトに対する各リガンドの配向を規定
する。
上記した立体配向データを用いて、２つ以上のリガン
ドを相互に結合させて新規リガンドを形成する。結合
は、リガンドの他のリガンドに対する及び標的分子に対
する立体配向を維持する方法で実施される。
ドを相互に結合させて新規リガンドを形成する。結合
は、リガンドの他のリガンドに対する及び標的分子に対
する立体配向を維持する方法で実施される。
本発明のNMRをベースとする発見方法には多くの利点
がある。第１に、本発明の方法は、標的分子に対する結
合を直接調べることによりリガンドを同定するので、偽
陽性の問題が有意に減少する。本発明の方法は標的分子
に対する特定結合サイトを同定するので、化合物が高濃
度の標的分子に非特異的に結合するために生ずる偽陽性
の問題が解消される。
がある。第１に、本発明の方法は、標的分子に対する結
合を直接調べることによりリガンドを同定するので、偽
陽性の問題が有意に減少する。本発明の方法は標的分子
に対する特定結合サイトを同定するので、化合物が高濃
度の標的分子に非特異的に結合するために生ずる偽陽性
の問題が解消される。
第２に、本発明の方法は広範囲の解離定数で標的分子
に特異的に結合する化合物を同定できるので、偽陰性の
問題も有意に減少する。化合物に対する解離または結合
定数は本発明の方法により測定することができる。
に特異的に結合する化合物を同定できるので、偽陰性の
問題も有意に減少する。化合物に対する解離または結合
定数は本発明の方法により測定することができる。
本発明の他の利点は、本発明の発見方法から提供され
る各リガンドに関するデータが豊富でありかつ詳細であ
ることに起因する。
る各リガンドに関するデータが豊富でありかつ詳細であ
ることに起因する。
結合したリガンドの位置がリガンドを添加したときに
変化する標的分子の化学シフトの分析及びリガンドと生
体分子間の核オーバーハウザー効果から決定され得るの
で、ターゲットに既に結合している第１リガンドの存在
下で第２リガンドの結合を測定することができる。各種
リガンドの結合サイトを同時に測定できることから、当
業者は、１）リガンド間の負または正の協同結合を規定
することができ、２）リガンドの他のリガントに対する
及び結合サイトに対する配向を適切に維持しながら２つ
以上のリガンドを結合して単一の化合物とすることによ
り、新規薬物を設計することができる。
変化する標的分子の化学シフトの分析及びリガンドと生
体分子間の核オーバーハウザー効果から決定され得るの
で、ターゲットに既に結合している第１リガンドの存在
下で第２リガンドの結合を測定することができる。各種
リガンドの結合サイトを同時に測定できることから、当
業者は、１）リガンド間の負または正の協同結合を規定
することができ、２）リガンドの他のリガントに対する
及び結合サイトに対する配向を適切に維持しながら２つ
以上のリガンドを結合して単一の化合物とすることによ
り、新規薬物を設計することができる。
更に、複数の結合サイトが存在する場合には、標的分
子の化学シフトの変化を添加したリガンドの濃度の関数
として分析することにより、各結合サイトの異なる結合
サイトに対する相対アフィニティーを測定することがで
きる。所与の化合物に構造的に類似する複数の化合物を
同時にスクリーニングすることにより、リガンドについ
ての詳細な構造／活性関係の情報を得ることができる。
子の化学シフトの変化を添加したリガンドの濃度の関数
として分析することにより、各結合サイトの異なる結合
サイトに対する相対アフィニティーを測定することがで
きる。所与の化合物に構造的に類似する複数の化合物を
同時にスクリーニングすることにより、リガンドについ
ての詳細な構造／活性関係の情報を得ることができる。
第１に、本発明は、特定の標的分子に結合するリガン
ドを同定するための化合物のスクリーニング方法を提供
する。この方法は、 ａ）15N−標識標的分子の第１の２次元15N/1H NMR相関
スペクトルを発生させするステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を１つまたはそれ以上の化合
物に作用させるステップ、 ｃ）ステップｂ）で１つまたはそれ以上の化合物に作用
させた標識標的分子の第２の２次元15N/1H NMR相関ス
ペクトルを発生させるステップ、及び ｄ）第１の２次元15N/1H NMR相関スペクトルと第２の
２次元15N/1H NMR相関スペクトルを比較して第１と第
２のスペクトルの違いを調べ、その違いから標的分子に
結合した１つまたはそれ以上のリガンドの存在を同定す
るステップを含む。
ドを同定するための化合物のスクリーニング方法を提供
する。この方法は、 ａ）15N−標識標的分子の第１の２次元15N/1H NMR相関
スペクトルを発生させするステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を１つまたはそれ以上の化合
物に作用させるステップ、 ｃ）ステップｂ）で１つまたはそれ以上の化合物に作用
させた標識標的分子の第２の２次元15N/1H NMR相関ス
ペクトルを発生させるステップ、及び ｄ）第１の２次元15N/1H NMR相関スペクトルと第２の
２次元15N/1H NMR相関スペクトルを比較して第１と第
２のスペクトルの違いを調べ、その違いから標的分子に
結合した１つまたはそれ以上のリガンドの存在を同定す
るステップを含む。
本発明の方法のステップｂ）において２種以上の化合
物をスクリーニングし、スペクトルの違いを観察する場
合には、どの化合物が標的分子に結合するかを同定する
ために追加のステップを実施する。これらの追加のステ
ップは、個別に各化合物について２次元15N/1H NMR相
関スペクトルを発生させ、各スペクトルと第１スペクト
ルを比較して、比較したスペクトル間に標的分子に結合
したリガンドの存在を示す違いがあるかどうか調べるこ
とからなる。
物をスクリーニングし、スペクトルの違いを観察する場
合には、どの化合物が標的分子に結合するかを同定する
ために追加のステップを実施する。これらの追加のステ
ップは、個別に各化合物について２次元15N/1H NMR相
関スペクトルを発生させ、各スペクトルと第１スペクト
ルを比較して、比較したスペクトル間に標的分子に結合
したリガンドの存在を示す違いがあるかどうか調べるこ
とからなる。
任意の15N−標識標的分子を本発明の方法で使用する
ことができる。医化学においてタンパク質が重要である
ので、好ましい標的分子はポリペプチドである。標的分
子は当業界で公知の手段を用いて15Nで標識され得る。
好ましい実施態様では、標的分子は形質転換された宿主
細胞を用いて形質転換型で調製され得る。特に好ましい
実施態様では、標的分子はポリペプチドである。高分解
NMRスペントルを与え且つ部分的にもしくは均一に15Nで
標識され得るポリペプチドが使用され得る。均一に15N
−標識されたポリペプチド標的分子の調製例は、実施例
に記載されている。
ことができる。医化学においてタンパク質が重要である
ので、好ましい標的分子はポリペプチドである。標的分
子は当業界で公知の手段を用いて15Nで標識され得る。
好ましい実施態様では、標的分子は形質転換された宿主
細胞を用いて形質転換型で調製され得る。特に好ましい
実施態様では、標的分子はポリペプチドである。高分解
NMRスペントルを与え且つ部分的にもしくは均一に15Nで
標識され得るポリペプチドが使用され得る。均一に15N
−標識されたポリペプチド標的分子の調製例は、実施例
に記載されている。
十分量の均一に15N−標識されたポリペプチドを調製
するための好ましい方法は、該ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて宿主細
胞を形質転換し、形質転換された細胞を15Nの同化可能
源を含む培地で培養することである。15Nの同化可能源
は当業界で公知である。好ましい源は15NH4Clである。
するための好ましい方法は、該ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて宿主細
胞を形質転換し、形質転換された細胞を15Nの同化可能
源を含む培地で培養することである。15Nの同化可能源
は当業界で公知である。好ましい源は15NH4Clである。
特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含む発現ベクターの調製方法は当業界で公知である。ま
た、宿主細胞を前記ベクターで形質転換する方法及び形
質転換された細胞を培養してポリペプチドを発現させる
方法も当業界で公知である。
含む発現ベクターの調製方法は当業界で公知である。ま
た、宿主細胞を前記ベクターで形質転換する方法及び形
質転換された細胞を培養してポリペプチドを発現させる
方法も当業界で公知である。
本発明のスクリーニング方法の第１ステップでは、標
識された標的分子の２次元15N/1H NMR相関スペクトル
を発生すなわち取得する。２次元15N/1H NMR相関スペ
クトルを発生させる方法は当業界で公知である（例え
ば、D.A.Eganら、Biochemistry,32（８）:1920−1927
（1993）、Bax,A.,Grzesiek,S.,Acc.Chem.Res.,26
（４）:131−138（1993）参照）。
識された標的分子の２次元15N/1H NMR相関スペクトル
を発生すなわち取得する。２次元15N/1H NMR相関スペ
クトルを発生させる方法は当業界で公知である（例え
ば、D.A.Eganら、Biochemistry,32（８）:1920−1927
（1993）、Bax,A.,Grzesiek,S.,Acc.Chem.Res.,26
（４）:131−138（1993）参照）。
本発明のスクリーニング方法で典型的に記録されるNM
Rスペクトルは、２次元15N/1H異核一量子相関（HSQC）
スペクトルである。タンパク質の骨格アミドに対応する
15N/1Hシグナルは通常うまく分解されるので、各アミド
の化学シフトの変化をモニターすることは容易である。
Rスペクトルは、２次元15N/1H異核一量子相関（HSQC）
スペクトルである。タンパク質の骨格アミドに対応する
15N/1Hシグナルは通常うまく分解されるので、各アミド
の化学シフトの変化をモニターすることは容易である。
上記したスペクトルを発生させるとき、大きな水シグ
ナルは勾配を妨害することにより抑制される。多数の化
合物に関するNMRデータ（例えば、合成されたまたは天
然に存在する小さな有機化合物のデータベース）の取得
を助けるために、サンプル充填機を用いる。このサンプ
ル充填機を用いると、全部で60個のサンプルを無人で流
すことができる。こうして、典型的な取得パラメーター
（自由誘導減衰（fid）当たり４スキャン）を用いて、1
00〜120のHSQCスペクトルを24時間で得ることができ
る。
ナルは勾配を妨害することにより抑制される。多数の化
合物に関するNMRデータ（例えば、合成されたまたは天
然に存在する小さな有機化合物のデータベース）の取得
を助けるために、サンプル充填機を用いる。このサンプ
ル充填機を用いると、全部で60個のサンプルを無人で流
すことができる。こうして、典型的な取得パラメーター
（自由誘導減衰（fid）当たり４スキャン）を用いて、1
00〜120のHSQCスペクトルを24時間で得ることができ
る。
NMRデータの処理を助けるために、コンピユータープ
ログラムを使用して複数の２次元NMRデータ（ルーチン
−自動相（routine−automatically phase）２次元NMR
データを含む）を変換し、自動的に処理する。個々のHS
QCスペクトルをすぐに検分し、添加化合物用のビヒクル
（DMSO）を含むものの添加化合物そのものを含まない対
照サンプルのHSQCスペクトルと比較するようにデータを
フォーマッティングすることにより、データは容易に分
析され得る。２次元15N/1H相関スペクトルを発生させる
方法の詳細は実施例に記載されている。
ログラムを使用して複数の２次元NMRデータ（ルーチン
−自動相（routine−automatically phase）２次元NMR
データを含む）を変換し、自動的に処理する。個々のHS
QCスペクトルをすぐに検分し、添加化合物用のビヒクル
（DMSO）を含むものの添加化合物そのものを含まない対
照サンプルのHSQCスペクトルと比較するようにデータを
フォーマッティングすることにより、データは容易に分
析され得る。２次元15N/1H相関スペクトルを発生させる
方法の詳細は実施例に記載されている。
15N−標識標的分子（ポリペプチド）の代表的な２次
元15N/1H相関スペクトルを図１に示す（E2タンパク質の
DNA結合ドメイン）。
元15N/1H相関スペクトルを図１に示す（E2タンパク質の
DNA結合ドメイン）。
第１のスペクトルを取得したら、標識された標的分子
を１つまたはそれ以上の試験化合物に作用させる。２つ
以上の試験化合物を同時に試験する場合には、複数の小
分子のような化合物のデータベースを使用することが好
ましい。典型的にはそのような分子を予め重水素化した
ジメチルスルホキシドに溶解する。データベース中の化
合物は所要または所望により業者から購入することもで
きるし、製造することもできる。
を１つまたはそれ以上の試験化合物に作用させる。２つ
以上の試験化合物を同時に試験する場合には、複数の小
分子のような化合物のデータベースを使用することが好
ましい。典型的にはそのような分子を予め重水素化した
ジメチルスルホキシドに溶解する。データベース中の化
合物は所要または所望により業者から購入することもで
きるし、製造することもできる。
個々の化合物を、特にサイズ（分子量＝100〜300）及
び分子の違いに基づいて選択することができる。広範囲
の結合サイトと相互作用する化合物を発見する可能性を
最大限とするために、異なる形態（例えばフラットな芳
香族環、皺のよった脂肪族環、一重、二重もしくは三重
結合を有する直鎖または分枝鎖脂肪族化合物）及び多様
の官能基（例えば、カルボン酸、エステル、エーテル、
アミン、アルデヒド、ケトン及び各種複素環）を有する
化合物を集める。
び分子の違いに基づいて選択することができる。広範囲
の結合サイトと相互作用する化合物を発見する可能性を
最大限とするために、異なる形態（例えばフラットな芳
香族環、皺のよった脂肪族環、一重、二重もしくは三重
結合を有する直鎖または分枝鎖脂肪族化合物）及び多様
の官能基（例えば、カルボン酸、エステル、エーテル、
アミン、アルデヒド、ケトン及び各種複素環）を有する
化合物を集める。
本発明のNMRスクリーニング方法では、約0.1〜約10.0
mMの範囲のリガンド濃度を使用することができる。この
濃度で、酸性または塩基性である化合物は緩衝されたタ
ンパク質溶液のpHを有意に変化させることができる。化
学シフトはpH変化及び直接的な結合相互作用に応じて変
化し、よってリガンドの結合ではなくpH変化の結果とし
て起こる「偽陽性の」化学シフト変化を観察することが
できる。従って、緩衝された溶液のpHがリガンドを添加
しても変化しないようにしなければならない。pHをコン
トロールする１つの手段を下記する。
mMの範囲のリガンド濃度を使用することができる。この
濃度で、酸性または塩基性である化合物は緩衝されたタ
ンパク質溶液のpHを有意に変化させることができる。化
学シフトはpH変化及び直接的な結合相互作用に応じて変
化し、よってリガンドの結合ではなくpH変化の結果とし
て起こる「偽陽性の」化学シフト変化を観察することが
できる。従って、緩衝された溶液のpHがリガンドを添加
しても変化しないようにしなければならない。pHをコン
トロールする１つの手段を下記する。
化合物を、ジメチルスルホキシド（DMSO）中の1.0M及
び0.1Mストック溶液として263゜Kで保存する。これは、
水溶液中のリガンドの溶解度が限られているから必要で
ある。DMSO溶液のpHを直接調節することはできない。更
に、HCl及びNaOHはDMSO中で不溶性塩を形成するので、
別の酸及び塩基を使用しなければならない。下記する方
法が安定なpHをもたらすことが判明した。
び0.1Mストック溶液として263゜Kで保存する。これは、
水溶液中のリガンドの溶解度が限られているから必要で
ある。DMSO溶液のpHを直接調節することはできない。更
に、HCl及びNaOHはDMSO中で不溶性塩を形成するので、
別の酸及び塩基を使用しなければならない。下記する方
法が安定なpHをもたらすことが判明した。
DMSO中の1.0Mストック溶液を50mMホスフェート（pH7.
