JP2003294819A - 多重複合体の化学シフトを同定する方法、多重複合体の立体構造を解析する方法、多重複合体のモデルを構築する方法、新規核酸分子及び試薬 - Google Patents
多重複合体の化学シフトを同定する方法、多重複合体の立体構造を解析する方法、多重複合体のモデルを構築する方法、新規核酸分子及び試薬Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 多重複合体の水素原子の化学シフトを帰属す
る方法を提供すること。 【解決手段】 (a)２個以上の同種の分子が同種の結合
様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合してい
る多重複合体であって、一方の末端側で１個の分子と結
合する部位の化学的環境が他方の末端側で１個の分子と
結合する部位の化学的環境と相違している前記多重複合
体を用意し、(b)(a)の多重複合体の化学シフトを測定
し、(c) (i) (a)の多重複合体を構成している高分子の
両末端側の結合部位の化学的環境の相違により差が生じ
る測定値、または(ii) (a)の多重複合体において１個の
分子が一方の末端側で高分子に結合している部分に相当
する単一複合体の化学的環境と(a)の多重複合体におい
て１個の分子が他方の末端側で高分子に結合している部
分に相当する単一複合体の化学的環境との相違により差
が生じる測定値(d)、(c)で得た測定値に基づいて、(b)
で測定した化学シフトを同定する。
る方法を提供すること。 【解決手段】 (a)２個以上の同種の分子が同種の結合
様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合してい
る多重複合体であって、一方の末端側で１個の分子と結
合する部位の化学的環境が他方の末端側で１個の分子と
結合する部位の化学的環境と相違している前記多重複合
体を用意し、(b)(a)の多重複合体の化学シフトを測定
し、(c) (i) (a)の多重複合体を構成している高分子の
両末端側の結合部位の化学的環境の相違により差が生じ
る測定値、または(ii) (a)の多重複合体において１個の
分子が一方の末端側で高分子に結合している部分に相当
する単一複合体の化学的環境と(a)の多重複合体におい
て１個の分子が他方の末端側で高分子に結合している部
分に相当する単一複合体の化学的環境との相違により差
が生じる測定値(d)、(c)で得た測定値に基づいて、(b)
で測定した化学シフトを同定する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、多重複合体の化学
シフトを同定する方法、多重複合体の立体構造を解析す
る方法、多重複合体のモデルを構築する方法、新規核酸
分子及び試薬に関する。
シフトを同定する方法、多重複合体の立体構造を解析す
る方法、多重複合体のモデルを構築する方法、新規核酸
分子及び試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】タンパク質の立体構造解析法としては、
Ｘ線結晶構造解析法が非常に長い歴史を持ち、数多くの
実績を持っている。１９８０年代後半になってから、核
磁気共鳴（ＮＭＲ）によるタンパク質の立体構造解析も
急速に進展した。
Ｘ線結晶構造解析法が非常に長い歴史を持ち、数多くの
実績を持っている。１９８０年代後半になってから、核
磁気共鳴（ＮＭＲ）によるタンパク質の立体構造解析も
急速に進展した。
【０００３】ＮＭＲは強い磁場のなかに置かれた核スピ
ンの共鳴を観測する分光法である。タンパク質の水溶液
のＮＭＲでは、核スピン1/2をもった原子核のみが有効
に観測できる。通常のタンパク質中で観測可能な核スピ
ン1/2をもっているのは水素原子のみである。窒素原子
や炭素原子の安定同位体の15Nや13Cは核スピン1/2をも
っているので、これらの安定同位体でタンパク質を標識
すると水素原子と同じように観察が可能となる。
ンの共鳴を観測する分光法である。タンパク質の水溶液
のＮＭＲでは、核スピン1/2をもった原子核のみが有効
に観測できる。通常のタンパク質中で観測可能な核スピ
ン1/2をもっているのは水素原子のみである。窒素原子
や炭素原子の安定同位体の15Nや13Cは核スピン1/2をも
っているので、これらの安定同位体でタンパク質を標識
すると水素原子と同じように観察が可能となる。
【０００４】ＮＭＲでは、（１）化学シフト、（２）ス
ピン結合、（３）核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）を
観察することができる。
ピン結合、（３）核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）を
観察することができる。
【０００５】化学シフトとは、同一の核種であっても核
の周囲の化学的環境が異なるために生じるＮＭＲの共鳴
周波数の差をいう。
の周囲の化学的環境が異なるために生じるＮＭＲの共鳴
周波数の差をいう。
【０００６】スピン結合は、３本以内の共有結合で結ば
れた核スピンの間の相互作用として観測される。スピン
結合を介した核の間の相関を測定するのが二次元の相関
分光法（COSY）であり、通常はその変法であるDQF-COSY
（二量子フィルターによる相関分光法）を使用する。ス
ピン結合を介した原子核の間の連続的な相関を測定する
のがTOCSY（全相関分光法）である。
れた核スピンの間の相互作用として観測される。スピン
結合を介した核の間の相関を測定するのが二次元の相関
分光法（COSY）であり、通常はその変法であるDQF-COSY
（二量子フィルターによる相関分光法）を使用する。ス
ピン結合を介した原子核の間の連続的な相関を測定する
のがTOCSY（全相関分光法）である。
【０００７】タンパク質を15Nで標識すると、15NHの間
に共有結合１本から成る非常に強いスピン結合（約95H
z)が生じる。この相関を観測するのが二次元HSQC（異核
間の単量子コヒーレンス）である。通常は横軸を水素原
子の化学シフトに、縦軸を15Nの化学シフトにとって、
その相関ピークをみる。タンパク質中のプロリン以外の
すべてのアミノ酸は必ずアミドのNHを１個もっているの
で、タンパク質のＮＭＲスペクトルの解析の基本とな
る。タンパク質を15Nと13Cで二重に標識すると、主鎖の
すべての原子間にスピン結合が存在し、主鎖骨格や側鎖
のすべての原子間で相関スペクトルが観測できる。
に共有結合１本から成る非常に強いスピン結合（約95H
z)が生じる。この相関を観測するのが二次元HSQC（異核
間の単量子コヒーレンス）である。通常は横軸を水素原
子の化学シフトに、縦軸を15Nの化学シフトにとって、
その相関ピークをみる。タンパク質中のプロリン以外の
すべてのアミノ酸は必ずアミドのNHを１個もっているの
で、タンパク質のＮＭＲスペクトルの解析の基本とな
る。タンパク質を15Nと13Cで二重に標識すると、主鎖の
すべての原子間にスピン結合が存在し、主鎖骨格や側鎖
のすべての原子間で相関スペクトルが観測できる。
【０００８】スピン結合のほかにスピン間の相互作用と
して核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）がある。スピン
1/2の核と水素原子が空間的に近いと、お互いのスピン
間に双極子相互作用が生じる。たとえば、空間的に５オ
ングストロ−ム以内の水素原子の間には強いＮＯＥが観
測される。どの水素原子の間にＮＯＥがあるのかを二次
元上で観測するスペクトルがNOESYである。距離的に近
い各水素原子の化学シフトの交点にクロスピークが現れ
る。アミノ酸残基数が６０を超えると、二次元のNOESY
では各ピークが重なって見えにくくなる。これを解消す
るために、15Nに結合した水素原子や13Cに結合した水素
原子間のNOEを測定するため、15Nや13Cで三次元に展開
することが行われる。
して核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）がある。スピン
1/2の核と水素原子が空間的に近いと、お互いのスピン
間に双極子相互作用が生じる。たとえば、空間的に５オ
ングストロ−ム以内の水素原子の間には強いＮＯＥが観
測される。どの水素原子の間にＮＯＥがあるのかを二次
元上で観測するスペクトルがNOESYである。距離的に近
い各水素原子の化学シフトの交点にクロスピークが現れ
る。アミノ酸残基数が６０を超えると、二次元のNOESY
では各ピークが重なって見えにくくなる。これを解消す
るために、15Nに結合した水素原子や13Cに結合した水素
原子間のNOEを測定するため、15Nや13Cで三次元に展開
することが行われる。
【０００９】ＮＭＲでタンパク質の構造解析を行うに
は、種々のスペクトルを解析することにより、タンパク
質中の水素原子や13Cや15Nのシグナルを帰属する必要が
ある。
は、種々のスペクトルを解析することにより、タンパク
質中の水素原子や13Cや15Nのシグナルを帰属する必要が
ある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、多重複合体
の水素原子の化学シフトを帰属する方法を提供すること
を目的とする。
の水素原子の化学シフトを帰属する方法を提供すること
を目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の要旨は以下の通
りである。 （１） ２個以上の同種の分子が同種の結合様式で１個
の高分子にそれぞれ異なる部位で結合している多重複合
体の化学シフトを同定する方法であって、(a)２個以上
の同種の分子が同種の結合様式で１個の高分子にそれぞ
れ異なる部位で結合している多重複合体であって、該多
重複合体を構成する高分子において、一方の末端側で１
個の分子と結合する部位の化学的環境が他方の末端側で
１個の分子と結合する部位の化学的環境と相違している
前記多重複合体を用意し、(b)(a)の多重複合体の化学シ
フトを測定し、(c)下記の(i)または(ii)のいずれかの測
定値を得、(i) (a)の多重複合体を構成している高分子
の両末端側の結合部位の化学的環境の相違により差が生
じる、ＮＭＲで得られる測定値、または(ii) (a)の多重
複合体において１個の分子が一方の末端側で高分子に結
合している部分に相当する単一複合体の化学的環境と
(a)の多重複合体において１個の分子が他方の末端側で
高分子に結合している部分に相当する単一複合体の化学
的環境との相違により差が生じる、ＮＭＲで得られる測
定値(d)(c)で得た測定値に基づいて、(b)で測定した化
学シフトを同定することを含む、前記の方法。
りである。 （１） ２個以上の同種の分子が同種の結合様式で１個
の高分子にそれぞれ異なる部位で結合している多重複合
体の化学シフトを同定する方法であって、(a)２個以上
の同種の分子が同種の結合様式で１個の高分子にそれぞ
れ異なる部位で結合している多重複合体であって、該多
重複合体を構成する高分子において、一方の末端側で１
個の分子と結合する部位の化学的環境が他方の末端側で
１個の分子と結合する部位の化学的環境と相違している
前記多重複合体を用意し、(b)(a)の多重複合体の化学シ
フトを測定し、(c)下記の(i)または(ii)のいずれかの測
定値を得、(i) (a)の多重複合体を構成している高分子
の両末端側の結合部位の化学的環境の相違により差が生
じる、ＮＭＲで得られる測定値、または(ii) (a)の多重
複合体において１個の分子が一方の末端側で高分子に結
合している部分に相当する単一複合体の化学的環境と
(a)の多重複合体において１個の分子が他方の末端側で
高分子に結合している部分に相当する単一複合体の化学
的環境との相違により差が生じる、ＮＭＲで得られる測
定値(d)(c)で得た測定値に基づいて、(b)で測定した化
学シフトを同定することを含む、前記の方法。
【００１２】（２） (a)の多重複合体を構成している
高分子の両末端側の結合部位の化学的環境の相違が、結
合部位の前および／または後の１個以上の原子の種類の
相違であり、(c)で得る測定値が、(a)の多重複合体にお
いて１個の分子が一方の末端側で高分子に結合している
部分に相当する単一複合体の化学シフトおよび(a)の多
重複合体において１個の分子が他方の末端側で高分子に
結合している部分に相当する単一複合体の化学シフトで
ある（１）記載の方法。
高分子の両末端側の結合部位の化学的環境の相違が、結
合部位の前および／または後の１個以上の原子の種類の
相違であり、(c)で得る測定値が、(a)の多重複合体にお
いて１個の分子が一方の末端側で高分子に結合している
部分に相当する単一複合体の化学シフトおよび(a)の多
重複合体において１個の分子が他方の末端側で高分子に
結合している部分に相当する単一複合体の化学シフトで
ある（１）記載の方法。
【００１３】（３） (a)の多重複合体を構成している
高分子の両末端側の結合部位の化学的環境の相違が、結
合部位の窒素および炭素原子の核種の相違であり、(c)
で得る測定値が、(a)の多重複合体の核オーバーハウザ
ー効果である（１）記載の方法。
高分子の両末端側の結合部位の化学的環境の相違が、結
合部位の窒素および炭素原子の核種の相違であり、(c)
で得る測定値が、(a)の多重複合体の核オーバーハウザ
ー効果である（１）記載の方法。
【００１４】（４） （１）〜（３）のいずれかに記載
の方法を利用して、２個以上の同種の分子が同種の結合
様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合してい
る多重複合体の立体構造を解析する方法。
の方法を利用して、２個以上の同種の分子が同種の結合
様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合してい
る多重複合体の立体構造を解析する方法。
【００１５】（５） （１）〜（３）のいずれかに記載
の方法を利用して、２個以上の同種の分子が同種の結合
様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合してい
る多重複合体のモデルを構築する方法。
の方法を利用して、２個以上の同種の分子が同種の結合
様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合してい
