MXPA98003810A - Uso de resonancia magnetica nuclear para identificar ligandos dirigidos a biomoleculas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso para identificar compuestos que se fijan a una molécula objetivo específica. El proceso incluye los pasos de:a) generar un primer espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional de una molécula objetivo etiquetada con 15N;b) exponer la molécula objetivo etiquetada a un compuesto químico o una mezcla de compuestos químicos;c) generar un segundo espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional de la molécula objetivo etiquetada que se ha expuesto a un compuesto o una mezcla de compuestos en el paso (b);y d) comparar el primero y segundo espectros de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional para determinar las diferencias entre el primero y segundo espectros, las diferencias identificando la presencia de uno o más compuestos que son ligandos que se han fijado a la molécula objetivo.

Description

USO DE RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR PARA IDENTIFICAR LIGANDOS DIRIGIDOS A BIOMOLECULAS Campo Técnico de la Invención La presente invención se relaciona con un método para la clasificación de compuestos para la actividad biológica y para la determinación de las constantes de disociación de fijación, usando análisis espectral de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional , para identificar y diseñar ligandos que se fijan a una biomolécula obj etivo .

Antecedentes de la Invención Una de las herramientas más poderosas para descubrir nuevos fármacos iniciales es la clasificación aleatoria de bases de datos de productos químicos y naturales, para descubrir compuestos que se fijen a una molécula objetivo particular (es decir, la identificación de ligandos de ese objetivo) . Usando este método, se pueden identificar los ligandos por su habilidad para formar una asociación física con una molécula objetivo, o por su habilidad para alterar la función de una molécula objetivo. Cuando se busca la fijación física, típicamente se expone una molécula objetivo a uno o más compuestos de los que se sospecha son ligandos, y se realizan ensayos para determinar si se forman complejos entre la molécula objetivo y uno o más de esos compuestos. Estos ensayos, como es bien sabido en la técnica, prueban para ver si hay cambios notorios en la molécula objetivo (por ejemplo, cambios en tamaño, carga, movilidad) que indiquen la formación del complejo. En donde se miden los cambios funcionales, se establecen condiciones de ensayo para permitir la medición de un evento biológico o químico relacionado con la molécula objetivo (por ejemplo, reacción catalizada de la enzima, activación de la enzima mediada por el receptor) . Para identificar una alteración, se determina la función de la molécula objetivo antes y después de la exposición a los compuestos de prueba.

Los ensayos físicos y funcionales existentes se han usado exitosamente para identificar nuevos fármacos iniciales para usarse en el diseño de compuestos terapéuticos. Sin embargo, existen limitaciones inherentes a esos ensayos que comprometen su exactitud, conflabilidad y eficiencia. Una deficiencia mayor de los ensayos existentes se relaciona con el problema de los "positivos falsos". En un ensayo funcional típico, un "positivo falso" es un compuesto que acciona el ensayo pero cuyo compuesto no es efectivo para provocar la respuesta fisiológica deseada. En un ensayo físico típico, un "positivo falso" es un compuesto que, por ejemplo, se une a sí mismo al objetivo, pero de una manera no específica (por ejemplo, fijación no específica) . Los positivos falsos son particularmente prevalentes y problemáticos cuando se clasifican concentraciones más elevadas de ligandos putativos, porque muchos compuestos tienen efectos no específicos a esas concentraciones . De manera similar, los ensayos existentes están plagados por el problema de "negativos falsos", que resultan cuando un compuesto da una respuesta negativa en el ensayo, pero cuyo compuesto es realmente un ligando para el objetivo. Los negativos falsos típicamente ocurren en ensayos que usan concentraciones de compuestos de prueba que son ya sea demasiado elevadas (que resultan en toxicidad) o demasiado bajas con relación a la constante de fijación o disociación del compuesto al objetivo. Otra deficiencia mayor de los ensayos existentes es la cantidad limitada de información que proporciona el ensayo mismo. Mientras que el ensayo puede identificar correctamente los compuestos que se unen a, o provocan una respuesta de la molécula objetivo, esos ensayos típicamente no proporcionan ninguna información acerca de o los sitios de fijación específicos en la molécula objetivo, o las relaciones de actividad de estructura entre el compuesto que se está probando y la molécula objetivo. La incapacidad para proporcionar alguna de esa información es particularmente problemática en donde el ensayo de clasificación se está usando para identificar fármacos iniciales para más estudio.