0）で1:10に希釈する。こうして希釈した溶液アリコー
トのpHを測定する。アリコートのpHに変化が見られない
ときには（すなわち7.0が保たれているときには）、DMS
Oストック溶液を1:10に希釈して0.1M溶液とすることに
より作業溶液を調製し、その溶液を保存する。
0）で1:10に希釈する。こうして希釈した溶液アリコー
トのpHを測定する。アリコートのpHに変化が見られない
ときには（すなわち7.0が保たれているときには）、DMS
Oストック溶液を1:10に希釈して0.1M溶液とすることに
より作業溶液を調製し、その溶液を保存する。
希釈したアリコートのpHが7.0未満のときには、エタ
ノールアミンを1.0MストックDMSO溶液に添加し、該スト
ック溶液を更にリン酸緩衝液で1:10に希釈して別のアリ
コートを作成し、このアリコートのpHを再び調べる。
ノールアミンを1.0MストックDMSO溶液に添加し、該スト
ック溶液を更にリン酸緩衝液で1:10に希釈して別のアリ
コートを作成し、このアリコートのpHを再び調べる。
希釈したアリコートのpHが7.0よりも高いときには、
酢酸を1.0MストックDMSO溶液に添加し、該ストック溶液
を更にリン酸緩衝液で1:10に希釈して別のアリコートを
作成し、このアリコートのpHを再び調べる。
酢酸を1.0MストックDMSO溶液に添加し、該ストック溶液
を更にリン酸緩衝液で1:10に希釈して別のアリコートを
作成し、このアリコートのpHを再び調べる。
エタノールアミン及び酢酸はDMSOに可溶性であり、適
切量を添加して水性緩衝液に移したときにpHが変化しな
いようにする。pHの調節は、所望の結果が得られるまで
繰り返し行われる交互作用（interactive）工程であ
る。
切量を添加して水性緩衝液に移したときにpHが変化しな
いようにする。pHの調節は、所望の結果が得られるまで
繰り返し行われる交互作用（interactive）工程であ
る。
この手順は、実験で使用する低濃度（0.1〜10mM）で
または異なる／より弱い緩衝系でpHの変化が観察されな
いように1.0Mストック溶液の1:10希釈物（100mMリガン
ド）で実施されることに留意されたい。
または異なる／より弱い緩衝系でpHの変化が観察されな
いように1.0Mストック溶液の1:10希釈物（100mMリガン
ド）で実施されることに留意されたい。
15N−標識標的分子を１つまたはそれ以上の試験化合
物に作用させた後、第２の２次元15N/1H NMR相関スペ
クトルを発生させる。第２スペクトルを上記と同様に発
生させる。次いで、第１と第２のスペクトルを比較し
て、２つのスペクトルの間に何らかの違いがあるかを調
べる。リガンドの存在の指標となる２次元15N/1H NMR
相関スペクトルの違いは、標的分子中の15N−標識サイ
トに対応する。これらの違いは、当業界で公知の標準的
な方法により測定される。
物に作用させた後、第２の２次元15N/1H NMR相関スペ
クトルを発生させる。第２スペクトルを上記と同様に発
生させる。次いで、第１と第２のスペクトルを比較し
て、２つのスペクトルの間に何らかの違いがあるかを調
べる。リガンドの存在の指標となる２次元15N/1H NMR
相関スペクトルの違いは、標的分子中の15N−標識サイ
トに対応する。これらの違いは、当業界で公知の標準的
な方法により測定される。
例えば、図２、３、４、５及び６は、各種標的分子を
各種試験化合物に作用させる前及びその後の相関スペク
トルの比較を示す。上記した試験をどのように実施した
かについては実施例２及び３に後記した。
各種試験化合物に作用させる前及びその後の相関スペク
トルの比較を示す。上記した試験をどのように実施した
かについては実施例２及び３に後記した。
２次元15N/1H NMR相関スペクトル中の特定シグナル
は、標的分子中の特定の窒素及びプロトン原子に対応す
る（例えば、タンパク質中のアミノ酸残基のアミド）。
例えば、図２から分かるように、試験化合物に作用させ
たE2のDNA結合ドメインの２次元15N/1H NMR相関スペク
トルの化学シフトは、15（I15）、21（Y21）、22（R2
2）及び23（L23）残基において生ずる。
は、標的分子中の特定の窒素及びプロトン原子に対応す
る（例えば、タンパク質中のアミノ酸残基のアミド）。
例えば、図２から分かるように、試験化合物に作用させ
たE2のDNA結合ドメインの２次元15N/1H NMR相関スペク
トルの化学シフトは、15（I15）、21（Y21）、22（R2
2）及び23（L23）残基において生ずる。
図２から分かるように、リガンドの結合は15位のイソ
ロイシン（Ile）残基、21位のチロシン（Tyr）残基、22
位のアルギニン（Arg）残基及び23位のロイシン（Leu）
残基を含んでいた。従って、本発明の方法は、リガンド
と標的分子の間の特定結合サイトを同定するためにも使
用することができる。
ロイシン（Ile）残基、21位のチロシン（Tyr）残基、22
位のアルギニン（Arg）残基及び23位のロイシン（Leu）
残基を含んでいた。従って、本発明の方法は、リガンド
と標的分子の間の特定結合サイトを同定するためにも使
用することができる。
各化合物への結合に係わるタンパク質の領域は、化合
物を添加したときに変化する複数の特定アミドシグナル
から同定される。これらのシグナルは、十分に確立され
ている多くの異核多次元NMR実験を用い、標準的な手順
によりタンパク質の各アミド基に帰属される。
物を添加したときに変化する複数の特定アミドシグナル
から同定される。これらのシグナルは、十分に確立され
ている多くの異核多次元NMR実験を用い、標準的な手順
によりタンパク質の各アミド基に帰属される。
タンパク質により強く結合する分子を発見するため
に、構造／活性の関係に基づいて試験するための分子
が、タンパク質に結合したときの第１回のリードに関す
る第１回のスクリーン及び／または構造の情報からの選
択される。例えば、第１回のスクリーニングにより、リ
ガンドが同定され、それらのリガンドすべてが芳香族環
を含むとすると、次回スクリーニングでは他の芳香族分
子を試験化合物として使用する。
に、構造／活性の関係に基づいて試験するための分子
が、タンパク質に結合したときの第１回のリードに関す
る第１回のスクリーン及び／または構造の情報からの選
択される。例えば、第１回のスクリーニングにより、リ
ガンドが同定され、それらのリガンドすべてが芳香族環
を含むとすると、次回スクリーニングでは他の芳香族分
子を試験化合物として使用する。
実施例２に後記するように、ストロメライシンの触媒
ドメインに対する結合についての第１回スクリーニング
アッセイでは、２つのビアリール化合物がリガンドとし
て同定された。そこで、第２回スクリーニングでは、種
々のビアリール誘導体を試験化合物として使用した。
ドメインに対する結合についての第１回スクリーニング
アッセイでは、２つのビアリール化合物がリガンドとし
て同定された。そこで、第２回スクリーニングでは、種
々のビアリール誘導体を試験化合物として使用した。
第２組の試験化合物について、まず1mMの濃度でスク
リーニングにかけ、アフィニティーを示す試験化合物の
結合定数を測定する。タンパク質に結合する最良のリガ
ンドを機能アッセイで得た結果と比較する。適切なリガ
ンドである上記化合物を化学的に修飾して、最終的には
新規な薬物を発見することができる類似化合物を製造す
る。
リーニングにかけ、アフィニティーを示す試験化合物の
結合定数を測定する。タンパク質に結合する最良のリガ
ンドを機能アッセイで得た結果と比較する。適切なリガ
ンドである上記化合物を化学的に修飾して、最終的には
新規な薬物を発見することができる類似化合物を製造す
る。
更に、本発明は、標的分子と該標的分子に結合するリ
ガンド間の解離定数を測定する方法を提供する。この方
法は、 ａ）15N−標識標的分子の第１の２次元15N/1H NMR相関
スペクトルを発生させるステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を濃度の異なるリガンドで滴
定するステップ、 ｃ）ステップｂ）の各濃度のリガンドで２次元15N/1H
NMR相関スペクトルを発生させるステップ、 ｄ）ステップａ）で発生させた第１スペクトルとステッ
プｃ）で発生させた他のすべてのスペクトルを比較し
て、これらのスペクトルの違いをリガンド濃度の変化の
関数として定量するステップ、及び ｅ）その違いから、標的分子とリガンド間の解離定数
（KD）を算出するステップを含む。
ガンド間の解離定数を測定する方法を提供する。この方
法は、 ａ）15N−標識標的分子の第１の２次元15N/1H NMR相関
スペクトルを発生させるステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を濃度の異なるリガンドで滴
定するステップ、 ｃ）ステップｂ）の各濃度のリガンドで２次元15N/1H
NMR相関スペクトルを発生させるステップ、 ｄ）ステップａ）で発生させた第１スペクトルとステッ
プｃ）で発生させた他のすべてのスペクトルを比較し
て、これらのスペクトルの違いをリガンド濃度の変化の
関数として定量するステップ、及び ｅ）その違いから、標的分子とリガンド間の解離定数
（KD）を算出するステップを含む。
医化学での重要性から、上記方法で使用される好まし
い標的分子はポリペプチドである。１つの好ましい実施
態様では、リガンドの解離定数を測定する方法は第２リ
ガンドの存在下で実施され得る。この実施態様では、15
N−標識標的分子を、該分子を試験化合物に作用させる
前に第２リガンドに結合させる。
い標的分子はポリペプチドである。１つの好ましい実施
態様では、リガンドの解離定数を測定する方法は第２リ
ガンドの存在下で実施され得る。この実施態様では、15
N−標識標的分子を、該分子を試験化合物に作用させる
前に第２リガンドに結合させる。
タンパク質の15N/1H化学シフトをリガンド濃度の関数
として追跡することにより、結合または解離定数を測定
する。既知濃度の標的分子（［Ｐ］０）を既に同定され
ている既知濃度のリガンド（［Ｌ］０）と混合し、２次
元15N/1H相関スペクトルを取得する。このスペクトルか
ら、観察された化学シフト値（δobs）を得る。リガン
ドの濃度を可能ならば標的分子の飽和点まで変化させる
べく上記方法を繰り返す。飽和の時点で飽和の極限化学
シフト値（δsat）を測定する。
として追跡することにより、結合または解離定数を測定
する。既知濃度の標的分子（［Ｐ］０）を既に同定され
ている既知濃度のリガンド（［Ｌ］０）と混合し、２次
元15N/1H相関スペクトルを取得する。このスペクトルか
ら、観察された化学シフト値（δobs）を得る。リガン
ドの濃度を可能ならば標的分子の飽和点まで変化させる
べく上記方法を繰り返す。飽和の時点で飽和の極限化学
シフト値（δsat）を測定する。
標的分子が飽和している場合には、特定リガントの標
的分子に対する結合の解離定数は下記式により計算され
る。
的分子に対する結合の解離定数は下記式により計算され
る。
上記式中、［Ｐ］ｏは標的分子の総モル濃度であり、
［Ｌ］ｏはリガンドの総モル濃度であり、ｘは式 （ここで、δfreeは遊離種の化学シフトであり、δobs
は観察された化学シフト値であり、Δは飽和（δsat）
の場合の極限化学シフト値とリガンドを含まない（δ
free）標的分子のの化学シフトの差である）に従って決
まる。
［Ｌ］ｏはリガンドの総モル濃度であり、ｘは式 （ここで、δfreeは遊離種の化学シフトであり、δobs
は観察された化学シフト値であり、Δは飽和（δsat）
の場合の極限化学シフト値とリガンドを含まない（δ
free）標的分子のの化学シフトの差である）に従って決
まる。
次いで、解離定数を、測定データに対するベストフィ
ットが標準の曲線当てはめ統計法を用いて得られるまで
その値を変化させることにより測定する。δsatが直接
既知でない場合には、KD及びδsatを変化させて同じ曲
線当てはめ法にかける。
ットが標準の曲線当てはめ統計法を用いて得られるまで
その値を変化させることにより測定する。δsatが直接
既知でない場合には、KD及びδsatを変化させて同じ曲
線当てはめ法にかける。
本発明の方法を、各種リガンドの各種標的分子に対す
る結合または解離アフィニティーを測定するために使用
した例は、後記実施例２及び３に記載されている。
る結合または解離アフィニティーを測定するために使用
した例は、後記実施例２及び３に記載されている。
好ましい標的分子、スペクトルを発生させる手段及び
スペクトルを比較する手段は上記と同じである。
スペクトルを比較する手段は上記と同じである。
設計方法の第１ステップでは、特定の標的分子に結合
する２つまたはそれ以上のリガンドを同定する。そのよ
うなリガンドの同定は、上記した２次元15N/1H NMR相
関スペクトルを用いて実施する。
する２つまたはそれ以上のリガンドを同定する。そのよ
うなリガンドの同定は、上記した２次元15N/1H NMR相
関スペクトルを用いて実施する。
２つ以上のリガンドが別々のサイトで標的分子に結合
すると同定されたなら、標的分子とリガンドとの複合体
が形成される。リガンドが２つのとき、複合体は３元複
合体である。リガンドが３つまたはそれ以上のときに
は、４元及び他の複合体が形成される。
すると同定されたなら、標的分子とリガンドとの複合体
が形成される。リガンドが２つのとき、複合体は３元複
合体である。リガンドが３つまたはそれ以上のときに
は、４元及び他の複合体が形成される。
複合体は、リガンドが標的に結合し得る条件下で標的
分子を各種リガンドと同時にまたは逐次に混合すること
により形成される。上記条件を決定する方法は当業界で
公知である。
分子を各種リガンドと同時にまたは逐次に混合すること
により形成される。上記条件を決定する方法は当業界で
公知である。
複合体が形成されたら、その３次元構造を調べる。３
次元構造を測定する任意の手段が使用される。そのよう
な手段は公知であり、例えばNMR及びＸ線結晶学であ
り、これらの方法が好ましい。３次元の二重及び三重共
鳴NMRをストロメライシンの触媒ドメインに結合した２
つのリガンドの３次元構造を測定するために使用した例
が、後記実施例４に詳細に記載されている。
次元構造を測定する任意の手段が使用される。そのよう
な手段は公知であり、例えばNMR及びＸ線結晶学であ
り、これらの方法が好ましい。３次元の二重及び三重共
鳴NMRをストロメライシンの触媒ドメインに結合した２
つのリガンドの３次元構造を測定するために使用した例