る多重複合体のモデルを構築する方法。
【００１６】（６） 下記の塩基配列(I)を有する核酸
分子。
分子。
【００１７】5'-R1TGTCAR2-3' (I)
（塩基配列(I)中、R1は塩基数１〜１００の塩基配列で
あり、R２は塩基数２〜１００の塩基配列であり、R1お
よびR２の塩基配列の各塩基は、アデニン、グアニン、
チミン及びシトシンからなる群より選択され、Tはチミ
ン、Gはグアニン、Cはチミン、Aはアデニンである）
あり、R２は塩基数２〜１００の塩基配列であり、R1お
よびR２の塩基配列の各塩基は、アデニン、グアニン、
チミン及びシトシンからなる群より選択され、Tはチミ
ン、Gはグアニン、Cはチミン、Aはアデニンである）
【００１８】（７） 下記の塩基配列(II)を有する核酸
分子。
分子。
【００１９】5'-R3TGTCAR4TGTCAR5-3' (II)
（塩基配列(II)中、R3は塩基数１〜１００個の塩基配列
であり、R4は塩基数２〜５０個の塩基配列であり、R5は
塩基数２〜１００個の塩基配列であり、R3、R4およびR5
の塩基配列の各塩基は、アデニン、グアニン、チミン及
びシトシンからなる群より選択され、Tはチミン、Gはグ
アニン、Cはチミン、Aはアデニンである）
であり、R4は塩基数２〜５０個の塩基配列であり、R5は
塩基数２〜１００個の塩基配列であり、R3、R4およびR5
の塩基配列の各塩基は、アデニン、グアニン、チミン及
びシトシンからなる群より選択され、Tはチミン、Gはグ
アニン、Cはチミン、Aはアデニンである）
【００２０】（８） 下記の塩基配列(III)を有する核
酸分子。
酸分子。
【００２１】5'-R6 AGGGTTR7 AGGGTTR8-3' (III)
（塩基配列(III)中、R6は塩基数１〜１００個の塩基配
列であり、R7は塩基数０〜５０個の塩基配列であり、R8
は塩基数１〜１００個の塩基配列であり、R6、R7および
R8の塩基配列の各塩基は、アデニン、グアニン、チミン
及びシトシンからなる群より選択され、Tはチミン、Gは
グアニン、Cはチミン、Aはアデニンであり、２箇所の下
線部の両方または片方の塩基において、窒素が15Nで標
識され、かつ炭素が13Cで標識されているか、窒素のみ
が15Nで標識されているか、あるいは炭素のみが13Cで標
識されている）
列であり、R7は塩基数０〜５０個の塩基配列であり、R8
は塩基数１〜１００個の塩基配列であり、R6、R7および
R8の塩基配列の各塩基は、アデニン、グアニン、チミン
及びシトシンからなる群より選択され、Tはチミン、Gは
グアニン、Cはチミン、Aはアデニンであり、２箇所の下
線部の両方または片方の塩基において、窒素が15Nで標
識され、かつ炭素が13Cで標識されているか、窒素のみ
が15Nで標識されているか、あるいは炭素のみが13Cで標
識されている）
【００２２】（９） ２個以上の同種の分子が同種の結
合様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合して
いる多重複合体を形成することができる高分子であっ
て、一方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的
環境が他方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学
的環境と相違している前記高分子を含む、２個以上の同
種の分子が同種の結合様式で１個の高分子にそれぞれ異
なる部位で結合している多重複合体の化学シフトを同定
するための試薬。
合様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合して
いる多重複合体を形成することができる高分子であっ
て、一方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的
環境が他方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学
的環境と相違している前記高分子を含む、２個以上の同
種の分子が同種の結合様式で１個の高分子にそれぞれ異
なる部位で結合している多重複合体の化学シフトを同定
するための試薬。
【００２３】（１０） ２個以上の同種の分子が同種の
結合様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合し
ている多重複合体を形成することができる高分子であっ
て、一方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的
環境が他方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学
的環境と相違している前記高分子を含む、２個以上の同
種の分子が同種の結合様式で１個の高分子にそれぞれ異
なる部位で結合している多重複合体の立体構造を解析す
るための試薬。
結合様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合し
ている多重複合体を形成することができる高分子であっ
て、一方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的
環境が他方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学
的環境と相違している前記高分子を含む、２個以上の同
種の分子が同種の結合様式で１個の高分子にそれぞれ異
なる部位で結合している多重複合体の立体構造を解析す
るための試薬。
【００２４】（１１） ２個以上の同種の分子が同種の
結合様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合し
ている多重複合体を形成することができる高分子であっ
て、一方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的
環境が他方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学
的環境と相違している前記高分子を含む、２個以上の同
種の分子が同種の結合様式で１個の高分子にそれぞれ異
なる部位で結合している多重複合体のモデルを構築する
ための試薬。
結合様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合し
ている多重複合体を形成することができる高分子であっ
て、一方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的
環境が他方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学
的環境と相違している前記高分子を含む、２個以上の同
種の分子が同種の結合様式で１個の高分子にそれぞれ異
なる部位で結合している多重複合体のモデルを構築する
ための試薬。
【００２５】本発明において、多重複合体を構成する２
個以上の同種の分子としては、タンパク質などの高分子
から低分子化合物（例えば、医薬品として利用されてい
るようなもの）までのいかなる物質であってもよい。
個以上の同種の分子としては、タンパク質などの高分子
から低分子化合物（例えば、医薬品として利用されてい
るようなもの）までのいかなる物質であってもよい。
【００２６】多重複合体を構成する高分子としては、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖などを例示することが
できる。
ＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖などを例示することが
できる。
【００２７】「２個以上の同種の分子が同種の結合様式
で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合している多
重複合体」とは、２個以上の同種の分子が１個の高分子
中の異なる位置に存在する同じ配列（例えば、塩基配
列、アミノ酸配列、糖鎖の配列など）を認識して結合し
ている複合体をいう。このような多重複合体としては、
フォスフェート遺伝子のプロモーターのリン酸ボックス
に結合したＰｈｏＢ、テロメアＤＮＡに結合したテロメ
アタンパク質ＴＲＦ１、ＴＲＦ２など、ＤＮＡに結合し
た染色体タンパク質のヒストン８量体、アクチンフィラ
メントに結合したアクチン結合タンパク質（ミオシンな
ど）、ＤＮＡに結合した薬剤（アクチノマイシンＤ、ド
ウノマイシン、ブレオマイシンなど）、ＲＮＡに結合し
たＲＮＰ、グリコーゲンに結合したグリコーゲンホスホ
リラーゼなどを例示することができる。
で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合している多
重複合体」とは、２個以上の同種の分子が１個の高分子
中の異なる位置に存在する同じ配列（例えば、塩基配
列、アミノ酸配列、糖鎖の配列など）を認識して結合し
ている複合体をいう。このような多重複合体としては、
フォスフェート遺伝子のプロモーターのリン酸ボックス
に結合したＰｈｏＢ、テロメアＤＮＡに結合したテロメ
アタンパク質ＴＲＦ１、ＴＲＦ２など、ＤＮＡに結合し
た染色体タンパク質のヒストン８量体、アクチンフィラ
メントに結合したアクチン結合タンパク質（ミオシンな
ど）、ＤＮＡに結合した薬剤（アクチノマイシンＤ、ド
ウノマイシン、ブレオマイシンなど）、ＲＮＡに結合し
たＲＮＰ、グリコーゲンに結合したグリコーゲンホスホ
リラーゼなどを例示することができる。
【００２８】「化学的環境」とは、原子の空間的な配置
をいう。この場合の原子とは、同位体を含む。
をいう。この場合の原子とは、同位体を含む。
【００２９】「一方の末端側で１個の分子と結合する部
位の化学的環境が他方の末端側で１個の分子と結合する
部位の化学的環境と相違している」例としては、多重複
合体を構成している高分子の両末端側の結合部位の前お
よび／または後の１個以上の原子の種類が相違している
こと（たとえば、結合部位の前後の配列（例えば、塩基
配列、アミノ酸配列、糖鎖の配列など）が異なるこ
と）、多重複合体を構成している高分子の両末端側の結
合部位の窒素および／または炭素原子の核種が相違して
いること（例えば、（１）片方の末端側の結合部位の窒
素と炭素がそれぞれ 15Nと13Cで標識され、もう片方の末
端側の結合部位の窒素と炭素はそれぞれ14Nと12Cである
こと、（２）片方の末端側の結合部位の窒素が15Nで標
識され、もう片方の末端側の結合部位の窒素は14Nであ
ること、（３）片方の末端側の結合部位の炭素が13Cで
標識され、もう片方の末端側の結合部位の炭素は12Cで
あることなど）などを挙げることができる。
位の化学的環境が他方の末端側で１個の分子と結合する
部位の化学的環境と相違している」例としては、多重複
合体を構成している高分子の両末端側の結合部位の前お
よび／または後の１個以上の原子の種類が相違している
こと（たとえば、結合部位の前後の配列（例えば、塩基
配列、アミノ酸配列、糖鎖の配列など）が異なるこ
と）、多重複合体を構成している高分子の両末端側の結
合部位の窒素および／または炭素原子の核種が相違して
いること（例えば、（１）片方の末端側の結合部位の窒
素と炭素がそれぞれ 15Nと13Cで標識され、もう片方の末
端側の結合部位の窒素と炭素はそれぞれ14Nと12Cである
こと、（２）片方の末端側の結合部位の窒素が15Nで標
識され、もう片方の末端側の結合部位の窒素は14Nであ
ること、（３）片方の末端側の結合部位の炭素が13Cで
標識され、もう片方の末端側の結合部位の炭素は12Cで
あることなど）などを挙げることができる。
【００３０】「単一複合体」とは、１個の分子が１個の
高分子断片に結合して形成する複合体をいう。
高分子断片に結合して形成する複合体をいう。
【００３１】「ＮＭＲで得られる測定値」としては、化
学シフト、ＮＯＥ、スピン結合などを例示することがで
きる。
学シフト、ＮＯＥ、スピン結合などを例示することがで
きる。
【００３２】「化学シフトを同定する」とは、その化学
シフトが多重複合体のどの水素原子に由来するものであ
るかを決定することをいう。
シフトが多重複合体のどの水素原子に由来するものであ
るかを決定することをいう。
【００３３】「多重複合体の立体構造を解析する」と
は、多重複合体中の各々の分子が１個の高分子に結合し
ている３次元座標のすべてを実験的に求めることをい
う。
は、多重複合体中の各々の分子が１個の高分子に結合し
ている３次元座標のすべてを実験的に求めることをい
う。
【００３４】「多重複合体のモデルを構築する」とは、
１個の分子の３次元座標と１個の高分子の３次元座標に
基づいて、多重複合体中の各々の分子と１個の高分子の
位置を決めることをいう。
１個の分子の３次元座標と１個の高分子の３次元座標に
基づいて、多重複合体中の各々の分子と１個の高分子の
位置を決めることをいう。
【００３５】また、本発明は、塩基配列(I)を有する核
酸分子を提供する。
酸分子を提供する。
【００３６】5'-R1TGTCAR2-3' (I)
【００３７】塩基配列(I)中、R1は塩基数１〜１００の
塩基配列であり、好ましくは、塩基数１〜５０個の塩基
配列であり、より好ましくは、塩基数１〜１０個の塩基
配列である。R２は塩基数２〜１００個の塩基配列であ
り、好ましくは、塩基数２〜５０個の塩基配列であり、
より好ましくは、塩基数２〜１０個の塩基配列である。
塩基配列であり、好ましくは、塩基数１〜５０個の塩基
配列であり、より好ましくは、塩基数１〜１０個の塩基
配列である。R２は塩基数２〜１００個の塩基配列であ
り、好ましくは、塩基数２〜５０個の塩基配列であり、
より好ましくは、塩基数２〜１０個の塩基配列である。
【００３８】塩基配列(I)を有する核酸分子としては、
下記の配列番号４の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ、下
記の配列番号４の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡとその
相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡ、下記の配列番号５の塩基
配列を有する一本鎖ＤＮＡ、下記の配列番号５の塩基配
列を有する一本鎖ＤＮＡとその相補鎖からなる二本鎖Ｄ