Recientemente se ha sugerido que se puede usar la cristalografía de rayos X para identificar los sitios de fijación de los solventes orgánicos en las macromoléculas . Sin embargo, este método no puede determinar las afinidades de fijación relativas en diferentes sitios en el objetivo. Esto solamente se puede aplicar a proteínas objetivo muy estables, que no se desnaturalizan en la presencia de concentraciones elevadas de solventes orgánicos. Por otra parte, este planteamiento no es un método de clasificación para probar rápidamente muchos compuestos que son químicamente diversos, sino que está limitado al mapeamiento de los sitios de fijación de solamente unos pocos solventes orgánicos, debido al largo tiempo que se necesita para determinar las estructuras de cristal individuales. Los compuestos se clasifican para identificar fármacos iniciales que se puedan usar en el diseño de nuevos fármacos que alteren la función de la biomolécula objetivo. Esos fármacos nuevos pueden ser análogos estructurales de fármacos iniciales identificados, o pueden ser conjugados de uno o más de esos compuestos iniciales. Debido a los problemas inherentes a los métodos de clasificación existentes, esos métodos frecuentemente son de poca ayuda en el diseño de nuevos fármacos . Sigue existiendo una necesidad de proporcionar medios nuevos, rápidos, eficientes, exactos y confiables para clasificar compuestos para identificar cualesquier ligandos de diseño que se fijen específicamente a un objetivo particular.

Breve Compendio de la Invención En un aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la clasificación de compuestos por la actividad biológica, para identificar ligandos que se fijen a una molécula objetivo específica. Ese proceso comprende los pasos de: a) generar un primer espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional de una molécula objetivo etiquetada de manera uniforme con 15N; b) exponer la molécula objetivo etiquetada a un compuesto químico o una mezcla de compuestos químicos; c) generar un segundo espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional de la molécula objetivo etiquetada que se ha expuesto a un compuesto o una mezcla de compuestos en el paso (b) ; y d) comparar el primero y segundo espectros de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional para determinar las diferencias entre el primero y segundo espectros, las diferencias identificando la presencia de uno o más compuestos que son ligandos que se han fijado a la molécula objetivo. En donde el proceso clasifica más de un compuesto en el paso (b) , esto es, una mezcla de compuestos, y en donde se genera una diferencia entre el primer espectro generado de la molécula objetivo sola, y que se generó de la molécula objetivo en la presencia de la mezcla, se realizan pasos adicionales para identificar qué compuesto o compuestos específicos contenidos en la mezcla se fijan a la molécula objetivo. Esos pasos adicionales comprenden los pasos de: e) exponer la molécula objetivo etiquetada con 15N individualmente a cada compuesto de la mezcla, f) generar un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de ^N/1!! bidimensional de la molécula objetivo etiquetada, que se ha expuesto individualmente a cada compuesto; y g) comparar cada espectro generado en el paso f) con el primer espectro generado de la molécula objetivo sola, para determinar las diferencias en cualquiera de esos espectros comparados, las diferencias identificando la presencia de un compuesto que es un ligando que se ha fijado a la molécula objetivo. Debido a que los valores del cambio químico de las señales 15N/1H particulares en el espectro de correlación bidimensional corresponden a ubicaciones específicas de agrupamientos atómicos en la molécula objetivo (por ejemplo, los átomos N-H del enlace amida o péptido de un residuo amino ácido particular en un polipéptido) , el proceso de clasificación no solamente permite la identificación de qué compuesto (s) se fija(n) a la molécula objetivo particular, sino que también permite la determinación del sitio de fijación particular del ligando en la molécula objetivo.