WO2006082963A1 - 標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物との結合検出方法 - Google Patents

標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物との結合検出方法 Download PDF

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WO2006082963A1
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target molecule
labeled
ligand
amino acid
atom
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PCT/JP2006/301984
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English (en)
French (fr)
Inventor
Toshiyuki Kohno
Original Assignee
Mitsubishi Chemical Corporation
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
    • G01R33/46—NMR spectroscopy
    • G01R33/465—NMR spectroscopy applied to biological material, e.g. in vitro testing

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting the binding between a target molecule and a ligand or a ligand candidate compound that binds to the target molecule, a method for identifying the binding site of a ligand that binds to the target molecule, and a target molecule and a ligand.
  • the present invention relates to a method for measuring a dissociation constant.
  • a novel drug candidate substance that specifically inhibits the pathogenic protein can be screened or obtained as a result of screening. It can be used for rapid drug design because it is possible to identify which part of the pathogenic protein is bound by the compound or other compound obtained by other methods. is there.
  • the 15 N HSQC measurement is relatively sensitive, so the sample concentration is relatively low and the measurement time is short to identify the substrate and ligand binding to such target molecules. There is a feature that can be completed.
  • the binding site if the target molecule is, for example, in the case of high molecular weight proteins, the determination of whether the force not the over 1 HSQC substrates or ligands that are multi-instrument assumed that each signal overlap of the spectrum are attached also binding In some cases, there were cases where problems occurred.
  • NM R signal target molecule is observed when 1 H- 15 N HSQC measurement of protein is a signal derived from the main backbone of 1 H- 15 N direct binding of the polypeptide chain.
  • the atoms are linked in the order of nitrogen atom, ⁇ carbon atom, and carbon carbon atom, so the nitrogen atom appears only in a ratio of 1 in 3 atoms. That is, in the ' ⁇ - 15 ⁇ HSQC spectrum, the site force for detecting the binding of the substrate exists only every 3 atoms.
  • the signal detected in the 15 N HSQ C spectrum is a correlation signal between 1 H and 15 N directly bound, and there is a correlation between the shifts of these chemical shifts.
  • a change in one signal is essentially a change in the chemical shift of one atom. From these, a method using an 1 HSQC spectrum would actually detects only changes in a limited range of target molecules. Therefore, in order to accurately identify whether or not the substrate or ligand has bound to the target molecule, or to accurately identify the binding site, a method is desired that can observe the site more widely and has a certain degree of sensitivity and force! /, The
  • a carbon atom in a protein is labeled using 13 C, which is capable of NMR measurement with a stable isotope, and H—C HSQC (heteronuclear single quantum coherence (See Table 2004 — 510952), specifically, HSQC measurements between the carbon and hydrogen atoms of the methyl group in the side chain of the target molecule were made and assumed for the target molecule.
  • H—C HSQC heterouclear single quantum coherence
  • This method detects the binding of a target molecule to a substrate or a ligand, in which HSQC measurement is performed mainly between the carbon atom and hydrogen atom of the methyl group to prevent signal overlap.
  • HSQC measurement is performed mainly between the carbon atom and hydrogen atom of the methyl group to prevent signal overlap.
  • amino acids with methyl groups Only Do can get HSQC signals, so it is impossible to detect the force was limited range of binding to the target molecule and the group quality or ligand.
  • a method using a two-dimensional or multidimensional correlation spectrum between two hydrogen atoms in an unlabeled protein has been developed. This method has problems such as very low NMR measurement sensitivity and the inability to obtain spectra for high molecular weight proteins.
  • the problem to be solved by the present invention is to observe a wider range of target molecules in a method for identifying the binding of a ligand or a ligand candidate compound and the binding site by NMR measurement, It is an object of the present invention to provide a method capable of more accurately identifying the binding of a compound and the identification of the binding site.
  • a human FKBP protein which is a target molecule
  • a hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the main chain Two-dimensional correlation spectrum of the carbonyl carbon atom in the amino acid residue immediately before the amino acid residue in which the nitrogen atom is present, and the hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the main chain and the amino acid residue in which the nitrogen atom is present Performs two-dimensional NMR measurement that can obtain the correlation spectrum of a carbon atom in the amino acid residue one before, and further coexists with the target molecule and 1-acetylyl proline methyl ester as a ligand candidate compound.
  • step (c) a hydrogen atom bonded to a nitrogen atom of the labeled main chain in the target molecule in step (b), and a labeled ⁇ carbon atom in an amino acid residue that is the same as or adjacent to the nitrogen atom), 8 carbons Measuring a two-dimensional correlation spectrum with atomic or carbo carbon atoms, and
  • step (d) A step of comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c) between the target molecule and the ligand or ligand compound. How to detect binding.
  • step (c) a hydrogen atom bonded to a nitrogen atom of the labeled main chain in the target molecule in step (b), and a labeled ⁇ carbon atom in an amino acid residue that is the same as or adjacent to the nitrogen atom), 8 carbons Measuring a two-dimensional correlation spectrum with atomic or carbo carbon atoms,
  • step (d) a step of comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c); (e) If a difference is found in the two-dimensional correlation spectrum in step (d), the compounds in the mixture of candidate ligand compounds are individually contacted with the target molecule, and labeled in the target molecule.
  • step (f) A method for screening a ligand compound that binds to a target molecule, comprising the step of comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional spectrum obtained in step (e).
  • step (c) a hydrogen atom bonded to a nitrogen atom of the labeled main chain in the target molecule in step (b), and a labeled ⁇ carbon atom in an amino acid residue that is the same as or adjacent to the nitrogen atom), 8 carbons Measuring a two-dimensional correlation spectrum with atomic or carbo carbon atoms,
  • step (d) a step of comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c);
  • step (e) If a difference is found in the two-dimensional correlation spectrum in step (d), a ligand or ligand combination that binds to the target molecule, including the step of identifying the amino acid corresponding to the signal in which the difference is seen A method for identifying a binding site of an object.
  • step (c) a hydrogen atom bonded to a nitrogen atom of the labeled main chain in the target molecule in step (b), and a labeled ⁇ carbon atom in an amino acid residue that is the same as or adjacent to the nitrogen atom), 8 carbons original Measuring a two-dimensional correlation spectrum with a child or carbo carbon atom,
  • step (d) comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c);
  • the target molecule and the ligand or ligand combination include a step of quantifying the difference in the spectrum as a function of the ligand or ligand concentration.
  • the two-dimensional correlation spectrum shows a hydrogen atom bonded to a nitrogen atom in the labeled main chain and a labeled carbohydrate in the amino acid residue immediately preceding the amino acid residue in which the nitrogen atom exists.
  • the two-dimensional correlation spectrum shows that the hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the labeled main chain and the labeled ⁇ in the amino acid residue immediately before the amino acid residue in which the nitrogen atom is present.
  • step (c) measuring a two-dimensional correlation spectrum between hydrogen atoms bonded to labeled main chain atoms in the target molecule in step (b) and other hydrogen atoms in the target molecule;
  • step (d) A step of comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c) between the target molecule and the ligand or ligand compound. How to detect binding.
  • step (b) contacting the target molecule with a mixture of ligand candidate compounds comprising two or more ligand candidate compounds; (c) a step of measuring a two-dimensional correlation spectrum between a hydrogen atom bonded to a labeled main chain atom in the target molecule in step (b) and another hydrogen atom in the target molecule;
  • step (d) a step of comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c);
  • step (e) When a difference is found in the two-dimensional correlation spectrum in step (d), the compounds in the mixture of ligand candidate compounds are individually contacted with the target molecule, and the label in the target molecule is labeled. Measuring a two-dimensional correlation spectrum between a hydrogen atom bonded to the selected main chain atom and another hydrogen atom in the target molecule;
  • step (f) A method for screening a ligand compound that binds to a target molecule, comprising the step of comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional spectrum obtained in step (e).
  • step (c) a step of measuring a two-dimensional correlation spectrum between a hydrogen atom bonded to a labeled main chain atom in the target molecule in step (b) and another hydrogen atom in the target molecule;
  • step (d) a step of comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c);
  • step (e) If a difference is found in the two-dimensional correlation spectrum in step (d), a ligand or ligand combination that binds to the target molecule, including the step of identifying the amino acid corresponding to the signal in which the difference is seen A method for identifying a binding site of an object.
  • step (c) a step of measuring a two-dimensional correlation spectrum between a hydrogen atom bonded to a labeled main chain atom in the target molecule in step (b) and another hydrogen atom in the target molecule; (d) comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c); and
  • the target molecule and the ligand or ligand combination include a step of quantifying the difference in the spectrum as a function of the ligand or ligand concentration.
  • the target molecule is a target molecule labeled with nitrogen and carbon in the main chain, and the hydrogen atom bonded to the labeled main chain atom is a hydrogen atom bonded to the labeled main chain nitrogen atom, The other hydrogen atom in the target molecule is a hydrogen atom bonded to the carbon atom of the labeled main chain in the amino acid residue immediately before the amino acid residue in which the nitrogen atom is present.
  • the method according to any one of (8) to (12).
  • the target molecule is a target molecule labeled with nitrogen and carbon in the main chain, and the hydrogen atom bonded to the labeled main chain atom is hydrogen bonded to the labeled main chain nitrogen atom.
  • Other hydrogen atoms in the target molecule are hydrogen atoms bonded to the amino acid residue in which the nitrogen atom is present and the labeled main chain carbon atom in the previous amino acid residue.
  • the target molecule is a target molecule labeled with nitrogen and carbon in the main chain, and the hydrogen atom bonded to the labeled main chain atom is hydrogen bonded to the labeled main chain nitrogen atom.
  • Other hydrogen atoms in the target molecule bonded to the labeled main chain carbon atom in the amino acid residue immediately preceding the amino acid residue in which the nitrogen atom is present, and the nitrogen The method according to any one of (8) to (12), characterized in that it is a hydrogen atom bonded to the ⁇ carbon atom in the amino acid residue immediately before the amino acid residue in which the atom exists. Best mode for carrying out
  • a hydrogen atom bonded to a nitrogen atom of a labeled main chain in a 13 CZ 15 N double-labeled target molecule is the same as or adjacent to the nitrogen atom.
  • a step of measuring a two-dimensional correlation spectrum (b) a step of contacting the target molecule with at least one ligand, a ligand compound, or a ligand candidate compound, (c) in the target molecule of step (b) Two-dimensional correlation between a hydrogen atom bonded to a nitrogen atom of the labeled main chain of and a labeled a carbon atom, ⁇ carbon atom or carbo carbon atom in an amino acid residue identical or adjacent to the nitrogen atom And (d) comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c).
  • a hydrogen atom bonded to a labeled main chain atom in a target molecule labeled with at least main chain nitrogen and Z or carbon Measuring a two-dimensional correlation spectrum between other hydrogen atoms in the target molecule, (b) contacting the target molecule with at least one ligand, ligand-ligand, or candidate ligand (C) measuring the two-dimensional correlation spectrum between the hydrogen atom bonded to the labeled main chain atom in the target molecule in step (b) and the other hydrogen atom in the target molecule; and (d) A method for detecting the binding between a target molecule and a ligand or ligand compound, comprising a step of comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c).
  • the “target molecule” means (1) having a main skeleton linked with amino acids, and (2) in the case of the first embodiment of the present invention described above, 13 CZ 15 N double-labeled.
  • the carbon atom or nitrogen atom of the main chain can be labeled with a label capable of NMR measurement such as 13 C or 15 N, (3) Any one can be used as long as a two-dimensional correlation vector described later can be acquired.
  • Specific examples include polypeptides, proteins, glycoproteins, partial fragments thereof or derivatives thereof, lipoproteins, partial fragments thereof or derivatives thereof.
  • the molecular weight is not particularly limited as long as the two-dimensional correlation spectrum described later can be obtained, but in the case of a polypeptide or protein, those having 10-: LOOO amino acid residue strength are preferable. In the case of glycoproteins or lipoproteins, those having a molecular weight of about 1 to about LOOkD are preferably used. In the case of polypeptides or proteins, chemical synthesis, It may be obtained by any method such as synthesis using a recombinant or cell-free protein synthesis system.
  • the target molecule when the target molecule is 13 CZ 15 N double-labeled, it is not necessary that all the carbon atoms or nitrogen atoms in the target molecule are the stable isotopes. At least the nitrogen atom of the main chain necessary for obtaining the two-dimensional correlation spectrum described later is 15 N, and the ⁇ carbon atom, ⁇ carbon atom, or carbon carbon in the amino acid residue that is the same as or adjacent to the nitrogen atom Other parts of the nitrogen and carbon atoms, as long as the atom is 13 C, may or may not be labeled with 15 or 13 C.
  • the hydrogen atoms bonded to labeled nitrogen atom of the main chain is required to be 1 Eta but a hydrogen atom the other may or may not be labeled with deuterium or the like.
  • some or all of the hydrogen atoms other than the hydrogen atom bonded to the nitrogen atom may be labeled with deuterium or the like. preferable.
  • the target molecule when the target molecule is labeled with 13 C and / or 15 ⁇ , it is necessary that all the carbon atoms or nitrogen atoms in the target molecule are the stable isotopes.
  • at least the other nitrogen and carbon atoms should be 15 or 13 C as long as the atoms necessary to acquire the two-dimensional correlation spectrum described later are labeled with 15 or 13 C. You don't have to be.
  • the atoms that need to be labeled to obtain the two-dimensional correlation spectrum described later are at least main chain nitrogen and ⁇ or carbon, and hydrogen atoms bonded to nitrogen or carbon other than the main chain are described below.
  • the nitrogen or carbon to which the hydrogen atom is bonded is also labeled.
  • a two-dimensional correlation between a hydrogen atom bonded to the main chain nitrogen atom in the target molecule and another hydrogen atom in the target molecule hereinafter sometimes referred to as a “second hydrogen atom”.
  • a target molecule that is also labeled with nitrogen or carbon to which a main chain nitrogen atom and a second hydrogen atom are bonded is preferably used.
  • the main chain ⁇ carbon atom preferably the second A target molecule labeled with nitrogen or carbon to which a hydrogen atom is bonded is used.
  • the hydrogen atom for obtaining the two-dimensional correlation spectrum described below is required to be 1 H.
  • Other hydrogen atoms may or may not be labeled with deuterium or the like.
  • some or all of the hydrogen atoms other than the hydrogen atom for observing the NMR signal may be labeled with deuterium or the like. preferable.
  • amino acids contained in the target molecule those amino acids that require labeling with 15 N or 13 C of the nitrogen and carbon atoms have already been identified as the amino acids to which the ligand or ligand compound binds. If it is or is assumed, the nitrogen atom and / or carbon atom of only the amino acid is labeled with 15 N or 13 C (hereinafter, this may be referred to as “labeling”), If necessary, other amino acids may or may not be labeled.
  • the hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the main chain and the carbon atom of the amino acid residue adjacent to the amino acid residue in which the nitrogen atom is present or the amino acid in which the nitrogen atom is present Amino acids adjacent to a residue
  • the ligand is! /
  • the amino acid to which the ligand compound is bound and the amino acid adjacent to it are the above It needs to be marked.
  • the labeling is performed for all amino acids.
  • Such a labeled target molecule is sometimes referred to herein as a “labeled target molecule”.
  • the labeling of the target molecule can be performed by a commonly used method in which the nitrogen atom and the carbon atom are labeled. Also, commercially available labeled amino acids (Cambridge Isotope Laboratories, etc.) can be used.
  • the target molecule is a polypeptide or a protein
  • a method of producing a labeled target molecule by performing protein synthesis using labeled amino acids and unlabeled amino acids as substrates is preferably used. Since the protein synthesis system is protein synthesis using stable isotopes, a cell-free protein synthesis system is preferably used, and a cell-free protein synthesis system using a wheat germ extract is particularly preferably used. Examples of wheat germ extract include Sawasaki.
  • Protein synthesis using a wheat germ extract can be carried out by a commonly used method. Specifically, for example, Sawasaki. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 55 9-564 (2000).
  • the concentration of the labeled substrate and the unlabeled substrate is suitably in the range of 0.05 to 0.4 mM.
  • transaminase inhibitor when selectively labeling alanine or aspartic acid, a method in which a transaminase inhibitor is present in a cell-free protein synthesis translation reaction solution in a concentration range that does not inhibit protein synthesis activity, etc. Is used.
  • a specific example of transaminase aminooxyacetic acid or the like is used, and a preferable concentration range in the translation reaction solution is 0.01 to: LOmM.
  • transaminase inhibitors and glutamine synthesis inhibitors are present in the cell-free protein synthesis translation reaction solution in a concentration range that does not inhibit protein synthesis activity. Or the like.
  • transaminase aminooxyacetic acid or the like is used, and a preferable concentration range in the translation reaction solution is 0.01 to: LOmM.
  • glutamine synthetase for example, L-methionine sulphoximine is used, and a preferable concentration range in the translation reaction solution is 0.01 to 20 mM.
  • the labeled target molecule synthesized by culling can be obtained by collecting it from the translation reaction solution and, if necessary, purifying it by an appropriate method.
  • concentration method include a method using an ultrafiltration concentrator.
  • a method using a commercially available spin column or the like is preferably used.
  • the hydrogen atom bonded to the labeled nitrogen atom in the target molecule (hereinafter sometimes referred to as “amide proton”) and the carbon atom for obtaining the two-dimensional correlation spectrum are the same as or adjacent to the nitrogen atom. It may be a deviation of a labeled a carbon atom, ⁇ carbon atom or carbonyl carbon atom in the amino acid residue.
  • Any NMR measurement method can be used as long as the correlation spectrum of the amide proton and carbon atom can be obtained. However, if there are many signals, they will overlap and analysis will be difficult.
  • An NMR measurement method that can obtain a correlation spectrum of one or two carbon atoms is obtained for one amide proton. Further, a correlation spectrum of one carbon atom is obtained for one amide proton.
  • the NMR measurement method is most preferred. Specific examples are shown below.
  • the H (N) CO method (Cavanagh, WJ, et al., Protein NMR) In the NHC03 next-order measurement method, which is self-published in Spe ctroscopy, Principles and Practice. Academic Press (1996), two-dimensional measurement omitting the N development time: Fig. 1) is used.
  • the H (NCA) CO method (Cavanagh, WJ) can be used to obtain a two-dimensional correlation spectrum between the carbon carbon atom in the same amino acid residue as the amido proton and the carbonyl carbon atom in the previous amino acid residue.
  • HN (CA) C03 dimensional measurement method uses two-dimensional measurement without N development time: Fig. 1).
  • H (NCO) CA method and avanagh, WJ, et al., Protein NMR spectroscopy, Principles ana Practice.
  • HN (CO) CA three-dimensional measurement method described in emic Press (1996), two-dimensional measurement without the N development time: Fig. 1) is used.
  • H (N) CA method (Cavanagh, WJ, et al.) Can be used to obtain a two-dimensional correlation spectrum of the ⁇ carbon atom in the same amino acid residue as the amide proton and the ⁇ carbon atom in the previous amino acid residue. al., Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice. Academic Press (1996), in the HNCA 3D measurement method, 2D measurement omitting the N development time: Fig. 1), in the same amino acid residue as the amide proton.
  • the H (N) CACB method (Cavanagh, WJ, et al.) is used to obtain two-dimensional correlation spectra between a carbon atom and ⁇ carbon atom, and oc carbon atom and ⁇ carbon atom in the previous amino acid residue.
  • a carbon atom and ⁇ carbon atom and oc carbon atom and ⁇ carbon atom in the previous amino acid residue.
  • the H (NCA) CB method (Yamazaki, Japan) can be used to obtain the two-dimensional correlation spectrum of the ⁇ carbon atom in the same amino acid residue as the amide proton and the ⁇ carbon atom in the previous amino acid residue.
  • the HNCACB three-dimensional measurement method described in T. et al., J. Am. Chem. Soc. 116 (1994) 11655-11666 the two-dimensional measurement in which the N expansion time is omitted: Fig. 1) is used.
  • the H (NCOCA) CB method (Yamazaki, T. et al., J.
  • TROSY- H (N) CO TROSY- H (NCA) CO
  • TROSY— H (NCO) CA TRO SY- H (N) CA
  • TROSY- H (N) CACB TROSY-CBCA (N) H
  • TROSY— H (NCO) CACB TROSY— CBCA (CO) NH
  • TROSY— H (NCA) CB It is desirable to use TROS Y—H (NCOCA) CB method.
  • the H (N) CO method, the H (NCO) CA method, and the H (N) CA method are preferred.
  • the H (N) CO method is the most preferred!
  • “Hydrogen atom bonded to labeled main chain atom in target molecule” means hydrogen atom bonded to nitrogen atom of main chain (hereinafter sometimes referred to as “amide proton”), label Any hydrogen atom bonded to the ⁇ carbon atom of the main chain (hereinafter, this may be referred to as “OC hydrogen atom”) may be used.