ＮＡなどを例示することができる。 5'-ACTGTCATAAATCTGT-3' (配列番号４） 5'-TCTGTCACCTGTTTGT-3'（配列番号５） （配列番号４および５の塩基配列中の下線部は、転写活
性化因子ＰｈｏＢの認識配列である。）
下記の配列番号４の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ、下
記の配列番号４の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡとその
相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡ、下記の配列番号５の塩基
配列を有する一本鎖ＤＮＡ、下記の配列番号５の塩基配
列を有する一本鎖ＤＮＡとその相補鎖からなる二本鎖Ｄ
ＮＡなどを例示することができる。 5'-ACTGTCATAAATCTGT-3' (配列番号４） 5'-TCTGTCACCTGTTTGT-3'（配列番号５） （配列番号４および５の塩基配列中の下線部は、転写活
性化因子ＰｈｏＢの認識配列である。）
【００３９】さらに、本発明は、塩基配列(II)を有する
核酸分子を提供する。
核酸分子を提供する。
【００４０】5'-R3TGTCAR4TGTCAR5-3' (II)
【００４１】塩基配列(II)中、R3は塩基数１〜１００個
の塩基配列であり、好ましくは、塩基数１〜５０個の塩
基配列であり、より好ましくは、塩基数１〜１０個の塩
基配列である。R4は塩基数２〜５０個の塩基配列であ
り、好ましくは、塩基数２〜２５個の塩基配列であり、
より好ましくは、塩基数２〜１０個の塩基配列である。
R5は塩基数２〜１００個の塩基配列であり、好ましく
は、塩基数２〜５０個の塩基配列であり、より好ましく
は、塩基数２〜１０個の塩基配列である。
の塩基配列であり、好ましくは、塩基数１〜５０個の塩
基配列であり、より好ましくは、塩基数１〜１０個の塩
基配列である。R4は塩基数２〜５０個の塩基配列であ
り、好ましくは、塩基数２〜２５個の塩基配列であり、
より好ましくは、塩基数２〜１０個の塩基配列である。
R5は塩基数２〜１００個の塩基配列であり、好ましく
は、塩基数２〜５０個の塩基配列であり、より好ましく
は、塩基数２〜１０個の塩基配列である。
【００４２】塩基配列(II)を有する核酸分子としては、
下記の配列番号１の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ、下
記の配列番号１の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡとその
相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡなどを例示することができ
る。 5'-ACTGTCATAAATCTGTCACCTGTTTGT-3'（配列番号１） （配列番号１の塩基配列中の下線部は、転写活性化因子
ＰｈｏＢの認識配列である。）
下記の配列番号１の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ、下
記の配列番号１の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡとその
相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡなどを例示することができ
る。 5'-ACTGTCATAAATCTGTCACCTGTTTGT-3'（配列番号１） （配列番号１の塩基配列中の下線部は、転写活性化因子
ＰｈｏＢの認識配列である。）
【００４３】さらにまた、本発明は、下記の塩基配列(I
II)を有する核酸分子を提供する。
II)を有する核酸分子を提供する。
【００４４】5'-R6 AGGGTTR7 AGGGTTR8-3' (III)
【００４５】塩基配列(III)中、R6は塩基数１〜１００
個の塩基配列であり、好ましくは、塩基数１〜５０個の
塩基配列であり、より好ましくは、塩基数１〜１０個の
塩基配列である。R7は塩基数０〜５０個の塩基配列であ
り、好ましくは、塩基数０〜２５個の塩基配列であり、
より好ましくは、塩基数０〜１０個の塩基配列である。
R8は塩基数１〜１００個の塩基配列であり、好ましく
は、塩基数１〜５０個の塩基配列であり、より好ましく
は、塩基数１〜１０個の塩基配列である。
個の塩基配列であり、好ましくは、塩基数１〜５０個の
塩基配列であり、より好ましくは、塩基数１〜１０個の
塩基配列である。R7は塩基数０〜５０個の塩基配列であ
り、好ましくは、塩基数０〜２５個の塩基配列であり、
より好ましくは、塩基数０〜１０個の塩基配列である。
R8は塩基数１〜１００個の塩基配列であり、好ましく
は、塩基数１〜５０個の塩基配列であり、より好ましく
は、塩基数１〜１０個の塩基配列である。
【００４６】塩基配列(III)の２箇所の下線部の両方ま
たは片方の塩基において、窒素が15Nで標識され、かつ
炭素が13Cで標識されているか、窒素のみが15Nで標識さ
れているか、あるいは炭素のみが13Cで標識されてい
る。さらに、R6、R7およびR8の塩基配列中の塩基のいず
れかが15Nおよび／または13Cで標識されていてもよい。
たは片方の塩基において、窒素が15Nで標識され、かつ
炭素が13Cで標識されているか、窒素のみが15Nで標識さ
れているか、あるいは炭素のみが13Cで標識されてい
る。さらに、R6、R7およびR8の塩基配列中の塩基のいず
れかが15Nおよび／または13Cで標識されていてもよい。
【００４７】塩基配列(III)を有する核酸分子として
は、下記の配列番号６の塩基配列を有する一本鎖ＤＮ
Ａ、下記の配列番号６の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ
とその相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡなどを例示すること
ができる。 5'-TAGGGTT A*G*G*G*T*T* A*G*-3'（配列番号６） （配列番号６の塩基配列中の下線部は、テロメアＤＮＡ
結合因子ＴＲＦ１の認識配列であり、右肩に＊を付した
塩基は15Nおよび13Cで標識されている。）
は、下記の配列番号６の塩基配列を有する一本鎖ＤＮ
Ａ、下記の配列番号６の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ
とその相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡなどを例示すること
ができる。 5'-TAGGGTT A*G*G*G*T*T* A*G*-3'（配列番号６） （配列番号６の塩基配列中の下線部は、テロメアＤＮＡ
結合因子ＴＲＦ１の認識配列であり、右肩に＊を付した
塩基は15Nおよび13Cで標識されている。）
【００４８】本明細書において、「核酸分子」には、Ｒ
ＮＡもＤＮＡも含まれ、核酸分子がＲＮＡの場合には、
塩基配列中のT（チミン）をU（ウラシル）に読みかえる
ものとし、核酸分子がＤＮＡの場合には、一本鎖ＤＮ
Ａ、その相補鎖も含む二本鎖ＤＮＡも含まれるものとす
る。
ＮＡもＤＮＡも含まれ、核酸分子がＲＮＡの場合には、
塩基配列中のT（チミン）をU（ウラシル）に読みかえる
ものとし、核酸分子がＤＮＡの場合には、一本鎖ＤＮ
Ａ、その相補鎖も含む二本鎖ＤＮＡも含まれるものとす
る。
【００４９】塩基配列(I)、(II)または(III)を有する核
酸分子は、公知の方法で製造することができる。
酸分子は、公知の方法で製造することができる。
【００５０】例えば、塩基配列(I)または(II)を有する
ＤＮＡ分子は、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成す
ることができる。
ＤＮＡ分子は、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成す
ることができる。
【００５１】塩基配列(III)を有するＤＮＡ分子は、以
下のようにして製造することができる。
下のようにして製造することができる。
【００５２】まず、13C,15N 標識dNTPを用意する。13C,
15N 標識dNTPは市販のもの（アイソテックインク（オハ
イオ州デイトン 米国）製）を購入してもよいし、Jour
nalof Biomolecular NMR, 10 (1997) 245-254、Deborah
E. Smith, Jin-Yuan Su and Fiona M. Jucker、Effici
ent enzymatic synthesis of 13C,15N-labeled DNAfor
NMR studiesなどの文献に従って調製することができ
る。
15N 標識dNTPは市販のもの（アイソテックインク（オハ
イオ州デイトン 米国）製）を購入してもよいし、Jour
nalof Biomolecular NMR, 10 (1997) 245-254、Deborah
E. Smith, Jin-Yuan Su and Fiona M. Jucker、Effici
ent enzymatic synthesis of 13C,15N-labeled DNAfor
NMR studiesなどの文献に従って調製することができ
る。
【００５３】また、例えば以下のように13C,15N 標識dN
TPを調製してもよい。
TPを調製してもよい。
【００５４】13C標識炭酸ガス（13CO2）および15N標識
硝酸塩（15NO3 -）を唯一の炭素原および窒素原とした培
地で藍藻類を培養する。培養後,遠心分離にて藍藻体を
回収し,有機溶媒等を使ってDNAを抽出する。抽出された
DNAを市販のデオキシリボヌクレアーゼで加水分解し,陰
イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製した後,
13C,15N 標識2'-デオキシリボヌクレオチド5'-モノリン
酸（以下dNMPs）を得る。dNMPsにリン酸基転移酵素を用
いてピロリン酸(PPi)を付加し,13C,15N 標識2'-デオキ
シリボヌクレオチド5'-トリリン酸（以下dNTPs）を得
る。
硝酸塩（15NO3 -）を唯一の炭素原および窒素原とした培
地で藍藻類を培養する。培養後,遠心分離にて藍藻体を
回収し,有機溶媒等を使ってDNAを抽出する。抽出された
DNAを市販のデオキシリボヌクレアーゼで加水分解し,陰
イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製した後,
13C,15N 標識2'-デオキシリボヌクレオチド5'-モノリン
酸（以下dNMPs）を得る。dNMPsにリン酸基転移酵素を用
いてピロリン酸(PPi)を付加し,13C,15N 標識2'-デオキ
シリボヌクレオチド5'-トリリン酸（以下dNTPs）を得
る。
【００５５】13C,15N 標識DNAは、13C,15N 標識dNTPを
用いて、Journal of Biomolecular NMR, 10 (1997) 245
-254、Deborah E. Smith, Jin-Yuan Su and Fiona M. J
ucker、Efficient enzymatic synthesis of 13C,15N-la
beled DNA for NMR studiesなどの文献に従って調製す
ることができる。
用いて、Journal of Biomolecular NMR, 10 (1997) 245
-254、Deborah E. Smith, Jin-Yuan Su and Fiona M. J
ucker、Efficient enzymatic synthesis of 13C,15N-la
beled DNA for NMR studiesなどの文献に従って調製す
ることができる。
【００５６】本発明の核酸分子は、塩基配列(I)、(II)
または(III)を構成成分として含む高分子とこれに結合
する２個以上の同種の分子から構成される多重複合体の
化学シフトを同定したり、そのような多重複合体の立体
構造解析やモデル構築に利用することができる。
または(III)を構成成分として含む高分子とこれに結合
する２個以上の同種の分子から構成される多重複合体の
化学シフトを同定したり、そのような多重複合体の立体
構造解析やモデル構築に利用することができる。
【００５７】本発明の試薬は、２個以上の同種の分子が
同種の結合様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で
結合している多重複合体を形成することができる高分子
であって、一方の末端側で１個の分子と結合する部位の
化学的環境が他方の末端側で１個の分子と結合する部位
の化学的環境と相違している前記高分子を含む。多重複
合体を構成している高分子の両末端側の結合部位の化学
的環境の相違は、結合部位の窒素および／または炭素原
子の核種の相違であってもよい（例えば、（１）片方の
末端側の結合部位の窒素と炭素がそれぞれ15Nと13Cで標
識され、もう片方の末端側の結合部位の窒素と炭素はそ
れぞれ14Nと12Cである、（２）片方の末端側の結合部位
の窒素が15Nで標識され、もう片方の末端側の結合部位
の窒素は1 4Nである、（３）片方の末端側の結合部位の
炭素が13Cで標識され、もう片方の末端側の結合部位の
炭素は12Cであるなど）。本発明の試薬に含まれる高分
子としては、塩基配列(I)、(II)または(III)を構成成分
として含む高分子を例示することができる。
同種の結合様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で
結合している多重複合体を形成することができる高分子
であって、一方の末端側で１個の分子と結合する部位の
化学的環境が他方の末端側で１個の分子と結合する部位
の化学的環境と相違している前記高分子を含む。多重複
合体を構成している高分子の両末端側の結合部位の化学
的環境の相違は、結合部位の窒素および／または炭素原
子の核種の相違であってもよい（例えば、（１）片方の
末端側の結合部位の窒素と炭素がそれぞれ15Nと13Cで標
識され、もう片方の末端側の結合部位の窒素と炭素はそ
れぞれ14Nと12Cである、（２）片方の末端側の結合部位
の窒素が15Nで標識され、もう片方の末端側の結合部位
の窒素は1 4Nである、（３）片方の末端側の結合部位の