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la determinación de la constante de disociación, KD, para un ligando dado y su molécula objetivo. Ese proceso comprende los pasos de a) generar un primer espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional de una molécula objetivo etiquetada con 15N; b) exponer la molécula objetivo etiquetada a diferentes concentraciones de un ligando; c) generar un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional a cada concentración de ligando en el paso (b) ; d) comparar cada espectro del paso (c) con el primer espectro del paso (a) ; y e) calcular la constante de disociación entre la molécula objetivo y el ligando por esas diferencias, de conformidad con la ecuación: ¾ = (G?10 - x) ( TLlp - x) x Un aspecto conveniente de la presente invención es la capacidad del proceso de la presente invención para determinar la constante de disociación de un ligando de la molécula objetivo en la presencia de una segunda molécula ya fijada al ligando. Generalmente esto no es posible con los métodos de la técnica anterior que emplean métodos analíticos de "producto químico húmedo" para determinar la fijación de un ligando a un sustrato de molécula objetivo. En esta modalidad preferida, el proceso para la determinación de la constante de disociación de un ligando se puede realizar en la presencia de un segundo ligando fijado. De conformidad con esta modalidad, la molécula objetivo etiquetada con 15N se fija a ese segundo ligando antes de exponer ese objetivo a los compuestos de prueba. La capacidad del presente método para determinar no solamente la existencia de fijación entre un ligando y la molécula objetivo, sino también el sitio particular de fijación en la presencia de un segundo ligando fijado, permite la capacidad para diseñar un fármaco que comprenda dos o más fracciones enlazadas constituidas de los ligandos. Este método usa el proceso de clasificación espectroscópico de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional , como se declara posteriormente, para identificar un primero y subsecuentes ligandos que se fijan a la molécula objetivo. Se forma un complejo de la molécula objetivo y dos o más ligandos, y se determina la estructura tridimensional de ese complejo usando, de preferencia, espectroscopia de resonancia magnética nuclear o cristalografía de rayos X. Esa estructura tridimensional se usa para determinar la orientación espacial de los ligandos unos con relación a los otros y con la molécula objetivo. En base a la orientación espacial, los ligandos se enlazan juntos para formar el fármaco. La selección de un grupo de enlace apropiado se hace por medio de mantener la orientación espacial de los ligandos entre sí y con la molécula objetivo en base a los principios de información de ángulo de enlace y longitud de enlace ben conocidos en la técnica de la química orgánica. Por lo tanto, el método de diseño molecular comprende la identificación de una primera fracción de ligando para la molécula objetivo usando espectroscopia de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional; identificar fracciones de ligando subsecuentes para la molécula objetivo, usando espectroscopia de correlación de resonancia magnética nuclear de ^N/1!! bidimensional; formar un complejo de la primera y subsecuentes fracciones de ligando para la molécula objetivo; determinar la estructura tridimensional del complejo y, de esta manera, la orientación espacial de la primera y subsecuentes fracciones de ligando en la molécula objetivo; y enlazar la primera y subsecuentes fracciones de ligando para formar el fármaco, para mantener la orientación espacial de las fracciones de ligando. La identificación de subsecuentes fracciones de ligando se puede realizar en la ausencia o presencia del primer ligando (por ejemplo, la molécula objetivo se puede fijar al primer ligando antes de que se le exponga a los compuestos de prueba para la identificación del segundo ligando) .