が、後記実施例４に詳細に記載されている。
３次元構造を分析すると、リガンドの他のリガンドに
対する及び標的分子の配置に対する立体配向が分かる。
まず、各リガンドの標的分子に対する立体配向から、結
合に直接関与するリガンドの部分（例えば、標的結合サ
イトと相互作用する部分）を同定することができ、結合
サイトから突出しており続く結合手順で使用され得る各
リガンドの部分を同定することができる。
対する及び標的分子の配置に対する立体配向が分かる。
まず、各リガンドの標的分子に対する立体配向から、結
合に直接関与するリガンドの部分（例えば、標的結合サ
イトと相互作用する部分）を同定することができ、結合
サイトから突出しており続く結合手順で使用され得る各
リガンドの部分を同定することができる。
第２に、立体配向データを、各リガンドの他のリガン
ドに対する相対位置をマッピングするために使用され
る。言い換えれば、空間的に配向されたリガンド間の離
散距離を計算することができる。
ドに対する相対位置をマッピングするために使用され
る。言い換えれば、空間的に配向されたリガンド間の離
散距離を計算することができる。
第３に、立体配向データは、複数のリガンドと標的間
の３次元関係をも規定する。すなわち、リガンド間の絶
対距離を計算する他、これらのリガンドの角配向をも測
定することができる。
の３次元関係をも規定する。すなわち、リガンド間の絶
対距離を計算する他、これらのリガンドの角配向をも測
定することができる。
リガンド及び標的の立体配向がわかれば、２つ以上の
リガンドを結合してすべてのリガンドを含む単一物質と
するリンカーを選択することができる。リンカーは、単
一物質の各リガンド部分を標的に対して適切な配向で維
持するために必要な距離及び角配向に基づいて設計され
る。
リガンドを結合してすべてのリガンドを含む単一物質と
するリンカーを選択することができる。リンカーは、単
一物質の各リガンド部分を標的に対して適切な配向で維
持するために必要な距離及び角配向に基づいて設計され
る。
適当なリンカーの３次元構造は、当業者に公知である
かまたは容易に確認することができる。理論的には２つ
以上のリガンドを任意の距離及び３次元投影で相互に結
合させることが可能であるとしても、実際には距離及び
投影にある制限を設けることが好ましい。好ましい実施
態様では、リガンドは約15オングストローム（Å）未
満、より好ましくは約10Å未満、更に好ましくは約５Å
未満の距離離れている。
かまたは容易に確認することができる。理論的には２つ
以上のリガンドを任意の距離及び３次元投影で相互に結
合させることが可能であるとしても、実際には距離及び
投影にある制限を設けることが好ましい。好ましい実施
態様では、リガンドは約15オングストローム（Å）未
満、より好ましくは約10Å未満、更に好ましくは約５Å
未満の距離離れている。
適当なリンカー基が同定されれば、リガンドをそのリ
ンカーで結合させる。リガンドを結合させる手段は当業
界で公知であり、リガンド及びリンカー基それ自体の化
学構造に依存する。リガンドは、標的分子への結合に直
接関与しないリガンドの部分を使用して互いに結合して
いる。
ンカーで結合させる。リガンドを結合させる手段は当業
界で公知であり、リガンド及びリンカー基それ自体の化
学構造に依存する。リガンドは、標的分子への結合に直
接関与しないリガンドの部分を使用して互いに結合して
いる。
本発明の方法を用いて設計された薬物であるストロメ
ライシンの蛋白分解活性を阻害する薬物の設計の詳細に
ついては、後記実施例４に記載している。
ライシンの蛋白分解活性を阻害する薬物の設計の詳細に
ついては、後記実施例４に記載している。
下記実施例に本発明の好ましい実施態様を示すが、こ
れら実施例は明細書及び請求の範囲を限定するものでは
ない。
れら実施例は明細書及び請求の範囲を限定するものでは
ない。
実施例１ 均一に15N−標識された標的分子の調製 A.ストロメライシン ヒトストロメライシンは、軟骨のタンパク質分解に関
与すると考えられている447アミノ酸のタンパク質であ
る。軟骨がタンパク質分解すると、関節軟骨が分解損失
し、骨関節症及びリウマチ様関節炎では関節機能の低下
が見られる。このタンパク質は、Ｎ−末端潜在の及びプ
ロペプチドドメイン、ホモペキシンに類似のＣ−末端ド
メイン及び内部の触媒ドメインを含めた一連のドメイン
を有する。
与すると考えられている447アミノ酸のタンパク質であ
る。軟骨がタンパク質分解すると、関節軟骨が分解損失
し、骨関節症及びリウマチ様関節炎では関節機能の低下
が見られる。このタンパク質は、Ｎ−末端潜在の及びプ
ロペプチドドメイン、ホモペキシンに類似のＣ−末端ド
メイン及び内部の触媒ドメインを含めた一連のドメイン
を有する。
研究で、約80個のアミノ酸のＮ−末端プロ配列を除去
すると、プロ酵素は45kDa成熟酵素に変換されることが
判明している。また、研究から、触媒ドメインを適切に
折りたたむためにも阻害剤と相互作用するためにも、Ｃ
−末端ホモペキシン相同ドメインが必要でないことが判
明している（例えば、A.I.Marcy,Biochemistry,30:6476
−6483（1991）参照）。そこで、ストロメライシンの81
−256アミノ酸残基の内部セグメントを、ストロメライ
シンに結合し、ストロメライシンの阻害剤として作用す
る可能性のある化合物を同定するために使用されるタン
パク質断片として選択した。
すると、プロ酵素は45kDa成熟酵素に変換されることが
判明している。また、研究から、触媒ドメインを適切に
折りたたむためにも阻害剤と相互作用するためにも、Ｃ
−末端ホモペキシン相同ドメインが必要でないことが判
明している（例えば、A.I.Marcy,Biochemistry,30:6476
−6483（1991）参照）。そこで、ストロメライシンの81
−256アミノ酸残基の内部セグメントを、ストロメライ
シンに結合し、ストロメライシンの阻害剤として作用す
る可能性のある化合物を同定するために使用されるタン
パク質断片として選択した。
本発明の方法を使用するためには、ペプチド骨格が同
位体的に15Nを多く含むストロメライシンの81−256断片
（配列番号１）を調製する必要があった。このために、
タンパク質断片の産生をコードするプラスミドを大腸菌
株に挿入し、遺伝子工学的に修飾した細菌菌株を15NH4C
l及び13C−グルコースに富む制限培地で増殖させた。
位体的に15Nを多く含むストロメライシンの81−256断片
（配列番号１）を調製する必要があった。このために、
タンパク質断片の産生をコードするプラスミドを大腸菌
株に挿入し、遺伝子工学的に修飾した細菌菌株を15NH4C
l及び13C−グルコースに富む制限培地で増殖させた。
培地から同位体を多く含むタンパク質断片を単離し、
精製した後試験化合物の結合を評価するための基礎とし
て使用した。これらの方法の手順を以下に記載する。
精製した後試験化合物の結合を評価するための基礎とし
て使用した。これらの方法の手順を以下に記載する。
ヒト皮膚繊維芽細胞（ATCC番号CRL 1507）を、Clark
ら、Archiv.Biochem.and Biophys.,241:36−45（198
5）に記載されている手順を用いて、増殖し、誘導し
た。総RNAを、Promega RNAgents（登録商標）総RNA単
離システムキット（カタログ番号Z5110、Promega Cor
p.,2800 Woods Hollow Road,マディソン，ウィスコ
ンシン州53711−5399）を用い、製造業者の指示に従っ
て、1gの細胞から単離した。１μｇ部分のRNAを80℃で
５分間熱変性後、GeneAmp（登録商標）RNA PCRキット
（カタログ番号N808−0017,Applied Biosystems/Perki
n−Elmer,761 Main Avenue,ノーウォーク，コネティ
カット州06859−0156）を用い、製造業者の指示に従っ
て、逆転写PCRにかけた。
ら、Archiv.Biochem.and Biophys.,241:36−45（198
5）に記載されている手順を用いて、増殖し、誘導し
た。総RNAを、Promega RNAgents（登録商標）総RNA単
離システムキット（カタログ番号Z5110、Promega Cor
p.,2800 Woods Hollow Road,マディソン，ウィスコ
ンシン州53711−5399）を用い、製造業者の指示に従っ
て、1gの細胞から単離した。１μｇ部分のRNAを80℃で
５分間熱変性後、GeneAmp（登録商標）RNA PCRキット
（カタログ番号N808−0017,Applied Biosystems/Perki
n−Elmer,761 Main Avenue,ノーウォーク，コネティ
カット州06859−0156）を用い、製造業者の指示に従っ
て、逆転写PCRにかけた。
入れ子（nested）PCRを、第１プライマー（Ａ） GAAATGAAGAGTCTTCAA（配列番号３）及び（Ｂ） GCGTCCCAGGTTCTGGAG（配列番号４）を用い、94℃×２分
間、45℃×２分間及び72℃×３分間の条件下で35サイク
ル施して実施した。続いて、内部プライマー（Ｃ） ATACCATGGCCTATCCATTGGATGGAGC（配列番号５）及び
（Ｄ） ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGAGTCAGG（配列番号６）を用
い、すぐ上に記載したと同じ条件下で30サイクル施して
再増幅して、ヒトストロメライシンのアミノ酸残基１−
256をコードするDNAを生じさせた。
間、45℃×２分間及び72℃×３分間の条件下で35サイク
ル施して実施した。続いて、内部プライマー（Ｃ） ATACCATGGCCTATCCATTGGATGGAGC（配列番号５）及び
（Ｄ） ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGAGTCAGG（配列番号６）を用
い、すぐ上に記載したと同じ条件下で30サイクル施して
再増幅して、ヒトストロメライシンのアミノ酸残基１−
256をコードするDNAを生じさせた。
次いで、PCR断片を、製造業者の指示に従ってPCRクロ
ーニングベクターpT7ブルー（Ｒ）（Novagen,Inc.,597
Science Drive,マディソン，ウィスコンシン州5371
1）にクローニングした。生じたプラスミドをNco I及び
BamH Iで切断し、ストロメライシン断片を製造業者の指
示に従ってNovagen発現ベクターpET3d（Novagen,Inc.,5
97 Science Drive,マディソン，ウィスコンシン州537
11）にサブクローニングした。
ーニングベクターpT7ブルー（Ｒ）（Novagen,Inc.,597
Science Drive,マディソン，ウィスコンシン州5371
1）にクローニングした。生じたプラスミドをNco I及び
BamH Iで切断し、ストロメライシン断片を製造業者の指
示に従ってNovagen発現ベクターpET3d（Novagen,Inc.,5
97 Science Drive,マディソン，ウィスコンシン州537
11）にサブクローニングした。
アミノ酸残基81−256プラス開始メチオニンをコード
する成熟ストロメライシン発現構築物を、１−256発現
構築物からPCR増幅法により調製した。生じたPCR断片
を、上記したように製造業者の指示に従って、まずNova
gen pT7Blue（Ｒ）ベクターにクローニングし、次いで
Novagen pET3dベクターにサブクローニングして、プラ
スミド（pETST−83−256）を調製した。この最終プラス
ミドは、本プラスミドがヒトストロメライシンの配列の
81番目の、より前の２つアミノ酸で始まるペプチド配列
をコードする点を除いて、Qi−Zhuangら、Biochemistr
y,31:11231−11235（1992）に記載されているものと同
一である。
する成熟ストロメライシン発現構築物を、１−256発現
構築物からPCR増幅法により調製した。生じたPCR断片
を、上記したように製造業者の指示に従って、まずNova
gen pT7Blue（Ｒ）ベクターにクローニングし、次いで
Novagen pET3dベクターにサブクローニングして、プラ
スミド（pETST−83−256）を調製した。この最終プラス
ミドは、本プラスミドがヒトストロメライシンの配列の
81番目の、より前の２つアミノ酸で始まるペプチド配列
をコードする点を除いて、Qi−Zhuangら、Biochemistr
y,31:11231−11235（1992）に記載されているものと同
一である。
プラスミドpETST−83−256を、製造業者の指示に従っ
て大腸菌株BL21（DE3）/pLysS（Novagen,Inc.,597 Sci
ence Drive,マディソン，ウィスコンシン州53711）に
形質転換して、発現株BL21（DE3）/pLysS/pETST−255−
１を得た。
て大腸菌株BL21（DE3）/pLysS（Novagen,Inc.,597 Sci
ence Drive,マディソン，ウィスコンシン州53711）に
形質転換して、発現株BL21（DE3）/pLysS/pETST−255−
１を得た。
予備培養培地を、脱イオン水150mlにNa2HP4・7H2O1.6
98g、KH2PO40.45g、NaCl0.075g、15NH4Cl0.150g、13C−
グルコース0.300g、1M−MgSO4水溶液300μｌ及びCaCl2
水溶液15μｌを溶解して調製した。
98g、KH2PO40.45g、NaCl0.075g、15NH4Cl0.150g、13C−
グルコース0.300g、1M−MgSO4水溶液300μｌ及びCaCl2
水溶液15μｌを溶解して調製した。
こうして調製した予備培養培地の溶液を滅菌し、500m
l容の滅菌バフルフラスコに移した。予備培養培地に細
菌菌株を接種する直前に、100％エタノール中に34mg/ml
のクロラムフェニコールを含む溶液150μｌ及び20mg/ml
のアンピシリンを含む溶液1.5mlをフラスコ内容物に添
加した。
l容の滅菌バフルフラスコに移した。予備培養培地に細
菌菌株を接種する直前に、100％エタノール中に34mg/ml
のクロラムフェニコールを含む溶液150μｌ及び20mg/ml
のアンピシリンを含む溶液1.5mlをフラスコ内容物に添
加した。
次いで、遺伝的に修飾した大腸菌株BL21（DE3）/pLys
S/pETST−255−１のグリセロールストック1mlをフラス
コ内容物に接種した。フラスコ内容物を、光学密度が0.