炭素が13Cで標識され、もう片方の末端側の結合部位の
炭素は12Cであるなど）。本発明の試薬に含まれる高分
子としては、塩基配列(I)、(II)または(III)を構成成分
として含む高分子を例示することができる。
【００５８】本発明の試薬は、さらに、脱イオン水、蒸
留水、リン酸などの緩衝液、塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌな
ど）、重水などを含んでもよい。
留水、リン酸などの緩衝液、塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌな
ど）、重水などを含んでもよい。
【００５９】
【実施例】以下、本発明を実施例によって具体的に説明
する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するため
のものであって、本発明の範囲を限定するものではな
い。
する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するため
のものであって、本発明の範囲を限定するものではな
い。
【００６０】［実施例１］ リン酸ボックス上のPhoBの
タンデムな二量体のモデル構築 PhoBは、大腸菌のホスフェート遺伝子のプロモーターに
おけるリン酸ボックスに結合する転写活性化因子であ
る。PhoBには、２つの機能性ドメイン、すなわち、N末
部位のリン酸化ドメインとC末部位のDNA結合／転写活性
化ドメインが含まれる。DNA結合ドメインの三次構造をN
MRにより決定した。それは、N末端の４本のβシート、
中央部の３本のヘリックスバンドルおよびC末端のβヘ
アピンからなり、２本目と３本目のヘリックスはヘリッ
クス-ターン-ヘリックス変異体モチーフを形成してい
る。PhoBの結合部位はTGTCA配列であり、リン酸ボック
スには２つの結合部位が含まれている。我々は、TROSY
を用いたNMR実験により、リン酸ボックスを含むDNAに結
合した２つのDNA結合ドメインの42 kDa三重複合体を調
べた。このDNA結合ドメインのアミノ酸の大半は２つの
明らかに分離した主鎖シグナルを呈し、これらはリン酸
ボックスの２つの異なる結合部位に結合した２つのDNA
結合ドメインに相当する。DNA-非結合型とDNA-結合型の
間での化学シフトの大きな変化は、各ドメインのヘリッ
クス-ターン-ヘリックス領域において観察されたが、DN
A-結合型において、２つのDNA結合ドメイン間のヘリッ
クス-ターン-ヘリックス領域の骨格の化学シフトの差異
はかなり小さい。このことは、リン酸ボックス上のこの
２つのドメインのDNA-認識モードが互いにとても類似し
ていることを示している。一方、この２つのDNA結合ド
メイン間の骨格シグナルの有意な化学シフトの変化はN-
およびC末端領域において観察されており、両者はDNA結
合ドメインの三次元構造上の反対側に位置している。従
って、この２つのDNA結合ドメインはタンデムに並んで
おり、一方のC末端領域はもう一方のN末端領域と相互作
用している。リン酸ボックス上で、この２つのDNA結合
ドメインは、ヘッドトゥーテイルの様式で相互作用する
ことにより二量体を形成しているが、これがDNAの大き
な曲がりを引き起こしている可能性が高い。
タンデムな二量体のモデル構築 PhoBは、大腸菌のホスフェート遺伝子のプロモーターに
おけるリン酸ボックスに結合する転写活性化因子であ
る。PhoBには、２つの機能性ドメイン、すなわち、N末
部位のリン酸化ドメインとC末部位のDNA結合／転写活性
化ドメインが含まれる。DNA結合ドメインの三次構造をN
MRにより決定した。それは、N末端の４本のβシート、
中央部の３本のヘリックスバンドルおよびC末端のβヘ
アピンからなり、２本目と３本目のヘリックスはヘリッ
クス-ターン-ヘリックス変異体モチーフを形成してい
る。PhoBの結合部位はTGTCA配列であり、リン酸ボック
スには２つの結合部位が含まれている。我々は、TROSY
を用いたNMR実験により、リン酸ボックスを含むDNAに結
合した２つのDNA結合ドメインの42 kDa三重複合体を調
べた。このDNA結合ドメインのアミノ酸の大半は２つの
明らかに分離した主鎖シグナルを呈し、これらはリン酸
ボックスの２つの異なる結合部位に結合した２つのDNA
結合ドメインに相当する。DNA-非結合型とDNA-結合型の
間での化学シフトの大きな変化は、各ドメインのヘリッ
クス-ターン-ヘリックス領域において観察されたが、DN
A-結合型において、２つのDNA結合ドメイン間のヘリッ
クス-ターン-ヘリックス領域の骨格の化学シフトの差異
はかなり小さい。このことは、リン酸ボックス上のこの
２つのドメインのDNA-認識モードが互いにとても類似し
ていることを示している。一方、この２つのDNA結合ド
メイン間の骨格シグナルの有意な化学シフトの変化はN-
およびC末端領域において観察されており、両者はDNA結
合ドメインの三次元構造上の反対側に位置している。従
って、この２つのDNA結合ドメインはタンデムに並んで
おり、一方のC末端領域はもう一方のN末端領域と相互作
用している。リン酸ボックス上で、この２つのDNA結合
ドメインは、ヘッドトゥーテイルの様式で相互作用する
ことにより二量体を形成しているが、これがDNAの大き
な曲がりを引き起こしている可能性が高い。
【００６１】使用されている略語
DDT:ジチオトレイトール
IPTG:イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド NMR:核磁気共鳴法 NOE:核オーバーハウザー効果 NOESY: nuclear Overhauser enhancement spectroscopy ppm: parts per million TOCSY: total correlation spectroscopy TROSY: transverse relaxation-optimized spectroscop
y
ノシド NMR:核磁気共鳴法 NOE:核オーバーハウザー効果 NOESY: nuclear Overhauser enhancement spectroscopy ppm: parts per million TOCSY: total correlation spectroscopy TROSY: transverse relaxation-optimized spectroscop
y
【００６２】結果と議論
DNAに結合したDNA結合ドメインのNMR
我々は、DNA分子のNHイミノシグナルをモニターするこ
とにより、PhoBの126-229番目のアミノ酸からなるDNA結
合ドメインと、リン酸ボックスを含む２７個のヌクレオ
チドからなるDNA分子との結合の様式を調べたところ、
２７個のヌクレオチドからなるDNA分子１個に結合した
２個のDNA結合ドメインの強固な複合体を得ることがで
きた。２７個のヌクレオチドからなるDNAの配列は、5'-
ACTGTCATAAATCTGTCACCTGTTTGT-3'（配列番号１）であ
り、これには、PhoBの２個の認識配列TGTCA部位が含ま
れており、そのTGTCA部位の後の3'部分の各々はDNA結合
ドメインが強固に結合するには十分な長さである。この
複合体の分子量は約42 kDaである。図１は、TROSY23を
用いた、15N標識DNA結合ドメインについてこの複合体の
1H-15N相関スペクトルを示す。スペクトル中のシグナル
は、TROSYを用いた三重共鳴実験24により同定した。５
個のプロリン残基およびＮ末端の３個の残基を除くほぼ
すべての残基（１０４残基中の９６残基）について、骨
格のNHのシグナルの同定を行った。DNAに結合していな
いDNA結合ドメインにおいては、Arg219とGly220の骨格
のNHのシグナルははっきりとは観察されなかったが、DN
Aと複合体を形成することにより、両残基のNHのシグナ
ルははっきりと同定された。
とにより、PhoBの126-229番目のアミノ酸からなるDNA結
合ドメインと、リン酸ボックスを含む２７個のヌクレオ
チドからなるDNA分子との結合の様式を調べたところ、
２７個のヌクレオチドからなるDNA分子１個に結合した
２個のDNA結合ドメインの強固な複合体を得ることがで
きた。２７個のヌクレオチドからなるDNAの配列は、5'-
ACTGTCATAAATCTGTCACCTGTTTGT-3'（配列番号１）であ
り、これには、PhoBの２個の認識配列TGTCA部位が含ま
れており、そのTGTCA部位の後の3'部分の各々はDNA結合
ドメインが強固に結合するには十分な長さである。この
複合体の分子量は約42 kDaである。図１は、TROSY23を
用いた、15N標識DNA結合ドメインについてこの複合体の
1H-15N相関スペクトルを示す。スペクトル中のシグナル
は、TROSYを用いた三重共鳴実験24により同定した。５
個のプロリン残基およびＮ末端の３個の残基を除くほぼ
すべての残基（１０４残基中の９６残基）について、骨
格のNHのシグナルの同定を行った。DNAに結合していな
いDNA結合ドメインにおいては、Arg219とGly220の骨格
のNHのシグナルははっきりとは観察されなかったが、DN
Aと複合体を形成することにより、両残基のNHのシグナ
ルははっきりと同定された。
【００６３】ほとんどのアミノ酸（９６個のアミノ酸の
うちの６５個）は、リン酸ボックスの２個の異なる結合
部位に結合した２個のDNA結合ドメインに対応する２個
の明らかに分離した1H-15Nシグナルを示す。常法の1H-
15N相関実験と比較して、この42 kDaの複合体について
のTROSYを用いた実験は良好な感度と解像度を示す。こ
の複合体は同じDNA結合ドメインを含むため、TROSY実験
の解像度が良好であることは、リン酸ボックス中の異な
る結合部位に結合した２個のDNA結合ドメインを区別す
るのに大変役立つ。
うちの６５個）は、リン酸ボックスの２個の異なる結合
部位に結合した２個のDNA結合ドメインに対応する２個
の明らかに分離した1H-15Nシグナルを示す。常法の1H-
15N相関実験と比較して、この42 kDaの複合体について
のTROSYを用いた実験は良好な感度と解像度を示す。こ
の複合体は同じDNA結合ドメインを含むため、TROSY実験
の解像度が良好であることは、リン酸ボックス中の異な
る結合部位に結合した２個のDNA結合ドメインを区別す
るのに大変役立つ。
【００６４】異なる部位に結合した２個のDNA結合ドメ
インの各々に対する２個の分離したシグナルの各々を同
定するために、我々は２７個のヌクレオチドからなるDN
Aの5'側の半分の部位を含む種々のDNA分子に結合した単
一のDNA結合ドメインのいくつかのDNA複合体を調べた。
１８個のヌクレオチドからなるDNA（5'-CTGTCATAAATCTG
TCAC-3'（配列番号２）10）とDNA結合ドメインとの複合
体において、２個のTGTCA部位を含むDNAがたった一つの
DNA結合ドメインに結合し、5'側のTGTCA部位を認識して
いた。しかしながら、１３個のヌクレオチドからなるDN
A（5'-ACTGTCATAAATC-3' （配列番号３））について
は、DNA結合ドメインの弱い結合が観察された（データ
は示さず）。これらのことは、DNA結合ドメインにはTGT
CA配列の後に3'部分の比較的長い領域が必要であること
を示している。１６個のヌクレオチドからなるDNA（5'-
ACTGTCATAAATCTGT-3' （配列番号４）（16-5'））につ
いては、DNAに結合した単一のDNA結合ドメインの強固な
複合体が得られ、この複合体を２７個のヌクレオチドか
らなるDNAとの複合体の参照として、NMR実験に用いた。
さらに、２７個のヌクレオチドからなるＤＮＡの3'側の
１６個のＤＮＡ（5'-TCTGTCACCTGTTTGT-3' （配列番号
５）（16-3'））を調製し、このＤＮＡと１個のＤＮＡ
結合ドメインとの強固な複合体も得て、２７個のヌクレ
オチドからなるＤＮＡとの複合体の参照として、ＮＭＲ
実験に用いた。
インの各々に対する２個の分離したシグナルの各々を同
定するために、我々は２７個のヌクレオチドからなるDN
Aの5'側の半分の部位を含む種々のDNA分子に結合した単
一のDNA結合ドメインのいくつかのDNA複合体を調べた。
１８個のヌクレオチドからなるDNA（5'-CTGTCATAAATCTG
TCAC-3'（配列番号２）10）とDNA結合ドメインとの複合
体において、２個のTGTCA部位を含むDNAがたった一つの
DNA結合ドメインに結合し、5'側のTGTCA部位を認識して
いた。しかしながら、１３個のヌクレオチドからなるDN
A（5'-ACTGTCATAAATC-3' （配列番号３））について
は、DNA結合ドメインの弱い結合が観察された（データ
は示さず）。これらのことは、DNA結合ドメインにはTGT
CA配列の後に3'部分の比較的長い領域が必要であること
を示している。１６個のヌクレオチドからなるDNA（5'-
ACTGTCATAAATCTGT-3' （配列番号４）（16-5'））につ
いては、DNAに結合した単一のDNA結合ドメインの強固な
複合体が得られ、この複合体を２７個のヌクレオチドか
らなるDNAとの複合体の参照として、NMR実験に用いた。
さらに、２７個のヌクレオチドからなるＤＮＡの3'側の
１６個のＤＮＡ（5'-TCTGTCACCTGTTTGT-3' （配列番号
５）（16-3'））を調製し、このＤＮＡと１個のＤＮＡ
結合ドメインとの強固な複合体も得て、２７個のヌクレ
オチドからなるＤＮＡとの複合体の参照として、ＮＭＲ
実験に用いた。
【００６５】図２は、TROSYを用いた23、15N標識DNA結
合ドメインの１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-5')
に対する１対１の複合体の1H-15N相関スペクトルを示
す。図３は、TROSYを用いた23、15N標識DNA結合ドメイ
ンの１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-3')に対する
１対１の複合体の1H-15N相関スペクトルを示す。TROSY
を用いた三重共鳴実験24を用いて、シグナルを同定し
た。５個のプロリン残基およびN末端の３個の残基を除
き、１０４残基のうちの９６残基について、骨格のNHの
シグナルを同定した(16-5')。５個のプロリン残基およ