  • the “other hydrogen atom in the target molecule” may be any hydrogen atom in the target molecule. Specifically, for example, a hydrogen atom bonded to a labeled a carbon atom or ⁇ 8 carbon atom in the amino acid residue that is the same as or adjacent to the above nitrogen atom, which is within a range where a two-dimensional correlation spectrum can be obtained by NMR at present. Etc. In this case, it is preferable that the nitrogen atom or carbon atom bonded to the hydrogen atom is labeled.
  • the NMR measurement method used may be any method as long as it can acquire the two-dimensional correlation spectrum between the hydrogen atoms. However, if there are many signals, they may overlap, making analysis difficult. Therefore, for a hydrogen atom bonded to one labeled main chain atom, an NMR measurement method that can obtain a correlation spectrum of one or two hydrogen atoms is preferred. Most preferred is an NMR measurement method that can obtain a correlation spectrum of one hydrogen atom for a hydrogen atom bonded to a chain atom. Specific examples are shown below.
  • the HA (CAN) H method (Kay, LE) is used to obtain the two-dimensional correlation spectrum of the 0C hydrogen atom in the same amino acid residue as the amide peptone and the 0C hydrogen atom in the previous amino acid residue.
  • et al, J. Magn. Reson. 91 (1991) 84-92 in the HA (CA) NH 3D measurement method, two-dimensional measurement without N expansion time: Fig. 1) or H (NCA) HA method
  • HN (CA) HA three-dimensional measurement method described in (Clubb, RT et al, J. Biomol. NMR2 (1992) 203-210, two-dimensional measurement with N development time omitted: Fig. 1) is used.
  • HBHA CBACACON
  • Method H Grzesiek, S., J. Biomol. NMR3 (1993) 185-204 described in NHB three-dimensional measurement method, development of N Two-dimensional measurement without time: Fig. 1 is used.
  • HBHA (CB is a method for obtaining two-dimensional correlation spectra of ⁇ and ⁇ hydrogen atoms in the same amino acid residue as the amide proton, and ⁇ and ⁇ hydrogen atoms in the previous amino acid residue.
  • Method H Wang. AC et al., J. Magn. Reson. B105 (1994) 196-198 in the three-dimensional measurement method with N expansion time omitted in the HBH A (CBCA) NH three-dimensional measurement method: Figure 1) etc.
  • the ⁇ (CCCON) H method (Sattler, M .et al., Prog. Nuc. Magn. Reson. Spectroscopy 34 (1999) 93-158, H (CCCO) NH 3D measurement method. Used. For high molecular weight proteins, use a measurement method that combines TROSY (Pervushin, K. et al. 'Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 12366-12371) with the above measurement method. Things are desirable.
  • the H (NCOCA) HA method or the HA (CACON) H method is most preferred.
  • a hydrogen atom bonded to a labeled nitrogen atom in the main chain and one amino acid residue before the nitrogen atom is present.
  • a two-dimensional correlation spectrum with the hydrogen atom bonded to the carbon of the labeled main chain in the amino acid residue is obtained.
  • the HA (CAN) H method or the H (NCA) HA method is preferred for Sarako.
  • the hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the labeled main chain, the amino acid residue in which the nitrogen atom is present, and the labeled main chain carbon in the previous amino acid residue Two-dimensional correlation spectra with hydrogen atoms bonded to atoms can be obtained.
  • the concentration of the buffer and the target molecule used can be appropriately selected within the range usually used in the NMR measurement method.
  • the NMR measurement buffer those of 25 mM potassium phosphate pH 6.5, 50 mM NaCl, 5 mM DTT are preferably used.
  • the target molecule is dissolved in the buffer solution at an appropriate concentration and used as a sample for NMR measurement.
  • the concentration of the target molecule is not particularly limited as long as the NMR measurement can be performed, but specifically, for example, a range of M to LOmM is preferable.
  • a step of bringing the target molecule into contact with at least one ligand or a ligand candidate compound is performed.
  • Ligand means a substance or derivative thereof bound in vivo when the target molecule is an in vivo molecule.
  • the “ligand candidate compound” means a compound that can bind to a target molecule and control the function of the target molecule. Any compound having such a possibility may be used.
  • Ligand compound means an active compound that binds to a target molecule and controls its function.
  • a ligand or a ligand conjugate does not necessarily have to bind to a target molecule with one molecule, but two or more identical or different molecules may fuse to form a complex with the target molecule.
  • a new ligand compound can be designed by analyzing the binding state between these molecules and the target molecule. Specifically, for example, the method described in Japanese Patent No. 3032301 is used.
  • the method of bringing the target molecule into contact with the ligand, the ligand compound, or some ligand candidate compound may be any method as long as they are capable of binding. Specific examples include a method of adding a ligand, a ligand compound, or a ligand candidate compound to an NMR measurement buffer solution containing the target molecule at an appropriate concentration.
  • Ligand, ligand compound, a Alternatively, the concentration of the ligand candidate compound can be appropriately selected depending on the relationship between the target molecule and the substance, but for example, a range of about M to LOOmM is preferable. At least one ligand, ligand compound, or ligand candidate compound is brought into contact with the target molecule.
  • a mixture of ligand candidate compounds when brought into contact with a target molecule, the binding of a large number of compounds to the target molecule can be detected at one time.
  • the mixture of ligand candidate compounds for example, a mixture of a plurality of compounds such as a derivative group of a certain compound or a candidate compound library such as a pharmaceutical can be used.
  • ⁇ Eta correlation spectrum may be any method differences between the two spectra can be detected. Specifically, a method is used in which two spectra are overlapped and the difference is visually detected. The chemical shift of the signal in the spectrum is identified using common NMR analysis software, and the values are compared. OK!
  • a specific 1 Pi 1 !! correlation spectrum can be explained by using, for example, the 15 N / 13 C-labeled target molecule (human FKBP protein) by the HA (CACON) H method.
  • the two-dimensional correlation spectrum measured by NMR is shown in FIG.
  • Figure 2 shows the two-dimensional correlation spectrum obtained by NMR measurement using the same HA (CAC ON) H method after contact with the target molecule!
  • Figure 24 shows the result of overlaying.
  • a hydrogen atom bonded to a nitrogen atom of a labeled main chain in a 13 CZ 15 N double-labeled target molecule is the same as or adjacent to the nitrogen atom.
  • the compounds in the mixture of ligand candidates are individually brought into contact with the target molecule, and the hydrogen atom bonded to the labeled main chain nitrogen atom in the target molecule is identical to the nitrogen atom.
  • 8 carbon atoms Measuring the two-dimensional correlation spectrum with a carbon atom, and (f) comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional spectrum obtained in step (e).
  • a method for screening a ligand compound that binds to a target molecule is provided.
  • step (a) at least nitrogen and Z or carbon in the main chain are labeled with a hydrogen atom bonded to a labeled main chain atom in the target molecule, and the other in the target molecule.
  • Measuring a two-dimensional correlation spectrum with a hydrogen atom (b) contacting the target molecule with a mixture of ligand candidate compounds including two or more ligand candidate compounds; c) a step of measuring a two-dimensional correlation spectrum between a hydrogen atom bonded to a labeled main chain atom in the target molecule in step (b) and another hydrogen atom in the target molecule; (d) step (a )
  • the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c) is compared with the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c).
  • step (d) a difference is found in the two-dimensional correlation spectrum.
  • the compounds in the mixture of candidate ligand compounds are individually contacted with the target molecule and labeled in the target molecule.
  • Measuring the two-dimensional correlation spectrum between the hydrogen atom bonded to the main chain atom and another hydrogen atom in the target molecule, and (f) the two-dimensional correlation spectrum and process obtained in step (a) ( There is provided a method for screening a ligand compound that binds to a target molecule, comprising a step of comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in e).
  • Ligand conjugate means a compound having an activity of binding to a target molecule and controlling the function of the target molecule.
  • steps (a) to (d) in the screening method for a ligand compound are as described in (1).
  • the “mixture of ligand candidate compounds” may be a mixture of any compounds, but it is necessary to be a collection of substances that can bind to a target molecule under the same NMR measurement conditions.
  • the binding to the target molecule is detected for each compound included in the ligand candidate complex group in step (e), it is also necessary that the group be separable from each other.
  • step (e) if a difference is found in the 1 H— 13 C correlation spectrum in step (d), individual steps in the mixture of ligand candidate compounds in step (b) A compound is brought into contact with a target molecule individually, a hydrogen atom bonded to a labeled main chain nitrogen atom in the target molecule, and a labeled ⁇ -carbon atom in an amino acid residue identical to or adjacent to the nitrogen atom, ) 8 carbon source
  • Each compound in a mixture of materials is brought into contact with the target molecule individually, and a two-dimensional correlation spectrum between the hydrogen atom bonded to the labeled main chain atom in the target molecule and the other hydrogen atom in the target molecule is obtained. taking measurement.
  • the contact method with the target molecule and the NMR measurement method are as described
  • step (f) is a step of comparing the 1 H— 13 C correlation spectrum obtained in step (a) with the 1 H— 13 C correlation spectrum obtained in step (e)? or step (a) obtained in 1 H - 1 obtained in the correlation spectrum and step (e) H - a step that compares a correlation spectrum.
  • the method for comparing two 1 H— 13 C correlation spectra and the method for comparing two 1 H—correlation vectors are as described above. If there is a difference in the 1 H— 13 C correlation spectrum or the 1 ⁇ — ⁇ — correlation spectrum by this comparison, the ligand candidate-compound contacted with the target molecule is selected as the ligand-compound.
  • a hydrogen atom bonded to a nitrogen atom of a labeled main chain in a 13 CZ 15 N double-labeled target molecule, and the same or adjacent to the nitrogen atom Measuring a two-dimensional correlation spectrum with a labeled a carbon atom, ⁇ carbon atom or carbonyl carbon atom in the amino acid residue to be treated, (b) the target molecule and at least one ligand or ligand candidate ⁇ A step of contacting the compound, (c) a hydrogen atom bonded to a nitrogen atom of the labeled main chain in the target molecule in step (b), and a label in an amino acid residue that is the same as or adjacent to the nitrogen atom A step of measuring a two-dimensional correlation spectrum with a carbon atom, a ⁇ carbon atom or a carbonyl carbon atom, (d) a two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a), and a step (c) Comparing the two-dimensional correlation spectrum,
  • a hydrogen atom bonded to an atom of the labeled main chain in the target molecule labeled with at least main chain nitrogen and Z or carbon, and another in the target molecule water Measuring a two-dimensional correlation spectrum between elementary atoms, (b) contacting the target molecule with at least one ligand or ligand candidate compound, (c) in the target molecule of step (b) A step of measuring a two-dimensional correlation spectrum between the hydrogen atom bonded to the labeled main chain atom of and another hydrogen atom in the target molecule, (d) the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a), and A step of comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c), and (e) an amino acid corresponding to a signal in which a difference is found when a difference is found in the two-dimensional correlation spectrum in step (d)
  • a method for identifying the binding site of a ligand or ligand-binding compound that binds to a target molecule is provided
  • Steps (a) to (d) of the above method are as described in (1).
  • the target molecule must be assigned to which amino acid each signal of the 1 H- 13 C correlation spectrum or 1 H-correlation vector obtained when the above NMR measurement is performed. is there.
  • Amino acids found to be different in the 1 H- 13 C correlation spectrum or 1 H-correlation spectrum in step (d) are related to the binding of the target molecule to the ligand or ligand ligand. Can be determined.
  • Each signal can be assigned before or after the NMR measurement.
  • the method for assigning each signal of the target molecule can be carried out by a commonly used method known per se, but can be carried out efficiently by the method described below.
  • the correlation signal between the amide proton of the amino acid of the target molecule and 13 C is determined based on this. Can do. Specifically, (i) the assignment of the amide proton of the protein and the correlation signal of 15 ⁇ ⁇ ⁇ was determined by the following method, and (ii) the ex carbon of the amino acid to be identified on the amino acid sequence of the target molecule atom or carbo - papermaking what Le carbon atoms is labeled with 13 C tone, (iii) the protein, and the amide proton of the amino acid to be Sho identified, labeled with 13 C of the same amino acid carbon (Iv) The amide protons in (i) and the 15 N correlation signal and (iii) the amide protons in 13C and the chemical shifts common to 13C are the same.
  • the correlation Shigunanore between the amide proton and 13 C in association with the correlation signal of the Amidopu port tons 15 N is a method of determining the attribution of the correlation signal of the amide proton and 13 C.
  • the hydrogen atom bonded to the labeled main chain atom of the target molecule and the target molecule The correlation signal between other hydrogen atoms can be determined.
  • the assignment of the amide proton of the protein and the correlation signal of 15 N is determined by the method described below, and (ii) the amide proton of the main chain of the target molecule and the other in the target molecule
  • the two-dimensional correlation spectrum between hydrogen atoms in (m) above is common to the (i) amide proton and 15 N correlation signal and (ii) the two-dimensional correlation spectrum between amide proton and hydrogen atom.
  • the correlation signal between the amide proton and another hydrogen atom is associated with the correlation signal between the amide proton and 15 N, and the amide proton and other hydrogen atoms are correlated. This is a method for determining the assignment of a correlation signal with an atom.
  • the amino acid to be identified may be one kind or plural kinds, or may be all amino acids, but can be associated without overlapping signals by signal association described later. Any range may be used.
  • the method for determining the attribution of each signal in the 15 N correlation spectrum is described in detail below.
  • the target molecule to which a signal is assigned must have an amino acid sequence that is the main skeleton identified.
  • the amino acid for which signal assignment is to be determined one of the amino acids adjacent to the amino acid sequence in the amino acid sequence of the target molecule is identified, and for the adjacent amino acid, its ⁇ carbon atom and carbo carbon atom are identified. Is 13 C and the main chain nitrogen atom is double-labeled with 15 ⁇ (hereinafter, this may be referred to as “double-labeled amino acid”), and for other amino acids, that only the nitrogen atom of the main chain is also amino force labeled with 15 New (hereinafter, there is a this called "13 CZ 15 N double-labeled target molecule”) is prepared.
  • the adjacent amino acid is double-labeled with its ⁇ carbon atom and carbonyl carbon atom being 13 C and the main chain nitrogen atom being 15 ⁇ .
  • An amino acid can be prepared by synthesizing a target molecule using an amino acid in which only the nitrogen atom of the main chain is labeled with 15 ⁇ as a substrate.
  • a two-dimensional correlation spectrum between the amide proton of the amino acid residue adjacent to the 13 CZ 15 N double-labeled amino acid and the nitrogen atom of the main chain (Hereinafter, this may be referred to as “ 15 N correlation signal”).
  • the HN (CO) method two-dimensional measurement in which the CO development time is omitted in the HNC03 dimensional measurement method described in Cavanagh, WJ, et al, Protein Spectroscopy, Principles. Press (1996)), etc. Can be mentioned.
  • the signal obtained by HN (CO) measurement is that of the amino acid residue adjacent to the C-terminal side of the double-labeled amino acid.
  • HN (CO) measurement is performed to obtain only the 1 H- 15 N correlation signal of the amino acid adjacent to the C-terminal side of the double-labeled amino acid. If there is a measurement method that can acquire only the 1 H— 15 N correlation signal of the amino acid adjacent to the side, that measurement method may be used.
  • a method for selecting a signal of a target amino acid is to synthesize a target protein using an amino acid in which only the nitrogen atom of the main chain of the target amino acid is labeled with 15 N as a substrate.
  • the 1 H- 15 N correlation signal can be obtained by NMR measurement and compared with HN (CO) measurement.
  • 1 H- 15 N correlated signal amino acid to be cane above identification may be obtained by the following method.
  • the amino acid to be cane identified 13 CZ 15 N double-labeled I spoon amino, others synthesize a protein of interest to 15 N-labeled amino acids as a substrate, 1 H- 15 double standard ⁇ I ⁇ amino About the protein
  • An NMR measurement that detects both the N correlation signal and the 1 H- 15 N correlation signal of the amino acid residue adjacent to it, specifically the HN (CA) method (Cavanagh, WJ, et al., Protein Spectroscopy, In the HNCA three-dimensional measurement method described in Principles. Press (1996), the measurement is performed by two-dimensional measurement with CA deployment time omitted).
  • CA HN
  • the same protein is measured by the HN (CO) method to obtain a signal and compared with the signal obtained by the HN (CA) method.
  • the non-overlapping signal is the signal of the same amino acid containing the target amino acid.
  • the amino acid number can be assigned using the same method as described above. In this case, the assignment procedure is slightly more complicated, but the number of samples can be reduced from 20 types.
  • the label of the amino acid adjacent to the amino acid to be identified does not necessarily require a double label of 13 CZ 15 N. That is, it is only necessary that the carbocarbon atom is 13 C-labeled.
  • a target protein is synthesized in which the nitrogen atoms of the main chain of a plurality of amino acids including the amino acid to be identified are labeled with 15 N. The synthesized protein was measured by the HN (CO) method, etc.
  • the combination of these signals and only the nitrogen atom of the main chain of the amino acid to be identified were labeled with 15 N.
  • Signals can be assigned in the same manner as described above by comparison with the 1 H— 15 N HSQC spectrum of the protein. According to this method, the carbonyl carbon atom is labeled with 13 C, the nitrogen atom of the main chain of the amino acid to be identified is labeled with 15 N, and then this HN (CO) is synthesized. If the signal obtained by measurement using a method is obtained, the amount of labeled protein can be reduced compared to conventional methods. In the above method, by repeating this, the ability to assign the signal obtained by NMR to all amino acids in the target molecule. The combination of the amino acid to be identified and the adjacent amino acid is the target protein. This method can only be used if there is only one in the sequence.
  • assignment can be performed by the method shown below. First, (i) for one of the amino acids adjacent to the amino acid to be identified on the amino acid sequence of the target molecule, the assignment of the correlation signal between the specific atom and the amide proton is determined by the above method.
  • the two-dimensional correlation scan Bae outside Le and, dual-labeled amino acid residues between 13 C and the amide proton of the double-labeled amino acid residue 13
  • An NMR measurement capable of obtaining a two-dimensional correlation spectrum with the amide proton of the amino acid residue to be identified adjacent to C is measured by, for example, the H (N) CA method to obtain a signal.
  • the correlation signal between the amino acid residue to be identified and the amide proton of the double-labeled amino acid residue and the nitrogen atom of the main chain is expressed by the H (NCO) CA method (Cavanagh, WJ, et al. al., Protein Spectroscopy, Principles. Press (1996), in the HN (CO) CA 3D measurement method, 2D measurement without N development time).
  • a signal having the same chemical shift as the chemical shift of the amide proton of the amino acid whose assignment in the signal obtained in (d) is determined is included in the signal obtained in (c). Select from.
  • a signal having the same chemical shift as the 13 C chemical shift of the selected signal is selected from the signals obtained in (c), and (g) the amide proton of the selected signal is selected.
  • a signal having the same chemical shift as the chemical shift is also selected.
  • the selected signal force is determined to be a signal of an amino acid adjacent to the amino acid belonging to the original signal.
  • 13 CZ 15 N double-labeled I spoon to kinds of amino acids is 13 CZ 15 N double-labeled I spoon appropriate several amino acids have to nag is one type on one protein specimen, other amino acids 15 N Signal assignment is possible even with labeling. In this case, the required labeling protein can be reduced from 20 types, but the analysis becomes a little complicated, so you can change the labeling method if necessary!
  • each signal of the 1 H- 15 N correlated spectra in the protein are attributed, in to the target molecule was labeled above , — 13 .
  • H (NCO) CA the correlation signal between the double-labeled amino acid and the amino proton of the next amino acid residue and the carbonyl carbon of the double-labeled amino acid is doubled.
  • a correlation signal between the amide proton of the next residue of the labeled amino acid and the ⁇ carbon atom of the double labeled amino acid is obtained.
  • H (N ) Assignment of signals obtained by measurement of C 0, H (NCO) CA can be easily performed.
  • H (N) CO, H (NCO) CA it is possible to assign signals using the same method when measuring H (NCA) CO, H (N) CA, etc. .
  • the method of force attribution which is the method of assigning 13 C signal after signal assignment, is not limited to this.
  • the ⁇ carbon atom or carbonyl carbon atom It is possible to assign correlation signals of amide protons.
  • each signal was labeled force above attributed correlation spectrum in proteins — Obtain a correlation signal.
  • the measurement is performed by the above-described H (NCOCA) HA, HA (CACON) HHAHBHA (CBCACON) H method, or the like.
  • H (NCOC A) HA and HA (CACON) H the amide proton and the amide proton are combined!
  • the above method is not limited to the method of force attribution, which is the method of assigning 1 H signal after J H- 15 H signal assignment.