En una modalidad preferida, la molécula objetivo que se usó en un proceso de clasificación o diseño es un polipéptido. El polipéptido objetivo se produce de preferencia en forma recombinante a partir de una célula anfitriona transformada con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el polipéptido, mediante el cultivo de la célula anfitriona transformada en un medio que contiene una fuente asimilable de 15N, de tal manera que el polipéptido producido de manera recombinante se etiqueta con 15N.

Breve Descripción de los Dibulos En los dibujos que forman una porción de la especificación : La Figura 1 muestra un espectro de correlación de 15N/1H del dominio de fijación de ADN del papilomavirus E2 de humano etiquetado de manera uniforme con 15N. El espectro (80 puntos de complejo, 4 exploraciones por decaimiento de inducción libre) se adquirió en una muestra de 0.5 raM de E2 en 20 mM de fosfato (pH de 6.5), 10 mM de ditiotreitol (DTT) y 10 por ciento de óxido de deuterio (D20) . La Figura 2 muestra los espectros de correlación de 15N/1H del dominio de fijación de ADN del papilomavirus E2 de humano etiquetado de manera uniforme con 15N, antes (múltiples contornos delgados) , y después (contornos individuales gruesos) de la adición de un compuesto de prueba final. La concentración final del compuesto fue 1.0 mM. Todas las otras condiciones son como se declara en la Figura 1. Se indican los residuos seleccionados que muestran cambios significativos sobre la fijación . La Figura 3 muestra los espectros de correlación de 15N/1H del dominio de fijación de ADN del papilomavirus E2 de humano etiquetado de manera uniforme con 15N, antes (múltiples contornos delgados) , y después (contornos individuales gruesos) de la adición de un segundo compuesto de prueba. La concentración final del compuesto fue 1.0 mM. Todas las otras condiciones son como se declara en la Figura 1. Se indican los residuos seleccionados que muestran cambios significativos sobre la fijación. La Figura 4 muestra los espectros de correlación de -^ , ? del dominio catalítico de estromelisina etiquetada de manera uniforme con 15N, antes (múltiples contornos delgados) , y después (contornos individuales gruesos) de la adición de un compuesto de prueba. La concentración final del compuesto fue 1.0 mM. Los espectros (80 puntos de complejo, 8 exploraciones por decaimiento de inducción libre) se adquirieron en una muestra de 0.3 mM de SCD en 20 mM de TRIS (pH de 7.0) , 20 mM de CaCl2 y 10 por ciento de óxido de deuterio. Se indican los residuos seleccionados que muestran cambios significativos sobre la fijación. La Figura 5 muestra los espectros de correlación de 15N/1H del dominio de fijación en Ras del péptido RAF etiquetado de manera uniforme con 15N, antes (múltiples contornos delgados) , y después (contornos individuales gruesos) de la adición de un compuesto de prueba. La concentración final del compuesto fue 1.0 mM. Los espectros (80 puntos de complejo, 8 exploraciones por decaimiento de inducción libre) se adquirieron en una muestra de 0.3 mM del fragmento de RAF en 20 mM de fosfato (pH de 7.0), 10 mM de ditiotreitol y 10 por ciento de óxido de deuterio. Se indican los residuos seleccionados que muestran cambios significativos sobre la fijación. La Figura 6 muestra los espectros de correlación de 15N/1H de FKBP etiquetado de manera uniforme con 15N, antes (múltiples contornos delgados) , y después (contornos individuales gruesos) de la adición de un compuesto de prueba. La concentración final del compuesto fue 1.0 mM. Los espectros (80 puntos de complejo, 4 exploraciones por decaimiento de inducción libre) se adquirieron en una muestra de 0.3 mM de FKBP en 50 mM de fosfato (pH de 6.5) , 100 mM de NaCl y 10 por ciento de óxido de deuterio. Se indican los residuos seleccionados que muestran cambios significativos sobre la fijación. La Figura 7 muestra una primera representación de la estructura derivada de la resonancia magnética nuclear del dominio de fijación de ADN de E2. Los dos monómeros del dímero simétrico están orientados de una manera de arriba hacia abajo, y se indican los términos N- y C- de cada monómero (N y C para un monómero, N* y C* para el otro) . En bandas se muestran los residuos que exhiben cambios de permutación química significativos (?d (½) >0.04 ppm; ?d (15N) >0.1 ppm) sobre la fijación a un primer compuesto de prueba. Estos residuos corresponden a la hélice de reconocimiento de ADN de E2. Los residuos seleccionados están numerados para ayudar en la visualización. La Figura 8 muestra una segunda representación de la estructura derivada de la resonancia magnética nuclear del dominio de fijación de ADN de E2. Los dos monómeros del dímero simétrico están orientados de una manera de arriba hacia abajo, y se indican los términos N- y C- de cada monómero (N y C para un monómero, N* y C* para el otro) . En bandas se muestran los residuos que exhiben cambios de permutación química significativos (?d (½) >0.04 ppm; ?d(15?)>0.1 ppm) sobre la fijación a un segundo compuesto de prueba. Estos residuos se localizan principalmente en la región de interconexión del dímero. Los residuos seleccionados están numerados para ayudar en la visualización. La Figura 9 muestra una representación de la estructura derivada del dominio catalítico de la estromelisina . Se indican los términos N- y C- . En bandas se muestran los residuos que exhiben cambios de permutación química significativos (?d (½) >0.04 ppm ?d(15?)>0.1 ppm) sobre la fijación a un compuesto de prueba. Estos o forman parte del sitio de fijación Si', o están espacialmente próximos a este sitio. Los residuos seleccionados están numerados para ayudar en la visualización.