65になるまで37℃で振とうした（225rpm）。
S/pETST−255−１のグリセロールストック1mlをフラス
コ内容物に接種した。フラスコ内容物を、光学密度が0.
65になるまで37℃で振とうした（225rpm）。
発酵栄養培地を、脱イオン水9604mlにNa2HP4・7H2O11
3.28g、KH2PO430g、NaCl5g及び１％DF−60消泡剤10mlを
溶解して調製した。この溶液をNew Brunswick Scient
ific Micros Fermenter（Edison,ニュージャージー
州）に入れ、121℃で40分間滅菌した。
3.28g、KH2PO430g、NaCl5g及び１％DF−60消泡剤10mlを
溶解して調製した。この溶液をNew Brunswick Scient
ific Micros Fermenter（Edison,ニュージャージー
州）に入れ、121℃で40分間滅菌した。
培養培地を接種する直前に、以下の成分、すなわち15
NH4Clの10％水溶液100ml、13C−グルコースの10％水溶
液100ml、1M−MgSO4水溶液20ml、1M−CaCl2水溶液1ml、
チアミン塩酸塩（10mg/ml）の水溶液5ml、100％エタノ
ール中に34mg/mlのクロラムフェニコールを含む溶液10m
l及び前記クロラムフェニコール溶液に溶解させた1.9g
のアンピシリンを、予め滅菌してから発酵容器内容物に
添加した。得られた溶液のpHを4N−H2SO4水溶液を添加
して7.00に調整した。
NH4Clの10％水溶液100ml、13C−グルコースの10％水溶
液100ml、1M−MgSO4水溶液20ml、1M−CaCl2水溶液1ml、
チアミン塩酸塩（10mg/ml）の水溶液5ml、100％エタノ
ール中に34mg/mlのクロラムフェニコールを含む溶液10m
l及び前記クロラムフェニコール溶液に溶解させた1.9g
のアンピシリンを、予め滅菌してから発酵容器内容物に
添加した。得られた溶液のpHを4N−H2SO4水溶液を添加
して7.00に調整した。
上記した振とうフラスコスケール法により調製した大
腸菌株BL21（DE3）/pLysS/pETST−255−１の予備培養物
を発酵槽内容物に添加し、光学密度が0.48になるまで細
胞を増殖させた。この間、必要に応じて4N−H2SO4また
は4N−KOHを添加して発酵槽内容物のpHを自動的に7.0に
維持した。発酵槽内容物の溶存酸素濃度を、その濃度が
55％未満になると撹拌速度が速くなる継続ループを用い
て55％以上に維持した。空気を７標準リットル／分（SL
PM）で発酵槽内容物に供給し、培養温度を処理中37℃に
維持した。
腸菌株BL21（DE3）/pLysS/pETST−255−１の予備培養物
を発酵槽内容物に添加し、光学密度が0.48になるまで細
胞を増殖させた。この間、必要に応じて4N−H2SO4また
は4N−KOHを添加して発酵槽内容物のpHを自動的に7.0に
維持した。発酵槽内容物の溶存酸素濃度を、その濃度が
55％未満になると撹拌速度が速くなる継続ループを用い
て55％以上に維持した。空気を７標準リットル／分（SL
PM）で発酵槽内容物に供給し、培養温度を処理中37℃に
維持した。
細胞を４℃、17,000×ｇで10分間遠心することにより
収集し、生じた細胞ペレットを集め−85℃で保存した。
生細胞収量は3.5g/であった。細胞溶菌液の可溶性及
び不溶性部分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）により分析したとこ
ろ、約50％の15N−ストロメライシンが可溶性相に認め
られた。
収集し、生じた細胞ペレットを集め−85℃で保存した。
生細胞収量は3.5g/であった。細胞溶菌液の可溶性及
び不溶性部分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）により分析したとこ
ろ、約50％の15N−ストロメライシンが可溶性相に認め
られた。
上記のようにして調製した同位体標識ストロメライシ
ン断片を、Yeら、Biochemistry,31:11231−11235（199
2）に記載されている方法の変法を用いて精製した。
ン断片を、Yeら、Biochemistry,31:11231−11235（199
2）に記載されている方法の変法を用いて精製した。
収集した細胞を、1mMのMgCl2、0.5mMのZnCl2、25単位
/mlのBenzonase（登録商標）酵素、及び１μg/mlの４−
（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフロリド
（“AEBSF"）と１μg/mlのLeupeptin（登録商標）と１
μg/mlのAprotinin（登録商標）と１μg/mlのPepstatin
（登録商標）とからなる阻害剤混合物を含む20mMのTris
−HCl緩衝液（pH8.0）ナトリウムアジド溶液に懸濁させ
た。なお、AEBSF、Leupeptin（登録商標）、Aprotinin
（登録商標）及びPepstatin（登録商標）は17Strathmor
e Road、ナティック、マサチューセッツ州01760に所在
のAmerican International Chemicalから市販されて
いる。
/mlのBenzonase（登録商標）酵素、及び１μg/mlの４−
（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフロリド
（“AEBSF"）と１μg/mlのLeupeptin（登録商標）と１
μg/mlのAprotinin（登録商標）と１μg/mlのPepstatin
（登録商標）とからなる阻害剤混合物を含む20mMのTris
−HCl緩衝液（pH8.0）ナトリウムアジド溶液に懸濁させ
た。なお、AEBSF、Leupeptin（登録商標）、Aprotinin
（登録商標）及びPepstatin（登録商標）は17Strathmor
e Road、ナティック、マサチューセッツ州01760に所在
のAmerican International Chemicalから市販されて
いる。
生じた混合物を１時間緩やかに撹拌してから、４℃に
冷却した。その後、細胞を50％の使用率（duty cycl
e）で音波破壊した。得られた溶菌液を14,000rpmで30分
間遠心し、不溶性分画のペレットを後続の処理（後記参
照）のために−80℃で凍結した。
冷却した。その後、細胞を50％の使用率（duty cycl
e）で音波破壊した。得られた溶菌液を14,000rpmで30分
間遠心し、不溶性分画のペレットを後続の処理（後記参
照）のために−80℃で凍結した。
固体の硫酸アンモニウムを飽和の20％のポイントまで
上清に添加し、生じた溶液を700mlフェニルセファロー
ス高速流動（“Ｑ−Sepharose FF"）カラム（Pharmaci
a Biotech.,800 Centennial Ave.,P.O.Box 1327,ピ
スカタウェー，ニュージャージー州08855）に充填し
た。充填前に、セファロースカラムを50mM−Tris−HCl
緩衝液（４℃でpH7.6）、5mM−CaCl2及び1M−（NH4）2S
O4で平衡化した。充填したカラムに直線勾配の（NH4）2
SO4水溶液及びTris−HCl緩衝液（pH7.6）中のCaCl2水溶
液を流して溶離させた。前記（NH4）2SO4水溶液の濃度
は1Mから0Mに漸減させ、前記CaCl2水溶液の濃度は5mMか
ら20mMに漸増させた。
上清に添加し、生じた溶液を700mlフェニルセファロー
ス高速流動（“Ｑ−Sepharose FF"）カラム（Pharmaci
a Biotech.,800 Centennial Ave.,P.O.Box 1327,ピ
スカタウェー，ニュージャージー州08855）に充填し
た。充填前に、セファロースカラムを50mM−Tris−HCl
緩衝液（４℃でpH7.6）、5mM−CaCl2及び1M−（NH4）2S
O4で平衡化した。充填したカラムに直線勾配の（NH4）2
SO4水溶液及びTris−HCl緩衝液（pH7.6）中のCaCl2水溶
液を流して溶離させた。前記（NH4）2SO4水溶液の濃度
は1Mから0Mに漸減させ、前記CaCl2水溶液の濃度は5mMか
ら20mMに漸増させた。
溶出液の活性分画をAmicon撹拌セル（Amicon,Inc.,72
Cherry Hill Drive,ビバリー，マサチューセッサ州
01915）に集め、濃縮した。濃縮したサンプルを、Ｑ−S
epharose FFカラム、10mMのCaCl2を含む50mMのTris−H
Cl（４℃でpH8.2）を用いて最初の緩衝液中に一晩透析
した。
Cherry Hill Drive,ビバリー，マサチューセッサ州
01915）に集め、濃縮した。濃縮したサンプルを、Ｑ−S
epharose FFカラム、10mMのCaCl2を含む50mMのTris−H
Cl（４℃でpH8.2）を用いて最初の緩衝液中に一晩透析
した。
次いで、透析したサンプルをＱ−Sepharose FFカラ
ムに充填し、最初の緩衝液及び200mM−NaClからなる直
線勾配で溶離させた。同位体標識したストロメライシン
の精製可溶性分画を濃縮し、４℃で保存した。
ムに充填し、最初の緩衝液及び200mM−NaClからなる直
線勾配で溶離させた。同位体標識したストロメライシン
の精製可溶性分画を濃縮し、４℃で保存した。
ペレットを8Mのグアニジン−HClに可溶化した。生じ
た溶液を20,000rpmで20分間遠心し、上清を、50mM−Tri
s−HCl（pH7.6）、10mM−CaCl2、0.5mM−ZnCl2、及び１
μg/mlのAEBEFと１μg/mlのLeupeptin（登録商標）と１
μg/mlのAprotinin（登録商標）と１μg/mlのPepstatin
（登録商標）とからなるフォールディング緩衝液中に滴
下した。フォールディング緩衝液の容量は上清の容量の
10倍とした。上清及びフォールディング緩衝液の混合物
を20,000rpmで30分間遠心した。
た溶液を20,000rpmで20分間遠心し、上清を、50mM−Tri
s−HCl（pH7.6）、10mM−CaCl2、0.5mM−ZnCl2、及び１
μg/mlのAEBEFと１μg/mlのLeupeptin（登録商標）と１
μg/mlのAprotinin（登録商標）と１μg/mlのPepstatin
（登録商標）とからなるフォールディング緩衝液中に滴
下した。フォールディング緩衝液の容量は上清の容量の
10倍とした。上清及びフォールディング緩衝液の混合物
を20,000rpmで30分間遠心した。
上記遠心から得た上清を４℃で保存し、ペレットに上
記したグアニジン−HCl中への可溶化、緩衝液中でのリ
フォールディング及び遠心のステップを２回施した。３
回の遠心の各々から得られた最終上清を合わせ、20％飽
和のポイントまで固体の硫酸アンモニウムを添加した。
こうして水溶性分画から誘導された溶液を、固体分画に
ついて上記したようにフェニルセファロース及びＱ−セ
ファロースを用いて精製した。
記したグアニジン−HCl中への可溶化、緩衝液中でのリ
フォールディング及び遠心のステップを２回施した。３
回の遠心の各々から得られた最終上清を合わせ、20％飽
和のポイントまで固体の硫酸アンモニウムを添加した。
こうして水溶性分画から誘導された溶液を、固体分画に
ついて上記したようにフェニルセファロース及びＱ−セ
ファロースを用いて精製した。
精製した可溶性及び不溶性分画を合わせて、元の細胞
ペースト1g当たり約1.8mgの精製した同位体標識ストロ
メライシン81−256分画を得た。
ペースト1g当たり約1.8mgの精製した同位体標識ストロ
メライシン81−256分画を得た。
B.ヒトパピローマウイルス（HPV）E2阻害剤 パピローマウィルスは、性器いぼ及び子宮頸癌を引き
起こす小DNAウィルスの科である。HPVのE2タンパク質は
ウィルス転写を調節し、ウィルスの複製に必要とされて
いる。従って、E2のDNAへの結合をブロックする分子はH
PVに対する有用な治療剤となり得る。DNAではなくタン
パク質を標的として選択したのは、より選択性の物質は
DNAよりもむしろタンパク質に結合するだろうと予測さ
れるからである。
起こす小DNAウィルスの科である。HPVのE2タンパク質は
ウィルス転写を調節し、ウィルスの複製に必要とされて
いる。従って、E2のDNAへの結合をブロックする分子はH
PVに対する有用な治療剤となり得る。DNAではなくタン
パク質を標的として選択したのは、より選択性の物質は
DNAよりもむしろタンパク質に結合するだろうと予測さ
れるからである。
ヒトパピローマウイルスE2のDNA−結合ドメインを、E
2をコードする完全長DNAからPCR法を用いてクローニン
グし、T7発現系を用いて細菌において過剰発現させた。
均一に15N−標識されたタンパク質を、15N−標識塩化ア
ンモニウムを含有する最少培地で増殖させた細菌から単
離した。このタンパク質を、緩衝液（50mM−Tris、100m
M−NaCl、1mM−EDTA、pH＝8.3）で予め平衡化したセフ
ァロース高速流動カラムを用いて細菌細胞溶菌液から精
製した。
2をコードする完全長DNAからPCR法を用いてクローニン
グし、T7発現系を用いて細菌において過剰発現させた。
均一に15N−標識されたタンパク質を、15N−標識塩化ア
ンモニウムを含有する最少培地で増殖させた細菌から単
離した。このタンパク質を、緩衝液（50mM−Tris、100m
M−NaCl、1mM−EDTA、pH＝8.3）で予め平衡化したセフ
ァロース高速流動カラムを用いて細菌細胞溶菌液から精
製した。
タンパク質を、緩衝液中100→500mMのNaClの直線勾配
で溶離し、プールし、pH7.0でMono−Ｓカラムにかけ
た。タンパク質を塩勾配（100→500mM）で溶離し、0.3m
Mまで濃縮し、アジ化ナトリウム（0.5％）を含むTRIS緩
衝（50mM、pH＝7.0）H2O/D2O（9/1）溶液に交換した。
で溶離し、プールし、pH7.0でMono−Ｓカラムにかけ
た。タンパク質を塩勾配（100→500mM）で溶離し、0.3m
Mまで濃縮し、アジ化ナトリウム（0.5％）を含むTRIS緩
衝（50mM、pH＝7.0）H2O/D2O（9/1）溶液に交換した。
C.RAF RAFタンパク質の均一に15N−標識したRas結合ドメイ
ンを、Emersonら、Biochemistry,34（21）:6911−6918
（1995）に記載されているように調製した。
ンを、Emersonら、Biochemistry,34（21）:6911−6918
（1995）に記載されているように調製した。
D.FKBP 均一に15N−標識した組換えヒトFK結合タンパク質（F
KBP）を、Loganら、J.Mol.Biol.,236:637−648（1994）
に記載されているように調製した。
KBP）を、Loganら、J.Mol.Biol.,236:637−648（1994）
に記載されているように調製した。
実施例２ ２次元15N/1H NMR相関スペクトル分析を用いる化合物
のスクリーニング ストロメライシンの触媒ドメインを実施例１の手順に