  • H (NCOCA) HA or HA (CACON) H and H (NCA) HA or HA (CAN) H spectrum combinations of the target protein with the same labeling as above, or HBHA (CBCACON) H and HBH A (CBCAN) H spectrum combination is acquired sequentially, and the correlation between the chemical shift of the ⁇ hydrogen atom or ⁇ hydrogen atom of the preceding and subsequent residues and the chemical shift of the amide proton is sequentially linked by the same method as above, It is also possible to assign the correlation signal between a hydrogen atom or j8 hydrogen atom and an amido proton.
  • a hydrogen atom bonded to a nitrogen atom of a labeled main chain in a 13 CZ 15 N double-labeled target molecule, and the same or adjacent to the nitrogen atom Measuring a two-dimensional correlation spectrum with a labeled a carbon atom, ⁇ carbon atom or carbonyl carbon atom in the amino acid residue to be treated, (b) contacting the target molecule with various concentrations of ligand or ligand compound Step (c) a hydrogen atom bonded to a nitrogen atom of the labeled main chain in the target molecule in step (b), and a labeled a carbon atom in the amino acid residue identical or adjacent to the nitrogen atom, ⁇ A step of measuring a two-dimensional correlation spectrum with a carbon atom or a carbonyl carbon atom, (d) a step of comparing the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (a) with the two-dimensional correlation spectrum obtained in step (c) And (e) the two
  • (a) at least nitrogen and Z or carbon in the main chain are labeled.
  • the target molecule and various concentrations of ligand or A step of contacting a ligand compound (c) a two-dimensional correlation between a hydrogen atom bonded to a labeled main chain atom in the target molecule in step (b) and another hydrogen atom in the target molecule.
  • a method for measuring the dissociation constant between the target molecule and the ligand or ligand-containing compound comprises the step of quantifying the difference in the spectrum as a function of the ligand or ligand-containing concentration.
  • Steps (a) to (d) are as described in (1) above.
  • step (b) the same NM R is used for the ligand or ligand compound in contact with the target molecule at different concentrations.
  • Ligand or ligand compound concentration is the force to contact appropriately different concentrations. Most preferably, it is preferable to prepare a contact with a concentration that saturates and perform NMR measurement. At the saturation concentration, the saturation limit shift ( ⁇ sat) is measured.
  • the dissociation constant between the target molecule and the ligand or ligand compound is calculated by the following formula 1.
  • KD ([P] o- x ) ([L] 0 — x )
  • [P] is the total molar concentration of the target molecule
  • [L] is a ligand or a ligand.
  • ⁇ free is the chemical shift of the free species
  • ⁇ obs is the observed chemical shift value
  • ⁇ is the target of the target without the saturation shift and the ligand or ligand ligand It is the difference from the chemical shift value of the molecule.
  • the dissociation constants thus measured are measured while changing the value until the best fit for the measurement data is obtained using a standard curve fitting statistical method. If ⁇ sat is not known, change KD and ⁇ sat and apply the same curve fitting method. Furthermore, a more preferable ligand derivative or ligand compound can be selected by measuring the dissociation constant.
  • the gene (Genbank accession No. M54881) of the human FKBP protein (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) is represented by SEQ ID NO: 1 and 2 using the Human Universal Quick Clone cDNA (manufactured by Clontech) as a saddle type. Amplification using a primer having the nucleotide sequence described above using PCR, ligation to a fusion protein with Glutathione S-transferase (Amersham), and then plasmid pEU3b (Sawasaki, ⁇ ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99 (23), 14652—14657 (2002)).
  • the above plasmid was made into a saddle type, and mRNA of a fusion protein of Glutathione S-transferase and human FKBP was transcribed with SP6 RNA polymerase (Promega) and synthesized.
  • the human FKBP protein in this concentrate was 70 M.
  • the measurement temperature was 30 ° C.
  • ACPM 1-acetyl proline methyl ester
  • FIG. 8 shows the result of measuring the H (N) C02 dimensional correlation spectrum in the presence of ACPM and superimposing it on the spectrum in the absence. Residues movement signal was seen in FIG. 8 was almost consistent with the 1 H- 15 N HSQC residues movement signals were observed in the spectrum.
  • Fig. 9 shows the result of measuring the H (NCO) CA two-dimensional correlation spectrum in the presence of ACPM and superposing it on the spectrum in the absence. Residues movement signal was seen in FIG. 9 was almost consistent with the 1 H- 15 N HSQC residues movement signals were observed in the spectrum.
  • FIG. 12 shows the H (N) C02 dimensional correlation spectrum measured in the presence of FOPI and superimposed on the spectrum in the absence. Residues movement signals were seen in 12 was almost consistent with the 1 H- 15 N HSQC residues movement signals were observed in the spectrum.
  • Fig. 13 shows the H (NCO) CA two-dimensional correlation spectrum measured in the presence of FOPI and superimposed on the spectrum in the absence. Residues with a signal shift in Fig. 13 are almost identical to those with a signal shift in the 1 H— 15 N HSQC spectrum! .
  • 1-piperidine-powered loboxamide which is known to bind to FKBP protein
  • PICA 1-piperidine-powered loboxamide
  • ImM FKBP protein
  • HSQC Measured The combined superimposed 1 H- 15 N HSQC spectra in PICA presence and absence shown in FIG. When these two spectra are compared, the residues corresponding to the signals in which migration is observed are concentrated in a specific region, as shown in the three-dimensional structure in Fig. 15. This region is the PICA binding site. It was identified.
  • FIG. 16 shows the H (N) C02 dimensional correlation spectrum measured in the presence of PICA and superimposed on the spectrum in the absence of PICA. Residues movement signal was seen in FIG. 16 was almost consistent with the 1 H- 15 N HSQC residues movement signals were observed in the spectrum.
  • Fig. 17 shows the H (NCO) CA two-dimensional correlation spectrum measured in the presence of PICA and superimposed on the spectrum in the absence of PICA. Residues move was seen in the signal in FIG. 17, -! 15 N HSQC substantially coincides with the movement was observed residues of the signal in the spectral / was ⁇ .
  • the gene (Genbank accession No. M54881) of the human FKBP protein (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) is represented by SEQ ID NO: 1 and 2 using the Human Universal Quick Clone cDNA (manufactured by Clontech) as a saddle type. Amplification using a primer having the nucleotide sequence described above using PCR, ligation to a fusion protein with Glutathione S-transferase (Amersham), and then plasmid pEU3b (Sawasaki, ⁇ ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99 (23), 14652—14657 (2002)).
  • the above plasmid was used as a saddle type, and mRNA, a fusion protein of Glutathione S-transferase and human FKBP, was transcribed with SP6 RNA polymerase (Promega) and synthesized.
  • a purified human FKBP protein solution was obtained by binding to Sepharose 4B (Amersham), cleaving the fusion protein with PreScission Protease (Amersham) and then elution. This protein solution was concentrated to 800 1 using a Centricon-3 ultrafiltration concentrator manufactured by Millipore, and the buffer for NMR measurement (25 mM potassium phosphate pH 6.5, 50 mM)
  • the human FKBP protein in this concentrate was 70 M.
  • the measurement temperature was 30 ° C.
  • the chemical shift assignments for amide protons, main chain nitrogen atoms, carbonyl carbon atoms, and a carbon atoms have been reported in the literature (Rosen et al., Biochemistry, 30, 477 4-4789; Xu et al., Biopolymers, 33, 535— 550 (1993)) was used as a reference to measure HA (CACON) H and HA (CAN) H as follows.
  • FIG. 24 shows the HA (CACON) H two-dimensional correlation spectrum measured in the presence of ACPM and superimposed on the spectrum in the absence.
  • the two spectra shown in FIG. 24 were compared, and amino acid residues corresponding to the signals in which migration was observed were confirmed.
  • the signal showing the movement is indicated by the amino acid number and amino acid name (V24, T27, G28, F48, L50, G51, Q53, 156, R57, E60, E61, G62, A64, Q65, Y80, 190, F99, D10 0).
  • the residues in which signal migration was observed almost coincided with the residues in which signal migration was observed in the 1 H— 15 N HSQC spectrum.
  • Fig. 25 shows the HA (CAN) H two-dimensional correlation spectrum measured in the presence of ACPM and superimposed on the spectrum in the absence.
  • the signal corresponding to the amino acid number written in uppercase is the correlation signal between the amide proton and a hydrogen atom in the residue
  • the signal corresponding to the amino acid number written in lowercase is the amide proton and its amide proton. It shows the correlation signal with the a hydrogen atom belonging to the residue immediately before the group to which it belongs.
  • the signal showing movement is indicated by the amino acid number and amino acid name (G19, V24, Y26, T27, G28, S38, R42, K47, F48, L50, G51, K52, Q53, E54, V55, 156, R57, W59, E60, E61, G62, V63, Q65, M66, Q70, T75, 176, Y80, V98, F99, D100, L103).
  • these are concentrated in a specific region and identified as a binding site for this region force FOPI.
  • Fig. 29 shows the HA (CAN) H2D correlation spectrum measured in the presence of FOPI and superimposed on the spectrum in the absence. The two spectra shown in FIG. 29 were compared, and amino acid residues corresponding to the signals in which migration was observed were confirmed.
  • the signal corresponding to the amino acid number written in uppercase is the correlation signal between the amide proton and a hydrogen atom in the residue
  • the signal corresponding to the amino acid number written in lowercase is the amide proton and its amide proton. It shows the correlation signal with the a hydrogen atom belonging to the residue immediately before the group to which it belongs.
  • amino acid number and amino acid name (gl9, V24, Y26, T27, g28, S38, R42, K47, F48, L50, g51, Q53, E54, V55, 156, R57, E60) E61, g62, V63, Q65, M66, T75, 176, Y80, V98, F99, D100, L103).
  • residues where signal migration was observed were consistent with those in the 15 N HSQC spectrum! [0103] (6) Formation of complex of FKBP protein and 1-piperidine carboxamide and NMR measurement
  • the amino acid number and amino acid name (G19, V24, Y26, T27, G28, E31, S38, R42, K47, F48, L50, G51, K52, Q53, V55, 156, R57, W59, E61, G62, V63, A64, Q65, M66, I76, 191 and F99).
  • the amino acid residues for which signal movement was observed in Fig. 30 are concentrated in a specific region, as shown in the three-dimensional structure of Fig. 31, and this region was identified as the binding site for PIC A. It was.
  • FIG. 32 shows the HA (CACON) H two-dimensional correlation spectrum measured in the presence of PICA and superimposed on the spectrum in the absence.
  • the signal showing movement is indicated by amino acid number and amino acid name (G19, V24, Y26, T27, G28, ⁇ 31, S38, R42, K47, F48, L5 0, G51, K52, Q53, V55, 156, R57 W59, E61, G62, A64, Q65, M66, 176, 191, F99).
  • the amino acid residues in which signal movement was observed coincided with the residues in which the signal movement was observed in the 1 H 15 N HSQC spectrum!
  • Fig. 33 shows the HA (CAN) H2D correlation spectrum measured in the presence of PICA and superimposed on the spectrum in the absence.
  • the signal corresponding to the amino acid number written in capital letters is the correlation signal between the amide proton in the residue and the ⁇ hydrogen atom
  • the signal corresponding to the amino acid number written in small letters is the amide proton and its amide proton. It shows the correlation signal with the ⁇ hydrogen atom belonging to the residue immediately before the residue.
  • the signal showing movement is represented by amino acid number and amino acid name (gl9, V24, Y26, T27, g28, E31, S38, R42, K47, F48, L50, g51, K52, Q53, V55, 156, R57, E61, g62, V63, A64, Q65, M66, 176, 191 and F99).
  • Figure 33 The amino acid residues that showed a signolele shift were consistent with those that showed a signal shift in the 15 N HSQC spectrum.
  • the method for detecting the binding between a target molecule of the present invention and a ligand or a ligand candidate compound, etc. is based on the fact that the two-dimensional NMR measurement used for the detection includes a hydrogen atom and a carbon atom bonded to the nitrogen atom of the main chain. Or two-dimensional correlation spectrum between one hydrogen atom bonded to a labeled main chain atom and another hydrogen atom in the target molecule. Since the main chain atom, that is, the nitrogen atom or the carbon atom is possessed by all amino acids of the target molecule, a signal can be obtained for all amino acids. In other words, any amino acid can be detected without any limitation on the binding between the target molecule and the ligand or ligand candidate substance. This is a very advantageous feature in identifying a binding site between a target molecule and a ligand or a ligand candidate dig compound, a method for measuring a dissociation constant, and the like.
  • FIG. 1 shows a two-dimensional phase of a hydrogen atom bonded to a labeled main chain nitrogen and an ex carbon atom, a ⁇ carbon atom, or a carbonyl carbon atom in an amino acid that is the same as or adjacent to the nitrogen. It is the figure which showed the NMR measuring method for acquiring a Seki spectrum.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of human FKBP protein.
  • FIG. 3 is a diagram showing a 1 H— 15 N HSQC spectrum of human FKBP protein.
  • FIG. 4 is a diagram showing a two-dimensional correlation spectrum obtained by the H (N) CO method of human FKBP protein.
  • Figure 5 shows the two-dimensional correlation spectrum obtained by the H (NCO) CA method for human FKBP protein.
  • FIG. 6 is a diagram showing 1 H— 15 N HSQC spectra of human FKBP protein alone and after 1-acetylpropyl methyl ester (ACPM) is allowed to act on human FKBP protein. Only the residues to which the signal has moved are marked with the amino acid number.
  • ACPM 1-acetylpropyl methyl ester
  • FIG. 7 shows the structural formula of 1-acetylylproline methyl ester (ACPM) and the signal position after 1-acetylylproline methyl ester (ACPM) acts on human F KBP protein.
  • FIG. 3 is a three-dimensional structure diagram showing a residue (gray colored portion).
  • FIG. 8 is a diagram showing a two-dimensional correlation spectrum obtained by the H (N) CO method after allowing human FKBP protein alone and 1-acetylpropyl methyl ester (ACPM) to act on human FKBP protein. It is.
  • Each amino acid number is the number of the amino acid to which the amide hydrogen atom belongs.
  • Fig. 9 shows the two-dimensional correlation spectrum obtained by the H (NCO) CA method after human FKBP protein alone and human FKBP protein were allowed to act on 1-acetylpyrine methyl ester (ACPM).
  • H NCO
  • ACPM 1-acetylpyrine methyl ester
  • FIG. 10 is a diagram showing human FKBP protein alone and 1 H- 15 N HSQC spectrum after 1 formylpiperidine (FOPI) is allowed to act on human FKBP protein. Write the amino acid number only for the residue to which the signal moved! /
  • FIG. 11 shows the structural formula of 1 formylpiperidine (FOPI) and the residues whose signal position changed after 1 formylpiperidine (FOPI) was allowed to act on human FKBP protein ( FIG. 3 is a three-dimensional structure diagram showing a portion colored in gray.
  • Figure 12 shows the two-dimensional correlation spectrum obtained by the H (N) CO method after human formaldehyde piperidine (FOPI) is allowed to act on human FKBP protein alone and human FKBP protein.
  • FIG. Each amino acid number is the number of the amino acid to which the amide hydrogen atom belongs.
  • FIG. 13 shows the two-dimensional correlation spectrum obtained by H (NCO) CA method after human formaldehyde piperidine (FOPI) is allowed to act on human FKBP protein alone and human FKBP protein.
  • H NCO
  • FOPI human formaldehyde piperidine
  • FIG. 14 is a human FKBP protein alone and, Ru FIG der showing the 1 H- 15 N HSQC spectrum of after the action of 1 Piberiji Nkarobokisamido (PICA) to human FKBP protein. Write the amino acid number only for the residue to which the signal has moved! /
  • FIG. 15 shows the structural formula of 1-piperidine carboxamide (PICA) and the signal of 1-piperidine carboxamide (PICA) after acting on human FKBP protein.
  • FIG. 3 is a three-dimensional structure diagram showing residues whose positions are changed (portions colored in gray).
  • FIG. 16 is a diagram showing two-dimensional correlation vectors obtained by the H (N) CO method after human FKBP protein alone and 1-piberidine carboxamide (PICA) are allowed to act on human FKBP protein. .
  • Each amino acid number is the number of the amino acid to which the amide hydrogen atom belongs.
  • FIG. 17 is a diagram showing a two-dimensional correlation spectrum obtained by the H (NCO) CA method after human FKBP protein alone and 1-piberidine carboxamide (PICA) are allowed to act on human FKBP protein.
  • Each amino acid number is the number of the amino acid to which the amide hydrogen atom belongs.
  • FIG. 18 is a diagram showing an NMR measurement method for obtaining a two-dimensional correlation spectrum between hydrogen atoms bonded to labeled main chain atoms and other hydrogen atoms in the target molecule. . Connected by arrows! /, A combination of atoms surrounded by a solid line gives a correlation signal. The atoms surrounded by the dotted line must be labeled with 13 C for carbon atoms and 15 N for nitrogen atoms.
  • FIG. 19 is a diagram showing a 1 H— 15 N HSQC spectrum of human FKBP protein.
  • FIG. 20 is a diagram showing a two-dimensional correlation spectrum obtained by the HA (CACON) H method of human FKBP protein.
  • FIG. 21 is a view showing a two-dimensional correlation vector obtained by the HA (CAN) H method of human FKBP protein.
  • FIG. 22 is a human FKBP protein alone and is a view to view the 1 H- 15 N HSQC spectrum of after the action of 1 Asechiru proline methyl ester (ACPM) to human FKBP protein. Only the residues to which the signal has moved are marked with the amino acid number.
  • FIG. 23 shows the structural formula of 1-acetylproline methyl ester (ACPM), and the signal position changed after 1-acetylylproline methyl ester (ACPM) was allowed to act on human FKBP protein.
  • FIG. 3 is a three-dimensional structure diagram showing a residue (a gray colored portion).
  • FIG. 24 is a diagram showing a two-dimensional correlation spectrum obtained by the HA (CACON) H method after human FKBP protein alone and 1-acetyl proline methyl ester (ACPM) was allowed to act on human FKBP protein. is there.
  • Each amino acid number is the number of the amino acid to which the amide hydrogen atom belongs.
  • FIG. 25 is a diagram showing a two-dimensional correlation spectrum obtained by the HA (CAN) H method after human FKBP protein alone and 1-acetyl proline methyl ester (ACPM) are allowed to act on human FKBP protein. is there. Only the residues to which the signal has moved are marked with the amino acid number.
  • the signal corresponding to the amino acid number written in uppercase is the correlation signal between the amide peptone and the ⁇ hydrogen atom in the residue, and the signal corresponding to the amino acid number written in lowercase belongs to the amide proton and the amide hydrogen atom. Represents a correlation signal with a hydrogen atom belonging to the residue immediately before the residue.
  • FIG. 26 is a diagram showing a 1 H- 15 N HSQC spectrum of human FKBP protein alone and after 1 formylpiperidine (FOPI) is allowed to act on human FKBP protein. Write the amino acid number only for the residue to which the signal moved! /
  • FIG. 27 shows the structural formula of 1 formylpiperidine (FOPI) and the residues in which the position of the signal changed after 1 formylpiperidine (FOPI) was allowed to act on human FKBP protein ( FIG. 3 is a three-dimensional structure diagram showing a portion colored in gray.
  • FIG. 28 is a diagram showing a two-dimensional correlation spectrum obtained by the HA (CACON) H method after human formaldehyde piperidine (FOPI) is allowed to act on human FKBP protein alone and human FKBP protein. is there. Only the residues to which the signal has moved are marked with the amino acid number.
  • HA CACON
  • FOPI human formaldehyde piperidine
  • FIG. 29 shows the two-dimensional correlation spectrum obtained by the HA (CAN) H method after human FKBP protein alone and 1 formylpiperidine (FOPI) was allowed to act on human FKBP protein.
  • FIG. Only the residues to which the signal has moved are marked with amino acid numbers.
  • the signal corresponding to the amino acid number written in uppercase is the correlation signal between the amide proton and a hydrogen atom in the residue, and the signal corresponding to the amino acid number written in lowercase is the amidoprobe. It shows the correlation signal between the mouth and the ⁇ hydrogen atom belonging to the residue immediately before the residue to which the amide proton belongs.
  • FIG. 30 is a diagram showing a 1 H— 15 N HSQC spectrum of human FKBP protein alone and after 1-piberidine carboxamide (PICA) is allowed to act on human FKBP protein. Write the amino acid number only for the residue to which the signal has moved! /
  • FIG. 31 shows the structural formula of 1-piperidine carboxamide (PICA) and the signal after 1-piperidine carboxamide (PICA) acts on human FKBP protein.
  • FIG. 3 is a three-dimensional structure diagram showing residues whose positions are changed (portions colored in gray).