びN末端の３個の残基を除き、１０４残基のうちの９６
残基について、骨格のNHのシグナルを同定した(16-
3')。１６個のヌクレオチドからなるDNAへの結合によ
り、Arg219とGly220の両方の骨格のNHのシグナルが再度
観察可能となった。
合ドメインの１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-5')
に対する１対１の複合体の1H-15N相関スペクトルを示
す。図３は、TROSYを用いた23、15N標識DNA結合ドメイ
ンの１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-3')に対する
１対１の複合体の1H-15N相関スペクトルを示す。TROSY
を用いた三重共鳴実験24を用いて、シグナルを同定し
た。５個のプロリン残基およびN末端の３個の残基を除
き、１０４残基のうちの９６残基について、骨格のNHの
シグナルを同定した(16-5')。５個のプロリン残基およ
びN末端の３個の残基を除き、１０４残基のうちの９６
残基について、骨格のNHのシグナルを同定した(16-
3')。１６個のヌクレオチドからなるDNAへの結合によ
り、Arg219とGly220の両方の骨格のNHのシグナルが再度
観察可能となった。
【００６６】図２および３で、９６個のアミノ酸のすべ
てが各NHアミド結合についてたった一つのシグナルを示
すことは明らかである。図４は、DNAに結合していない
状態と１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-5'と16-
3')に結合した状態との間で生じた化学シフトの変化を
示す。同時に、DNAに結合していない状態と２７個のヌ
クレオチドからなるDNAに結合した状態との間で生じた
化学シフトの変化も示す。両方の複合体において、３番
目のヘリックス領域の付近で大きな化学シフトが観察さ
れ、１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-5'と16-3')
の複合体および２７個のヌクレオチドからなるDNAの複
合体において、DNA結合ドメインの化学シフトの変化の
全体的なパターンは互いに非常に似通っていた。２７個
のヌクレオチドからなるDNAとの複合体における２個の
ドメインおよび１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-
5'と16-3')との複合体における各々のドメインはお互い
に非常に似通っていることが示唆される。
てが各NHアミド結合についてたった一つのシグナルを示
すことは明らかである。図４は、DNAに結合していない
状態と１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-5'と16-
3')に結合した状態との間で生じた化学シフトの変化を
示す。同時に、DNAに結合していない状態と２７個のヌ
クレオチドからなるDNAに結合した状態との間で生じた
化学シフトの変化も示す。両方の複合体において、３番
目のヘリックス領域の付近で大きな化学シフトが観察さ
れ、１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-5'と16-3')
の複合体および２７個のヌクレオチドからなるDNAの複
合体において、DNA結合ドメインの化学シフトの変化の
全体的なパターンは互いに非常に似通っていた。２７個
のヌクレオチドからなるDNAとの複合体における２個の
ドメインおよび１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-
5'と16-3')との複合体における各々のドメインはお互い
に非常に似通っていることが示唆される。
【００６７】２７個のヌクレオチドからなるDNAの異な
る部位に結合した２個のDNA結合ドメインの各々を順次
同定していくことは非常に難しい。なぜなら、２７個の
ヌクレオチドからなるDNAに結合した２個のDNA結合ドメ
インの間で、13Cスペクトルの多くが重なり、1H-15Nシ
グナルのいくつかが重なるからである。1HN-1HN NOEシ
グナルを連続的につなげることにより、２７個のヌクレ
オチドからなるDNA上の各ドメインをいくつかのセグメ
ントにおいて順次同定することができた。図４は、DNA
結合ドメインのうまく同定できたセグメントをアミノ酸
配列の上の矢印で示した。C末端のβヘアピンについ
て、２７個のヌクレオチドからなるDNAの複合体におけ
る各DNA結合ドメインの骨格を順次完全に同定した。N末
端領域のセグメントを各DNA結合ドメインに分割したも
のをさらに同定するために、１６個のヌクレオチドから
なるDNA(16-5'と16-3')の複合体の1H-15Nの帰属を用い
た。１６個のヌクレオチドからなる複合体(16-5'と16-
3')におけるDNA結合ドメインは、２７個のヌクレオチド
からなるDNAの複合体における5'部位のドメインと3'部
位のドメインの各々に相当した。N末端のβシート領域
について、２個の分離したNHシグナルの各々は、１６個
のヌクレオチドからなるDNAの複合体(16-5'と16-3')の
対応するシグナルに非常に似通っていた。従って、一連
のNHシグナルを5'TGTCA部位と3'部位に結合したドメイ
ンと同定することができた。
る部位に結合した２個のDNA結合ドメインの各々を順次
同定していくことは非常に難しい。なぜなら、２７個の
ヌクレオチドからなるDNAに結合した２個のDNA結合ドメ
インの間で、13Cスペクトルの多くが重なり、1H-15Nシ
グナルのいくつかが重なるからである。1HN-1HN NOEシ
グナルを連続的につなげることにより、２７個のヌクレ
オチドからなるDNA上の各ドメインをいくつかのセグメ
ントにおいて順次同定することができた。図４は、DNA
結合ドメインのうまく同定できたセグメントをアミノ酸
配列の上の矢印で示した。C末端のβヘアピンについ
て、２７個のヌクレオチドからなるDNAの複合体におけ
る各DNA結合ドメインの骨格を順次完全に同定した。N末
端領域のセグメントを各DNA結合ドメインに分割したも
のをさらに同定するために、１６個のヌクレオチドから
なるDNA(16-5'と16-3')の複合体の1H-15Nの帰属を用い
た。１６個のヌクレオチドからなる複合体(16-5'と16-
3')におけるDNA結合ドメインは、２７個のヌクレオチド
からなるDNAの複合体における5'部位のドメインと3'部
位のドメインの各々に相当した。N末端のβシート領域
について、２個の分離したNHシグナルの各々は、１６個
のヌクレオチドからなるDNAの複合体(16-5'と16-3')の
対応するシグナルに非常に似通っていた。従って、一連
のNHシグナルを5'TGTCA部位と3'部位に結合したドメイ
ンと同定することができた。
【００６８】図５は、現在の同定に基づいて、１６個の
ヌクレオチドからなるDNA(16-5'と16-3')の複合体およ
び２７個のヌクレオチドからなるDNAの複合体の間で生
じた化学シフトを示す。青で示した変化は２７個のヌク
レオチドからなるDNAの複合体における5'部位のDNA結合
ドメインについての変化に対応し、赤で示した変化は3'
部位のドメインについての変化に対応する。
ヌクレオチドからなるDNA(16-5'と16-3')の複合体およ
び２７個のヌクレオチドからなるDNAの複合体の間で生
じた化学シフトを示す。青で示した変化は２７個のヌク
レオチドからなるDNAの複合体における5'部位のDNA結合
ドメインについての変化に対応し、赤で示した変化は3'
部位のドメインについての変化に対応する。
【００６９】２個のDNA結合ドメインをリン酸ボックス
に割り当てる 図６は、DNA結合ドメインの３次構造上の有意な化学シ
フトの変化のマップを示す。図６（ａ）は、２７個のヌ
クレオチドからなるDNAの複合体における２個のDNA結合
ドメイン間の有意な変化を示す。図６（ｂ）および
（ｃ）は、それぞれ、5'部位のドメインおよび3'部位の
ドメインに同定することができた、１６個のヌクレオチ
ドからなるDNA(16-5'と16-3')の複合体および２７個の
ヌクレオチドからなるDNAの複合体間の有意な化学シフ
トの変化のマップを示す。ほとんどすべての有意な変化
を同定することができ、有意な変化は5'部位のドメイン
のC末端側のβヘアピン、3'部位のドメインのN末端側の
βシートと１番目のヘリックスの一部において観察され
た。
に割り当てる 図６は、DNA結合ドメインの３次構造上の有意な化学シ
フトの変化のマップを示す。図６（ａ）は、２７個のヌ
クレオチドからなるDNAの複合体における２個のDNA結合
ドメイン間の有意な変化を示す。図６（ｂ）および
（ｃ）は、それぞれ、5'部位のドメインおよび3'部位の
ドメインに同定することができた、１６個のヌクレオチ
ドからなるDNA(16-5'と16-3')の複合体および２７個の
ヌクレオチドからなるDNAの複合体間の有意な化学シフ
トの変化のマップを示す。ほとんどすべての有意な変化
を同定することができ、有意な変化は5'部位のドメイン
のC末端側のβヘアピン、3'部位のドメインのN末端側の
βシートと１番目のヘリックスの一部において観察され
た。
【００７０】このことは、明らかに、2個のDNA結合ドメ
インはタンデムにDNAに結合し、一つのDNA結合ドメイン
のC末端側のβヘアピンと、もう一つのDNA結合ドメイン
のN末端側のβシートと１番目のヘリックスの一部によ
って密接に接触していることを示している。図４は、１
６個のヌクレオチドからなるDNA複合体(16-5'と16-3')
において、N末端側のβシートは、DNAと複合体を形成す
ることにより、有意な化学シフトの変化を示さないこと
を示している。従って、２７個のヌクレオチドからなる
DNAの複合体において観察されたN末端側のβシート領域
における有意な化学シフトの変化は、２７個のヌクレオ
チドからなるDNA上の２個のDNA結合ドメイン間の相互作
用により生じたものである。図６（ｂ）および（ｃ）
は、リン酸ボックスを含む２７個のヌクレオチドからな
るDNA上の２個のDNA結合ドメイン間の密に接触する部位
を示している。
インはタンデムにDNAに結合し、一つのDNA結合ドメイン
のC末端側のβヘアピンと、もう一つのDNA結合ドメイン
のN末端側のβシートと１番目のヘリックスの一部によ
って密接に接触していることを示している。図４は、１
６個のヌクレオチドからなるDNA複合体(16-5'と16-3')
において、N末端側のβシートは、DNAと複合体を形成す
ることにより、有意な化学シフトの変化を示さないこと
を示している。従って、２７個のヌクレオチドからなる
DNAの複合体において観察されたN末端側のβシート領域
における有意な化学シフトの変化は、２７個のヌクレオ
チドからなるDNA上の２個のDNA結合ドメイン間の相互作
用により生じたものである。図６（ｂ）および（ｃ）
は、リン酸ボックスを含む２７個のヌクレオチドからな
るDNA上の２個のDNA結合ドメイン間の密に接触する部位
を示している。
【００７１】DNA結合ドメインと１６個のヌクレオチド
からなるDNA(16-5')との複合体において、いくつかのNO
Eシグナルが観察された。図７は、１６個のヌクレオチ
ドからなるDNA(16-5')によって分子間NOEを示す残基を
示す。これらのNOEに基づいて、我々は２７個のヌクレ
オチドからなるDNAに結合した2個のDNA結合ドメインの
モデルを構築して、図８に示した。着色した残基は２個
のタンデムなDNA結合ドメイン間の密な接触部位である
が、それらはこのモデル構造において互いにわずかに離
れている。これはPhoBの二量体の結合によるB型DNAのコ
ンフォメーションの変化を示唆している。我々の以前の
研究において、我々はPhoBのDNA結合ドメインの１８個
のヌクレオチドへの結合によるDNAのイミノプロトンの
化学シフトの変化を調べた10。有意な変化はTGTCA部位
の後の3'部分の広い範囲において観察され、それはDNA
のコンフォメーションの変化によって説明することがで
きた。２７個のヌクレオチドからなるDNAにおける２個
の認識TGTCA部位は１１塩基対離れており、それは、通
常のB型DNAの１ピッチよりわずかに大きい。２７個のヌ
クレオチドからなるDNA上の２個のDNA結合ドメイン間で
密接に接触するために、このDNA分子は曲がるのであろ
う。このことは、PhoBとDNAとの複合体のゲルデターデ
ーションアッセイによっても支持されている20。
からなるDNA(16-5')との複合体において、いくつかのNO
Eシグナルが観察された。図７は、１６個のヌクレオチ
ドからなるDNA(16-5')によって分子間NOEを示す残基を
示す。これらのNOEに基づいて、我々は２７個のヌクレ
オチドからなるDNAに結合した2個のDNA結合ドメインの
モデルを構築して、図８に示した。着色した残基は２個
のタンデムなDNA結合ドメイン間の密な接触部位である
が、それらはこのモデル構造において互いにわずかに離
れている。これはPhoBの二量体の結合によるB型DNAのコ
ンフォメーションの変化を示唆している。我々の以前の
研究において、我々はPhoBのDNA結合ドメインの１８個
のヌクレオチドへの結合によるDNAのイミノプロトンの
化学シフトの変化を調べた10。有意な変化はTGTCA部位
の後の3'部分の広い範囲において観察され、それはDNA
のコンフォメーションの変化によって説明することがで
きた。２７個のヌクレオチドからなるDNAにおける２個
の認識TGTCA部位は１１塩基対離れており、それは、通
常のB型DNAの１ピッチよりわずかに大きい。２７個のヌ
クレオチドからなるDNA上の２個のDNA結合ドメイン間で
密接に接触するために、このDNA分子は曲がるのであろ
う。このことは、PhoBとDNAとの複合体のゲルデターデ
ーションアッセイによっても支持されている20。
【００７２】DNAが曲がった後、２個のDNA結合ドメイン
は互いに密接に接触する。２個のＤＮＡ結合ドメインの
２番目と３番目のヘリックスの間の２本のループは曲が
ったＤＮＡの内側でRNAポリメラーゼに対する広い結合
面となる。それはRNAポリメラーゼのσ70サブユニット
の仮想の相互作用部位である。Phoレギュロンのプロモ
ーターであるpstSには１１塩基対離れた２個のタンデム