従って調製した。スクリーニングアッセイで使用したタ
ンパク質溶液は、TRIS緩衝（50mM、pH＝7.0）H2O/D2O
（9/1）溶液中にストロメライシンの均一に15N−標識し
た触媒ドメイン（0.3mM）、アセトヒドロキサム酸（500
mM）、CaCl2（20mM）、及びアジ化ナトリウム（0.5％）
を含むものであった。
のスクリーニング ストロメライシンの触媒ドメインを実施例１の手順に
従って調製した。スクリーニングアッセイで使用したタ
ンパク質溶液は、TRIS緩衝（50mM、pH＝7.0）H2O/D2O
（9/1）溶液中にストロメライシンの均一に15N−標識し
た触媒ドメイン（0.3mM）、アセトヒドロキサム酸（500
mM）、CaCl2（20mM）、及びアジ化ナトリウム（0.5％）
を含むものであった。
２次元15N/1H NMR相関スペクトルを、三重共鳴プロ
ーブ及びBrukerサンプル充填機を備えたBruker AMX500
NMR分光光度計を用いて29℃で発生させた。15N/1H H
SQCスペクトルを、掃引幅2000Hz（15N,t1）及び8333Hz
（1H,t2）を用いて80×1024複合点として得た。データ
は、スキャン間の遅延を１秒とし、自由誘導減衰（fi
d）当たり８スキャンとして収集した。すべてのNMRスペ
クトルをSilicon Graphicsコンピューターでインハウ
スで作成されたソフトウェアを用いて処理し、分析し
た。
ーブ及びBrukerサンプル充填機を備えたBruker AMX500
NMR分光光度計を用いて29℃で発生させた。15N/1H H
SQCスペクトルを、掃引幅2000Hz（15N,t1）及び8333Hz
（1H,t2）を用いて80×1024複合点として得た。データ
は、スキャン間の遅延を１秒とし、自由誘導減衰（fi
d）当たり８スキャンとして収集した。すべてのNMRスペ
クトルをSilicon Graphicsコンピューターでインハウ
スで作成されたソフトウェアを用いて処理し、分析し
た。
上記した15N−標識ストロメライシン標的分子につい
て第１の２次元15N/1H−NMR相関スペクトルを得た。つ
いで、ストロメライシン標的を試験化合物のデータベー
スに作用させた。化合物のストック溶液を100mM及び1M
で調製した。また、１サンプル当たり８〜10種の化合物
を各化合物を100mMの濃度で含む組み合わせライブラリ
ーも作成した。
て第１の２次元15N/1H−NMR相関スペクトルを得た。つ
いで、ストロメライシン標的を試験化合物のデータベー
スに作用させた。化合物のストック溶液を100mM及び1M
で調製した。また、１サンプル当たり８〜10種の化合物
を各化合物を100mMの濃度で含む組み合わせライブラリ
ーも作成した。
100mMリン酸緩衝溶液（pH＝7.0）で1/10倍希釈しても
pH変化が生じないように、1Mストック溶液のpHを酢酸及
びエタノールアミンで調節した。pHの調節は重要であ
る。なぜならば、pHがわずかにでも変化すると生体分子
の化学シフトが変化し、NMRデータの解釈を難しくする
可能性があるからである。
pH変化が生じないように、1Mストック溶液のpHを酢酸及
びエタノールアミンで調節した。pHの調節は重要であ
る。なぜならば、pHがわずかにでも変化すると生体分子
の化学シフトが変化し、NMRデータの解釈を難しくする
可能性があるからである。
データベース中の化合物をサイズ（分子量＝100〜30
0）及び分子の違いに基づいて選択した。広範囲にわた
る結合サイズと相互作用する化合物を発見する可能性を
最大現とするためには、コレクション中の分子は様々な
形態（例えば、フラットな芳香族環、皺がよった脂肪族
環、一重、二重もしくは三重結合を有する直鎖及び分枝
鎖脂肪族化合物）及び様々な官能基（例えばカルボン
酸、エステル、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン
及び各種複素環）を持っていた。
0）及び分子の違いに基づいて選択した。広範囲にわた
る結合サイズと相互作用する化合物を発見する可能性を
最大現とするためには、コレクション中の分子は様々な
形態（例えば、フラットな芳香族環、皺がよった脂肪族
環、一重、二重もしくは三重結合を有する直鎖及び分枝
鎖脂肪族化合物）及び様々な官能基（例えばカルボン
酸、エステル、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン
及び各種複素環）を持っていた。
NMRサンプルは、各化合物を100mMの濃度で含む化合物
混合物のDMSOストック溶液４μｌを均一に15N−標識し
たタンパク質のH2O/D2O（9/1）緩衝溶液0.4mlに添加す
ることにより調製した。NMRサンプル中の各化合物の最
終濃度は約1mMであった。
混合物のDMSOストック溶液４μｌを均一に15N−標識し
たタンパク質のH2O/D2O（9/1）緩衝溶液0.4mlに添加す
ることにより調製した。NMRサンプル中の各化合物の最
終濃度は約1mMであった。
第１回のスクリーニングにおいて、ストロメライシン
の触媒ドメインに結合する２つの化合物を見つけた。こ
れらの化合物は両方ともビアリール部分を含む。こうし
た第１回目の最初のヒットに基づいて、複数の構造的に
類似の化合物をストロメライシンに対してテストした。
ビアリール化合物の構造は以下の構造式Ｉにより表され
る。
の触媒ドメインに結合する２つの化合物を見つけた。こ
れらの化合物は両方ともビアリール部分を含む。こうし
た第１回目の最初のヒットに基づいて、複数の構造的に
類似の化合物をストロメライシンに対してテストした。
ビアリール化合物の構造は以下の構造式Ｉにより表され
る。
R1〜R3及びA1〜A3の定義については表１を参照された
い。
い。
第２回のスクリーニングにおいて、アセトヒドロキサ
ム酸の飽和量（500mM）の存在下または非存在下での結
合を調べた。
ム酸の飽和量（500mM）の存在下または非存在下での結
合を調べた。
多くのビアリール化合物がストロメライシンの触媒ド
メインに結合することが判明した。図４に、ストロメラ
イシンにビアリール試験化合物を作用させる前及びその
後の代表的な２次元15N/1H NMR相関スペクトルを示
す。図４から明らかなように、化合物はW124、T187、A1
99及びG204と命名したサイトのような15N−サイトに化
学シフトを生じさせた。
メインに結合することが判明した。図４に、ストロメラ
イシンにビアリール試験化合物を作用させる前及びその
後の代表的な２次元15N/1H NMR相関スペクトルを示
す。図４から明らかなように、化合物はW124、T187、A1
99及びG204と命名したサイトのような15N−サイトに化
学シフトを生じさせた。
これらのサイトは、配列番号１の124位のトリプトフ
ァン（TrP）残基、187位のトレオニン（Thr）残基、199
位のアラニン（Ala）残基及び204位のグリシン（Gly）
残基に対応する。図９は、NMR結合データとストロメラ
イシンの触媒ドメインのNMR誘導３次元構造の図の相関
関係を示す。特定リガンドの特定結合サイトを位置決定
できることは本発明の利点である。
ァン（TrP）残基、187位のトレオニン（Thr）残基、199
位のアラニン（Ala）残基及び204位のグリシン（Gly）
残基に対応する。図９は、NMR結合データとストロメラ
イシンの触媒ドメインのNMR誘導３次元構造の図の相関
関係を示す。特定リガンドの特定結合サイトを位置決定
できることは本発明の利点である。
数種の化合物のみがヒドロキサム酸の存在下でストロ
メライシンに結合した。従って、数種の化合物の結合ア
フィニティーがヒドロキサム酸の存在下で増強された
（すなわち、協同的である）。これらの結果は、他の分
子の存在下でタンパク質に結合する化合物を同定できる
という本発明のスクリーニングアッセイの別の重要な可
能性を例示している。
メライシンに結合した。従って、数種の化合物の結合ア
フィニティーがヒドロキサム酸の存在下で増強された
（すなわち、協同的である）。これらの結果は、他の分
子の存在下でタンパク質に結合する化合物を同定できる
という本発明のスクリーニングアッセイの別の重要な可
能性を例示している。
構造Ｉを有する各種ビアリール化合物を、異なる濃度
でストロメライシンへの結合について試験した。各濃度
で発生した15N/1Hスペクトルを評価し、スペクトルの違
いを化合物濃度の関数として定量した。これらの違いか
ら、結合または解離定数（KD）を当業界で公知の標準的
な方法に従って算出した。これらの試験の結果を表１に
示す。表１中のR1〜R3及びA1〜A3の位置は上記構造式Ｉ
を参照されたい。
でストロメライシンへの結合について試験した。各濃度
で発生した15N/1Hスペクトルを評価し、スペクトルの違
いを化合物濃度の関数として定量した。これらの違いか
ら、結合または解離定数（KD）を当業界で公知の標準的
な方法に従って算出した。これらの試験の結果を表１に
示す。表１中のR1〜R3及びA1〜A3の位置は上記構造式Ｉ
を参照されたい。
表１のデータから、本発明の方法がリガンドと標的分
子間の解離または結合定数を測定するために使用される
ことが分かる。
子間の解離または結合定数を測定するために使用される
ことが分かる。
本発明のNMRスクリーニングアッセイの別の利点は、
２次元15N/1H NMR相関スペクトルにおいて観察された
化学シフトを標的分子配置の他のスペクトルまたは投影
と相関させ得ることである。そのような相関の代表的な
結果を図９に示す。図９には基質分子との結合が最も確
実に起こるであろうポリペプチドの領域が示されてい
る。この図では、ストロメライシンにおける（表１の）
化合物１に対する見かけ結合領域が示されている。
２次元15N/1H NMR相関スペクトルにおいて観察された
化学シフトを標的分子配置の他のスペクトルまたは投影
と相関させ得ることである。そのような相関の代表的な
結果を図９に示す。図９には基質分子との結合が最も確
実に起こるであろうポリペプチドの領域が示されてい
る。この図では、ストロメライシンにおける（表１の）
化合物１に対する見かけ結合領域が示されている。
E2タンパク質のDNA−結合ドメインへの結合につい
て、データベースからの化合物を同様にスクリーニング
した。試験した化合物は以下の構造式IIを有するもので
あった。
て、データベースからの化合物を同様にスクリーニング
した。試験した化合物は以下の構造式IIを有するもので
あった。
R1〜R4及びＡの定義については表２を参照されたい。
NMR実験は、三重共鳴プローブ及びBrukerサンプル充
填機を備えたBruker AMX500 NMR分光光度計を用いて2
9℃で実施した。15N/1H HSQCスペクトルを、掃引幅200
0Hz（15N,t1）及び8333Hz（1H,t2）を用いて80×1024複
合点として得た。データは、スキャン間の遅延を１秒と
し、自由誘導減衰（fid）当たり４スキャンとして収集
した。すべてのNMRスペクトルをSilicon Graphicsコン
ピューターで処理し、分析した。
填機を備えたBruker AMX500 NMR分光光度計を用いて2
9℃で実施した。15N/1H HSQCスペクトルを、掃引幅200
0Hz（15N,t1）及び8333Hz（1H,t2）を用いて80×1024複
合点として得た。データは、スキャン間の遅延を１秒と
し、自由誘導減衰（fid）当たり４スキャンとして収集
した。すべてのNMRスペクトルをSilicon Graphicsコン
ピューターで処理し、分析した。
図２及び図３はそれぞれ、E2のDNA結合ドメインを第
１及び第２の試験化合物に作用させる前及び後の代表的
な２次元15N/1H NMR相関スペクトルを示す。
１及び第２の試験化合物に作用させる前及び後の代表的
な２次元15N/1H NMR相関スペクトルを示す。
図２から明らかなように、第１の化合物はI15、Y21、
R22及びL23と命名されるサイトのような15N−サイトに
化学シフトを生じさせた。これらのサイトは、配列番号
６の15位のイソロイシン（Ile）残基、21位のチロシン
（Tyr）残基、22位のアルギニン（Arg）残基及び23位の
ロイシン（Leu）残基に相当する。
R22及びL23と命名されるサイトのような15N−サイトに
化学シフトを生じさせた。これらのサイトは、配列番号
６の15位のイソロイシン（Ile）残基、21位のチロシン
（Tyr）残基、22位のアルギニン（Arg）残基及び23位の
ロイシン（Leu）残基に相当する。
図３から明らかなように、第２の化合物はI6、G11、H
38及びT52と命名される特定の15N−サイトに化学シフト
を生じさせた。これらのサイトは、配列番号６の６位の
イソロイシン（Ile）残基、11位のグリシン（Gly）残
基、38位のヒスチジン（His）残基及び52位のトレオニ
ン（Thr）残基に相当する。
38及びT52と命名される特定の15N−サイトに化学シフト
を生じさせた。これらのサイトは、配列番号６の６位の
イソロイシン（Ile）残基、11位のグリシン（Gly）残
基、38位のヒスチジン（His）残基及び52位のトレオニ
ン（Thr）残基に相当する。
図７及び図８は、上記したNMTR結合データとE2のDNA
−結合ドメインのNMR誘導３次元構造の図との相関関係
を示す。
−結合ドメインのNMR誘導３次元構造の図との相関関係
を示す。
数種の構造的に類似の化合物は、1mMの濃度でスクリ
ーニングしたときタンパク質の化学シフトの変化を生じ
させた。化合物の添加時に２組の明確なアミド共鳴が変
化することが見られた。１組のシグナルは２つのモノマ
ー間に形成されるβ−バレル中に位置するアミドに相当
し、他組のシグナルはDNA結合サイトの近くに位置する
アミドに相当する。
ーニングしたときタンパク質の化学シフトの変化を生じ
させた。化合物の添加時に２組の明確なアミド共鳴が変
化することが見られた。１組のシグナルは２つのモノマ
ー間に形成されるβ−バレル中に位置するアミドに相当
し、他組のシグナルはDNA結合サイトの近くに位置する
アミドに相当する。
例えば、２個のフェニル環を有し、該環を連結する炭
素に結合したカルボン酸を有する化合物のみが、DNA結
合サイトのアミドの化学シフトを変化させた。対照的
に、ベンゾフェノン及びフェノキシフェニル含有化合物
のみがβ−バレル（barrel）に結合した。他の化合物で
は両組のシグナルの化学シフトの変化を生じさせたが、
量を変えることにより各組のシグナルはシフトされた。
このことから、２つの明確な結合サイトの存在が示唆さ
れる。
素に結合したカルボン酸を有する化合物のみが、DNA結
合サイトのアミドの化学シフトを変化させた。対照的
に、ベンゾフェノン及びフェノキシフェニル含有化合物
のみがβ−バレル（barrel）に結合した。他の化合物で
は両組のシグナルの化学シフトの変化を生じさせたが、
量を変えることにより各組のシグナルはシフトされた。
このことから、２つの明確な結合サイトの存在が示唆さ
れる。
リガンド濃度の関数として化学シフトの変化をモニタ
ーすることにより、２つの結合サイトに対する結合定数