  • FIG. 32 is a diagram showing a two-dimensional correlation spectrum obtained by the HA (CACON) H method after allowing human FKBP protein alone and 1-piberidine carboxamide (PICA) to act on human FKBP protein. Only the residues to which the signal has moved are marked with amino acid numbers.
  • FIG. 33 is a diagram showing a two-dimensional correlation spectrum obtained by the HA (CAN) H method after human FKBP protein alone and 1-piberidine carboxamide (PICA) was allowed to act on human FKBP protein. .
  • the signal corresponding to the amino acid number written in uppercase is the correlation signal between the amide proton and a hydrogen atom in the residue
  • the signal corresponding to the amino acid number written in lowercase is the amide proton and the residue to which the amide proton belongs. It represents the correlation signal with the ⁇ hydrogen atom belonging to the previous residue.

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Abstract

　本発明の目的は、ＮＭＲ測定によりリガンドあるいはリガンド候補化合物の結合および結合部位を同定する方法において、標的分子のより広範な範囲を観測し、リガンドやリガンド候補化合物の結合および結合部位の同定をより正確に行なえる方法を提供することである。本発明では、標的分子のアミノ酸残基の主鎖の炭素原子とアミドプロトンとの相関シグナル、あるいは主鎖の原子に結合した水素原子と標的分子中の他の水素原子との相関シグナルを取得し、該標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物とを接触させた後に同じ相関シグナルを取得して、両シグナルを比較することによって標的分子とリガンドあるいはリガンド化合物との結合を検出する。

Description

明 細 書
標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物との結合検出方法 技術分野
[0001] 本発明は、標的分子とこれと結合するリガンドあるいはリガンド候補ィ匕合物との結合 を検出する方法、標的分子に結合するリガンドの結合部位の同定方法、および標的 分子とリガンドとの解離定数を測定する方法等に関する。
背景技術
[0002] NMRを用いて、標的分子に結合する基質やリガンドを同定したり、その結合部位 を特定することは、これまでにも広く行われてきた。主に用いられている方法は、タン パク質中の窒素原子を、安定同位体で NMR観測可能な15 Nを用いて標識し、 — 15 N H¾QC (heteronuclear single quantum coherence)スヘクトノレ 用 、る力法 (1列 ば、特許第 3032301号公報を参照)である。具体的には、標的分子単独の状態に おいて1 H— 15 N HSQCを観測し、さらに標的分子に想定される基質やリガンドを共 存させた状態で1 H— 15N HSQCを観測し、両者のスペクトルを比較し、シグナルの 変化が見られるかどうかで標的生体分子に基質やリガンドが結合したかどうかを知る ことができる。また、他の NMR測定を組み合わせ、 ー1 HSQCスペクトルの各 シグナルのアミノ酸の種類と番号まで含めた帰属を行い（例えば、 Ikura, et al., Bioch emistry, 30, 5498-5504 (1992)を参照）、それらのデータを基に、基質やリガンドが標 的生体分子に結合する部位の同定（例えば、 Hensmann, et al., Protein Science, 3, 1020-1030 (1994)を参照）を行う方法も開示されている。このような方法を、例えば標 的分子を病因タンパク質とし、リガンドを低分子化合物として適用することにより、病 因タンパク質を特異的に阻害する新規薬剤候補物質をスクリーニングしたり、スクリー ユングの結果得られた化合物や他の方法によって得られたィ匕合物が病因タンパク質 のどの部位に結合しているかを同定することができ、迅速な薬剤設計に用いることが できるため、産業上も非常に有用である。
[0003] 15 N HSQC測定は、感度が比較的高いので、このような標的分子に対する基 質やリガンドの結合を同定するのに試料濃度が比較的少なくて済み、測定時間も短 くて済むなどの特徴が有る。しかし、標的分子が、例えば高分子量タンパク質の場合 には、 ー1 HSQCスペクトルの各シグナルが重なることが多ぐ想定された基質 やリガンドが結合する力否かの判定、また結合する場合の結合部位の判定にぉ 、て 、不具合が生じる場合があった。
[0004] また、標的分子がタンパク質の場合1 H— 15 N HSQC測定において観測される NM Rシグナルは、主にポリペプチド鎖の主鎖の1 H— 15 N直接結合に由来するシグナル である。ポリペプチド鎖の主鎖においては、原子は、窒素原子、 α炭素原子、カルボ -ル炭素原子の順番で繰り返し連結されているので、窒素原子は 3原子に 1つの割 合でしか出現しない。すなわち、 'Η-15Ν HSQCスペクトルにおいては、基質の結 合を検出する部位力 3原子おきにしか存在しないことになる。また、 — 15N HSQ Cスペクトルで検出されるシグナルは、直接結合した1 Hと15 Nの相関シグナルであり、 これらの化学シフトの移動には相関関係があるので、 2次元 NMR測定でありながら、 一つのシグナルの変化は実質的に一つの原子の化学シフトの変化を見ていることに なる。これらのことから、 一1 HSQCスペクトルを用いる方法は、実際には標的 分子の限られた範囲における変化だけを検出していることになる。よって、基質やリガ ンドが標的分子に結合したかどうか、あるいは結合部位を正確に特定するためには、 より広 、部位を観測でき、し力もある程度感度の良 、方法が望まれて!/、る。
[0005] 一方、タンパク質中の炭素原子を、安定同位体で NMR測定可能な13 Cを用いて標 識し、 H— C HSQC (heteronuclear single quantum coherenceノスぺクトノレを用 ヽ る方法 (例えば、特表 2004— 510952号公報を参照)も開発されている。具体的に は、標的分子の側鎖のメチル基の炭素原子と水素原子の間の HSQC測定を行い、さ らに標的分子に想定される基質やリガンドを共存させた状態で標的分子の側鎖のメ チル基の炭素原子と水素原子の間の HSQC測定を行って、両者のスペクトルを比較 し、シグナルの変化を検出することにより、標的分子と基質やリガンドとの結合を検出 する方法である。この方法では、標的分子の主にメチル基の炭素原子と水素原子の 間の HSQC測定を行うことで、シグナルが重なることを防いでいる力 逆にメチル基を 有するアミノ酸でしか HSQCシグナルを取得することができな 、ので、標的分子と基 質あるいはリガンドとの結合を限られた範囲でし力検出することができない。 [0006] また、標識ィ匕していないタンパク質中の 2つの水素原子間の 2次元または多次元相 関スペクトルを用いる方法 (例えば、 WO03Z054532号公報を参照)も開発されて いる。この方法では、 NMRの測定感度が非常に低いこと、および高分子のタンパク 質にぉ ヽてはスペクトルが取得できな 、等の問題があった。
[0007] そこで、上記のような NMR測定方法とは異なる、リガンドゃリガンド候補ィ匕合物と標 的分子との結合、および結合部位の同定を、より確実に、アミノ酸の種類などに限定 されずに行える方法が求められていた。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明が解決しょうとする課題は、 NMR測定によりリガンドあるいはリガンド候補ィ匕 合物の結合および結合部位を同定する方法において、標的分子のより広範な範囲 を観測し、リガンドゃリガンド候補ィ匕合物の結合および結合部位の同定をより正確に 行える方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、標的分子であるヒト FKBPタンパク質を、 15NZ13C二重標識し、主鎖の窒素原子に結合した水素原子と 該窒素原子が存在するアミノ酸残基の 1つ前のアミノ酸残基中のカルボニル炭素原 子の 2次元相関スペクトル、及び主鎖の窒素原子に結合した水素原子と該窒素原子 が存在するアミノ酸残基の 1つ前のアミノ酸残基中の a炭素原子の相関スペクトルが 取得可能な 2次元 NMR測定を行い、さらに、標的分子とリガンド候補ィ匕合物として 1 ーァセチルプロリンメチルエステル等とを共存させた状態で上記 2次元 NMR測定を 行って、得られた 2つのシグナルを比較したところ、標的分子に、想定されるリガンド 候補物質が結合するかどうか、また結合する場合には、リガンド物質が結合する標的 分子の部位を精度良く同定することが可能なことを見出だした。さらに本発明者らは 、標的分子であるヒト FKBPタンパク質を、 15NZ13C二重標識し、主鎖の窒素原子に 結合した水素原子と、該窒素原子が存在するアミノ酸残基の 1つ前のアミノ酸残基中 の標識された主鎖の炭素原子に結合した水素原子の 2次元相関スペクトルが取得可 能な 2次元 NMR測定を行い、さら〖こ、標的分子とリガンド候補ィ匕合物として 1ーァセ チルプロリンメチルエステル等とを共存させた状態で上記 2次元 NMR測定を行って 、得られた 2つのシグナルを比較したところ、標的分子に、想定されるリガンド候補物 質が結合するかどうか、また結合する場合には、リガンド物質が結合する標的分子の 部位を精度良く同定することが可能なことを見出だした。本発明は、これらの知見に 基づ 、て成し遂げられたものである。
[0010] 即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
( 1) (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結 合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測 定する工程、
(b)該標的分子と、少なくとも 1つのリガンド、リガンドィ匕合物、あるいはリガンド候補ィ匕 合物とを接触させる工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該 窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭素原子、）8炭素原 子またはカルボ-ル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、及び
(d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スぺク トルとを比較する工程を含む、標的分子とリガンドあるいはリガンドィ匕合物との結合の 検出方法。
[0011] (2) (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結 合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測 定する工程、
(b)該標的分子と、リガンド候補化合物の混合物とを接触させる工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該 窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭素原子、）8炭素原 子またはカルボ-ル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、
(d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スぺク トルとを比較する工程、 (e)工程 (d)で該 2次元相関スペクトルに違 ヽが見出された場合、該リガンド候補ィ匕 合物の混合物中の化合物を個別に標的分子と接触させ、標的分子中の標識された 主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸 残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元 相関スペクトルを測定する工程、及び
(f)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (e)で得られた 2次元スペクトルと を比較する工程を含む、標的分子に結合するリガンドィ匕合物のスクリーニング方法。
[0012] (3) (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結 合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測 定する工程、
(b)該標的分子と、少なくとも 1つのリガンドまたはリガンド候補ィ匕合物とを接触させる 工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該 窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭素原子、）8炭素原 子またはカルボ-ル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、
(d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スぺク トルとを比較する工程、及び
(e)工程 (d)で該 2次元相関スペクトルに違いが見出された場合、違いが見られるシ グナルに相当するアミノ酸を特定する工程を含む、標的分子に結合するリガンドまた はリガンドィ匕合物の結合部位の同定方法。
[0013] (4) (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結 合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測 定する工程、
(b)該標的分子と、各種濃度のリガンドまたはリガンドィ匕合物を接触させる工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該 窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭素原子、）8炭素原 子またはカルボ-ル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、
(d)工程 (a)で得られる 2次元相関スペクトルと、工程 (c)で得られる 2次元相関スぺク トルとを比較する工程、及び
(e)該 2次元相関スペクトルに違 、が見られた場合、該スペクトルの違 、をリガンドま たはリガンドィ匕合物濃度の関数として定量する工程を含む、標的分子とリガンドまた はリガンドィ匕合物との解離定数の測定方法。
[0014] (5) 標的分子がポリペプチドである、（1)〜 (4)のいずれかに記載の方法。
(6) 2次元相関スぺ外ルが、標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、 該窒素原子が存在するアミノ酸残基の 1つ前のアミノ酸残基中の標識されたカルボ- ル炭素原子の 2次元相関スペクトルである、 (1)〜（5)のいずれかに記載の方法。
(7) 2次元相関スぺ外ルが、標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、 該窒素原子が存在するアミノ酸残基の 1つ前のアミノ酸残基中の標識された α炭素 原子の 2次元相関スペクトルである、 (1)〜（5)のいずれかに記載の方法。
[0015] (8) (a)少なくとも主鎖の窒素及び Ζまたは炭素が標識された標的分子中の、標識 された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次元 相関スペクトルを測定する工程、
(b)該標的分子と、少なくとも 1つのリガンド、リガンドィ匕合物、あるいはリガンド候補ィ匕 合物とを接触させる工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分 子中の他の水素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、及び
(d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スぺク トルとを比較する工程を含む、標的分子とリガンドあるいはリガンドィ匕合物との結合の 検出方法。
[0016] (9) (a)少なくとも主鎖の窒素及び Zまたは炭素が標識された標的分子中の、標識 された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次元 相関スペクトルを測定する工程、
(b)該標的分子と、 2つ以上のリガンド候補ィ匕合物を含むリガンド候補ィ匕合物の混合 物とを接触させる工程、 (c)工程 (b)の標的分子中の、標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的 分子中の他の水素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、
(d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スぺク トルとを比較する工程、
(e)工程 (d)で該 2次元相関スペクトルに違 ヽが見出された場合、該リガンド候補ィ匕 合物の混合物中の化合物を個別に標的分子と接触させ、標的分子中の、標識され た主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次元相関 スペクトルを測定する工程、及び
(f)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (e)で得られた 2次元スペクトルと を比較する工程を含む、標的分子に結合するリガンドィ匕合物のスクリーニング方法。
[0017] (10) (a)少なくとも主鎖の窒素及び Zまたは炭素が標識された標的分子中の、標 識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次 元相関スペクトルを測定する工程、
(b)該標的分子と、 1つ以上のリガンドまたはリガンド候補ィ匕合物とを接触させる工程
(c)工程 (b)の標的分子中の、標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的 分子中の他の水素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、
(d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スぺク トルとを比較する工程、及び
(e)工程 (d)で該 2次元相関スペクトルに違いが見出された場合、違いが見られるシ グナルに相当するアミノ酸を特定する工程を含む、標的分子に結合するリガンドまた はリガンドィ匕合物の結合部位の同定方法。
[0018] (11) (a)少なくとも主鎖の窒素及び Zまたは炭素が標識された標的分子中の、標 識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次 元相関スペクトルを測定する工程、
(b)該標的分子と、各種濃度のリガンドまたはリガンドィ匕合物を接触させる工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の、標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的 分子中の他の水素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、 (d)工程 (a)で得られる 2次元相関スペクトルと、工程 (c)で得られる 2次元相関スぺク トルを比較する工程、及び
(e)該 2次元相関スペクトルに違 、が見られた場合、該スペクトルの違 、をリガンドま たはリガンドィ匕合物濃度の関数として定量する工程を含む、標的分子とリガンドまた はリガンドィ匕合物との解離定数の測定方法。
[0019] ( 12) 標的分子がポリペプチドである、（8)〜（11)のいずれかに記載の方法。
( 13) 標的分子が、主鎖の窒素及び炭素が標識された標的分子で、標識された主 鎖の原子に結合した水素原子が、標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子 で、標的分子中の他の水素原子が、上記窒素原子が存在するアミノ酸残基の 1つ前 のアミノ酸残基中の標識された主鎖の炭素原子に結合した水素原子であることを特 徴とする、（8)〜（12)のいずれかに記載の方法。
[0020] ( 14) 標的分子が、主鎖の窒素及び炭素が標識された標的分子で、標識された主 鎖の原子に結合した水素原子が、標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子 で、標的分子中の他の水素原子が、上記窒素原子が存在するアミノ酸残基、および その 1つ前のアミノ酸残基中の標識された主鎖の炭素原子に結合した水素原子であ ることを特徴とする、（8)〜（12)のいずれかに記載の方法。
[0021] ( 15) 標的分子が、主鎖の窒素及び炭素が標識された標的分子で、標識された主 鎖の原子に結合した水素原子が、標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子 で、標的分子中の他の水素原子が、上記窒素原子が存在するアミノ酸残基の 1つ前 のアミノ酸残基中の標識された主鎖の炭素原子に結合した水素原子、および上記窒 素原子が存在するアミノ酸残基の 1つ前のアミノ酸残基中の β炭素原子に結合した 水素原子であることを特徴とする、 (8)〜（12)のいずれかに記載の方法、 発明を実施するための最良の形態
[0022] 以下、本発明をさらに詳細に説明する。
( 1)標的分子とリガンドあるいはリガンド候補ィ匕合物との結合の検出方法
本発明の第一の態様によれば、 (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中の標識 された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するァ ミノ酸残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、（b)該標的分子と、少なくとも 1つのリガンド、 リガンド化合物、あるいはリガンド候補ィ匕合物とを接触させる工程、（c)工程 (b)の標 的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素原子と同一 または隣接するアミノ酸残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボ -ル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、及び (d)工程 (a)で得られ た 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スペクトルとを比較する工程 を含む、標的分子とリガンドあるいはリガンドィ匕合物との結合の検出方法が提供され る。
[0023] 本発明の第二の態様によれば、（a)少なくとも主鎖の窒素及び Zまたは炭素が標 識された標的分子中の、標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中 の他の水素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、（b)該標的分子と、少な くとも 1つのリガンド、リガンドィ匕合物、あるいはリガンド候補ィ匕合物とを接触させるェ 程、（c)工程 (b)の標的分子中の標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標 的分子中の他の水素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、及び (d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スペクトルとを 比較する工程を含む、標的分子とリガンドあるいはリガンド化合物との結合の検出方 法が提供される。
[0024] 「標的分子」とは、（1)アミノ酸が連結した主骨格を有し、（2)上記した本発明の第 一の態様の場合には、 13CZ15N二重標識ィ匕することができ、また上記した本発明の 第二の態様の場合には、その主鎖の炭素原子あるいは窒素原子を13 Cあるいは15 N 等の NMR測定可能な標識で標識ィ匕することができ、かつ（3)後述する 2次元相関ス ベクトルが取得できるものであれば何れのものでもよい。具体的には、ポリペプチド、 タンパク質、糖タンパク質、その部分フラグメント、あるいはその誘導体、リポタンパク 質、その部分フラグメント、あるいはその誘導体等が挙げられる。また、その分子量も 、後述する 2次元相関スペクトルが取得できる範囲であれば特に制限はないが、ポリ ペプチドあるいはタンパク質の場合、 10〜： LOOOアミノ酸残基力もなるものが好ましい 。また、糖タンパク質あるいはリポタンパク質等の場合には、分子量が 1〜： LOOkD程 度のものが好ましく用いられる。ポリペプチドまたはタンパク質の場合は、化学合成、 組換え体を用いた合成、無細胞タンパク質合成系等如何なる方法で取得されたもの でもよい。