なリン酸ボックスがあるので、４個のPhoB結合部位がそ
の中でタンデムに位置している20。４個のPhoB分子はこ
れらの部位でタンデムに結合している可能性が高く、Ph
oBの協調的な結合によりDNAの大きな曲がりが誘導され
うる。DNAのこのコンフォメーションの変化は、RNAポリ
メラーゼのσ70サブユニットの相互作用に必要だろう。
は互いに密接に接触する。２個のＤＮＡ結合ドメインの
２番目と３番目のヘリックスの間の２本のループは曲が
ったＤＮＡの内側でRNAポリメラーゼに対する広い結合
面となる。それはRNAポリメラーゼのσ70サブユニット
の仮想の相互作用部位である。Phoレギュロンのプロモ
ーターであるpstSには１１塩基対離れた２個のタンデム
なリン酸ボックスがあるので、４個のPhoB結合部位がそ
の中でタンデムに位置している20。４個のPhoB分子はこ
れらの部位でタンデムに結合している可能性が高く、Ph
oBの協調的な結合によりDNAの大きな曲がりが誘導され
うる。DNAのこのコンフォメーションの変化は、RNAポリ
メラーゼのσ70サブユニットの相互作用に必要だろう。
【００７３】材料と方法
PhoBのDNA結合ドメインのサンプル調製
PhoBの残基126-229に相当する、DNA結合ドメインの遺伝
子配列をpT7-7発現ベクターに挿入した。このプラスミ
ドを大腸菌BL21(DE3)に導入した。この大腸菌を３７℃
で[15N]塩化アンモニウムおよび[13C]グルコース含有M9
最小培地で培養した。部分的に重水素化したサンプルを
得るために、大腸菌を60%2H2Oの存在下で培養した。OD
600=1.0のときに1mMのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド(IPTG)を添加した。3.0時間後、
大腸菌を回収した。大腸菌のペレットを50mMリン酸緩衝
液(pH 7.0)、1mM PMSF、10mM EDTAおよび10mMジチオト
レイトール(DTT)中に再懸濁した。細胞を氷上で超音波
処理により破砕して遠心分離し、上清を60%硫酸アンモ
ニウム沈殿させた。沈殿を50mMリン酸緩衝液(pH 7.0, 1
mM EDTA)に溶解し、50mMリン酸緩衝液(pH 5.0, 1mM EDT
A)で透析し、CMセルロースカラム(CM52, Whatman)にか
けた。タンパク質サンプルを50mM〜200mMのリン酸緩衝
液直線勾配により溶離させた。タンパク質サンプルを含
有する画分を集め、硫酸アンモニウム(80%)を添加して
沈殿させた。沈殿を50mMリン酸緩衝液(pH6.8, 500mM Na
Cl)に溶解してから、Superdex 75(Pharmacia)にかけ、
サンプル画分を集めた。
子配列をpT7-7発現ベクターに挿入した。このプラスミ
ドを大腸菌BL21(DE3)に導入した。この大腸菌を３７℃
で[15N]塩化アンモニウムおよび[13C]グルコース含有M9
最小培地で培養した。部分的に重水素化したサンプルを
得るために、大腸菌を60%2H2Oの存在下で培養した。OD
600=1.0のときに1mMのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド(IPTG)を添加した。3.0時間後、
大腸菌を回収した。大腸菌のペレットを50mMリン酸緩衝
液(pH 7.0)、1mM PMSF、10mM EDTAおよび10mMジチオト
レイトール(DTT)中に再懸濁した。細胞を氷上で超音波
処理により破砕して遠心分離し、上清を60%硫酸アンモ
ニウム沈殿させた。沈殿を50mMリン酸緩衝液(pH 7.0, 1
mM EDTA)に溶解し、50mMリン酸緩衝液(pH 5.0, 1mM EDT
A)で透析し、CMセルロースカラム(CM52, Whatman)にか
けた。タンパク質サンプルを50mM〜200mMのリン酸緩衝
液直線勾配により溶離させた。タンパク質サンプルを含
有する画分を集め、硫酸アンモニウム(80%)を添加して
沈殿させた。沈殿を50mMリン酸緩衝液(pH6.8, 500mM Na
Cl)に溶解してから、Superdex 75(Pharmacia)にかけ、
サンプル画分を集めた。
【００７４】２個のDNA結合ドメインと２７個のヌクレ
オチドからなるDNAとの３重複合体のNMR実験 ２７個のヌクレオチドからなる２本鎖オリゴヌクレオチ
ド5'-ACTGTCATAAATCTGTCACCTGTTTGT-3'（配列番号１）
に、均一に13C, 15Nで標識し、部分的に60%2Hで標識し
たPhoBのDNA結合ドメインを２倍量で添加することによ
り、３重タンパク質−DNA複合体を調製した。NMR実験用
のサンプル溶液には、1.0mMの複合体がH 2O/2H2O(90%/10
%)中の10mMリン酸緩衝液(pH 6.8)に含まれていた。三重
共鳴勾配プローブを備えたBruker Avance 600分光計を
用いて、すべてのNMR実験を310Kで行った。データの処
理と分析はnmrPipe25およびPIPP26ソフトウェアを用い
て行った。タンパク質骨格の1H, 13Cおよび15N共鳴の同
定については、TROSYを用いた三重共鳴実験、1H-15N TR
OSY23, TROSY-HNCA, TROSY-HN(CO)CA, TROSY-HNCOおよ
びTROSY-HN(CA)CO24を記録した。
オチドからなるDNAとの３重複合体のNMR実験 ２７個のヌクレオチドからなる２本鎖オリゴヌクレオチ
ド5'-ACTGTCATAAATCTGTCACCTGTTTGT-3'（配列番号１）
に、均一に13C, 15Nで標識し、部分的に60%2Hで標識し
たPhoBのDNA結合ドメインを２倍量で添加することによ
り、３重タンパク質−DNA複合体を調製した。NMR実験用
のサンプル溶液には、1.0mMの複合体がH 2O/2H2O(90%/10
%)中の10mMリン酸緩衝液(pH 6.8)に含まれていた。三重
共鳴勾配プローブを備えたBruker Avance 600分光計を
用いて、すべてのNMR実験を310Kで行った。データの処
理と分析はnmrPipe25およびPIPP26ソフトウェアを用い
て行った。タンパク質骨格の1H, 13Cおよび15N共鳴の同
定については、TROSYを用いた三重共鳴実験、1H-15N TR
OSY23, TROSY-HNCA, TROSY-HN(CO)CA, TROSY-HNCOおよ
びTROSY-HN(CA)CO24を記録した。
【００７５】一つのDNA結合ドメインと１６個のヌクレ
オチドからなるDNA(16-5'と16-3')との複合体のNMR実験 １６個のヌクレオチドからなる２本鎖オリゴヌクレオチ
ド5'-ACTGTCATAAATCTGT-3' （配列番号４）(16-5')と5'
-TCTGTCACCTGTTTGT-3' （配列番号５）（16-3'）の各々
を１：１で、均一に13C, 15Nで標識して、部分的に60%2
Hで標識したPhoBのDNA結合ドメインに添加することによ
り、タンパク質−DNA複合体を調製した。NMR実験用のサ
ンプル溶液は、2.0mMの複合体がH2O/2H2O(90%/10%)また
は2H2O中の10mMリン酸カリウム緩衝液(pH 6.8)中に含ま
れていた。三重共鳴勾配プローブを備えたBruker Avanc
e 600またはDMX-600分光計のいずれかを用いて、すべて
のNMR実験を310Kで行った。データの処理と分析は、nmr
Pipe25およびPIPP26ソフトウェアを用いて行った。タン
パク質骨格の1H, 13Cおよび15N共鳴の同定については、
三重共鳴実験、HNCA、HN(CO)CA27を記録した。タンパク
質側鎖の1H, 13Cおよび15N共鳴の同定については、CBCA
(CO)NH, CBCANH, HBHA(CO)NH28,29, C(CO)NH, H(CCO)NH
30, HCCH-TOCSY31, (HB)CB(CDCG)HG, (HB)CB(CDCGCE)HE
32実験を記録した。タンパク質−DNA分子間NOEを得るた
めに、13C/15Nフィルター15N編集NOESY, 13C編集13Cフ
ィルターNOESY33を記録した。
オチドからなるDNA(16-5'と16-3')との複合体のNMR実験 １６個のヌクレオチドからなる２本鎖オリゴヌクレオチ
ド5'-ACTGTCATAAATCTGT-3' （配列番号４）(16-5')と5'
-TCTGTCACCTGTTTGT-3' （配列番号５）（16-3'）の各々
を１：１で、均一に13C, 15Nで標識して、部分的に60%2
Hで標識したPhoBのDNA結合ドメインに添加することによ
り、タンパク質−DNA複合体を調製した。NMR実験用のサ
ンプル溶液は、2.0mMの複合体がH2O/2H2O(90%/10%)また
は2H2O中の10mMリン酸カリウム緩衝液(pH 6.8)中に含ま
れていた。三重共鳴勾配プローブを備えたBruker Avanc
e 600またはDMX-600分光計のいずれかを用いて、すべて
のNMR実験を310Kで行った。データの処理と分析は、nmr
Pipe25およびPIPP26ソフトウェアを用いて行った。タン
パク質骨格の1H, 13Cおよび15N共鳴の同定については、
三重共鳴実験、HNCA、HN(CO)CA27を記録した。タンパク
質側鎖の1H, 13Cおよび15N共鳴の同定については、CBCA
(CO)NH, CBCANH, HBHA(CO)NH28,29, C(CO)NH, H(CCO)NH
30, HCCH-TOCSY31, (HB)CB(CDCG)HG, (HB)CB(CDCGCE)HE
32実験を記録した。タンパク質−DNA分子間NOEを得るた
めに、13C/15Nフィルター15N編集NOESY, 13C編集13Cフ
ィルターNOESY33を記録した。
【００７６】［実施例２］ テロメアＤＮＡに結合した
ＴＲＦ１のタンデムな二量体のモデル構築 １．ＤＮＡの調製材料 13 C,15N 標識 dNTP13 C,15N標識 2'-デオキシリボヌクレオチド5'-トリリン
酸（以下、「 dNTPs-1 3C,15N」という）は、アイソテッ
クインク（オハイオ州デイトン 米国）から購入した。 鋳型およびプライマーDNA 以下のオリゴヌクレオチドを北海道システムサイエンス
社（北海道西区発寒）より購入した。 5'−CTAACCCTAACCCTA−3' （１）（配列番号７） 5'−TAGGGTT−3' （２）（配列番号
８） DNA合成酵素 DNA合成酵素は純正化学（東京中央区日本橋）より購入
した。
ＴＲＦ１のタンデムな二量体のモデル構築 １．ＤＮＡの調製材料 13 C,15N 標識 dNTP13 C,15N標識 2'-デオキシリボヌクレオチド5'-トリリン
酸（以下、「 dNTPs-1 3C,15N」という）は、アイソテッ
クインク（オハイオ州デイトン 米国）から購入した。 鋳型およびプライマーDNA 以下のオリゴヌクレオチドを北海道システムサイエンス
社（北海道西区発寒）より購入した。 5'−CTAACCCTAACCCTA−3' （１）（配列番号７） 5'−TAGGGTT−3' （２）（配列番号
８） DNA合成酵素 DNA合成酵素は純正化学（東京中央区日本橋）より購入
した。
【００７７】 13C,15N 標識DNA調製方法 13
C,15N 標識DNAは以下の文献に従って調製した。
Journal of Biomolecular NMR, 10 (1997) 245-254
Deborah E. Smith, Jin-Yuan Su and Fiona M. Jucker
Efficient enzymatic synthesis of 13C,15N-labeled D
NA for NMR studies
NA for NMR studies
【００７８】上記文献に記述されている調製方法によ
り、上記（１）（２）のDNAを使って、以下の13C,15N
標識DNAを得た。 5'−TAGGGTTA*G*G*G*T*T*A*G*−3' （右肩に*を付した
塩基は15Nおよび13Cで標識されている）（３）（配列番
号６）
り、上記（１）（２）のDNAを使って、以下の13C,15N
標識DNAを得た。 5'−TAGGGTTA*G*G*G*T*T*A*G*−3' （右肩に*を付した
塩基は15Nおよび13Cで標識されている）（３）（配列番
号６）
【００７９】２．テロメアＤＮＡ結合因子ＴＲＦ１のDN
A結合ドメインの調製 ヒトTRF1のDNA結合ドメインは、アミノ酸371番〜439番
で、N末端にメチオニンを付加して、ベクターpET13A(Ge
rchman et al., 1994)を用いて、大腸菌BL21(DE3)pLysS
(Novagen)に大量発現させた。大腸菌を３７℃で培養し
て、OD600が0.4となったところで、タンパク質発現を誘
導するために1mMのイソプロピル−１−チオ−β−D−ガ
ラクトピラノシド（IPTG）を加えた。添加後３時間培養
し、大腸菌を集めて、バッファーA(50 mM Tris-HCl, pH
8.0, 5 mM EDTA, 1mM PMSF, 1mMベンズアミジン及び5%
グリセロール)に懸濁した。安定同位体でラベルするた
めには、15NH4Cl(0.15%)及び／又は[13C]-グルコース
（0.2%）を含むM9最小培地を培養に使った。大腸菌は氷
上で超音波で破砕し、遠心して集めた。上清を次の精製
のために使った。DNA結合ドメインはイオン交換クロマ
トグラフィー（P11, CM52; Whatman）、ゲル濾過(Super
dex 75; Pharmacia)及び疎水（Phenyl sepharose; Phar
macia）カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
サンプルの同定と純度は、MALDI-TOF質量分析法と電気
泳動法によって確認した。
A結合ドメインの調製 ヒトTRF1のDNA結合ドメインは、アミノ酸371番〜439番
で、N末端にメチオニンを付加して、ベクターpET13A(Ge
rchman et al., 1994)を用いて、大腸菌BL21(DE3)pLysS
(Novagen)に大量発現させた。大腸菌を３７℃で培養し
て、OD600が0.4となったところで、タンパク質発現を誘
導するために1mMのイソプロピル−１−チオ−β−D−ガ
ラクトピラノシド（IPTG）を加えた。添加後３時間培養
し、大腸菌を集めて、バッファーA(50 mM Tris-HCl, pH