をも測定した。これらの試験結果を下記表２にまとめて
示す。
ーすることにより、２つの結合サイトに対する結合定数
をも測定した。これらの試験結果を下記表２にまとめて
示す。
RAFタンパク質の均一に15N−標識したRas結合ドメイ
ンを実施例１に記載されているように調製し、上記した
NMR手順に従って２次元15N/1H NMR相関スペクトル分析
を用いてスクリーニングした。代表的な試験結果を図５
に示す。図５には、試験化合物を作用させる前及びその
後の２次元15N/1H NMR相関スペクトルを示す。
ンを実施例１に記載されているように調製し、上記した
NMR手順に従って２次元15N/1H NMR相関スペクトル分析
を用いてスクリーニングした。代表的な試験結果を図５
に示す。図５には、試験化合物を作用させる前及びその
後の２次元15N/1H NMR相関スペクトルを示す。
均一に15N−標識したFKBPを実施例１に記載されてい
るように調製し、上記したNMR手順に従って２次元15N/1
H NMR相関スペクトル分析を用いてスクリーニングし
た。代表的な試験結果を図６に示す。図６には、試験化
合物に作用させる前及びその後の２次元15N/1H NMR相
関スペクトルを示す。
るように調製し、上記したNMR手順に従って２次元15N/1
H NMR相関スペクトル分析を用いてスクリーニングし
た。代表的な試験結果を図６に示す。図６には、試験化
合物に作用させる前及びその後の２次元15N/1H NMR相
関スペクトルを示す。
実施例３ NMR、酵素、フィルター結合及びゲルシフトスクリーニ
ングアッセイの比較 本発明のNMR法により測定したリガントの各種生体分
子に対する結合定数を、複数の従来方法で得た結果と比
較するために試験を実施した。
ングアッセイの比較 本発明のNMR法により測定したリガントの各種生体分
子に対する結合定数を、複数の従来方法で得た結果と比
較するために試験を実施した。
第１の試験では、本発明のNMR法及び従来の酵素アッ
セイにより結合定数を測定した。標的分子は、実施例１
の手順に従って調製したストロメライシンの触媒ドメイ
ンであった。NMR結合定数KDは、実施例２に記載の２次
元15N/1H NMR相関スペクトルを用いて得た。こうして
得たKD値を、酵素アッセイで測定した阻害定数KIと比較
した。
セイにより結合定数を測定した。標的分子は、実施例１
の手順に従って調製したストロメライシンの触媒ドメイ
ンであった。NMR結合定数KDは、実施例２に記載の２次
元15N/1H NMR相関スペクトルを用いて得た。こうして
得たKD値を、酵素アッセイで測定した阻害定数KIと比較
した。
酵素アッセイでは、発蛍光団とクエンチング剤の分離
を引き起こすペプチド分解時の蛍光増加を追跡すること
により蛍光基質の分解速度を測定した。酵素活性を、各
種濃度のアセトヒドロキサム酸とビアリール化合物のマ
トリックスを用いて測定した。アッセイは、Matayoshi
ら、Science:247:954−958（1990）に記載の蛍光基質特
性を使用し、H.Weingartenら、Anal.Biochem.,147:437
−440（1985）に記載の方法の改変である。
を引き起こすペプチド分解時の蛍光増加を追跡すること
により蛍光基質の分解速度を測定した。酵素活性を、各
種濃度のアセトヒドロキサム酸とビアリール化合物のマ
トリックスを用いて測定した。アッセイは、Matayoshi
ら、Science:247:954−958（1990）に記載の蛍光基質特
性を使用し、H.Weingartenら、Anal.Biochem.,147:437
−440（1985）に記載の方法の改変である。
アセトヒドロキサム酸の濃度を0.0〜1.0Mの範囲で８
段階で変え、化合物の濃度を６段階で変え、全体で48点
で試験した。各化合物の濃度は溶解性及び活性により変
化させた。
段階で変え、化合物の濃度を６段階で変え、全体で48点
で試験した。各化合物の濃度は溶解性及び活性により変
化させた。
アセトヒドロキサム酸それ自体を滴定することを除い
て、すべてのNMR測定を500mMのアセトヒドロキサム酸の
存在下で実施した。化学シフトが添加したリガントに応
じて変化することが観察されたことから、解離定数を求
めた。次いで、標準的な手順に従って阻害データから阻
害定数を求めた。
て、すべてのNMR測定を500mMのアセトヒドロキサム酸の
存在下で実施した。化学シフトが添加したリガントに応
じて変化することが観察されたことから、解離定数を求
めた。次いで、標準的な手順に従って阻害データから阻
害定数を求めた。
これらの試験結果を下記表３にまとめて示す。この表
には、NMR誘導解離定数（KD）と蛍光基質を用いる酵素
アッセイで測定した阻害定数（KI）とを比較して示す。
には、NMR誘導解離定数（KD）と蛍光基質を用いる酵素
アッセイで測定した阻害定数（KI）とを比較して示す。
表３のデータから、本発明のNMR法はリガンドの標的
生体分子に対する解離または結合定数の迅速、効率的且
つ正確な測定方法を提供することが分かる。２つの方法
で測定した結合定数の比較から、試験した化合物の活性
が同じランクに位置づけられる。すなわち、２つの方法
で測定した所与の基質に対する値は同一ではないが、こ
れらの値は相互に比例している。
生体分子に対する解離または結合定数の迅速、効率的且
つ正確な測定方法を提供することが分かる。２つの方法
で測定した結合定数の比較から、試験した化合物の活性
が同じランクに位置づけられる。すなわち、２つの方法
で測定した所与の基質に対する値は同一ではないが、こ
れらの値は相互に比例している。
第２の実験で、E2のDNA−結合ドメインのその標的DNA
に対する結合結果を従来方法で得、本発明の方法で得た
結果と比較した。標的は、実施例１の手順に従って調製
したE2のDNA−結合ドメインであった。NMRスクリーニン
グアッセイ及びリガンド解離定数を測定するためのNMR
法は実施例２に記載のように実施した。
に対する結合結果を従来方法で得、本発明の方法で得た
結果と比較した。標的は、実施例１の手順に従って調製
したE2のDNA−結合ドメインであった。NMRスクリーニン
グアッセイ及びリガンド解離定数を測定するためのNMR
法は実施例２に記載のように実施した。
NMR法による結合定数を、DNAの標的への結合を測定す
る物理的フィルター結合アッセイの結果と比較した。高
処理量フィルター結合アッセイは、上記実施例２に従っ
て調製したE2を用いて実施した。33P−標識DNAは、３個
の高アフィニティーE2結合サイト及び１つの低アフィニ
ティーE2結合サイトを含むHPV−11ゲノムをPSP−65プラ
スミド（Promega,マディソン，ウィスコンシン州）に挿
入して形成した10,329塩基対プラスミドからなるもので
あった。
る物理的フィルター結合アッセイの結果と比較した。高
処理量フィルター結合アッセイは、上記実施例２に従っ
て調製したE2を用いて実施した。33P−標識DNAは、３個
の高アフィニティーE2結合サイト及び１つの低アフィニ
ティーE2結合サイトを含むHPV−11ゲノムをPSP−65プラ
スミド（Promega,マディソン，ウィスコンシン州）に挿
入して形成した10,329塩基対プラスミドからなるもので
あった。
複数の化合物について、NMRで測定した異なるサイト
の結合アフィニティーをフィルター結合アッセイで測定
したE2のDNAへの結合の抑制と比較した。上記した表２
から明らかなように、フィルター結合アッセイで測定し
た活性は、DNA結合サイトのアミドから求めた結合アフ
ィニティーと密接に相関するが、β−バレルサイトで測
定したアフィニティーとは相関しなかった。これは、各
サイトの相対位置に一致する。
の結合アフィニティーをフィルター結合アッセイで測定
したE2のDNAへの結合の抑制と比較した。上記した表２
から明らかなように、フィルター結合アッセイで測定し
た活性は、DNA結合サイトのアミドから求めた結合アフ
ィニティーと密接に相関するが、β−バレルサイトで測
定したアフィニティーとは相関しなかった。これは、各
サイトの相対位置に一致する。
別の試験では、NMRで測定した結合の結果は、当業界
で公知の方法を用いる従来のゲル−シフトアッセイで得
た結果と類似していた。ゲル−シフトアッセイは、完全
長E2と２つのE2結合サイトを含む33P−標識62塩基対DNA
断片とを含むGST融合タンパク質を用いて実施した。
で公知の方法を用いる従来のゲル−シフトアッセイで得
た結果と類似していた。ゲル−シフトアッセイは、完全
長E2と２つのE2結合サイトを含む33P−標識62塩基対DNA
断片とを含むGST融合タンパク質を用いて実施した。
上記方法により、ゲル−シフトアッセイで正の結果を
示した多数の化合物を同定した。しかしながら、正の結
果の幾つかはDNAに結合することに起因するものと考え
られた。何故ならば、この場合、本発明のNMR法を用い
るとE2タンパク質への結合は認められなかったからであ
る。化合物を添加したときタンパク質よりもDNAの化学
シフトが変化することが立証されているように、上記化
合物は実際にはE2よりもむしろDNAに結合することが分
かった。これらのデータから、本発明の更に別の利点が
偽陽性の発現率を最小にし得ることであるが分かる。
示した多数の化合物を同定した。しかしながら、正の結
果の幾つかはDNAに結合することに起因するものと考え
られた。何故ならば、この場合、本発明のNMR法を用い
るとE2タンパク質への結合は認められなかったからであ
る。化合物を添加したときタンパク質よりもDNAの化学
シフトが変化することが立証されているように、上記化
合物は実際にはE2よりもむしろDNAに結合することが分
かった。これらのデータから、本発明の更に別の利点が
偽陽性の発現率を最小にし得ることであるが分かる。
実施例４ ストロメライシンの強力な非ペプチド阻害剤の設計 ストロメライシンの触媒ドメインに結合する新規リガ
ンドを設計するために試験を実施した。ストロメライシ
ンは自己分解されるので、ストロメライシンの分解をブ
ロックする阻害剤を探した。そのような阻害剤を用いれ
ば、酵素の他のサイトに結合する他の強力なリガンドを
容易にスクリーニングできるであろう。
ンドを設計するために試験を実施した。ストロメライシ
ンは自己分解されるので、ストロメライシンの分解をブ
ロックする阻害剤を探した。そのような阻害剤を用いれ
ば、酵素の他のサイトに結合する他の強力なリガンドを
容易にスクリーニングできるであろう。
他の結合サイトをスクリーニングする際に化合物を選
択するときに用いられる基準は、主にリガンドのサイズ
に基づいた。飽和（酵素の＞98％占有率）するに十分な
溶解度を有し酵素を阻害する最小のリガンドを探した。
択するときに用いられる基準は、主にリガンドのサイズ
に基づいた。飽和（酵素の＞98％占有率）するに十分な
溶解度を有し酵素を阻害する最小のリガンドを探した。
ストロメライシンの触媒ドメインのクローニング、発
現及び精製を実施例１に記載した手順を用いて実施し
た。新規リガントを設計する場合の第１ステップは、ス
トロメライシン標的に結合した第１リガンドを同定する
ことであった。その同定は、上記した２次元15N/1H NM
R相関スクリーニング法に従って実施した。
現及び精製を実施例１に記載した手順を用いて実施し
た。新規リガントを設計する場合の第１ステップは、ス
トロメライシン標的に結合した第１リガンドを同定する
ことであった。その同定は、上記した２次元15N/1H NM
R相関スクリーニング法に従って実施した。
一般式Ｒ−（CO）NHOHを有する多数のヒドロキサム酸
を、実施例２に記載の手順を用いてストロメライシンへ
の結合についてスクリーニングした。試験した化合物の
うち、アセトヒドロキサム酸［CH3（CO）NHOH］が選択
基準に最もよく適合した。この化合物は17mMというスト
ロメライシンに対する結合アティニティーを示し、良好
な水溶性を示した。500mMの濃度で、アセトヒドロキサ
ム酸は酵素の分解を抑制し、他の有力なリガンドのスク
リーニングに使用し得る。
を、実施例２に記載の手順を用いてストロメライシンへ
の結合についてスクリーニングした。試験した化合物の
うち、アセトヒドロキサム酸［CH3（CO）NHOH］が選択
基準に最もよく適合した。この化合物は17mMというスト
ロメライシンに対する結合アティニティーを示し、良好
な水溶性を示した。500mMの濃度で、アセトヒドロキサ
ム酸は酵素の分解を抑制し、他の有力なリガンドのスク
リーニングに使用し得る。
設計方法の第２ステツプは、アセトヒドロキサム酸の
結合サイトとは異なるサイトで標的ストロメライシンに
結合する第２のリガンドを同定することであった。この
ために、飽和量のアセトヒドロキサム酸の存在下でスト
ロメライシンに結合する能力について複数の化合物をス
クリーニングした。この第２同定ステップの手順の詳細
及び結果は実施例２に記載した通りである。
結合サイトとは異なるサイトで標的ストロメライシンに
結合する第２のリガンドを同定することであった。この
ために、飽和量のアセトヒドロキサム酸の存在下でスト
ロメライシンに結合する能力について複数の化合物をス
クリーニングした。この第２同定ステップの手順の詳細
及び結果は実施例２に記載した通りである。
これらの試験から第２リガンドとして同定された化合
物は表１の化合物No.4であり（実施例２参照）、この化
合物を次の設計ステップで使用した。
物は表１の化合物No.4であり（実施例２参照）、この化
合物を次の設計ステップで使用した。
設計方法の第３ステップでは、標的ストロメライシ
ン、第１リガンド及び第２リガンドの３元複合体を構築
した。このために、ストロメライシン標的を複合体を形
成し得る条件で２つのリガンドに作用させた。次いで、
３元複合体の３次元構造を下記のNMR分光分析法を用い
て調べた。
ン、第１リガンド及び第２リガンドの３元複合体を構築
した。このために、ストロメライシン標的を複合体を形
成し得る条件で２つのリガンドに作用させた。次いで、
３元複合体の３次元構造を下記のNMR分光分析法を用い
て調べた。
３元複合体中のストロメライシンの1H、13C及び15N骨
格共鳴を、複数の３次元二重及び三重共鳴NMRスペクト
ルを分析して帰属させた（A.Baxら、Acc.Chem.Res.,26:
131−138（1993））。隣接スピン系のＣα共鳴を、それ
ぞれF1（15H）、F2（13C）及びF3（1H）の各ディメンジ
ョンにおいて1773Hz（35.0ppm）、3788Hz（30.1ppm）及
び8333Hz（16.67ppm）の同一スペクトル幅で記録した３
次元（3D）HNCAスペクトル（L.Kayら、J.Magn.Reson.,8
9:496−514（1990））及びHN（CO）CA（A.Baxら、J.Bio
l.NMR,1:99（1991）スペクトルの分析から同定した。
格共鳴を、複数の３次元二重及び三重共鳴NMRスペクト
ルを分析して帰属させた（A.Baxら、Acc.Chem.Res.,26:
131−138（1993））。隣接スピン系のＣα共鳴を、それ