[0025] 上記した本発明の第一の態様において、標的分子を13 CZ15N二重標識化する場 合、標的分子中の全ての炭素原子あるいは窒素原子が上記安定同位体である必要 はなぐ少なくとも、後述する 2次元相関スペクトルを取得するのに必要な主鎖の窒素 原子が15 Nで、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の α炭素原子、 β 炭素原子またはカルボ-ル炭素原子が13 Cであればよぐその他の部分の窒素原子 および炭素原子は、 15Νあるいは13 Cで標識ィ匕されていてもされていなくてもよい。また 、主鎖の標識化された窒素原子に結合する水素原子は1 Ηであることが必要であるが 、それ以外の水素原子は、重水素等で標識化されていてもいなくてもよい。ここで、 特に高分子量の標的分子の場合には、感度の低下を防ぐために、窒素原子に結合 した水素原子以外の水素原子の一部または全部が重水素等で標識化されているこ とが好ましい。
[0026] 上記した本発明の第二の態様において、標的分子を13 C及び/または15 Νで標識 化する場合、標的分子中の全ての炭素原子あるいは窒素原子が上記安定同位体で ある必要はなぐ少なくとも、後述する 2次元相関スペクトルを取得するのに必要な原 子が15 Νあるいは13 Cであればよぐその他の部分の窒素原子および炭素原子は、 15Ν あるいは13 Cで標識ィ匕されて 、てもされて 、なくてもょ 、。後述する 2次元相関スぺタト ルを取得するのに標識が必要な原子は、少なくとも主鎖窒素及び Ζまたは炭素であ り、主鎖以外の窒素または炭素に結合した水素原子を後述する 2次元相関スぺタト ルの取得に用いる場合には、該水素原子が結合した窒素または炭素も標識されてい ることが好ましい。具体的には、標的分子中の主鎖の窒素原子に結合した水素原子 と標的分子中の他の水素原子 (以下、これを「第 2の水素原子」と称することがある）の 2次元相関スペクトルを取得する場合は主鎖の窒素原子と、好ましくは、第 2の水素 原子が結合した窒素または炭素も標識されている標的分子が用いられる。また、標 的分子中の主鎖の炭素原子に結合した水素原子と標的分子中の他の水素原子の 2 次元相関スペクトルを取得する場合は主鎖の α炭素原子と、好ましくは、第 2の水素 原子が結合した窒素あるいは炭素も標識されている標的分子が用いられる。また、後 述する 2次元相関スペクトルを取得する水素原子は1 Hであることが必要である力 そ れ以外の水素原子は、重水素等で標識化されていてもいなくてもよい。ここで、特に 高分子量の標的分子の場合には、感度の低下を防ぐために、 NMRシグナルを観測 する水素原子以外の水素原子の一部または全部が重水素等で標識化されているこ とが好ましい。
[0027] また、標的分子に含まれるアミノ酸のうち、上記窒素原子および炭素原子の15 Nある いは13 Cによる標識ィ匕が必要なアミノ酸は、リガンドまたはリガンド化合物が結合する アミノ酸が既に同定されていたり、または想定されている場合には、そのアミノ酸のみ の窒素原子及び/または炭素原子が15 Nあるいは13 Cによって標識化 (以下、これを「 標識化」と称することがある）されて 、ればよぐそれ以外のアミノ酸につ 、ては標識 化されていてもされていなくてもよい。下述する 2次元 NMR測定において、主鎖の窒 素原子に結合する水素原子と、該窒素原子が存在するアミノ酸残基に隣接するアミ ノ酸残基の炭素原子または該窒素原子が存在するアミノ酸残基に隣接するアミノ酸 残基の炭素原子に結合した水素原子との 2次元相関スペクトルを取得する場合には 、リガンドある!/、はリガンドィ匕合物が結合するアミノ酸およびそれに隣接するアミノ酸 が上記標識ィ匕をされている必要がある。また、リガンドまたはリガンド化合物が結合す るアミノ酸が既に同定されていたり、または想定されていない場合には、全てのァミノ 酸にっ 、て上記標識化がされて 、ることが好ま 、。このように標識化された標的分 子を、本明細書中では、「標識ィ匕標的分子」と称することがある。
[0028] 標的分子の標識化は、上記の窒素原子および炭素原子が標識化される方法で、 通常用いられる方法により行うことができる。また、市販の標識化アミノ酸 (Cambridge Isotope Laboratories社製等）を用いることができる。標的分子がポリペプチドあるいは タンパク質である場合には、標識ィ匕および非標識ィ匕アミノ酸を基質としてタンパク質 合成を行なうことにより標識ィ匕標的分子を製造する方法が好ましく用いられる。タンパ ク質合成系は、安定同位体を用いたタンパク質合成であるため、無細胞タンパク質 合成系が好ましく用いられ、特にコムギ胚芽抽出液を用いる無細胞タンパク質合成 系が好ましく用いられる。コムギ胚芽抽出液としては、例えば、 Sawasaki.et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 559-564(2000)、特開 2000— 2368996号公報、特開 20 02— 125693号公報、特開 2002— 204689号公報等に従って調製されたものや、 あるいは PROTEIOS™ (TOYOBO社製）等の巿販のもの等が挙げられる。
[0029] コムギ胚芽抽出液を用いたタンパク質の合成は、通常用いられる方法で行うことが できるが、具体的には、例えば、 Sawasaki.et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 55 9-564(2000)に記載の方法等が挙げられる。この場合、標識化基質および非標識ィ匕 基質の濃度としては、 0. 05-0. 4mMの範囲が適当である。
[0030] コムギ胚芽抽出液を上記標識化標的分子の合成に用いる場合、該抽出液中に含 まれるアミノ酸代謝酵素による影響を考慮する必要がある。コムギ胚芽抽出液中のァ ミノ酸代謝酵素によれば、ァラニンがァスパラギン酸およびグルタミン酸に代謝され、 ァスパラギン酸がグルタミン酸に代謝され、さらにグルタミン酸がァスパラギン酸また はグルタミンに代謝される。そこで、標的分子中のァラニン、ァスパラギン酸、ダルタミ ン酸を選択的に標識化する場合には、それぞれのアミノ酸代謝酵素の活性を阻害し て、かつ該タンパク質合成系における翻訳反応を阻害しな!、条件下で標識化標的 分子を合成する必要がある。具体的には、ァラニンあるいはァスパラギン酸を選択的 に標識化する場合、無細胞タンパク質合成系の翻訳反応液に、トランスアミナーゼ阻 害剤を、タンパク質合成活性を阻害しな ヽ濃度範囲で存在させる方法等が用いられ る。トランスアミナーゼの具体例としては、アミノォキシ酢酸等が用いられ、翻訳反応 液中の好ましい濃度範囲は 0. 01〜： LOmMである。また、グルタミン酸を選択的に標 識ィ匕する場合には、無細胞タンパク質合成系の翻訳反応液に、トランスアミナーゼ阻 害剤およびグルタミン合成阻害剤を、タンパク質合成活性を阻害しな ヽ濃度範囲で 存在させる方法等が用いられる。トランスアミナーゼの具体例としては、アミノォキシ 酢酸等が用いられ、翻訳反応液中の好ましい濃度範囲は 0. 01〜： LOmMである。ま た、グルタミン合成酵素の具体例は、例えば、 L メチォニンサルフォキシィミン等が 用いられ、翻訳反応液中の好ましい濃度範囲は 0. 01〜20mMである。
[0031] カゝくして合成された標識化標的分子は、これを翻訳反応液から回収し、必要であれ ば適当な方法により精製することにより取得することができる。しかし、コムギ胚芽抽 出液で合成された標的分子を NMR測定に用いる場合には、精製は必ずしも必要な ぐそれ自体公知の方法により適当な濃度に濃縮して、かつ緩衝液を NMR測定用 に交換することで十分なことが多い。濃縮方法としては、例えば、限外濾過濃縮装置 を用いる方法が挙げられる。また、緩衝液の交換は、市販のスピンカラムを用いる方 法等が好ましく用いられる。
[0032] 本発明の第一の態様の方法では、まず (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中 の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接 するアミノ酸残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原 子との 2次元相関スペクトル (以下、これを Γ^Η— 13C相関スペクトル」あるいは Γ^Η— 13 C相関シグナル」と称することがある)を測定する。標的分子中の標識された窒素原 子に結合した水素原子（以下、これを「アミドプロトン」と称することがある）と 2次元相 関スペクトルを取得する炭素原子は、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基 中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子の 、ずれでも よい。用いられる NMR測定方法は、上記アミドプロトンおよび炭素原子の相関スぺク トルが取得できるものであれば如何なるものでもよいが、シグナルが多いと、それらが 重なりあってしまい、解析が困難になるので、 1つのアミドプロトンに対しては、 1つま たは 2つの炭素原子の相関スペクトルが得られる NMR測定方法が好ましぐさらには 1つのアミドプロトンに対して 1つの炭素原子の相関スペクトルが得られる NMR測定 方法が最も好ましい。具体例を以下に示す。
[0033] アミドプロトンと、 1つ前のアミノ酸残基のカルボニル炭素原子の 2次元相関スぺタト ルを取得する方法としては、 H (N) CO法（Cavanagh, W. J., et al.， Protein NMR Spe ctroscopy, Principles and Practice. Academic Press (1996)に己載の NHC03次兀測 定法において、 Nの展開時間を省略した 2次元測定：図 1)等が用いられる。また、ァ ミドプロトンと同一アミノ酸残基中のカルボ-ル炭素原子、及び 1つの前のアミノ酸残 基中のカルボニル炭素原子の 2次元相関スペクトルを取得する方法として H (NCA) CO法 (Cavanagh, W. J., et al., Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice. Academic Press (1996)に記載の HN(CA)C03次元測定法において、 Nの展開時間 を省略した 2次元測定：図 1)が用いられる。また、アミドプロトンと、 1つの前のアミノ酸 残基の a炭素原子の 2次元相関スペクトルを取得する方法としては H (NCO) CA法 (し avanagh, W. J., et al., Protein NMR spectroscopy, Principles ana Practice. Acad emic Press (1996)に記載の HN(CO)CA3次元測定法において、 Nの展開時間を省略 した 2次元測定：図 1)等が用いられる。また、アミドプロトンと同一アミノ酸残基中の α 炭素原子、及び 1つ前のアミノ酸残基中の α炭素原子の 2次元相関スペクトルを取得 する方法として H (N) CA法（Cavanagh, W. J. , et al. , Protein NMR Spectroscopy, Pr inciples and Practice. Academic Press (1996)に記載の HNCA3次元測定法において 、 Nの展開時間を省略した 2次元測定：図 1)、アミドプロトンと同一アミノ酸残基中の a炭素原子と β炭素原子、また 1つ前のアミノ酸残基中の oc炭素原子と β炭素原子 との 2次元相関スペクトルを取得する方法として H (N) CACB法（Cavanagh, W. J., et al. , Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice. Academic Press (199Mこ 記載の HNCACB3次元測定法において、 Nの展開時間を省略した 2次元測定：図 1) 、及び CBCA (N) H法（Cavanagh, W. J., et al., Protein NMR Spectroscopy, Principl es and Practice. Academic Press (1996)に記載の CBCANH3次元測定法において 、 Nの展開時間を省略した 2次元測定：図 1)等が用いられる。さらに、アミドプロトンと 1つ前のアミノ酸残基中の ex炭素原子と β炭素原子との 2次元相関スペクトルを取得 する方法としては、 H (NCO) CACB法（Cavanagh, W. J., et al. , Protein NMR Spect roscopy, Principles and Practice. Academic Press (1996)に記載の HN(CO)CACB3次 元測定法において、 Nの展開時間を省略した 2次元測定：図 1)、及び CBCA (CON ) H法 (Cavanagh, W. J., et al. , Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice. Academic Press (1996)に記載の CBCA(CO)NH3次元測定法において、 Nの展開時 間を省略した 2次元測定：図 1)等が用いられる。また、アミドプロトンと同一アミノ酸残 基中の β炭素原子及び 1つ前のアミノ酸残基中の β炭素原子の 2次元相関スぺタト ルを取得する方法としては H (NCA) CB法（Yamazaki, T. et al. , J. Am. Chem. Soc. 116 (1994) 11655-11666に記載の HNCACB3次元測定法において、 Nの展開時間を 省略した 2次元測定：図 1)等が用いられる。さらにアミドプロトンと 1つ前のアミノ酸残 基中の β炭素原子との 2次元相関スペクトルを取得する方法としては H (NCOCA) CB法（Yamazaki, T. et al. , J. Am. Chem. Soc. 116 (1994) 11655- 11666に記載の HN (COCA)CB3次元測定法において、 Nの展開時間を省略した 2次元測定：図 1)等が 用いられる。高分子量の蛋白質の場合は、上記全ての測定方法に TROSY (Pervus hin, K. et al , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 12366- 12371)を組み合わせた TROSY- H (N) CO、 TROSY- H (NCA) CO、 TROSY— H (NCO) CA、 TRO SY- H (N) CA、 TROSY- H (N) CACB、 TROSY - CBCA (N) H, TROSY— H (NCO) CACB、 TROSY— CBCA (CO) NH、 TROSY— H (NCA) CB、 TROS Y— H (NCOCA) CB法等を用いる事が望ましい。これらの測定方法のうち、 H (N) C O法、 H (NCO) CA法、 H (N) CA法が好ましぐ H (N) CO法が最も好まし!/、。
[0034] また、本発明の第二の態様の方法では、まず (a)少なくとも主鎖の窒素及び Zまた は炭素が標識された標的分子中の、標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、 標的分子中の他の水素原子との 2次元相関スペクトル (以下、これを Γ^Η— 相関ス ベクトル」あるいは「 — 相関シグナル」と称することがある）を測定する。「標的分 子中の標識された主鎖の原子に結合した水素原子」とは、主鎖の窒素原子に結合し た水素原子 (以下、これを「アミドプロトン」と称することがある）、標識された主鎖の α 炭素原子に結合した水素原子 (以下、これを「 OC水素原子」と称することがある）の何 れでもよい。また、「標的分子中の他の水素原子」とは、標的分子中のいずれの水素 原子でもよい。具体的には、例えば、現在 NMRにより 2次元相関スペクトルが取得で きる範囲である、上記窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された a 炭素原子や ι8炭素原子に結合した水素原子等が挙げられる。この場合、該水素原 子が結合して 、る窒素原子あるいは炭素原子が上記標識化されて 、ることが好まし い。
[0035] 用いられる NMR測定方法は、上記水素原子間の 2次元相関スペクトルが取得でき るものであれば如何なるものでもよいが、シグナルが多いと、それらが重なりあってし まい、解析が困難になるので、 1つの標識された主鎖の原子に結合した水素原子に 対しては、 1つまたは 2つの水素原子の相関スペクトルが得られる NMR測定方法が 好ましぐさらには 1つの標識された主鎖の原子に結合した水素原子に対して 1つの 水素原子の相関スペクトルが得られる NMR測定方法が最も好ま 、。具体例を以下 に示す。
[0036] アミドプロトンと、 1つ前のアミノ酸残基の ex水素原子の 2次元相関スペクトルを取得 する方法としては、 HA (CACON) H法（Boucher, W. et al. , J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 2262-2264に記載の HCA (CO) NH4次元測定法において、 C a及び Nの展 開時間を省略した 2次元測定：図 1)または H (NCOCA) HA法 (Kay, L. E. et al, J. Magn. Reson. 98 (1992) 443-450に記載の NH (CO) CAHA4次元測定法において 、 C a及び Nの展開時間を省略した 2次元測定：図 1)等が用いられる。また、アミドプ 口トンと同一アミノ酸残基中の 0C水素原子、及び 1つ前のアミノ酸残基中の 0C水素原 子の 2次元相関スペクトルを取得する方法として HA (CAN) H法（Kay, L. E. et al, J . Magn. Reson. 91 (1991) 84- 92に記載の HA (CA) NH3次元測定法において、 Nの 展開時間を省略した 2次元測定：図 1)または H (NCA) HA法 (Clubb, R. T. et al, J. Biomol. NMR2 (1992) 203- 210に記載の HN (CA) HA3次元測定法において、 Nの 展開時間を省略した 2次元測定：図 1)等が用いられる。
また、アミドプロトンと 1つ前のアミノ酸残基中の OC水素原子、及び β炭素原子に結 合した水素原子 (以下、これを「 |8水素原子」と称することがある）との 2次元相関スぺ タトルを取得する方法としては、 HBHA(CBACACON) H法（Grzesiek, S., J. Biom ol. NMR3 (1993) 185- 204に記載の HBHA(CBCACO) NH3次元測定法において 、 Nの展開時間を省略した 2次元測定：図 1)等が用いられる。さらに、アミドプロトンと 同一アミノ酸残基中の α水素原子と β水素原子、また 1つ前のアミノ酸残基中の α 水素原子と β水素原子との 2次元相関スペクトルを取得する方法として HBHA (CB CAN) H法（Wang. A.C. et al., J.Magn. Reson. B105 (1994) 196- 198に記載の HBH A (CBCA) NH3次元測定法において、 Nの展開時間を省略した 2次元測定：図 1) 等が用いられる。さらに、アミドプロトンと 1つ前のアミノ酸残基中の α水素原子、 β水 素原子及びその他の水素原子との 2次元相関スペクトルを取得する方法としては、 Η (CCCON) H法（Sattler, M.et al., Prog. Nuc. Magn. Reson. Spectroscopy 34(1999) 93-158に記載の H (CCCO) NH3次元測定法において、 Nの展開時間を省略した 2 次元測定：図 1)等が用いられる。高分子量の蛋白質の場合は、上記の測定方法に T ROSY(Pervushin, K. et al.'Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(1997)12366— 12371)を組 み合わせた測定法を用いる事が望ましい。これらの測定方法のうち、 H (NCOCA) H A法または HA(CACON) H法が最も好ましい。この測定法によれば、標識された主 鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素原子が存在するアミノ酸残基の 1つ前 のアミノ酸残基中の標識された主鎖の炭素に結合した水素原子との 2次元相関スぺ タトルが取得される。さら〖こは、上記 HA(CAN) H法または H (NCA) HA法が好まし い。この測定法によれば、標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、上記 窒素原子が存在するアミノ酸残基、およびその 1つ前のアミノ酸残基中の標識された 主鎖の炭素原子に結合した水素原子との 2次元相関スペクトルが取得できる。
[0038] 上記 NMR測定にお 、て、用いられる緩衝液および標的分子の濃度等は通常 NM R測定法において用いられている範囲で適宜選択することができる。具体的には、例 えば、 NMR測定用緩衝液としては、 25mMリン酸カリウム pH6. 5、 50mM NaCl、 5mM DTTのもの等が好ましく用いられる。該緩衝液に標的分子を適当な濃度で溶 解することにより NMR測定用試料として用いる。標的分子の濃度は NMR測定が行 い得る範囲であれば特に制限はないが、具体的には、例えば M〜： LOmMの範 囲が好ましい。
[0039] 本発明では、次に (b)該標的分子と、少なくとも 1つのリガンド、あるいはリガンド候 補化合物とを接触させる工程を行なう。「リガンド」とは、上記標的分子が生体内分子 である場合、これに生体内で結合している物質またはその誘導体を意味する。また、 「リガンド候補ィ匕合物」とは、標的分子に結合して、標的分子の機能を制御する可能 性のある化合物を意味する。このような可能性のある化合物であれば如何なる構造を 有するものでもよい。「リガンド化合物」とは、標的分子に結合してその機能を制御す る活性のある化合物を意味する。リガンドあるいはリガンドィ匕合物は、必ずしも 1分子 で標的分子に結合するものでなくてもよぐ同一のまたは異なる 2分子以上が融合し て標的分子と複合体を形成するものでもよ 、。 2つ以上の分子が融合して標的分子と 複合体を形成するものである場合、これらと標的分子との結合状態を解析して新たな リガンド化合物の設計を行なうことができる。具体的には、例えば、特許第 3032301 号に記載の方法等が用いられる。
[0040] 標的分子とリガンド、リガンド化合物、ある!/、はリガンド候補ィ匕合物を接触させる方 法は、これらが結合し得る条件下であれば如何なる方法でもよい。具体的には、上記 標的分子を適当濃度で含む NMR測定用緩衝液にリガンド、リガンド化合物、あるい はリガンド候補ィ匕合物を添加する方法等が挙げられる。リガンド、リガンドィ匕合物、あ るいはリガンド候補ィ匕合物の濃度は、標的分子と該物質との関係により適宜選択する ことができるが、例えば M〜： LOOmM程度の範囲が好ましい。標的分子に接触 させるリガンド、リガンド化合物、あるいはリガンド候補ィ匕合物は、少なくとも 1つである 。また、リガンド候補化合物の混合物を標的分子と接触させれば一度に多数の化合 物の標的分子への結合を検出することができる。リガンド候補化合物の混合物とは、 例えば、ある化合物の誘導体群や、医薬品等の候補化合物ライブラリ一等複数の化 合物が混在して 、るもの等を用いることができる。
[0041] 本発明の第一の態様の方法では、次に、 (c)上記の NMR測定用試料中の標的分 子中の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素原子と同一または 隣接するアミノ酸残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭 素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程を行う。 NMR測定方法は、上記の とおりである。また、本発明の第二の態様の方法では、次に、（c)上記の NMR測定 用試料中の標的分子中の標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、該標的分 子中の他の水素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程を行なう。 NMR測定 方法は、上記のとおりである。
[0042] 本発明の第一の態様の方法では、次に、（d)上記工程 (a)で得られた1 Η— 13 C相関 スペクトルと上記工程 (c)で得られた1 H— 13 C相関スペクトルとを比較する工程を行う 。また、本発明の第二の態様の方法では、次に、（d)上記工程 (a)で得られた1 H—1 H相関スペクトルと、上記工程 (c)で得られた1 H - 相関スペクトルとを比較するェ 程を行なう。ここで、比較する 2つの 2次元相関スペクトルは、上記の NMR測定法の うち、同一の測定方法により測定されたものである必要がある。 ¾ 13 C相関スぺタト ルまたは1 Η— ^Η相関スペクトルの比較は、 2つのスペクトルの相違が検出できる方法 であれば如何なるものでもよい。具体的には 2つのスペクトルを重ねあわせ、 目視に より相違を検出する方法等が用いられるし、スペクトル中のシグナルの化学シフトを一 般的な NMR解析ソフトウェアを用いて同定し、その値を比較しても良!、。