8.0, 5 mM EDTA, 1mM PMSF, 1mMベンズアミジン及び5%
グリセロール)に懸濁した。安定同位体でラベルするた
めには、15NH4Cl(0.15%)及び／又は[13C]-グルコース
（0.2%）を含むM9最小培地を培養に使った。大腸菌は氷
上で超音波で破砕し、遠心して集めた。上清を次の精製
のために使った。DNA結合ドメインはイオン交換クロマ
トグラフィー（P11, CM52; Whatman）、ゲル濾過(Super
dex 75; Pharmacia)及び疎水（Phenyl sepharose; Phar
macia）カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
サンプルの同定と純度は、MALDI-TOF質量分析法と電気
泳動法によって確認した。
【００８０】３．テロメアＤＮＡ結合因子ＴＲＦ１のDN
A結合ドメインとDNAとの複合体の作製 （１）のＤＮＡと（３）の13C,15N 標識ＤＮＡを50 mM
リン酸カリウムバッファー（pH 6.8）中で９０℃から徐
々に温度を下げて巻き戻す。試料の純度はゲル濾過によ
って確認する。
A結合ドメインとDNAとの複合体の作製 （１）のＤＮＡと（３）の13C,15N 標識ＤＮＡを50 mM
リン酸カリウムバッファー（pH 6.8）中で９０℃から徐
々に温度を下げて巻き戻す。試料の純度はゲル濾過によ
って確認する。
【００８１】DNA結合ドメインとDNAとの複合体は、タン
パク質にDNA溶液を徐々に等量になるまで加えることに
よって得る。沈殿物が出るのを避けるために、タンパク
質及びDNAは、100 mM NaClを含有する50 mMリン酸カリ
ウム緩衝液（pH 6.8）に溶かし、試料の濃度は、混合前
には1 mM以下に抑える。さらに、NMR実験のために、そ
の溶液を濃縮して、3kDaカットオフメンブレンを持った
centricon(Amicon)で塩強度を薄める。
パク質にDNA溶液を徐々に等量になるまで加えることに
よって得る。沈殿物が出るのを避けるために、タンパク
質及びDNAは、100 mM NaClを含有する50 mMリン酸カリ
ウム緩衝液（pH 6.8）に溶かし、試料の濃度は、混合前
には1 mM以下に抑える。さらに、NMR実験のために、そ
の溶液を濃縮して、3kDaカットオフメンブレンを持った
centricon(Amicon)で塩強度を薄める。
【００８２】４．ＮＭＲ実験
上記のようにして作製した複合体について、以下のＮＭ
Ｒ測定を行う。 3D CBCA(CO)NH 3D CBCANH 3D HBHA(CO)NH 3D C(CO)NH 3D H(CCO)NH 3D TROSY-HNCO(hydrogen bond) 3D HCCH-TOCSY 2D (HB)CB(CDCG)HG 2D (HB)CB(CDCGCE)HE 3D HNHB 3D HN(CO) HB 3D HNHA 2D 15N-spin echo difference CT-HSQC 4D 13C-edited(F1) 15N-edited(F3) HMQC-NOESY-HSQC 4D 13C-edited(F1) 13C-edited(F3) HMQC-NOESY-HSQC 3D 15N-edited(F1) 15N-edited(F2) HMQC-NOESY-HSQC 2D 13C/15N-filtered(F1,F2) NOESY 2D 13C-filtered(F1,F2) NOESY 2D 13C-filtered(F1) DQF-COSY 2D 13C-filtered(F1) TOCSY 3D 13C/15N-filtered(F1) 15N-edited(F2) NOESY-HSQC 3D 15N-edited(F2) NOESY-HSQC 3D 13C-edited(F1) HSQC-NOESY 3D 13C-edited(F1) 13C-filtered(F3) HSQC-NOESY
Ｒ測定を行う。 3D CBCA(CO)NH 3D CBCANH 3D HBHA(CO)NH 3D C(CO)NH 3D H(CCO)NH 3D TROSY-HNCO(hydrogen bond) 3D HCCH-TOCSY 2D (HB)CB(CDCG)HG 2D (HB)CB(CDCGCE)HE 3D HNHB 3D HN(CO) HB 3D HNHA 2D 15N-spin echo difference CT-HSQC 4D 13C-edited(F1) 15N-edited(F3) HMQC-NOESY-HSQC 4D 13C-edited(F1) 13C-edited(F3) HMQC-NOESY-HSQC 3D 15N-edited(F1) 15N-edited(F2) HMQC-NOESY-HSQC 2D 13C/15N-filtered(F1,F2) NOESY 2D 13C-filtered(F1,F2) NOESY 2D 13C-filtered(F1) DQF-COSY 2D 13C-filtered(F1) TOCSY 3D 13C/15N-filtered(F1) 15N-edited(F2) NOESY-HSQC 3D 15N-edited(F2) NOESY-HSQC 3D 13C-edited(F1) HSQC-NOESY 3D 13C-edited(F1) 13C-filtered(F3) HSQC-NOESY
【００８３】
【発明の効果】本発明により、多重複合体の水素原子の
化学シフトを帰属することができるようになった。 引用文献
化学シフトを帰属することができるようになった。 引用文献
【００８４】
【表１】
【００８５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Nishimura, Yoshifumi
NIPPON SANSO CORPORATION
<120> A method for identifying chemical shifts of a multiple
complex, a method for analyzing the steric structure of
a multiple complex, a method for constructing a model
of a multiple complex, novel nucleic acid molecules and reagents
<130> P01-052
<140>
<141>
<160> 8
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 1
actgtcataa atctgtcacc tgtttgt 27
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 2
ctgtcataaa tctgtcac 18
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 3
actgtcataa atc 13
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 4
actgtcataa atctgt 16
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 5
tctgtcacct gtttgt 16
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 6
tagggttagg gttag 15
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 7
ctaaccctaa cccta 15
<210> 8
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA
<400> 8
tagggtt 7
【００８６】
【配列番号１】配列番号１は、ＰｈｏＢの２個の認識配
列TGTCA部位を含む、２７個のヌクレオチドからなるＤ
ＮＡの塩基配列を示す。
列TGTCA部位を含む、２７個のヌクレオチドからなるＤ
ＮＡの塩基配列を示す。
【００８７】
【配列番号２】配列番号２は、ＰｈｏＢの２個の認識配
列TGTCA部位を含む、１８個のヌクレオチドからなるＤ
ＮＡの塩基配列を示す。
列TGTCA部位を含む、１８個のヌクレオチドからなるＤ
ＮＡの塩基配列を示す。
【００８８】
【配列番号３】配列番号３は、ＰｈｏＢの１個の認識配
列TGTCA部位を含む、１３個のヌクレオチドからなるＤ
ＮＡの塩基配列を示す。
列TGTCA部位を含む、１３個のヌクレオチドからなるＤ
ＮＡの塩基配列を示す。
【００８９】
【配列番号４】配列番号４は、ＰｈｏＢの１個の認識配
列TGTCA部位を含む、１６個のヌクレオチドからなるＤ
ＮＡ（16-5'）の塩基配列を示す。
列TGTCA部位を含む、１６個のヌクレオチドからなるＤ
ＮＡ（16-5'）の塩基配列を示す。
【００９０】
【配列番号５】配列番号５は、ＰｈｏＢの１個の認識配
列TGTCA部位を含む、１６個のヌクレオチドからなるＤ
ＮＡ（16-3'）の塩基配列を示す。
列TGTCA部位を含む、１６個のヌクレオチドからなるＤ
ＮＡ（16-3'）の塩基配列を示す。
【００９１】
【配列番号６】配列番号６は、ＴＲＦ１の２個の認識配
列AGGGTT部位を含む、１５個のヌクレオチドからなるＤ
ＮＡの塩基配列を示す。
列AGGGTT部位を含む、１５個のヌクレオチドからなるＤ
ＮＡの塩基配列を示す。
【００９２】
【配列番号７】配列番号７は、配列番号６の塩基配列を
有するＤＮＡの相補鎖の塩基配列を示す。
有するＤＮＡの相補鎖の塩基配列を示す。
【００９３】
【配列番号８】配列番号８は、配列番号６の塩基配列を
有するＤＮＡを調製するために使用するプライマーの塩
基配列を示す。
有するＤＮＡを調製するために使用するプライマーの塩
基配列を示す。
【図１】２７個のヌクレオチドからなるDNAに結合したP
hoBの２個のDNA結合ドメインの 1H-15N TROSYスペクト
ル。
hoBの２個のDNA結合ドメインの 1H-15N TROSYスペクト
ル。
【図２】１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-5')に結
合したPhoBのDNA結合ドメインの1H-15N TROSYスペクト
ル。
合したPhoBのDNA結合ドメインの1H-15N TROSYスペクト
ル。
【図３】１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-3')に結
合したPhoBのDNA結合ドメインの1H-15N TROSYスペクト
ル。
合したPhoBのDNA結合ドメインの1H-15N TROSYスペクト
ル。
【図４】DNAに結合していない状態とDNAに結合した状態
でのPhoBのDNA結合ドメインの化学シフトの変化のまと
め。 （ａ）１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-5')との複
合体形成によるPhoBのDNA結合ドメインのアミドプロト
ンおよび窒素原子の化学シフトの変化。残基あたりのプ
ロトンの化学シフトの変化（Δδ(1H)）および窒素の化
学シフトの変化（Δδ(1５N)）は以下の方程式を用いて
平均化する。 [{Δδ(1H)}2+{Δδ(1５N)/αN}2]1/2 式中、αN=7 （ｂ）２７個のヌクレオチドからなるDNAとの複合体形
成によるPhoBの２個のDNA結合ドメインのアミドプロト
ンおよび窒素原子の化学シフトの変化。残基毎の２本の
棒は、２７個のヌクレオチドからなるDNAの２個のDNA結
合ドメインに由来する。プロトンの化学シフトの変化お
よび窒素の化学シフトの変化は（ａ）と同様にして平均
化する。配列上の矢印は、２７個のヌクレオチドからな
るDNA上のDNA結合ドメインの各々を順次うまく同定でき
たものを示す。 （ｃ）（ｂ）で観測された２個のＤＮＡ結合ドメインの
間の化学シフトの変化。残基あたりのプロトンの化学シ
フトの変化および窒素の化学シフトの変化は（ａ）と同
様にして平均化する。 （ｄ）PhoBのＤＮＡ結合ドメインと１６個のヌクレオチ
ドからなるＤＮＡの16-5'と16-3'との複合体の間の化学
シフトの変化。残基あたりのプロトンの化学シフトの変
化および窒素の化学シフトの変化は（ａ）と同様にして
平均化する。 （ｅ）１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-3')との複
合体形成によるPhoBのDNA結合ドメインのアミドプロト
ンおよび窒素原子の化学シフトの変化。残基あたりのプ
ロトンの化学シフトの変化および窒素の化学シフトの変
化は（ａ）と同様にして平均化する。
でのPhoBのDNA結合ドメインの化学シフトの変化のまと
め。 （ａ）１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-5')との複
合体形成によるPhoBのDNA結合ドメインのアミドプロト
ンおよび窒素原子の化学シフトの変化。残基あたりのプ
ロトンの化学シフトの変化（Δδ(1H)）および窒素の化
学シフトの変化（Δδ(1５N)）は以下の方程式を用いて
平均化する。 [{Δδ(1H)}2+{Δδ(1５N)/αN}2]1/2 式中、αN=7 （ｂ）２７個のヌクレオチドからなるDNAとの複合体形
成によるPhoBの２個のDNA結合ドメインのアミドプロト
ンおよび窒素原子の化学シフトの変化。残基毎の２本の
棒は、２７個のヌクレオチドからなるDNAの２個のDNA結
合ドメインに由来する。プロトンの化学シフトの変化お
よび窒素の化学シフトの変化は（ａ）と同様にして平均
化する。配列上の矢印は、２７個のヌクレオチドからな
るDNA上のDNA結合ドメインの各々を順次うまく同定でき
たものを示す。 （ｃ）（ｂ）で観測された２個のＤＮＡ結合ドメインの
間の化学シフトの変化。残基あたりのプロトンの化学シ
フトの変化および窒素の化学シフトの変化は（ａ）と同
様にして平均化する。 （ｄ）PhoBのＤＮＡ結合ドメインと１６個のヌクレオチ
ドからなるＤＮＡの16-5'と16-3'との複合体の間の化学
シフトの変化。残基あたりのプロトンの化学シフトの変
化および窒素の化学シフトの変化は（ａ）と同様にして
平均化する。 （ｅ）１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-3')との複