ぞれF1（15H）、F2（13C）及びF3（1H）の各ディメンジ
ョンにおいて1773Hz（35.0ppm）、3788Hz（30.1ppm）及
び8333Hz（16.67ppm）の同一スペクトル幅で記録した３
次元（3D）HNCAスペクトル（L.Kayら、J.Magn.Reson.,8
9:496−514（1990））及びHN（CO）CA（A.Baxら、J.Bio
l.NMR,1:99（1991）スペクトルの分析から同定した。
データマトリックスは、HNCAスペクトルの場合には38
（t1）×48（t2）×1024（t3）複合点であり、HN（CO）
CAスペクトルの場合には32（t1）×40（t2）×1024
（t3）複合点であった。両方のスペクトルを16スキャン
／インクレメントで取得した。３次元CBCA（CO）NHスペ
クトル（S.Grzesiekら、J.Am.Chem.Sco.,114:6261−629
3（1992））を、32（t1,15N）×48（t2,13C）×1024（t
3,1H）複合点及び32スキャン／インクレメントで集め
た。スペクトル幅は、15N、13C及び1Hの各ディメンジョ
ンで1773Hz（35.0ppm）、7575.8Hz（60.2ppm）及び8333
Hz（16.67ppm）であった。
（t1）×48（t2）×1024（t3）複合点であり、HN（CO）
CAスペクトルの場合には32（t1）×40（t2）×1024
（t3）複合点であった。両方のスペクトルを16スキャン
／インクレメントで取得した。３次元CBCA（CO）NHスペ
クトル（S.Grzesiekら、J.Am.Chem.Sco.,114:6261−629
3（1992））を、32（t1,15N）×48（t2,13C）×1024（t
3,1H）複合点及び32スキャン／インクレメントで集め
た。スペクトル幅は、15N、13C及び1Hの各ディメンジョ
ンで1773Hz（35.0ppm）、7575.8Hz（60.2ppm）及び8333
Hz（16.67ppm）であった。
３つのスペクトルすべてについて、1Hキャリア周波数
は水の共鳴に設定し、15Nキャリア周波数は119.1ppmに
設定した。13Cキャリア周波数は、HNCA及びHN（CO）CA
実験の場合には55.0ppm、CBCA（CO）NH実験の場合には4
6.0ppmに設定した。
は水の共鳴に設定し、15Nキャリア周波数は119.1ppmに
設定した。13Cキャリア周波数は、HNCA及びHN（CO）CA
実験の場合には55.0ppm、CBCA（CO）NH実験の場合には4
6.0ppmに設定した。
骨格の帰属を、15N−分離３次元NOESY−HSQCスペクト
ル及び３次元HNHA−Ｊスペクトルで観察された交差ピー
クの分析により確認した。15N−分離３次元NOESY−HSQC
スペクトル（S.Fesikら、J.Magn.Reson.,87:588−593
（1988）、D.Marionら、J.Am.Chem.Soc.,111:1515−151
7（1989））は、80msのスピンロック時間（mixing tim
e）で集めた。16スキャン／インクレメントで全部で68
（t1,15N）×96（t2,1H）×1024（t3,1H）複合点を集
め、スペクトル幅は、15Nディメンジョンに対しては177
3Hz（35.0ppm）、1Hディメンジョンに対しては6666.6Hz
（t2,1H,13.3ppm）及び8333Hz（16.7ppm）であった。
ル及び３次元HNHA−Ｊスペクトルで観察された交差ピー
クの分析により確認した。15N−分離３次元NOESY−HSQC
スペクトル（S.Fesikら、J.Magn.Reson.,87:588−593
（1988）、D.Marionら、J.Am.Chem.Soc.,111:1515−151
7（1989））は、80msのスピンロック時間（mixing tim
e）で集めた。16スキャン／インクレメントで全部で68
（t1,15N）×96（t2,1H）×1024（t3,1H）複合点を集
め、スペクトル幅は、15Nディメンジョンに対しては177
3Hz（35.0ppm）、1Hディメンジョンに対しては6666.6Hz
（t2,1H,13.3ppm）及び8333Hz（16.7ppm）であった。
3JHNαカップリング定数を得るためにも使用された３
次元HNHA−Ｊスペクトル（G.Vuisterら、J.Am.Chem.So
c.,115:7772−7777（1993））を、35（t1,15N）×64（t
2,1H）×1024（t3,1H）複合点及び32スキャン／インク
レメントで取得した。スペクトル幅及びキャリア周波数
は、15N−分離NOESY−HSQCスペクトルと同一であった。
幾つかのＨβシグナルをHNHB実験により帰属させた。掃
引幅は、32（t1,15N）×96（t2,1H）×1024（t3,1H）複
合点で取得した15N−分離NOESY−HSQCスペクトルの場合
と同一であった。
次元HNHA−Ｊスペクトル（G.Vuisterら、J.Am.Chem.So
c.,115:7772−7777（1993））を、35（t1,15N）×64（t
2,1H）×1024（t3,1H）複合点及び32スキャン／インク
レメントで取得した。スペクトル幅及びキャリア周波数
は、15N−分離NOESY−HSQCスペクトルと同一であった。
幾つかのＨβシグナルをHNHB実験により帰属させた。掃
引幅は、32（t1,15N）×96（t2,1H）×1024（t3,1H）複
合点で取得した15N−分離NOESY−HSQCスペクトルの場合
と同一であった。
1H及び13C化学シフトを、殆どすべての側鎖共鳴に対
して帰属させた。３次元HCCH−TOCSYスペクトル（L.Kay
ら、J.Magn.Reson.,101b:333−337（1993））を、13C同
位体スピンロックの場合にはDIPSI−２シークエンス
（S.Ruckerら、Mol.Phys.,68:509（1989））を用いて13
msのスピンロック時間で取得した。全部で96（t1,13C）
×96（t2,1H）×1024（t3,1H）複合データ点を、10638H
z（70.8ppm,w1）、4000Hz（6.67ppm,w2）及び4844Hz
（8.07ppm,w3）のスペクトル幅を用いて16スキャン／イ
ンクレメントで集めた。キャリア位置は、40ppm、2.5pp
m、並びに13C、間接的に検出される1H及び測定される1H
の各ディメンジョンに対する水の周波数であった。
して帰属させた。３次元HCCH−TOCSYスペクトル（L.Kay
ら、J.Magn.Reson.,101b:333−337（1993））を、13C同
位体スピンロックの場合にはDIPSI−２シークエンス
（S.Ruckerら、Mol.Phys.,68:509（1989））を用いて13
msのスピンロック時間で取得した。全部で96（t1,13C）
×96（t2,1H）×1024（t3,1H）複合データ点を、10638H
z（70.8ppm,w1）、4000Hz（6.67ppm,w2）及び4844Hz
（8.07ppm,w3）のスペクトル幅を用いて16スキャン／イ
ンクレメントで集めた。キャリア位置は、40ppm、2.5pp
m、並びに13C、間接的に検出される1H及び測定される1H
の各ディメンジョンに対する水の周波数であった。
別の３次元HCCH−TOCSY実験を、122.5ppmで13C−キャ
リアを用いて実施し、芳香族残基を帰属させた。スペク
トルを、5263Hz（35.0ppm,w1）、3180Hz（5.30ppm,w2）
及び10,000Hz（16.7ppm,w3）のスペクトル幅を用いて、
36（t1,13C）×48（t2,1H）×1024（t3,1H）複合点で得
た。キャリア位置は、122.5ppm、7.5ppm、並びに13C、
間接的に検出される1H及び測定される1Hの各ディメンジ
ョンに対する水周波数であった。
リアを用いて実施し、芳香族残基を帰属させた。スペク
トルを、5263Hz（35.0ppm,w1）、3180Hz（5.30ppm,w2）
及び10,000Hz（16.7ppm,w3）のスペクトル幅を用いて、
36（t1,13C）×48（t2,1H）×1024（t3,1H）複合点で得
た。キャリア位置は、122.5ppm、7.5ppm、並びに13C、
間接的に検出される1H及び測定される1Hの各ディメンジ
ョンに対する水周波数であった。
13C−分離３次元NOESY−HMQCスペクトル（S.Fesik
ら、J.Magn.Reson.,87:588−593（1988）、D.Marion
ら、J.Am.Chem.Soc.,111:1515−1517（1989））を、75m
sのスピンロック時間で記録した。16スキャン／インク
レメントで全部で80（t1,13C）×72（t2,1H）×1024（t
3,1H）複合データ点を、10638Hz（70.49ppm,w1）、666
6.6Hz（13.3ppm,w2）及び8333.3Hz（16.67ppm,w3）のス
ペクトル幅に亘って集めた。1Hキャリア周波数を水の共
鳴に設定し、13Cキャリア周波数を40.0ppmとした。
ら、J.Magn.Reson.,87:588−593（1988）、D.Marion
ら、J.Am.Chem.Soc.,111:1515−1517（1989））を、75m
sのスピンロック時間で記録した。16スキャン／インク
レメントで全部で80（t1,13C）×72（t2,1H）×1024（t
3,1H）複合データ点を、10638Hz（70.49ppm,w1）、666
6.6Hz（13.3ppm,w2）及び8333.3Hz（16.67ppm,w3）のス
ペクトル幅に亘って集めた。1Hキャリア周波数を水の共
鳴に設定し、13Cキャリア周波数を40.0ppmとした。
バリン残基及びロイシン残基のメチル基の立体特異的
帰属を、断片的に13C−標識したタンパク質サンプルの
高分解1H,13C−HSQCスペクトル（G.Bodenhausenら、J.C
hem.Phy.Lett.,69:185−189（1980））において観察さ
れた13C−13C一重結合カップリングパターンに基づく生
合成法（Neriら、Biochem.,28:7510−7516（1989））に
より得た。スペクトルを、200（13C,t1）×2048（1H,
t2）複合点で5000Hz（39.8ppm,13C）及び8333Hz（16.67
ppm,1H）のスペクトル幅に亘って取得した。キャリア位
置は、13Cディメンジョンに対しては20.0ppm、1Hディメ
ンジョンに対しては水の周波数であった。
帰属を、断片的に13C−標識したタンパク質サンプルの
高分解1H,13C−HSQCスペクトル（G.Bodenhausenら、J.C
hem.Phy.Lett.,69:185−189（1980））において観察さ
れた13C−13C一重結合カップリングパターンに基づく生
合成法（Neriら、Biochem.,28:7510−7516（1989））に
より得た。スペクトルを、200（13C,t1）×2048（1H,
t2）複合点で5000Hz（39.8ppm,13C）及び8333Hz（16.67
ppm,1H）のスペクトル幅に亘って取得した。キャリア位
置は、13Cディメンジョンに対しては20.0ppm、1Hディメ
ンジョンに対しては水の周波数であった。
２つのリガンドとタンパク質間のNOEを検出するため
に、３次元の12C−濾過,13C−編集NOESYスペクトルを集
めた。パルススキームは、NOESY−HMQCシークエンス
（S.Fesikら、J.Magn.Reson.,87:588−593（1988）、D.
Marionら、J.Am.Chem.Soc.,111:1515−1517（1989））
と連結した、２重13C−濾過配列からなる（A.Gemmeker
ら、J.Magn.Reson.,96:199−204（1992））。スペクト
ルを80msのスピンロック時間、１インクレメント当たり
16スキャンでもって80（t1,13C）×80（t2,1H）×1024
（t3,1H）全複合点で記録した。スペクトル幅は8865Hz
（17.73ppm,w1）、6667Hz（13.33ppm,w2）及び8333Hz
（16.67ppm,w3）であり、炭素ディメンジョンに対する
キャリア位置は40.0ppmであり、両プロトンディメンジ
ョンに対するキャリア位置は水の周波数であった。
に、３次元の12C−濾過,13C−編集NOESYスペクトルを集
めた。パルススキームは、NOESY−HMQCシークエンス
（S.Fesikら、J.Magn.Reson.,87:588−593（1988）、D.
Marionら、J.Am.Chem.Soc.,111:1515−1517（1989））
と連結した、２重13C−濾過配列からなる（A.Gemmeker
ら、J.Magn.Reson.,96:199−204（1992））。スペクト
ルを80msのスピンロック時間、１インクレメント当たり
16スキャンでもって80（t1,13C）×80（t2,1H）×1024
（t3,1H）全複合点で記録した。スペクトル幅は8865Hz
（17.73ppm,w1）、6667Hz（13.33ppm,w2）及び8333Hz
（16.67ppm,w3）であり、炭素ディメンジョンに対する
キャリア位置は40.0ppmであり、両プロトンディメンジ
ョンに対するキャリア位置は水の周波数であった。
溶媒とゆっくり交換するアミド基を同定するために、
一連の1H,15N−HSQCスペクトル（G.Bodebhausenら、J.C
hem.Phys.Lett.,68:185−189（1980））を、タンパク質
をD2Oに交換した後25℃で２時間間隔で記録した。D2Oを
添加してから２時間後から、第１のFSQCスペクトルの取
得を開始した。
一連の1H,15N−HSQCスペクトル（G.Bodebhausenら、J.C
hem.Phys.Lett.,68:185−189（1980））を、タンパク質
をD2Oに交換した後25℃で２時間間隔で記録した。D2Oを
添加してから２時間後から、第１のFSQCスペクトルの取
得を開始した。
すべてのNMRスペクトルをBruker AMX500またはAMX60
0 NMR分光光度計を用いて25℃で記録した。NMRデータ
をSilicon Graphicsコンピューターを用いて処理し、
分析した。すべてのNMR実験で、適宜記載（A.Baxら、J.
Magn.Reson.,99:638（1992））されているようにパルス
場勾配（pulsed field gradient）を与え、溶媒シグ
ナル及び人工的なスペクトル結果を抑制した。間接的に
検出されたディメンジョンの定積分検出を、States−TP
PI法（D.Marionら、J.Am.Chem.Soc.,111:1515−1517（1
989））を用いて実施した。記載（E.Olejniczakら、J.M
agn.Reson.,87:628−632（1990））されている直線予測
法を使用した。
0 NMR分光光度計を用いて25℃で記録した。NMRデータ
をSilicon Graphicsコンピューターを用いて処理し、
分析した。すべてのNMR実験で、適宜記載（A.Baxら、J.