[0043] 具体的な1 H— 13C相関スペクトルを用いて説明すると、例えば、 15NZ13C標識ィ匕標 的分子（ヒト FKBPタンパク質）について、上記 H (N) CO法により NMR測定した 2次 元相関スペクトルは、図 4に示すとおりである。標的分子に結合することがわ力つてい る 1 ァセチルブロリンメチルエステルを接触させた後に、同じ H (N) CO法により N MR測定して得られた 2次元相関スペクトルを図 4に重ね合わせたものが図 8である。 重ね合わせることにより両スペクトルを比較すると、図 8に示されるように 3つのシグナ ルにおいて相違があることがわかる。このように、両スペクトルにおいて相違が見られ た場合、標的分子に接触させたリガンドまたはリガンド候補ィ匕合物と標的分子との結 合を検出することができる。
[0044] 具体的な1 Pi 1!!相関スぺ外ルを用いて説明すると、例えば、 15N/13C標識ィ匕標 的分子（ヒト FKBPタンパク質）について、上記 HA (CACON) H法により NMR測定 した 2次元相関スペクトルは、図 20に示すとおりである。標的分子に結合することが わかって!/、る 1—ァセチルブロリンメチルエステルを接触させた後に、同じ HA (CAC ON) H法により NMR測定して得られた 2次元相関スペクトルを図 20に重ね合わせた ものが図 24である。重ね合わせることにより両スペクトルを比較すると、図 24に示され るように相違があることがわかる。このように、両スペクトルにおいて相違が見られた場 合、標的分子に接触させたリガンドまたはリガンド候補ィ匕合物と標的分子との結合を 検出することができる。
[0045] (2)標的分子に結合するリガンド化合物のスクリーニング方法
本発明の別の側面によれば、 (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中の標識さ れた主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミ ノ酸残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボ-ル炭素原子との 2 次元相関スペクトルを測定する工程、（b)該標的分子と、リガンド候補化合物の混合 物とを接触させる工程、（c)工程 (b)の標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に 結合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識され た (X炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元相関スペクトルを 測定する工程、 (d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2 次元相関スペクトルとを比較する工程、 (e)工程 (d)で該 2次元相関スペクトルに違い が見出された場合、該リガンド候補ィ匕合物の混合物中の化合物を個別に標的分子と 接触させ、標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素 原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭素原子、 |8炭素原子ま たはカルボ-ル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、及び (f)工程 (a )で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (e)で得られた 2次元スペクトルとを比較する 工程を含む、標的分子に結合するリガンド化合物のスクリーニング方法が提供される
[0046] さらに本発明によれば、（a)少なくとも主鎖の窒素及び Zまたは炭素が標識された 標的分子中の標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水 素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、（b)該標的分子と、 2つ以上のリガ ンド候補ィ匕合物を含むリガンド候補ィ匕合物の混合物とを接触させる工程、（c)工程 (b )の標的分子中の標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の 水素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、 (d)工程 (a)で得られた 2次元 相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スペクトルとを比較する工程、 (e)ェ 程 (d)で該 2次元相関スペクトルに違 ヽが見出された場合、該リガンド候補化合物の 混合物中の化合物を個別に標的分子と接触させ、標的分子中の標識された主鎖の 原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次元相関スペクトル を測定する工程、及び (f)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (e)で得ら れた 2次元相関スペクトルとを比較する工程を含む、標的分子に結合するリガンドィ匕 合物のスクリーニング方法が提供される。
[0047] 「リガンドィ匕合物」とは、標的分子に結合して標的分子の機能を制御する活性を有 する化合物を意味する。リガンドィ匕合物のスクリーニング方法における上記工程 (a) 〜（d)は、（1)に説明したものである。ここで「リガンド候補ィ匕合物の混合物」は、如何 なる化合物の混合物であってもよいが、同一の NMR測定の条件で標的分子に結合 し得るものの集まりであることが必要である。また、工程 (e)で上記リガンド候補ィ匕合 物群に含まれる個々の化合物について標的分子との結合を検出するので、個々に 分離し得る集団であることも必要である。
[0048] 上記の工程 (e)においては、工程 (d)で該1 H— 13 C相関スペクトルに相違が見られ た場合、工程 (b)のリガンド候補ィ匕合物の混合物中の個々の化合物を個別に標的分 子と接触させ、標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該 窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭素原子、）8炭素原 子またはカルボ-ル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定する力、あるいは、ェ 程 (d)で該1 H - 相関スペクトルに相違が見られた場合、工程 (b)のリガンド候補ィ匕 合物の混合物中の個々の化合物を個別に標的分子と接触させ、標的分子中の標識 された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次元 相関スペクトルを測定する。標的分子との接触方法および NMR測定方法は、上述 のとおりである。
[0049] さらに工程 (f)においては、工程 (a)で得られた1 H— 13 C相関スペクトルと工程 (e)で 得られた1 H— 13 C相関スペクトルとを比較する工程を行なうか、あるいは工程 (a)で得 られた1 H - 相関スペクトルと工程 (e)で得られた1 H - 相関スペクトルとを比較す る工程を行なう。 2つの1 H— 13C相関スペクトルの比較方法及び 2つの1 H - 相関ス ベクトルの比較方法は上述のとおりである。この比較により1 H— 13 C相関スペクトルま たは1 Η— ^Η相関スペクトルに相違が見られた場合、標的分子と接触させたリガンド 候補ィ匕合物はリガンドィ匕合物として選択される。
[0050] (3)標的分子に結合するリガンドの結合部位の同定方法
本発明のさらに別の側面によれば、 (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中の 標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接 するアミノ酸残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原 子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、（b)該標的分子と、少なくとも 1つのリガ ンドまたはリガンド候補ィ匕合物とを接触させる工程、（c)工程 (b)の標的分子中の標 識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接する アミノ酸残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子と の 2次元相関スペクトルを測定する工程、 (d)工程 (a)で得られた 2次元相関スぺタト ルと工程 (c)で得られた 2次元相関スペクトルとを比較する工程、及び (e)工程 (d)で 該 2次元相関スペクトルに違いが見出された場合、違いが見られるシグナルに相当 するアミノ酸を特定する工程を含む、標的分子に結合するリガンドまたはリガンドィ匕合 物の結合部位の同定方法が提供される。
[0051] 本発明によればさらに、（a)少なくとも主鎖の窒素及び Zまたは炭素が標識された 標的分子中の標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水 素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、（b)該標的分子と、少なくとも 1つ のリガンドまたはリガンド候補ィ匕合物とを接触させる工程、（c)工程 (b)の標的分子中 の標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、 (d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトル と工程 (c)で得られた 2次元相関スペクトルとを比較する工程、及び (e)工程 (d)で該 2次元相関スペクトルに違いが見出された場合、違いが見られるシグナルに相当する アミノ酸を特定する工程を含む、標的分子に結合するリガンドまたはリガンドィ匕合物の 結合部位の同定方法が提供される。
[0052] 上記方法の工程 (a)〜（d)は（1)で説明したとおりである。但し、標的分子は、上記 NMR測定を行なった場合に得られる1 H - 13C相関スペクトルまたは1 H - 相関ス ベクトルの各シグナルがどのアミノ酸に由来するものであるかが帰属されている必要 がある。工程 (d)で1 H - 13C相関スぺクトルまたは1 H - 相関スペクトルに違 ヽが見 出されたアミノ酸は、標的分子とリガンドまたはリガンドィ匕合物との結合に関連して 、 ると決定することができる。各シグナルの帰属は、上記 NMR測定を行なう前でも後で もよ 、。標的分子の各シグナルの帰属方法はそれ自体公知の通常用いられる方法 で行うことができるが、以下に説明する方法で行えば効率良く帰属付けを行なうこと ができる。
[0053] 例えば、以下のように、 ^— Ν相関スペクトルの各シグナルの帰属を決定した後 に、これをもとに、標的分子のアミノ酸のアミドプロトンと13 Cの相関シグナルを決定す ることができる。具体的には、（i)蛋白質のアミドプロトンと15 Νの相関シグナルについ て下述の方法によりその帰属を決定し、（ii)標的分子のアミノ酸配列上で、同定しょう とするアミノ酸の ex炭素原子またはカルボ-ル炭素原子が13 Cで標識されたものを調 製し、（iii)該蛋白質について、同定しょうとするアミノ酸中のアミドプロトンと、同じアミ ノ酸の13 Cで標識された炭素原子との相関シグナルを取得し、 (iv)上記 (i)のアミドプ 口トンと15 Nの相関シグナルと（iii)のアミドプロトンと13 Cに共通するアミドプロトンの化学 シフトが同じであることを指標として、アミドプロトンと13 Cとの相関シグナノレを該アミドプ 口トンと15 Nの相関シグナルに対応付けて、アミドプロトンと13 Cとの相関シグナルの帰 属を決定する方法である。 [0054] また、例えば、以下のように、 15 N相関スペクトルの各シグナルの帰属を決定し た後に、これをもとに標的分子の標識された主鎖の原子に結合した水素原子と標的 分子の他の水素原子間の相関シグナルを決定することができる。具体的には、（i)蛋 白質のアミドプロトンと15 Nの相関シグナルについて下述の方法によりその帰属を決 定し、（ii)標的分子の主鎖のアミドプロトンと、標的分子中の他の水素原子間の 2次 元相関スペクトルを取得して、（m)上記 (i)のアミドプロトンと15 Nの相関シグナルと (ii) のアミドプロトンと水素原子間の 2次元相関スペクトルに共通する、アミドプロトンの化 学シフトが同じであることを指標として、アミドプロトンと他の水素原子間の相関シグナ ルを、該アミドプロトンと15 Nの相関シグナルに対応付けて、アミドプロトンと他の水素 原子との相関シグナルの帰属を決定する方法である。
[0055] 同定しょうとするアミノ酸とは、 1種類でもよぐ複数種類でもよぐまた、全部のァミノ 酸でもよ 、が、後述するシグナルの対応付けでシグナルが重ならずに対応付けが可 能な範囲であれば何れでもよい。まず、 15 N相関スペクトルの各シグナルの帰属 の決定方法を以下に詳細に説明する。
[0056] シグナルの帰属を行う標的分子は、その主要骨格であるアミノ酸配列が同定されて いることが必要である。まず、シグナルの帰属を決定しょうとするアミノ酸について、標 的分子のアミノ酸配列上で該アミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸を特定し、該 隣接アミノ酸についてはその α炭素原子およびカルボ-ル炭素原子が13 Cで、また主 鎖の窒素原子が15 Νで二重標識されて 、て (以下、これを「二重標識ィ匕アミノ酸」と称 することがある）、それ以外のアミノ酸については、主鎖の窒素原子のみが15 Νで標識 されたアミノ酸力もなるもの (以下、これを「13CZ15N二重標識化標的分子」と称するこ とがある）を調製する。標的分子がポリペプチドまたはタンパク質の場合には、該隣接 アミノ酸についてはその α炭素原子およびカルボニル炭素原子が13 Cで、また主鎖の 窒素原子が15 Νで二重標識されていて、それ以外のアミノ酸については、主鎖の窒素 原子のみが15 Νで標識されたアミノ酸を基質として、標的分子を合成することで調製 することができる。
[0057] 次に、上記の13 CZ15N二重標識化標的分子について、 13CZ15N二重標識化ァミノ 酸に隣接するアミノ酸残基のアミドプロトンと主鎖の窒素原子の 2次元相関スペクトル のみ（以下、これを「 15 N相関シグナル」と称することがある）が取得可能な NMR 解析を行う。具体的には、 HN (CO)法（Cavanagh, W. J., et al, Protein Spectrosco py, Principles. Press(1996)に記載の HNC03次元測定法において、 COの展開時間 を省略した 2次元測定)等が挙げられる。 HN (CO)測定により得られたシグナルは、 二重標識ィ匕アミノ酸の C末側に隣接するアミノ酸残基のものである。ここでは、二重標 識ィ匕アミノ酸の C端側に隣接するアミノ酸の1 H - 15N相関シグナルのみを取得できる HN (CO)測定を行っているが、二重標識ィ匕アミノ酸の N端側に隣接するアミノ酸の1 H— 15 N相関シグナルのみを取得できる測定法が有れば、その測定法を用いてもよ い。
[0058] これらのシグナルの中から、 目的アミノ酸のシグナルを選択する方法としては、 目的 アミノ酸の主鎖の窒素原子のみが15 Nで標識されたアミノ酸を基質として目的タンパク 質を合成し、該タンパク質について NMR測定により1 H— 15 N相関シグナルを取得し て、 HN (CO)測定と比較することにより行うことができる。
[0059] 上記の同定しょうとするアミノ酸の1 H— 15N相関シグナルは、以下の方法で取得して もよい。まず、同定しょうとするアミノ酸は13 CZ15N二重標識ィ匕アミノ酸、その他は15 N 標識化アミノ酸を基質として目的タンパク質を合成し、該タンパク質について二重標 識ィ匕アミノ酸の1 H-15N相関シグナルと、それに隣接するアミノ酸残基の1 H-15N相 関シグナルの両方が検出される NMR測定、具体的には HN (CA)法（Cavanagh, W. J., et al., Protein Spectroscopy, Principles. Press(1996)に記載の HNCA3次元測 定法において、 CAの展開時間を省略した 2次元測定)等で測定する。また、同じタン パク質にっ 、て HN (CO)法で測定してシグナルを取得し、 HN (CA)法で得られた シグナルと比較する。ここで、重なっていないシグナルが目的アミノ酸を含む同じアミ ノ酸のシグナルである。また、二重標識ィ匕アミノ酸を 2種類以上用いて合成した目的 タンパク質を用いても、上記方法と同様の方法を用いて、アミノ酸番号の帰属が可能 である。この場合には、帰属の手順が若干複雑にはなるが、試料の数を 20種類より 減らすことが可能である。
[0060] ここで、同定しょうとするアミノ酸と隣接するアミノ酸の組み合わせがその目的タンパ ク質配列中に 1つしか存在しな 、ようなアミノ酸残基にっ 、てのみ帰属を行えば良 ヽ 場合には、同定しょうとするアミノ酸に隣接するアミノ酸の標識は、必ずしも13 CZ15N の二重の標識が必要ではない。すなわち、そのカルボ-ル炭素原子が13 C標識され ていればよい。この場合には、目的タンパク質として、さらに同定しょうとするアミノ酸 を含む複数のアミノ酸の主鎖の窒素原子が15 Nで標識されて 、るものを合成する。合 成されたタンパク質を HN (CO)法等で測定してシグナルを取得し、これらのシグナ ルの組み合わせと、同定しょうとするアミノ酸の主鎖の窒素原子だけを15 Nで標識ィ匕し たタンパク質の1 H— 15 N HSQCスペクトルと比較することによって、上記と同様にシ グナルを帰属することができる。この方法を用いることによれば、カルボニル炭素原子 が13 C標識されていて、同定しょうとするアミノ酸の主鎖の窒素原子が15 Nで標識され て 、るものを合成し、この HN (CO)法等により測定して得られたシグナルを取得して V、く従来の方法に比べて、標識タンパク質の種類が少なくてすむと!、う効果がある。 上記の方法は、これを繰り返すことによって、標的分子中の全てのアミノ酸に対して N MRで得られるシグナルの帰属を行うことができる力 同定しょうとするアミノ酸と隣接 するアミノ酸の組み合わせがその目的タンパク質配列中に 1つしか存在しない場合に のみ用いることができる方法である。
[0061] 標的分子中に同定しょうとするアミノ酸と隣接するアミノ酸の組み合わせが 2つ以上 存在する場合、以下に示す方法により帰属を行うことができる。まず、（i)標的分子の アミノ酸配列上で同定しょうとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸につい て、その特定の原子とアミドプロトンとの相関シグナルを上記の方法で帰属を決定す る。次に、（ii)帰属が決定されたアミノ酸残基中の特定の原子とアミドプロトンとの相 関シグナルと、（iii)同定しょうとするアミノ酸中の (i)と同じ特定の原子とアミドプロトン との相関シグナルを、 (iv)それらの間に存在する原子とアミドプロトンとの相関シグナ ルを取得して、共通する原子の化学シフトが同じであることをもとに対応付けていくこ とにより、帰属が決定されたアミノ酸に隣接するアミノ酸の相関シグナルであることを 同定して帰属を決定することができる。
[0062] 具体的には、まず、（a)標的分子のアミノ酸配列上で、同定しょうとするアミノ酸に隣 接するどちらか一方のアミノ酸について、上記の方法でその帰属を決定する。次に (b )同定しょうとするアミノ酸に隣接するアミノ酸の α炭素原子およびカルボ-ル炭素原 子が13 Cで、また主鎖の窒素原子が15 Nで二重標識され、さらに少なくとも同定しようと するアミノ酸の主鎖の窒素原子が15 Nで標識された標的分子を調製する。 (c)得られ た二重標識ィ匕標的分子について、二重標識されたアミノ酸残基の13 Cとアミドプロトン との 2次元相関スぺ外ルと、二重標識されたアミノ酸残基の13 Cと隣接する同定しょう とするアミノ酸残基のアミドプロトンとの 2次元相関スペクトルが取得可能な NMR測定 、例えば、 H (N) CA法等で測定し、シグナルを取得する。さらに、（d)同定しようとす るアミノ酸残基と、上記で二重標識したアミノ酸残基のアミドプロトンと主鎖の窒素原 子の相関シグナルを H (NCO) CA法（Cavanagh, W. J., et al.， Protein Spectroscopy , Principles. Press(1996)に記載の HN (CO) CA3次元測定法において、 Nの展開時 間を省略した 2次元測定)等で取得する。
[0063] 次に、（e) (d)で取得したシグナル中の帰属が決定されているアミノ酸のアミドプロト ンの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（c)で得られたシグナルの中 から選択する。さらに、（f)選択されたシグナルの13 Cの化学シフトと同一の化学シフト を有するシグナルを (c)で得られたシグナルの中から選択し、（g)選択されたシグナ ルのアミドプロトンの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（d)で得られ たシグナルの中力も選択する。ここで、選択されたシグナル力 もとのシグナルに帰属 されるアミノ酸と隣接するアミノ酸のシグナルであると決定される。
[0064] 上記のシグナルの帰属法における標識方法につ!、てであるが、上記標識法ではァ ミノ酸 C (任意のアミノ酸)だけを13 CZ15N二重標識ィ匕しその他のアミノ酸は15 N標識ィ匕 した目的タンパク質を調製した力 実際に測定シグナルを与えるのはアミノ酸 C及び その一つ後ろにあるアミノ酸残基だけであるから、 目的タンパク質のアミノ酸配列から 、アミノ酸残基 Cの後ろにあるアミノ酸の種類のみを15 N標識ィ匕しても HN (CO)、 HN (CA)、 HN (CO) CAに関して、残りのアミノ酸全てを15 N標識ィ匕したものと全く同じス ベクトルが得られる。また、 13CZ15N二重標識ィ匕するアミノ酸の種類は一タンパク質試 料に一種類である必要はなぐ適宜数種類のアミノ酸を13 CZ15N二重標識ィ匕し、他の アミノ酸を15 N標識ィ匕しても、シグナルの帰属は可能である。この場合は、必要な標識 タンパク質が 20種類より減らすことができるが、解析が若干複雑になるので、必要に 応じて標識の仕方を変更すればよ!、。 [0065] 本発明の一態様によれば、上記の方法を用いることにより、タンパク質中の1 H— 15 N 相関スペクトルの各シグナルが帰属されるが、上記の標識を行った標的分子に対し て、 —13。相関シグナルを取得する。具体的には、 H (N) CO、 H (NCO) CA法等 で測定を行う。例えば、 H (N) COでは二重標識ィ匕アミノ酸と次のアミノ酸残基のアミ ドプロトンと二重標識ィ匕アミノ酸のカルボニル炭素との相関シグナル相関シグナルが 、 H (NCO) CAでは、二重標識ィ匕アミノ酸の次の残基のアミドプロトンと二重標識ィ匕 アミノ酸の α炭素原子との相関シグナルが得られる。これらのシグナルのアミドプロト ンの化学シフトに注目し、すでに帰属されている1 Η— 15Νシグナルのアミドプロトンの うち同一の化学シフトをもつシグナルを選択して帰属を参照することにより、 H (N) C 0、 H (NCO) CAの測定で得られるシグナルの帰属が容易に行える。 H (N) CO、 H (NCO) CAの測定だけではなく、 H (NCA) CO、 H (N) CA等の測定を行っても、全 く同様の方法により、シグナルの帰属が可能である。
[0066] 上記の方法は、 —15？^シグナルの帰属を行った後に、 13 Cシグナルの帰属を 行う方法である力 帰属の方法はこれに限らない。例えば、上記と同じ標識を行った 目的タンパク質の H (N) CAと H (NCO) CAのスペクトルの組み合わせ、あるいは H ( N) COと H (NCA) COのスペクトルの組み合わせを順次取得し、前後の残基の a炭 素原子またはカルボ-ル炭素の化学シフトとアミドプロトンの化学シフトの相関関係を 上記と同様の方法によって順次連結していくことによっても、 α炭素原子或いはカル ボニル炭素原子とアミドプロトンの相関シグナルの帰属を行うことが可能である。
[0067] 本発明の別の態様によれば、上記の方法を用いることにより、タンパク質中の1 Η— 1 5Ν相関スペクトルの各シグナルが帰属される力 上記の標識を行った標的分子に対 して、 — ¾相関シグナルを取得する。具体的には、上述した H (NCOCA) HA、 HA (CACON) Hゝ HBHA (CBCACON) H法等で測定を行う。例免ば、 H (NCOC A) HAや HA (CACON) Hではアミドプロトンと該アミドプロトンが結合して!/、る窒素 原子が存在する 1つ前のアミノ酸残基の α水素原子との相関シグナル力 HBHA (C BCACON) Hではアミドプロトンと該アミドプロトンが結合して 、る窒素原子が存在す る 1つ前のアミノ酸残基の α水素原子及び β水素原子との相関シグナルが得られる 。これらのシグナルのアミドプロトンの化学シフトに注目し、すでに帰属されている1 Η Nシグナルのアミドプロトンのうち同一の化学シフトをもつシグナルを選択して帰 属を参照することにより、 H (NCOCA) HA、 HA (CACON) H、 HBHA (CBCACO N) Hの測定で得られるシグナルの帰属が容易に行える。 H (NCOCA) HA、 HA (C ACON) H、 HBHA (CBCACON) Hの測定だけではなぐ H (NCA) HA、 HA (C AN) H、 HBHA (CBCAN) H等の測定を行っても、全く同様の方法により、シグナ ルの帰属が可能である。