合体形成によるPhoBのDNA結合ドメインのアミドプロト
ンおよび窒素原子の化学シフトの変化。残基あたりのプ
ロトンの化学シフトの変化および窒素の化学シフトの変
化は（ａ）と同様にして平均化する。
【図５】１６個のヌクレオチドからなるDNA(16-5'と16-
3')との複合体形成および２７個のヌクレオチドからな
るDNAとの複合体形成との間のPhoBのDNA結合ドメインの
化学シフトの変化のまとめ。２７個のヌクレオチドから
なるDNA上の２個のドメイン間の有意な化学シフトの変
化を示す多くの残基を含む領域を示す。左と右の棒は、
それぞれ、5'部位のドメインの変化および3'部位のドメ
インの変化を示す。
3')との複合体形成および２７個のヌクレオチドからな
るDNAとの複合体形成との間のPhoBのDNA結合ドメインの
化学シフトの変化のまとめ。２７個のヌクレオチドから
なるDNA上の２個のドメイン間の有意な化学シフトの変
化を示す多くの残基を含む領域を示す。左と右の棒は、
それぞれ、5'部位のドメインの変化および3'部位のドメ
インの変化を示す。
【図６】化学シフトの変化のまとめ。
（ａ）２７個のヌクレオチドからなるDNAの複合体にお
ける２個のDNA結合ドメイン間の有意な化学シフトの変
化（＞0.1ppm）を示す残基。プロトンの化学シフトの変
化と窒素の化学シフトの変化を図３と同じ方程式を用い
て平均化する。 （ｂ），（ｃ）図４に基づく、１６個のヌクレオチドか
らなるDNA(16-5'と16-3')の複合体中のドメインおよび
２７個のヌクレオチドからなるDNAの複合体における5'
部位のDNA結合ドメイン（ｂ）または3'部位のDNA結合ド
メイン（ｃ）間の有意な化学シフトの変化（＞0.1ppm）
を示す残基。これらの図はすべてMOLSCRIPT3 4プログラ
ムを用いて描いた。
ける２個のDNA結合ドメイン間の有意な化学シフトの変
化（＞0.1ppm）を示す残基。プロトンの化学シフトの変
化と窒素の化学シフトの変化を図３と同じ方程式を用い
て平均化する。 （ｂ），（ｃ）図４に基づく、１６個のヌクレオチドか
らなるDNA(16-5'と16-3')の複合体中のドメインおよび
２７個のヌクレオチドからなるDNAの複合体における5'
部位のDNA結合ドメイン（ｂ）または3'部位のDNA結合ド
メイン（ｃ）間の有意な化学シフトの変化（＞0.1ppm）
を示す残基。これらの図はすべてMOLSCRIPT3 4プログラ
ムを用いて描いた。
【図７】１６個のヌクレオチドからなるDNAの複合体に
おいてタンパク質−DNA分子間NOEが観察された残基。こ
の図はMOLSCRIPT34プログラムを用いて描いた。
おいてタンパク質−DNA分子間NOEが観察された残基。こ
の図はMOLSCRIPT34プログラムを用いて描いた。
【図８】２７個のヌクレオチドからなるDNA上の２個のD
NA結合ドメインの複合体のモデル構造。DNAの構造は通
常のB形であると仮定した。黒塗りの残基は図５（ｂ）
および（ｃ）と同様である。DNAのコンフォメーション
の変化を最適化する試みは行わなかった。この図はMOLS
CRIPT34プログラムを用いて描いた。
NA結合ドメインの複合体のモデル構造。DNAの構造は通
常のB形であると仮定した。黒塗りの残基は図５（ｂ）
および（ｃ）と同様である。DNAのコンフォメーション
の変化を最適化する試みは行わなかった。この図はMOLS
CRIPT34プログラムを用いて描いた。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＴＤ
Ｇ０１Ｒ 33/28 Ｇ０１Ｎ 24/08 ５１０Ｄ
24/02 Ｂ
(72)発明者 横山 順
東京都港区西新橋１丁目16番７号 日本酸
素株式会社内
(72)発明者 細野 和美
東京都港区西新橋１丁目16番７号 日酸総
合サービス株式会社内
Ｆターム(参考） 2G045 DA13 FA36 JA01
4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 CA20
HA01 HA11 HA20
4B063 QA11 QQ42 QQ52 QQ79 QR32
QR35 QR38 QR56 QS03 QS39
QX10
Claims (11)
- 【請求項１】 ２個以上の同種の分子が同種の結合様式
で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合している多
重複合体の化学シフトを同定する方法であって、 (a)２個以上の同種の分子が同種の結合様式で１個の高
分子にそれぞれ異なる部位で結合している多重複合体で
あって、該多重複合体を構成する高分子において、一方
の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的環境が他
方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的環境と
相違している前記多重複合体を用意し、 (b)(a)の多重複合体の化学シフトを測定し、 (c)下記の(i)または(ii)のいずれかの測定値を得、 (i) (a)の多重複合体を構成している高分子の両末端側
の結合部位の化学的環境の相違により差が生じる、ＮＭ
Ｒで得られる測定値、または(ii) (a)の多重複合体にお
いて１個の分子が一方の末端側で高分子に結合している
部分に相当する単一複合体の化学的環境と(a)の多重複
合体において１個の分子が他方の末端側で高分子に結合
している部分に相当する単一複合体の化学的環境との相
違により差が生じる、ＮＭＲで得られる測定値 (d)(c)で得た測定値に基づいて、(b)で測定した化学シ
フトを同定することを含む、前記の方法。 - 【請求項２】 (a)の多重複合体を構成している高分子
の両末端側の結合部位の化学的環境の相違が、結合部位
の前および／または後の１個以上の原子の種類の相違で
あり、(c)で得る測定値が、(a)の多重複合体において１
個の分子が一方の末端側で高分子に結合している部分に
相当する単一複合体の化学シフトおよび(a)の多重複合
体において１個の分子が他方の末端側で高分子に結合し
ている部分に相当する単一複合体の化学シフトである請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 (a)の多重複合体を構成している高分子
の両末端側の結合部位の化学的環境の相違が、結合部位
の窒素および炭素原子の核種の相違であり、(c)で得る
測定値が、(a)の多重複合体の核オーバーハウザー効果
である請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の方法を
利用して、２個以上の同種の分子が同種の結合様式で１
個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合している多重複
合体の立体構造を解析する方法。 - 【請求項５】 請求項１〜３のいずれかに記載の方法を
利用して、２個以上の同種の分子が同種の結合様式で１
個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合している多重複
合体のモデルを構築する方法。 - 【請求項６】 下記の塩基配列(I)を有する核酸分子。 5'-R1TGTCAR2-3' (I) （塩基配列(I)中、R1は塩基数１〜１００の塩基配列で
あり、R２は塩基数２〜１００の塩基配列であり、R1お
よびR２の塩基配列の各塩基は、アデニン、グアニン、
チミン及びシトシンからなる群より選択され、Tはチミ
ン、Gはグアニン、Cはチミン、Aはアデニンである） - 【請求項７】 下記の塩基配列(II)を有する核酸分子。 5'-R3TGTCAR4TGTCAR5-3' (II) （塩基配列(II)中、R3は塩基数１〜１００個の塩基配列
であり、R4は塩基数２〜５０個の塩基配列であり、R5は
塩基数２〜１００個の塩基配列であり、R3、R4およびR5
の塩基配列の各塩基は、アデニン、グアニン、チミン及
びシトシンからなる群より選択され、Tはチミン、Gはグ
アニン、Cはチミン、Aはアデニンである） - 【請求項８】 下記の塩基配列(III)を有する核酸分
子。 5'-R6 AGGGTTR7 AGGGTTR8-3' (III) （塩基配列(III)中、R6は塩基数１〜１００個の塩基配
列であり、R7は塩基数０〜５０個の塩基配列であり、R8
は塩基数１〜１００個の塩基配列であり、R6、R7および
R8の塩基配列の各塩基は、アデニン、グアニン、チミン
及びシトシンからなる群より選択され、Tはチミン、Gは
グアニン、Cはチミン、Aはアデニンであり、２箇所の下
線部の両方または片方の塩基において、窒素が15Nで標
識され、かつ炭素が13Cで標識されているか、窒素のみ
が15Nで標識されているか、あるいは炭素のみが13Cで標
識されている） - 【請求項９】 ２個以上の同種の分子が同種の結合様式
で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合している多
重複合体を形成することができる高分子であって、一方
の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的環境が他
方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的環境と
相違している前記高分子を含む、２個以上の同種の分子
が同種の結合様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位
で結合している多重複合体の化学シフトを同定するため
の試薬。 - 【請求項１０】 ２個以上の同種の分子が同種の結合様
式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合している
多重複合体を形成することができる高分子であって、一
方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的環境が
他方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的環境
と相違している前記高分子を含む、２個以上の同種の分
子が同種の結合様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部
位で結合している多重複合体の立体構造を解析するため
の試薬。 - 【請求項１１】 ２個以上の同種の分子が同種の結合様
式で１個の高分子にそれぞれ異なる部位で結合している
多重複合体を形成することができる高分子であって、一
方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的環境が
他方の末端側で１個の分子と結合する部位の化学的環境
と相違している前記高分子を含む、２個以上の同種の分
子が同種の結合様式で１個の高分子にそれぞれ異なる部
位で結合している多重複合体のモデルを構築するための
試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002093949A JP2003294819A (ja) | 2002-03-29 | 2002-03-29 | 多重複合体の化学シフトを同定する方法、多重複合体の立体構造を解析する方法、多重複合体のモデルを構築する方法、新規核酸分子及び試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002093949A JP2003294819A (ja) | 2002-03-29 | 2002-03-29 | 多重複合体の化学シフトを同定する方法、多重複合体の立体構造を解析する方法、多重複合体のモデルを構築する方法、新規核酸分子及び試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003294819A true JP2003294819A (ja) | 2003-10-15 |
Family
ID=29238176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002093949A Pending JP2003294819A (ja) | 2002-03-29 | 2002-03-29 | 多重複合体の化学シフトを同定する方法、多重複合体の立体構造を解析する方法、多重複合体のモデルを構築する方法、新規核酸分子及び試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003294819A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006082963A1 (ja) * | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | 標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物との結合検出方法 |
| JP2007255910A (ja) * | 2006-03-20 | 2007-10-04 | Hokkaido Univ | Ｎｍｒシグナルの帰属方法 |
| JP2009506313A (ja) * | 2005-08-24 | 2009-02-12 | アイシス イノヴェーション リミテッド | 群知能を伴う生体分子構造決定 |
-
2002
- 2002-03-29 JP JP2002093949A patent/JP2003294819A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006082963A1 (ja) * | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | 標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物との結合検出方法 |
| JP2009506313A (ja) * | 2005-08-24 | 2009-02-12 | アイシス イノヴェーション リミテッド | 群知能を伴う生体分子構造決定 |
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