JP2007255910A - Nmrシグナルの帰属方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】1)n個のアミノ酸残基からなるポリペプチドPnのアミノ酸配列X1−・・・−Xnを決定し、2)決定したアミノ酸配列X1−・・・−Xnからなる安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチドPnの混合物を合成する。3)更に、アミノ酸X1、X2、・・・Xnにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルx1’、x2’、・・・xn’を用いて、1)で決定したアミノ酸配列X1−・・・−Xnからなる安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチドPn’の混合物を合成する。2)で合成したポリペプチドPnの混合物と3)で合成したポリペプチドPn’の混合物についてそれぞれNMR測定を行い、対応するシグナル間のシグナル強度比を計算して各シグナルの帰属を決定する。
【選択図】なし
Description
Yabuki, T. et al., J. Biomol. NMR,、1998年、第11巻、第295−306頁
1)n個のアミノ酸残基からなるポリペプチドPnのアミノ酸配列X1−・・・−Xnを決定する工程、ここでXは任意のアミノ酸を、nは2以上の任意の整数を示す、
2)アミノ酸X1、X2、・・・Xnにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルx1、x2、・・・xnを用いて、1)で決定したアミノ酸配列X1−・・・−Xnからなる安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチドPnの混合物を合成する工程、ここで該カクテルは安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素でラベル化されていないアミノ酸との混合物であり、かつ前記ポリペプチドPnを対象としたNMR測定で得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率が、他の全てのアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率とは異なる、
3)アミノ酸X1、X2、・・・Xnにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルx1’、x2’、・・・xn’を用いて、1)で決定したアミノ酸配列X1−・・・−Xnからなる安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチドPn’の混合物を合成する工程、ここで該カクテルは安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素でラベルされていないアミノ酸との混合物であり、かつ前記ポリペプチドPnを対象としたNMR測定で得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率が全て同一である、
4)2)で合成したポリペプチドPnの混合物と3)で合成したポリペプチドPn’の混合物についてそれぞれNMR測定を行う工程、及び
5)4)で得られたそれぞれ対応するシグナル間のシグナル強度比を計算して、各シグナルの帰属を決定する工程。
1)アミノ酸配列の決定
まず、ポリペプチドP10のアミノ酸配列を、X1−X2−・・・・−X9−X10の様に決定する。アミノ酸配列は、NMRによって測定しようとするポリペプチドを構成するアミノ酸配列をそのまま再現すればよい。
次に、このアミノ酸配列X1−X2−・・・・−X9−X10の各アミノ酸残基について、安定同位体元素によるラベリング比率を、例えば10%、20%、・・・90%及び100%と、互いに異なるように設定したラベル化されたポリペプチドP10の混合物を合成する。
ポリペプチドP10の混合物とは別に、アミノ酸配列X1−X2−・・・・−X9−X10からなり、各アミノ酸残基の安定同位体元素によるラベリング比率が同一、例えば10%である、ラベル化されたポリペプチドP10’の混合物を合成する。
上記の2)で合成したポリペプチドP10の混合物、ならびに上記の3)で合成したポリペプチドP10’の混合物それぞれの等量物について、共通する測定条件下でNMRスペクトル、典型的には1H−15N HSQCスペクトルを測定し、シグナルを得る。
1)アミノ酸配列の決定
上記Aと同じである。なお、シグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基の種類、配列上の位置には特に制限はない。
ポリペプチドP10を構成する全てのアミノ酸残基ではなく、幾つかの特定のアミノ酸残基に関してのみシグナル帰属を行おうとするときは、その対象とするアミノ酸残基が他の全てのアミノ酸残基とは異なるラベリング比率を有するようにラベリング比率を設定し、ポリペプチドP10の混合物を合成すればよい。例えば、シグナル帰属を行おうとする4つのアミノ酸残基、X2、X4、X6、X8について、安定同位体元素によるラベリング比率をX2:20%、X4:40%、X6:60%、X8:80%等のように設定し、合成すればよい。ここで、ラベリング比率は前記A)と同義である。
ポリペプチドP10の混合物とは別に、アミノ酸配列X1−X2−・・・・−X9−X10からなり、アミノ酸残基X2、X4、X6、X8の各アミノ酸残基の安定同位体元素によるラベリング比率が同一、例えば10%であり、かつ他のアミノ酸残基のラベリング比率が対応するポリペプチドP10のアミノ酸残基のラベリング比率と同じである、ラベル化されたポリペプチドP10’の混合物を合成する。
上記の2)で合成したポリペプチドP10の混合物、ならびに上記の3)で合成したポリペプチドP10’の混合物それぞれの等量物について、共通する測定条件下でNMRスペクトル、典型的には1H−15N HSQCスペクトルを測定し、シグナルを得る。
次に、上記アミノ酸配列において4つのグリシン(G5、G6、G10、G17)の各アミノ酸残基のシグナル帰属を目的として、ラベリング比率をG5:20%、G6:40%、G10:60%、G17:80%とそれぞれ設定した。
Claims (6)
- 下記の工程を含む、ポリペプチドを対象としたNMR測定法により得られたシグナルの帰属方法:
1)n個のアミノ酸残基からなるポリペプチドPnのアミノ酸配列X1−・・・−Xnを決定する工程、ここでXは任意のアミノ酸を、nは2以上の任意の整数を示す、
2)アミノ酸X1、X2、・・・Xnにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルx1、x2、・・・xnを用いて、1)で決定したアミノ酸配列X1−・・・−Xnからなる安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチドPnの混合物を合成する工程、ここで該カクテルは安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素でラベル化されていないアミノ酸との混合物であり、かつ前記ポリペプチドPnを対象としたNMR測定で得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率が、他の全てのアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率とは異なる、
3)アミノ酸X1、X2、・・・Xnにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルx1’、x2’、・・・xn’を用いて、1)で決定したアミノ酸配列X1−・・・−Xnからなる安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチドPn’の混合物を合成する工程、ここで該カクテルは安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素でラベルされていないアミノ酸との混合物であり、かつ前記ポリペプチドPnを対象としたNMR測定で得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率が全て同一である、
4)2)で合成したポリペプチドPnの混合物と3)で合成したポリペプチドPn’の混合物についてそれぞれNMR測定を行う工程、及び
5)4)で得られたそれぞれ対応するシグナル間のシグナル強度比を計算して、各シグナルの帰属を決定する工程。 - 安定同位体元素が15N、13C及び2Hよりなる群から選ばれる一以上の安定同位体元素である、請求項1に記載のシグナルの帰属方法。
- アミノ酸を構成する全ての窒素原子、炭素原子もしくは非交換性の水素原子が、それぞれ15N、13Cもしくは2Hによってラベル化されたアミノ酸を使用する、請求項2に記載のシグナルの帰属方法。
- ペプチド結合を形成する窒素原子、炭素原子もしくは水素原子が選択的にそれぞれ15N、13Cもしくは2Hによってラベル化されたアミノ酸を使用する、請求項2に記載のシグナルの帰属方法。
- 化学合成用の保護基によって修飾されたアミノ酸のカクテルを使用してポリペプチドPnの混合物及びポリペプチドPn’の混合物を合成する、請求項1に記載のシグナルの帰属方法。
- NMR測定法が1H−15N HSQC測定法である、請求項2〜4のいずれかに記載のシグナルの帰属方法。
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