[0068] 上記の方法は、 JH - 15Νシグナルの帰属を行った後に、1 Η シグナルの帰属を 行う方法である力 帰属の方法はこれに限らない。例えば、上記と同じ標識を行った 目的タンノ ク質の H (NCOCA) HAまたは HA (CACON) Hと H (NCA) HAまたは HA (CAN) Hのスペクトルの組み合わせ、あるいは HBHA (CBCACON) Hと HBH A (CBCAN) Hのスペクトルの組み合わせを順次取得し、前後の残基の α水素原子 または β水素原子の化学シフトとアミドプロトンの化学シフトの相関関係を上記と同様 の方法によって順次連結して 、くことによっても、 a水素原子或いは j8水素原子とァ ミドプロトンの相関シグナルの帰属を行うことが可能である。
[0069] (4)標的分子とリガンドまたはリガンドィ匕合物との解離定数の測定方法
本発明のさらに別の側面によれば、 (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中の 標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接 するアミノ酸残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原 子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、（b)該標的分子と、各種濃度のリガンド またはリガンド化合物を接触させる工程、（c)工程 (b)の標的分子中の標識された主 鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残 基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元相 関スペクトルを測定する工程、（d)工程 (a)で得られる 2次元相関スペクトルと、工程（ c)で得られる 2次元相関スペクトルとを比較する工程、及び (e)該 2次元相関スぺタト ルに違 、が見られた場合、該スペクトルの違 、をリガンドまたはリガンドィ匕合物濃度の 関数として定量する工程を含む、標的分子とリガンドまたはリガンドィ匕合物との解離定 数の測定方法が提供される。
[0070] 本発明によればさらに、（a)少なくとも主鎖の窒素及び Zまたは炭素が標識された 標的分子中の標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子の他の水素 原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、（b)該標的分子と、各種濃度のリガ ンドあるいはリガンドィ匕合物を接触させる工程、（c)工程 (b)の標的分子中の標識さ れた主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次元相 関スペクトルを測定する工程、（d)工程 (a)で得られる 2次元相関スペクトルと、工程（ c)で得られる 2次元相関スペクトルを比較する工程、及び (e)該 2次元相関スペクトル に違 、が見られた場合、該スペクトルの違 、をリガンドまたはリガンドィ匕合物濃度の関 数として定量する工程を含む、標的分子とリガンドまたはリガンドィ匕合物との解離定数 の測定方法が提供される。
[0071] 工程 (a)〜（d)までは上記（1)に記載のとおりである力 工程 (b)において、異なる 濃度のリガンド、またはリガンド化合物と標的分子を接触させたものについて同じ NM R測定を行なう。リガンドまたはリガンドィ匕合物濃度は適当に異なる濃度のものを接触 させる力 最も高くは、飽和する濃度で接触させたものを調製して NMR測定を行なう ことが好ましい。飽和濃度では飽和の極限ィ匕学シフト値（ δ sat)を測定する。飽和濃 度のリガンドまたはリガンドィ匕合物を接触させた標的分子について上記 NMR測定を 行なった場合、標的分子と該リガンドあるいはリガンドィ匕合物との解離定数は下記数 式 1で算出される。
[0072] [化 1]
KD = ( [P] o-x ) ( [L] 0—x )
X
[0073] 上記式中、 [P]は標的分子の総モル濃度であり、 [L]はリガンドあるいはリガンド
0 0
化合物の総モル濃度であり、 Xは下記数式 2で算出される。
[0074] [化 2] リ obs ° free
X =
Δ
[0075] 式中、 δ freeは遊離種の化学シフトであり、 δ obsは観察された化学シフト値であり、
Δは飽和の場合の極限ィ匕学シフト値とリガンドまたはリガンドィ匕合物を含まな 、標的 分子の化学シフト値との差である。
[0076] このように測定した解離定数を測定データに対するベストフィットが標準の曲線あて はめ統計法を用いて得られるまでその値を変化させて測定する。 δ satが既知でない 場合には、 KD及び δ satを変化させて同じ曲線当てはめ法にかける。さらに、このよ うな解離定数の測定により、より好ましいリガンドの誘導体あるいはリガンド化合物を 選択することちできる。
[0077] 以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施 例により限定されるものではない。
実施例
[0078] ¾細 ヒト FKBPタンパク リガンド の の 屮,
(1)铸型 mRNAの調製
ヒト FKBPタンパク質 (アミノ酸配列は、配列表の配列番号 3に示される）の遺伝子（ Genbank accession No. M54881)は、 Human Universal Quick Clone cDNA (Clontech社製）を铸型として、配列番号 1および 2に記載の塩基配列力 な るプライマーを用いて PCR法を用いて増幅し、 Glutathione S— transferase (Am ersham社製）との融合タンパク質となるように連結後、プラスミド pEU3b (Sawasaki , Τ. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 99 (23) , 14652— 14657 (2002) )の Sp e Iと Sal Iの部位に導入した。 16mMのマグネシウムイオン存在下で上記プラスミドを 铸型として、 Glutathione S— transferaseとヒト FKBPの融合タンパク質の mRNA を SP6 RNA polymerase (Promega社製）で転写し、合成した。
[0079] (2)均一に13 CZ15N二重標識化されたアミノ酸を基質に用いた目的タンパク質合成 上記（1)で合成した mRNAを 100 gZ50 1に成るように濃縮し、コムギ胚芽抽 出液 (Proteios™、 TOYOBO社製）と混合した (4. 8ml)。その混合液を、 20種類す ベてのアミノ酸力 S13CZ15N二重標識化された（Cambridge Isotope Laboratories 社製)透析緩衝液に対して、 2日間反応を行い、透析緩衝液を交換し、さらに 3日間 のタンパク質合成反応を行った。反応液を、あらかじめ緩衝液（50mM Tris-HCl pH7. 2、 5mM Dithiothreitol、 lOOmM NaCl)で平衡化された Glutathione
Sepharose 4B (Amersham社製)に結合させ、 PreScission Protease (Amer sham社製)で融合タンパク質を切断後、溶出することにより精製ヒト FKBPタンパク質 溶液を得た。このタンパク質溶液をミリポア社製の Centricon— 3限外濾過濃縮装置 で 800 1まで濃縮し、 NMR測定用緩衝液（25mM リン酸カリウム pH6. 5、 50mM
NaCl、 5mM DTT)に置換後、最終的に 250 ほで濃縮して NMR測定試料とし た。この濃縮液中のヒト FKBPタンパク質は 70 Mとなった。
[0080] (3) NMR測定
NMR測定には、 Bruker社製 Avance— 500スぺクトロメーターを用い、測定試料 には磁場の安定性を保っための NMRロック用に 5%D Oを添カ卩し、測定を行った。
2
測定温度は 30°Cとした。
[0081] アミドプロトン、主鎖の窒素原子、カルボニル炭素原子、 α炭素原子の化学シフトの 帰属は、文献（Rosen et al. , Biochemistry, 30, 4774-4789 ;Xu et al. , Biopolymers, 33, 535— 550 (1993) )の値を参考とし、 HNCAゝ HN (CO) CA、 HN (CO)、 HN (CA) COの測定を行った。
[0082] 薬剤を作用させる前の FKBPタンパク質の 2次元相関スペクトルとして、 13CZ15N二 重標識したヒト FKBPタンパク質の1 H— 15N HSQCスペクトル（図 3)、 H (N) COス ヘクトノレ (し avanagn, W.J., et al., Protein NMR spectroscopy. Principles and Practice , Academic Press (1996)に記載の NHC03次元測定法において、 Nの展開時間を省 略した 2次元測定）（図 4)、 H (NCO) CAスペクトル（Cavanagh, W.J., et al., Protein NMR spectroscopy. Principles ana Practice, Academic Press (1996)【こ 己¾の Ή (C 0) CA3次元測定法において、 Nの展開時間を省略した 2次元測定）（図 5)を測定し た。
[0083] (4) FKBPタンパク質と 1ーァセチルプロリンメチルエステルとの複合体の形成および NMR測定
次に、 FKBPタンパク質に結合することがわかっている 1ーァセチルプロリンメチル エステル (ACPM)を ImMになるように FKBPタンパク質に混合し、 — 15N HSQ Cスペクトルを測定した。 ACPM存在下と非存在下における1 H— 15N HSQCスぺク トルを重ね合わせたものを図 6に示した。この 2つのスペクトルを比較し、移動が見ら れるシグナルに対応する残基は、図 7の立体構造上で示すように、ある特定の領域 に集中しており、この領域が ACPMの結合部位であることが同定された。
[0084] 次に、 ACPM存在下で、 H (N) C02次元相関スペクトルを測定し、非存在下にお けるスペクトルと重ね合わせたものを図 8に示した。図 8においてシグナルの移動が見 られた残基は1 H— 15N HSQCスペクトルにおいてシグナルの移動が見られた残基と ほぼ一致していた。
[0085] また、 ACPM存在下で、 H (NCO) CA2次元相関スペクトルを測定し、非存在下に おけるスペクトルと重ね合わせたものを図 9に示した。図 9においてシグナルの移動が 見られた残基は1 H— 15N HSQCスペクトルにおいてシグナルの移動が見られた残 基とほぼ一致していた。
[0086] (5) FKBPタンパク質と 1 ホルミルピぺリジンとの複合体の形成および NMR測定 同様にして、 FKBPタンパク質に結合することがわかっている 1 ホルミルピベリジ ン（FOPI)を ImMになるように FKBPタンパク質に混合し、 15N HSQCスぺタト ルを測定した。 FOPI存在下と非存在下における1 H— 15N HSQCスペクトルを重ね 合わせたものを図 10に示した。この 2つのスペクトルを比較し、移動が見られるシグナ ルに対応する残基は、図 11の立体構造上で示すように、ある特定の領域に集中して おり、この領域力FOPIの結合部位であることが同定された。
[0087] 次に、 FOPI存在下で、 H (N) C02次元相関スペクトルを測定し、非存在下におけ るスペクトルと重ね合わせたものを図 12に示した。図 12においてシグナルの移動が 見られた残基は1 H— 15N HSQCスペクトルにおいてシグナルの移動が見られた残 基とほぼ一致していた。
[0088] また、 FOPI存在下で、 H (NCO) CA2次元相関スペクトルを測定し、非存在下に おけるスペクトルと重ね合わせたものを図 13に示した。図 13にお!/、てシグナルの移 動が見られた残基は1 H— 15N HSQCスペクトルにお!/、てシグナルの移動が見られ た残基とほぼ一致して!/ヽた。
[0089] (6) FKBPタンパク質と 1 ピぺリジンカロボキサミドとの複合体の形成および NMR 測定
さらに、 FKBPタンパク質に結合することがわかっている 1ーピペリジン力ロボキサミ ド（PICA)を ImMになるように FKBPタンパク質に混合し、 HSQCスぺタト ルを測定した。 PICA存在下と非存在下における1 H— 15 N HSQCスペクトルを重ね 合わせたものを図 14に示した。この 2つのスペクトルを比較し、移動が見られるシグナ ルに対応する残基は、図 15の立体構造上で示すように、ある特定の領域に集中して おり、この領域が PICAの結合部位であることが同定された。
[0090] 次に、 PICA存在下で、 H (N) C02次元相関スペクトルを測定し、非存在下におけ るスペクトルと重ね合わせたものを図 16に示した。図 16においてシグナルの移動が 見られた残基は1 H— 15N HSQCスペクトルにおいてシグナルの移動が見られた残 基とほぼ一致していた。
[0091] また、 PICA存在下で、 H (NCO) CA2次元相関スペクトルを測定し、非存在下に おけるスペクトルと重ね合わせたものを図 17に示した。図 17においてシグナルの移 動が見られた残基は、 — 15 N HSQCスペクトルにおいてシグナルの移動が見られ た残基とほぼ一致して!/ヽた。
[0092] 以上のことより、 H (N) COあるいは H (N) CA2次元測定法を用いることにより、標 的分子に基質やィ匕合物が結合した力どうかを同定すること、および結合する場合に、 標的分子のどの部位に結合するのかを同定することが可能であることがわ力つた。
[0093] 実飾 12 ヒト FKBPタンパク皙 リガンド の結合の枪出
(1)铸型 mRNAの調製
ヒト FKBPタンパク質 (アミノ酸配列は、配列表の配列番号 3に示される）の遺伝子（ Genbank accession No. M54881)は、 Human Universal Quick Clone cDNA (Clontech社製）を铸型として、配列番号 1および 2に記載の塩基配列力 な るプライマーを用いて PCR法を用いて増幅し、 Glutathione S— transferase (Am ersham社製）との融合タンパク質となるように連結後、プラスミド pEU3b (Sawasaki , Τ. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 99 (23) , 14652— 14657 (2002) )の S pe Iと Sal Iの部位に導入した。 16mMのマグネシウムイオン存在下で上記プラスミド を铸型として、 Glutathione S— transferaseとヒト FKBPの融合タンパク質の mRN Aを SP6 RNA polymerase (Promega社製）で転写し、合成した。
[0094] (2)均一に13 CZ15N二重標識化されたアミノ酸を基質に用いた目的タンパク質合成 上記（1)で合成した mRNAを 100 gZ50 1に成るように濃縮し、コムギ胚芽抽 出液 (Proteios , TOYOBO社製）と混合した 8ml)。その混合液を、 20種類す ベてのアミノ酸が13 CZ15N二重標識化された（Cambridge Isotope Laboratories 社製)透析緩衝液に対して、 2日間反応を行い、透析緩衝液を交換し、さらに 3日間 のタンパク質合成反応を行った。反応液を、あらかじめ緩衝液（50mM Tris-HCl pH7. 2、 5mM Dithiothreitol、 lOOmM NaCl)で平衡化された Glutathione
Sepharose 4B (Amersham社製)に結合させ、 PreScission Protease (Amer sham社製)で融合タンパク質を切断後、溶出することにより精製ヒト FKBPタンパク質 溶液を得た。このタンパク質溶液をミリポア社製の Centricon— 3限外濾過濃縮装置 で 800 1まで濃縮し、 NMR測定用緩衝液（25mM リン酸カリウム pH6. 5、 50mM
NaCl、 5mM DTT)に置換後、最終的に 250 ほで濃縮して NMR測定試料とし た。この濃縮液中のヒト FKBPタンパク質は 70 Mとなった。
[0095] (3) NMR測定
NMR測定には、 Bruker社製 Avance— 500スぺクトロメーターを用い、測定試料 には磁場の安定性を保っための NMRロック用に 5%D Oを添カ卩し、測定を行った。
2
測定温度は 30°Cとした。アミドプロトン、主鎖の窒素原子、カルボニル炭素原子、 a 炭素原子の化学シフトの帰属は、文献（Rosen et al. , Biochemistry, 30, 477 4-4789 ;Xu et al. , Biopolymers, 33, 535— 550 (1993) )の値を参考とし、 HA (CACON) H、 HA (CAN) Hの測定を以下のように行った。
[0096] 薬剤（リガンドィ匕合物）を作用させる前の FKBPタンパク質の 2次元相関スペクトルと して、 13C/15N二重標識したヒト FKBPタンパク質の1 H— 15N HSQCスペクトル（図 1 9)、 HA (CACON) Hスペクトル（Boucher, W. et al. , J. Am. Chem. Soc. 11 4 (1992) 2262— 2264【こ記載の HCA (CO) NH4次元 ¾J定法【こお!ヽて、 C a及び Nの展開時間を省略した 2次元測定）（図 20)、 HA (CAN) H法 (Kay, L. E. et al . , J. Magn. Reson. 91 (1991) 84— 92に記載の HA (CA) NH3次元測定法にお いて、 Nの展開時間を省略した 2次元スペクトル）（図 21)を測定した。
[0097] (4) FKBPタンパク質と 1ーァセチルプロリンメチルエステルとの複合体の形成および NMR測定
次に、 FKBPタンパク質に結合することがわかっている 1ーァセチルプロリンメチル エステル (ACPM)を ImMになるように FKBPタンパク質に混合し、 H— N HSQ Cスペクトルを測定した。 ACPM存在下と非存在下における1 H— 15N HSQCスぺク トルを重ね合わせたものを図 22に示した。この 2つのスペクトルを比較し、移動が見ら れるシグナルに対応するアミノ酸残基を確認した。図中、移動が見られたシグナルを アミノ酸番号とアミノ酸の名前（V24、 T27、 G28、 F48、 L50、 G51、 Q53、 156、 R5 7、 E60、 E61、 G62、 A64、 Q65、 Y80、 190、 F99、 DIOO)で示した。これらの、シ グナルが移動したアミノ酸残基は、図 23の立体構造上で示すように、ある特定の領 域に集中しており、この領域が ACPMの結合部位であることが同定された。
[0098] 次に、 ACPM存在下で、 HA (CACON) H2次元相関スペクトルを測定し、非存在 下におけるスペクトルと重ね合わせたものを図 24に示した。図 24に示した両スぺタト ルを比較し、移動が見られるシグナルに対応するアミノ酸残基を確認した。図中、移 動が見られるシグナルをアミノ酸番号とアミノ酸の名前（V24、 T27、 G28、 F48、 L5 0、 G51、 Q53、 156、 R57、 E60、 E61、 G62、 A64、 Q65、 Y80、 190、 F99、 D10 0)で示した。図 24においてシグナルの移動が見られた残基は1 H— 15N HSQCスぺ タトルにお ヽてシグナルの移動が見られた残基とほぼ一致して 、た。
[0099] また、 ACPM存在下で、 HA (CAN) H2次元相関スペクトルを測定し、非存在下に おけるスペクトルと重ね合わせたものを図 25に示した。図 25に示した両スペクトルを 比較し、移動が見られるシグナルに対応するアミノ酸残基を確認した。図中、大文字 で書かれたアミノ酸番号に対応するシグナルは、残基内のアミドプロトンと a水素原 子の相関シグナル、小文字で書かれたアミノ酸番号に対応するシグナルはアミドプロ トンとそのアミドプロトンの属する残基の一つ手前の残基に属する a水素原子との相 関シグナルを表している。ここで、移動が見られるシグナルをアミノ酸番号とアミノ酸の 名前（V24、 T27、 G28、 F48、 L50、 G51、 Q53、 156、 R57、 E60、 E61、 G62、 A 64、 Q65、 Y80、 190、 F99、 D100)で示した。図 25にお!/、てシグナノレの移動力 ^見 られた残基は1 H— 15N HSQCスペクトルにおいてシグナルの移動が見られた残基と 一致していた。
[0100] (5) FKBPタンパク質と 1 ホルミルピぺリジンとの複合体の形成および NMR測定 同様にして、 FKBPタンパク質に結合することがわかっている 1 ホルミルピベリジ ン（FOPI)を ImMになるように FKBPタンパク質に混合し、 H— N HSQCスぺタト ルを測定した。 FOPI存在下と非存在下における1 H— 15N HSQCスペクトルを重ね 合わせたものを図 26に示した。この 2つのスペクトルを比較し、移動が見られるシグナ ルに対応する残基を確認した。図中、移動が見られるシグナルをアミノ酸番号とァミノ 酸の名前（G19、 V24, Y26, T27、 G28、 S38, R42、 K47、 F48、 L50、 G51、 K 52、 Q53、 E54、 V55、 156、 R57、 W59、 E60、 E61、 G62、 V63、 Q65、 M66、 Q 70、 T75、 176、 Y80、 V98、 F99、 D100、 L103)で示した。これらは、図 27の立体 構造上で示すように、ある特定の領域に集中しており、この領域力 FOPIの結合部位 であることが同定された。
[0101] 次に、 FOPI存在下で、 HA (CACON) H2次元相関スペクトルを測定し、非存在 下におけるスペクトルと重ね合わせたものを図 28に示した。この 2つのスペクトルを比 較し、移動が見られたシグナルに対応する残基を確認した。図中、移動が見られるシ グナルをアミノ酸番号とアミノ酸の名前（G19、 V24、 Y26、 T27、 G28、 S38、 R42、 K47、 F48、 L50、 G51、 Q53、 E54、 V55、 156、 R57、 G58、 E60、 E61、 G62、 Q65、 M66、 T75、 176、 Y80、 V98、 F99、 D100、 L103)で示した。図 28【こお!ヽ てシグナルの移動が見られた残基は1 H— 15N HSQCスペクトルにおいてシグナル の移動が見られた残基とほぼ一致して 、た。
[0102] また、 FOPI存在下で、 HA (CAN) H2次元相関スペクトルを測定し、非存在下に おけるスペクトルと重ね合わせたものを図 29に示した。図 29に示した両スペクトルを 比較し、移動が見られるシグナルに対応するアミノ酸残基を確認した。図中、大文字 で書かれたアミノ酸番号に対応するシグナルは、残基内のアミドプロトンと a水素原 子の相関シグナル、小文字で書かれたアミノ酸番号に対応するシグナルはアミドプロ トンとそのアミドプロトンの属する残基の一つ手前の残基に属する a水素原子との相 関シグナルを表している。ここで、移動が見られるシグナルをアミノ酸番号とアミノ酸の 名前（gl9、 V24、 Y26、 T27、 g28、 S38、 R42、 K47、 F48、 L50、 g51、 Q53、 E 54、 V55、 156、 R57、 E60、 E61、 g62、 V63、 Q65、 M66、 T75、 176、 Y80、 V9 8、 F99、 D100、 L103)で示した。図 29においてシグナルの移動が見られた残基は ¾一 15N HSQCスペクトルにお!/、てシグナルの移動が見られた残基と一致して!/、た [0103] (6) FKBPタンパク質と 1ーピペリジンカロボキサミドとの複合体の形成および NMR 測定
さらに、 FKBPタンパク質に結合することがわかっている 1ーピペリジン力ロボキサミ ド（PICA)を ImMになるように FKBPタンパク質に混合し、 15N HSQCスぺタト ルを測定した。 PICA存在下と非存在下における1 H— 15 N HSQCスペクトルを重ね 合わせたものを図 30に示した。この 2つのスペクトルを比較し、移動が見られるシグナ ルに対応する残基を確認した。図中、移動が見られるシグナルをアミノ酸番号とァミノ 酸の名前（G19、 V24, Y26, T27、 G28、 E31、 S38, R42、 K47、 F48、 L50、 G 51、 K52、 Q53、 V55、 156、 R57、 W59、 E61、 G62、 V63、 A64、 Q65、 M66、 I 76、 191、 F99)で示した。図 30においてシグナルの移動が見られたアミノ酸残基は 、図 31の立体構造上で示すように、ある特定の領域に集中しており、この領域が PIC Aの結合部位であることが同定された。
[0104] 次に、 PICA存在下で、 HA(CACON) H2次元相関スペクトルを測定し、非存在 下におけるスペクトルと重ね合わせたものを図 32に示した。図 32においてシグナル の移動が見られた残基を確認した。図中、移動が見られるシグナルをアミノ酸番号と アミノ酸の名前（G19、 V24、 Y26、 T27、 G28、 Ε31、 S38、 R42、 K47、 F48、 L5 0、 G51、 K52、 Q53、 V55、 156、 R57、 W59、 E61、 G62、 A64、 Q65、 M66、 17 6、 191、 F99)で示した。図 32においてシグナルの移動が見られたアミノ酸残基は、 1 H 15N HSQCスペクトルにお!/、てシグナルの移動が見られた残基と一致して!/、た
[0105] また、 PICA存在下で、 HA (CAN) H2次元相関スペクトルを測定し、非存在下に おけるスペクトルと重ね合わせたものを図 33に示した。図 33においてシグナルの移 動が見られた残基を確認した。図中、大文字で書かれたアミノ酸番号に対応するシ グナルは、残基内のアミドプロトンと α水素原子の相関シグナル、小文字で書かれた アミノ酸番号に対応するシグナルはアミドプロトンとそのアミドプロトンの属する残基の 一つ手前の残基に属する α水素原子との相関シグナルを表している。ここで、移動 が見られるシグナルをアミノ酸番号とアミノ酸の名前（gl9、 V24、 Y26、 T27、 g28、 E31、 S38、 R42、 K47、 F48、 L50、 g51、 K52、 Q53、 V55、 156、 R57、 E61、 g 62、 V63、 A64、 Q65, M66、 176、 191、 F99)で示した。図 33【こお!ヽてシグナノレの 移動が見られたアミノ酸残基は、 — 15 N HSQCスペクトルにおいてシグナルの移 動が見られた残基と一致して 、た。