Magn.Reson.,99:638（1992））されているようにパルス
場勾配（pulsed field gradient）を与え、溶媒シグ
ナル及び人工的なスペクトル結果を抑制した。間接的に
検出されたディメンジョンの定積分検出を、States−TP
PI法（D.Marionら、J.Am.Chem.Soc.,111:1515−1517（1
989））を用いて実施した。記載（E.Olejniczakら、J.M
agn.Reson.,87:628−632（1990））されている直線予測
法を使用した。
次いで、３元複合体の誘導された３次元構造を用い
て、第１及び第２のリガンドの一方のリガンドに対する
及び標的ストロメライシン分子に対する立体配向を規定
した。
て、第１及び第２のリガンドの一方のリガンドに対する
及び標的ストロメライシン分子に対する立体配向を規定
した。
NOEデータから誘導される距離抑制（distancerestrai
ns）を、下限を1.8Å及び上限をそれぞれ2.5Å、3.0
Å、3.5Å、4.0Å、4.5Å及び5.0Åとして、NOE交差ピ
ーク強度に基づいて６カテゴリーに分類した。φねじれ
角に対する抑制を、３次元HNHA−Ｊスペクトル（G.Vuis
terら、J.Am.Chem.Soc.,115:7772−7777（1993））から
測定した3JNHα結合定数から誘導した。φ角度は、3JHN
Hα＞8.5Hzの場合には120％±40％に、3JNHα＞5Hzの場
合には60％±40％に抑制された。
ns）を、下限を1.8Å及び上限をそれぞれ2.5Å、3.0
Å、3.5Å、4.0Å、4.5Å及び5.0Åとして、NOE交差ピ
ーク強度に基づいて６カテゴリーに分類した。φねじれ
角に対する抑制を、３次元HNHA−Ｊスペクトル（G.Vuis
terら、J.Am.Chem.Soc.,115:7772−7777（1993））から
測定した3JNHα結合定数から誘導した。φ角度は、3JHN
Hα＞8.5Hzの場合には120％±40％に、3JNHα＞5Hzの場
合には60％±40％に抑制された。
当初の構造に基づいてアミドをゆっくり交換するため
に同定される水素結合は、２つの抑制、すなわちＨ−Ｏ
距離の場合には1.8〜2.5Å及びＮ−Ｏ距離の場合には1.
8〜3.3Åにより規定された。構造を、Silicon Graphic
sコンピユーターにより、Ｘ−PLOR3.1プログラム（A.Br
nger,“XPLOR3.1マニュアル",Yale University Pre
ss,New Haven,1992）で、ハイブリッド距離幾何学−模
擬アニーリング法（M.Nilgesら、FEBS Lett.,229:317
−324（1988））を用いて計算した。
に同定される水素結合は、２つの抑制、すなわちＨ−Ｏ
距離の場合には1.8〜2.5Å及びＮ−Ｏ距離の場合には1.
8〜3.3Åにより規定された。構造を、Silicon Graphic
sコンピユーターにより、Ｘ−PLOR3.1プログラム（A.Br
nger,“XPLOR3.1マニュアル",Yale University Pre
ss,New Haven,1992）で、ハイブリッド距離幾何学−模
擬アニーリング法（M.Nilgesら、FEBS Lett.,229:317
−324（1988））を用いて計算した。
全体で1032個の推定プロトン間距離抑制をNOEデータ
から誘導した。更に、21個の不明瞭な分子間距離抑制を
３次元12C濾過,13C−編集NOESYスペクトルから誘導し
た。タンパク質を含めた1032個のNOE抑制のうち、341は
残基間であり、410は主要配列中の５個未満のアミノ酸
により分離される残基間の逐次またはショートレンジで
あり、281は少なくとも５個のアミノ酸で分離される残
基を含むロングレンジであった。
から誘導した。更に、21個の不明瞭な分子間距離抑制を
３次元12C濾過,13C−編集NOESYスペクトルから誘導し
た。タンパク質を含めた1032個のNOE抑制のうち、341は
残基間であり、410は主要配列中の５個未満のアミノ酸
により分離される残基間の逐次またはショートレンジで
あり、281は少なくとも５個のアミノ酸で分離される残
基を含むロングレンジであった。
NOE距離抑制に加えて、14個のφ二面角抑制が、HNHA
−Ｊスペクトル（G.Viiosterら、J.Am.Chem.Soc.,115:7
772−7777（1993））から求めた３つの結合カップリン
グ定数（3JHNHα）から誘導された構造計算中に含まれ
た。実験的抑制は、60個の水素結合に相当する120個の
距離抑制を含んでいた。水素結合に関与するアミドは、
特徴的な遅い交換速度及び水素結合の抑制なしに計算さ
れた最初のNMRスペクトルからの水素結合の相手に基づ
いて同定された。非冗長な実験的に誘導される抑制の総
数は1166であった。
−Ｊスペクトル（G.Viiosterら、J.Am.Chem.Soc.,115:7
772−7777（1993））から求めた３つの結合カップリン
グ定数（3JHNHα）から誘導された構造計算中に含まれ
た。実験的抑制は、60個の水素結合に相当する120個の
距離抑制を含んでいた。水素結合に関与するアミドは、
特徴的な遅い交換速度及び水素結合の抑制なしに計算さ
れた最初のNMRスペクトルからの水素結合の相手に基づ
いて同定された。非冗長な実験的に誘導される抑制の総
数は1166であった。
構造は、NMR実験的抑制とうまく一致した。0.4Å以上
の距離侵害も５度以上の二面角侵害もなかった。また、
ファンデルワールス反発力の偽装エネルギーは小さく、
このことから構造は誤った原子間作用を欠いていた。
の距離侵害も５度以上の二面角侵害もなかった。また、
ファンデルワールス反発力の偽装エネルギーは小さく、
このことから構造は誤った原子間作用を欠いていた。
対応する理想化パラメーターからの結合−長さ及び結
合−角度のずれが小さいことが示すように、NMR構造は
良好な共役結合幾何学的構造を示した。残基93〜247の
８つの構造の、平均座標からの平均の原子２乗平均偏差
は、骨格原子（Ca,N及びＣ′）の場合0.93Åであり、非
水素原子の場合はすべて1.43Åであった。
合−角度のずれが小さいことが示すように、NMR構造は
良好な共役結合幾何学的構造を示した。残基93〜247の
８つの構造の、平均座標からの平均の原子２乗平均偏差
は、骨格原子（Ca,N及びＣ′）の場合0.93Åであり、非
水素原子の場合はすべて1.43Åであった。
ストロメライシン、アセトヒドロキサム酸（第１リガ
ンド）及び第２リガンドを含む３元複合体のリボンプロ
ットを図10に示す。構造は、他のマトリックスメタロプ
ロテインナーゼの全ホールドと非常に類似しており、５
−ストランドβ−シート及び３個のａ−ヘリックスから
構成されている。
ンド）及び第２リガンドを含む３元複合体のリボンプロ
ットを図10に示す。構造は、他のマトリックスメタロプ
ロテインナーゼの全ホールドと非常に類似しており、５
−ストランドβ−シート及び３個のａ−ヘリックスから
構成されている。
触媒亜鉛は結合ポケット中に位置していた。亜鉛は３
つのヒスチジンとアセトヒドロキサム酸の２つの酸素原
子と配位していた。第２リガンドのビアリール基は、第
２ヘリックスと残基218〜223から形成されるループとの
間のS1′ポケット中に位置していた。この深く且つ狭い
ポケットには、リガンドとうまく作用させる疎水性残基
がライニングされていた。
つのヒスチジンとアセトヒドロキサム酸の２つの酸素原
子と配位していた。第２リガンドのビアリール基は、第
２ヘリックスと残基218〜223から形成されるループとの
間のS1′ポケット中に位置していた。この深く且つ狭い
ポケットには、リガンドとうまく作用させる疎水性残基
がライニングされていた。
上記したように調べた３元複合体の３次元構造及びス
トロメライシンに対する、第２リガンドに構造的に類似
している化合物（すなわち、他のビアリール化合物）の
結合について測定した構造／活性の関係に基づいて、ア
セトヒドロキサム酸をビアリールに結合させる新規分子
を設計した。
トロメライシンに対する、第２リガンドに構造的に類似
している化合物（すなわち、他のビアリール化合物）の
結合について測定した構造／活性の関係に基づいて、ア
セトヒドロキサム酸をビアリールに結合させる新規分子
を設計した。
以下の表４に示すように、選択した当初のビアリール
類は酸素リンカーを含み、ビアリール結合に対してパラ
位にCNを任意に存在するものであった。最初のリンカー
は、長さの異なるメチレン単位を含んでいた。長さの異
なるメチレン単位を有するリンカーを用いて化合物を結
合させる方法は当業界で公知である。
類は酸素リンカーを含み、ビアリール結合に対してパラ
位にCNを任意に存在するものであった。最初のリンカー
は、長さの異なるメチレン単位を含んでいた。長さの異
なるメチレン単位を有するリンカーを用いて化合物を結
合させる方法は当業界で公知である。
CN置換ビアリールがストロメライシンに対してうまく
結合することから予測されるように、CN誘導体は良好な
ストロメライシン抑制を示した。ストロメライシンを最
高に抑制した化合物は、２つのメチレン単位を含むリン
カーを含んでいた。
結合することから予測されるように、CN誘導体は良好な
ストロメライシン抑制を示した。ストロメライシンを最
高に抑制した化合物は、２つのメチレン単位を含むリン
カーを含んでいた。
本発明を好ましい実施態様を参照しながら説明してき
た。これらの実施態様により、請求の範囲及び明細書を
限定されない。当業者ならば、本発明の範囲及び思想を
逸脱しない範囲で上記実施態様に変化、変更及び修正を
容易に加えることができる。
た。これらの実施態様により、請求の範囲及び明細書を
限定されない。当業者ならば、本発明の範囲及び思想を
逸脱しない範囲で上記実施態様に変化、変更及び修正を
容易に加えることができる。
配列表 配列番号:1 配列の長さ:174 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:2 配列の長さ:83 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:3 配列の長さ:18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA（genomic） 配列 配列番号:4 配列の長さ:18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA（genomic） 配列 配列番号:5 配列の長さ:28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA（genomic） 配列 配列番号:6 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:DNA（genomic） 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ＳＣＩＥＮＣＥ ｖｏｌ．274 ｐｐ. 1531−1534 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 24/00 - 24/12
Claims (7)
- 【請求項１】特定の標的分子に結合するリガンドである
化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法で
あって、 ａ）15N−標識標的分子の第１の２次元15N/1H NMR相関
スペクトルを発生させるステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を１つまたはそれ以上の化学
化合物に作用させるステップ、 ｃ）ステップｂ）で１つまたはそれ以上の化合物に作用
させた標識標的分子の第２の２次元15N/1H NMR相関ス
ペクトルを発生させるステップ、及び ｄ）第１の２次元15N/1H NMR相関スペクトルと第２の
２次元15N/1H NMR相関スペクトルを比較して第１と第
２のスペクトルの違いを調べ、その違いから標的分子に
結合したリガンドである１つまたはそれ以上の化合物の
存在を同定するステップを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】ステップｂ）において15N−標識標的分子
を化学化合物の混合物に作用させ、更にステップｄ）に
続いて ｅ）15N−標識標的分子を個別に前記混合物中の各化合
物に作用させるステップ、 ｆ）個別に各化合物に作用させた標識標的分子の２次元
15N/1H NMR相関スペクトルを発生させるステップ、及
び ｇ）ステップｆ）で発生した各スペクトルと第１スペク
トルを比較して第１スペクトルと各化合物のスペクトル
の違いを調べ、その違いから標的分子に結合したリガン
ドである化合物の存在を同定するステップを含むことを
特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】２次元15N/1H NMR相関スペクトルの違い
が標的分子中の特定の15N−標識サイトの化学シフト及
び前記15N−標識サイトに結合したプロトンの化学シフ
トであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】標的分子がポリペプチドである請求項１に
記載の方法。 - 【請求項５】標的分子と前記標的分子に結合するリガン
ド間の解離定数を測定する方法であって、 ａ）15N−標識標的分子の第１の２次元15N/1H NMR相関
スペクトルを発生させるステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を濃度の異なるリガンドに作
用させるステップ、 ｃ）ステップｂ）の各濃度のリガンドで２次元15N/1H
NMR相関スペクトルを発生させるステップ、 ｄ）ステップｃ）で発生させた各スペクトルをステップ
ａ）で発生させた第１スペクトル及びステップｃ）で発
生させた他のすべてのスペクトルと比較してスペクトル
間の違いをリガンド濃度の違いの変化の関数として定量
するステップ、及び ｅ）前記した違いから、式 ｛式中、［Ｐ］０は標的分子の総モル濃度であり、
［Ｌ］０はリガンドの総モル濃度であり、ｘは式 （ここで、δobs及びδfreeはそれぞれリガンドの各濃
度で測定した標的分子に対する化学シフト値及びリガン
ド不在下での標的分子に対する化学シフト値であり、Δ
は飽和量のリガンド及びδfreeでの化学シフト間の差で
ある）に従って決定される結合種のモル濃度である｝ に従って標的分子とリガンド間の解離定数を算出するス
テップを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項６】標的分子がポリペプチドであることを特徴
とする請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】更にステップａ）の前に、標識標的分子を
第２リガンドに結合させるステップを含むことを特徴と
する請求項５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/555,691 | 1995-11-14 | ||
| US555,691 | 1995-11-14 | ||
| US08/555,691 US5698401A (en) | 1995-11-14 | 1995-11-14 | Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules |
| PCT/US1996/018270 WO1997018471A1 (en) | 1995-11-14 | 1996-11-13 | Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11513498A JPH11513498A (ja) | 1999-11-16 |
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Family
ID=24218250
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9519074A Expired - Lifetime JP3032301B2 (ja) | 1995-11-14 | 1996-11-13 | 生体分子の標的用リガンドを同定するための核磁気共鳴の使用 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (2) | EP0866967B2 (ja) |
| JP (1) | JP3032301B2 (ja) |
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| AU (1) | AU701810B2 (ja) |
| CA (1) | CA2237343C (ja) |
| DE (2) | DE69631842D1 (ja) |
| DK (1) | DK0866967T4 (ja) |
| ES (1) | ES2143793T5 (ja) |
| GR (1) | GR3032361T3 (ja) |
| IL (2) | IL123923A (ja) |
| PT (1) | PT866967E (ja) |
| WO (1) | WO1997018471A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006082963A1 (ja) * | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | 標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物との結合検出方法 |
Families Citing this family (77)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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