[0106] 以上のことより、 HA (CACON) Hあるいは HA (CAN) H2次元測定法を用いること により、標的分子に基質やィ匕合物が結合したかどうかを同定すること、および結合す る場合に、標的分子のどの部位に結合するのかを同定することが可能であることがわ かった。
産業上の利用可能性
[0107] 本発明の標的分子とリガンドまたはリガンド候補ィ匕合物との結合の検出方法等は、 その検出に用いる 2次元 NMR測定が、主鎖の窒素原子に結合した水素原子と炭素 原子との 2次元相関スペクトル、又は標識された主鎖の原子に結合した 1つの水素原 子と、標的分子中の他の 1つの水素原子との 2次元相関スペクトルを取得するもので ある。主鎖の原子、即ち窒素原子あるいは炭素原子は、標的分子の全てのアミノ酸 が有するものであるので、シグナルが全てのアミノ酸にお 、て取得することができる。 つまり、標的分子とリガンドあるいはリガンド候補物質との結合がどのアミノ酸におい て起こっていても制限なく検出することができる。このことは、標的分子とリガンドある いはリガンド候補ィヒ合物との結合部位の同定や、解離定数の測定方法等を行う上で も非常に有利な特徴である。 図面の簡単な説明
[0108] [図 1]図 1は、標識された主鎖の窒素に結合した水素原子と、該窒素と同一または隣 接するアミノ酸中の ex炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子の 2次元相 関スペクトルを取得するための NMR測定方法を示した図である。
[図 2]図 2は、ヒト FKBPタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
[図 3]図 3は、ヒト FKBPタンパク質の1 H— 15N HSQCスペクトルを示す図である。
[図 4]図 4は、ヒト FKBPタンパク質の H (N) CO法により得られた 2次元相関スペクトル を示す図である。
[図 5]図 5は、ヒト FKBPタンパク質の H (NCO) CA法により得られた 2次元相関スぺク トルを示す図である。
[図 6]図 6は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1ーァセチルプ 口リンメチルエステル (ACPM)を作用させた後の1 H— 15N HSQCスペクトルを示す 図である。シグナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記して 、る。
[図 7]図 7は、 1ーァセチルプロリンメチルエステル (ACPM)の構造式、および、ヒト F KBPタンパク質に 1ーァセチルプロリンメチルエステル (ACPM)を作用させた後に、 シグナルの位置が変化した残基を示す (灰色に着色した部分)立体構造図である。
[図 8]図 8は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1ーァセチルプ 口リンメチルエステル (ACPM)を作用させた後の H (N) CO法により得られた 2次元 相関スペクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、アミド水素原子の属する アミノ酸の番号である。
[図 9]図 9は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1ーァセチルプ 口リンメチルエステル (ACPM)を作用させた後の H (NCO) CA法により得られた 2次 元相関スペクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、アミド水素原子の属 するアミノ酸の番号である。
[図 10]図 10は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1 ホルミル ピぺリジン（FOPI)を作用させた後の1 H— 15N HSQCスペクトルを示す図である。シ グナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記して！/、る。
[図 11]図 11は、 1 ホルミルピぺリジン (FOPI)の構造式、および、ヒト FKBPタンパク 質に 1 ホルミルピぺリジン (FOPI)を作用させた後に、シグナルの位置が変化した 残基を示す (灰色に着色した部分)立体構造図である。
[図 12]図 12は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1 ホルミル ピぺリジン (FOPI)を作用させた後の H (N) CO法により得られた 2次元相関スぺタト ルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、アミド水素原子の属するアミノ酸の番 号である。
[図 13]図 13は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1 ホルミル ピぺリジン (FOPI)を作用させた後の H (NCO) CA法により得られた 2次元相関スぺ タトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、アミド水素原子の属するアミノ酸 の番号である。
[図 14]図 14は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1ーピベリジ ンカロボキサミド（PICA)を作用させた後の1 H— 15N HSQCスペクトルを示す図であ る。シグナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記して！/、る。
[図 15]図 15は、 1ーピペリジンカロボキサミド（PICA)の構造式、および、ヒト FKBPタ ンパク質に 1—ピぺリジンカロボキサミド (PICA)を作用させた後に、シグナルの位置 が変化した残基を示す (灰色に着色した部分)立体構造図である。
[図 16]図 16は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1ーピベリジ ンカロボキサミド（PICA)を作用させた後の H (N) CO法により得られた 2次元相関ス ベクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、アミド水素原子の属するァミノ 酸の番号である。
[図 17]図 17は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1ーピベリジ ンカロボキサミド（PICA)を作用させた後の H (NCO) CA法により得られた 2次元相 関スペクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、アミド水素原子の属するァ ミノ酸の番号である。
[図 18]図 18は、標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中のその他 の水素原子間の 2次元相関スペクトルを取得するための NMR測定方法を示した図 である。矢印でつながれて!/、る実線で囲んだ原子の組み合わせが相関シグナルを 与える。点線で囲まれている原子は、炭素原子は13 C、窒素原子は15 Nで標識化され ている必要が有る。
[図 19]図 19は、ヒト FKBPタンパク質の1 H— 15N HSQCスペクトルを示す図である。
[図 20]図 20は、ヒト FKBPタンパク質の HA(CACON) H法により得られた 2次元相 関スペクトルを示す図である。
[図 21]図 21は、ヒト FKBPタンパク質の HA (CAN) H法により得られた 2次元相関ス ベクトルを示す図である。
[図 22]図 22は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1ーァセチル プロリンメチルエステル (ACPM)を作用させた後の1 H— 15N HSQCスペクトルを示 す図である。シグナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記して 、る。 [図 23]図 23は、 1ーァセチルプロリンメチルエステル (ACPM)の構造式、および、ヒト FKBPタンパク質に 1ーァセチルプロリンメチルエステル (ACPM)を作用させた後に 、シグナルの位置が変化した残基を示す (灰色に着色した部分)立体構造図である。
[図 24]図 24は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1ーァセチル プロリンメチルエステル (ACPM)を作用させた後の HA (CACON) H法により得られ た 2次元相関スペクトルを示す図である。それぞれのアミノ酸番号は、アミド水素原子 の属するアミノ酸の番号である。
[図 25]図 25は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1ーァセチル プロリンメチルエステル (ACPM)を作用させた後の HA (CAN) H法により得られた 2 次元相関スペクトルを示す図である。シグナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記 している。大文字で書かれたアミノ酸番号に対応するシグナルは、残基内のアミドプ 口トンと α水素原子の相関シグナル、小文字で書かれたアミノ酸番号に対応するシグ ナルはアミドプロトンとそのアミド水素原子の属する残基の一つ手前の残基に属する a水素原子との相関シグナルを表して 、る。
[図 26]図 26は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1 ホルミル ピぺリジン（FOPI)を作用させた後の1 H— 15N HSQCスペクトルを示す図である。シ グナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記して！/、る。
[図 27]図 27は、 1 ホルミルピぺリジン (FOPI)の構造式、および、ヒト FKBPタンパク 質に 1 ホルミルピぺリジン (FOPI)を作用させた後に、シグナルの位置が変化した 残基を示す (灰色に着色した部分)立体構造図である。
[図 28]図 28は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1 ホルミル ピぺリジン (FOPI)を作用させた後の HA (CACON) H法により得られた 2次元相関 スペクトルを示す図である。シグナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記して 、る。
[図 29]図 29は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1 ホルミル ピぺリジン (FOPI)を作用させた後の HA (CAN) H法により得られた 2次元相関スぺ タトルを示す図である。シグナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記している。大文 字で書かれたアミノ酸番号に対応するシグナルは、残基内のアミドプロトンと a水素 原子の相関シグナル、小文字で書かれたアミノ酸番号に対応するシグナルはアミドプ 口トンとそのアミドプロトンの属する残基の一つ手前の残基に属する α水素原子との 相関シグナルを表して 、る。
[図 30]図 30は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1ーピベリジ ンカロボキサミド（PICA)を作用させた後の1 H— 15N HSQCスペクトルを示す図であ る。シグナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記して！/、る。
[図 31]図 31は、 1ーピペリジンカロボキサミド（PICA)の構造式、および、ヒト FKBPタ ンパク質に 1—ピぺリジンカロボキサミド (PICA)を作用させた後に、シグナルの位置 が変化した残基を示す (灰色に着色した部分)立体構造図である。
[図 32]図 32は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1ーピベリジ ンカロボキサミド（PICA)を作用させた後の HA (CACON) H法により得られた 2次元 相関スペクトルを示す図である。シグナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記して いる。
[図 33]図 33は、ヒト FKBPタンパク質単独及び、ヒト FKBPタンパク質に 1ーピベリジ ンカロボキサミド（PICA)を作用させた後の HA (CAN) H法により得られた 2次元相 関スペクトルを示す図である。シグナルが移動した残基のみアミノ酸番号を記して!/ヽ る。大文字で書かれたアミノ酸番号に対応するシグナルは、残基内のアミドプロトンと a水素原子の相関シグナル、小文字で書かれたアミノ酸番号に対応するシグナルは アミドプロトンとそのアミドプロトンの属する残基の一つ手前の残基に属する α水素原 子との相関シグナルを表して 、る。

Claims

請求の範囲
[1] (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合し た水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭 素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定す る工程、
(b)該標的分子と、少なくとも 1つのリガンド、リガンドィ匕合物、あるいはリガンド候補ィ匕 合物とを接触させる工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該 窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭素原子、）8炭素原 子またはカルボ-ル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、及び
(d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スぺク トルとを比較する工程を含む、標的分子とリガンドあるいはリガンドィ匕合物との結合の 検出方法。
[2] (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合し た水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭 素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定す る工程、
(b)該標的分子と、リガンド候補化合物の混合物とを接触させる工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該 窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭素原子、）8炭素原 子またはカルボ-ル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、
(d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スぺク トルとを比較する工程、
(e)工程 (d)で該 2次元相関スペクトルに違 ヽが見出された場合、該リガンド候補ィ匕 合物の混合物中の化合物を個別に標的分子と接触させ、標的分子中の標識された 主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸 残基中の標識された a炭素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元 相関スペクトルを測定する工程、及び (f)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (e)で得られた 2次元スペクトルと を比較する工程を含む、標的分子に結合するリガンドィ匕合物のスクリーニング方法。
[3] (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合し た水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭 素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定す る工程、
(b)該標的分子と、少なくとも 1つのリガンドまたはリガンド候補ィ匕合物とを接触させる 工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該 窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭素原子、）8炭素原 子またはカルボ-ル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、
(d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スぺク トルとを比較する工程、及び
(e)工程 (d)で該 2次元相関スペクトルに違いが見出された場合、違いが見られるシ グナルに相当するアミノ酸を特定する工程を含む、標的分子に結合するリガンドまた はリガンドィ匕合物の結合部位の同定方法。
[4] (a) 13CZ15N二重標識化された標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合し た水素原子と、該窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭 素原子、 β炭素原子またはカルボニル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定す る工程、
(b)該標的分子と、各種濃度のリガンドまたはリガンドィ匕合物を接触させる工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該 窒素原子と同一または隣接するアミノ酸残基中の標識された α炭素原子、）8炭素原 子またはカルボ-ル炭素原子との 2次元相関スペクトルを測定する工程、
(d)工程 (a)で得られる 2次元相関スペクトルと、工程 (c)で得られる 2次元相関スぺク トルとを比較する工程、及び
(e)該 2次元相関スペクトルに違 、が見られた場合、該スペクトルの違 、をリガンドま たはリガンドィ匕合物濃度の関数として定量する工程を含む、標的分子とリガンドまた はリガンドィ匕合物との解離定数の測定方法。
[5] 標的分子がポリペプチドである、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。
[6] 2次元相関スペクトルが、標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素 原子が存在するアミノ酸残基の 1つ前のアミノ酸残基中の標識されたカルボ-ル炭素 原子の 2次元相関スペクトルである、請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の方法。
[7] 2次元相関スペクトルが、標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子と、該窒素 原子が存在するアミノ酸残基の 1つ前のアミノ酸残基中の標識された α炭素原子の 2 次元相関スペクトルである、請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の方法。
[8] (a)少なくとも主鎖の窒素及び Ζまたは炭素が標識された標的分子中の、標識され た主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次元相関 スペクトルを測定する工程、
(b)該標的分子と、少なくとも 1つのリガンド、リガンドィ匕合物、あるいはリガンド候補ィ匕 合物とを接触させる工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分 子中の他の水素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、及び
(d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スぺク トルとを比較する工程を含む、標的分子とリガンドあるいはリガンドィ匕合物との結合の 検出方法。
[9] (a)少なくとも主鎖の窒素及び Zまたは炭素が標識された標的分子中の、標識され た主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次元相関 スペクトルを測定する工程、
(b)該標的分子と、 2つ以上のリガンド候補ィ匕合物を含むリガンド候補ィ匕合物の混合 物とを接触させる工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の、標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的 分子中の他の水素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、
(d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スぺク トルとを比較する工程、
(e)工程 (d)で該 2次元相関スペクトルに違 ヽが見出された場合、該リガンド候補ィ匕 合物の混合物中の化合物を個別に標的分子と接触させ、標的分子中の、標識され た主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次元相関 スペクトルを測定する工程、及び
(f)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (e)で得られた 2次元スペクトルと を比較する工程を含む、標的分子に結合するリガンドィ匕合物のスクリーニング方法。
[10] (a)少なくとも主鎖の窒素及び Zまたは炭素が標識された標的分子中の、標識され た主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次元相関 スペクトルを測定する工程、
(b)該標的分子と、 1つ以上のリガンドまたはリガンド候補ィ匕合物とを接触させる工程
(c)工程 (b)の標的分子中の、標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的 分子中の他の水素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、
(d)工程 (a)で得られた 2次元相関スペクトルと工程 (c)で得られた 2次元相関スぺク トルとを比較する工程、及び
(e)工程 (d)で該 2次元相関スペクトルに違いが見出された場合、違いが見られるシ グナルに相当するアミノ酸を特定する工程を含む、標的分子に結合するリガンドまた はリガンドィ匕合物の結合部位の同定方法。
[11] (a)少なくとも主鎖の窒素及び Zまたは炭素が標識された標的分子中の、標識され た主鎖の原子に結合した水素原子と、標的分子中の他の水素原子間の 2次元相関 スペクトルを測定する工程、
(b)該標的分子と、各種濃度のリガンドまたはリガンドィ匕合物を接触させる工程、
(c)工程 (b)の標的分子中の、標識された主鎖の原子に結合した水素原子と、標的 分子中の他の水素原子間の 2次元相関スペクトルを測定する工程、
(d)工程 (a)で得られる 2次元相関スペクトルと、工程 (c)で得られる 2次元相関スぺク トルを比較する工程、及び
(e)該 2次元相関スペクトルに違 、が見られた場合、該スペクトルの違 、をリガンドま たはリガンドィ匕合物濃度の関数として定量する工程を含む、標的分子とリガンドまた はリガンドィ匕合物との解離定数の測定方法。
[12] 標的分子がポリペプチドである、請求項 8〜： L 1のいずれか 1項に記載の方法。
[13] 標的分子が、主鎖の窒素及び炭素が標識された標的分子で、標識された主鎖の原 子に結合した水素原子が、標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子で、標 的分子中の他の水素原子力、上記窒素原子が存在するアミノ酸残基の 1つ前のアミ ノ酸残基中の標識された主鎖の炭素原子に結合した水素原子であることを特徴とす る、請求項 8〜12のいずれか 1項に記載の方法。
[14] 標的分子が、主鎖の窒素及び炭素が標識された標的分子で、標識された主鎖の原 子に結合した水素原子が、標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子で、標 的分子中の他の水素原子が、上記窒素原子が存在するアミノ酸残基、およびその 1 つ前のアミノ酸残基中の標識された主鎖の炭素原子に結合した水素原子であること を特徴とする、請求項 8〜12のいずれか 1項に記載の方法。
[15] 標的分子が、主鎖の窒素及び炭素が標識された標的分子で、標識された主鎖の原 子に結合した水素原子が、標識された主鎖の窒素原子に結合した水素原子で、標 的分子中の他の水素原子力、上記窒素原子が存在するアミノ酸残基の 1つ前のアミ ノ酸残基中の標識された主鎖の炭素原子に結合した水素原子、および上記窒素原 子が存在するアミノ酸残基の 1つ前のアミノ酸残基中の β炭素原子に結合した水素 原子であることを特徴とする、請求項 8〜12のいずれか 1項に記載の方法。
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