La Figura 10 muestra una gráfica de bandas de un complejo ternario de primero y segundo ligandos fijados al dominio catalítico de la estromelisina .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un método de clasificación rápido y eficiente para identificar ligandos que se fijen a moléculas objetivo terapéuticas. Los ligandos se identifican por medio de probar la fijación de las moléculas a una molécula objetivo (por ejemplo, proteína, ácido nucleico, etcétera) mediante el seguimiento, con espectroscopia de resonancia magnética nuclear ( MR) , de los cambios en las desviaciones químicas de la molécula objetivo sobre la adición de los compuestos de ligando en la base de datos . También se determinan las afinidades de fijación de los ligandos por las biomoléculas, por un análisis de los cambios de permutación química de la molécula objetivo como una función de la concentración del ligando. La ubicación del sitio de fijación para cada ligando se determina por un análisis de las desviaciones químicas de la biomolécula que cambia sobre la adición del ligando y por los efectos nucleares de Overhauser (NOEs) entre el ligando y la biomolécula . La información sobre las relaciones de estructura/actividad entre los ligandos identificados por este proceso se puede usar entonces para diseñar nuevos fármacos que sirvan como ligandos a la molécula objetivo. A manera de ejemplo, en donde se identifican dos o más ligandos a una molécula objetivo dada, se forma un complejo de esos ligandos y la molécula objetivo. La orientación espacial de los ligandos unos con los otros, así como con la molécula objetivo, se deriva de la estructura tridimensional. La orientación espacial define la distancia entre los sitios de fijación de los dos ligandos, y la orientación de cada ligando a esos sitios. Usando esos datos de orientación espacial, se enlazan juntos entonces los dos o más ligandos para formar un nuevo ligando. El enlace se consigue de una manera que mantenga la orientación espacial de los ligandos unos con los otros y con la molécula objetivo. Existen numerosas ventajas para el proceso de descubrimiento basado en la resonancia magnética nuclear de la presente invención. Primeramente, porque un proceso de la presente invención que identifica ligandos por medio de medir directamente la fijación a la molécula objetivo, reduce significativamente el problema de positivos falsos. Debido a que el presente proceso identifica los sitios de fijación específicos a la molécula objetivo, se elimina el problema de positivos falsos que resultan por la fijación no específica de los compuestos a la molécula objetivo a concentraciones elevadas. En segundo lugar, se reduce significativamente el problema de negativos falsos porque el presente proceso puede identificar compuestos que se fijan específicamente a la molécula objetivo con un amplio rango de constantes de disociación. De hecho, se puede determinar la constante de disociación o fijación para los compuestos con el presente proceso . Otras ventajas de la presente invención son el resultado de la diversidad y detalle de los datos proporcionados acerca de cada ligando, por el proceso de descubrimiento. Debido a que se puede determinar la ubicación del ligando fijado por un análisis de las desviaciones químicas de la molécula objetivo, que cambia sobre la adición del ligando, y por los efectos nucleares de Overhauser (NOEs) entre el ligando y la biomolécula, se puede medir la fijación de un segundo ligando en la presencia de un primer ligando que ya esté fijado al objetivo. La capacidad para identificar simultáneamente sitios de fijación de diferentes ligandos, permite que un experto 1) defina la fijación cooperativa negativa y positiva entre ligandos y 2) diseñe nuevos fármacos mediante el enlace de dos o más ligandos en un solo compuesto, mientras mantiene una orientación apropiada de los ligandos unos con los otros, y con sus sitios de fijación. Además, si existen múltiples sitios de fijación, se puede medir la afinidad relativa de las fracciones de fijación individuales para los diferentes sitios de fijación, por un análisis de los cambios de permutación química de la molécula objetivo, como una función de la concentración añadida del ligando. Por medio de clasificar simultáneamente numerosos análogos estructurales de un compuesto dado, se proporcionan relaciones detalladas de estructura/actividad acerca de los ligandos . En su aspecto principal, la presente invención proporciona un proceso de clasificación de compuestos, para identificar ligandos que se fijen a una molécula objetivo específica. Ese proceso comprende los pasos de: a) generar un primer espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional de una molécula objetivo etiquetada con 15N; b) exponer la molécula objetivo etiquetada a uno o más compuestos; c) generar un segundo espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de "^N/1*. bidimensional de la molécula objetivo etiquetada que se ha expuesto a los compuestos del paso (b) ; y d) comparar el primero y segundo espectros para determinar si existen diferencias en esos dos espectros, qué diferencias indican la presencia de uno o más ligandos que se han fijado a la molécula objetivo. En donde un proceso de la presente invención clasifica más de un compuesto en el paso (b) , y en donde se observa una diferencia entre los espectros, se realizan pasos adicionales para identificar qué compuesto específico se fija a las moléculas objetivos. Esos pasos adicionales comprenden generar un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional para cada compuesto individual, y comparar cada espectro con el primer espectro para determinar si existen diferencias en cualquiera de esos espectros comparados, qué diferencias indican la presencia de un ligando que se ha fijado a la molécula objetivo. En un proceso de la presente invención se puede usar cualquier molécula objetivo etiquetada con 15N. Debido a la importancia de las proteínas en la química medicinal, una molécula objetivo preferida es un polipéptido. La molécula objetivo se puede etiquetar con 15N usando cualquier medio bien conocido en la técnica. En una modalidad preferida, la molécula objetivo se prepara en forma recombinante, usando células anfitrionas transformadas. En una modalidad especialmente preferida, la molécula objetivo es un polipéptido. Se puede usar cualquier polipéptido que de un espectro de resonancia magnética nuclear de alta resolución, y que se pueda etiquetar parcial o uniformemente con 15N. Posteriormente en la presente, en los Ejemplos, se expone la preparación de moléculas objetivo de polipéptido ejemplar etiquetadas de manera uniforme con 15N.

Un medio preferido para la preparación de cantidades adecuadas de polipéptidos etiquetados de manera uniforme con 15N es transformar una célula anfitriona con un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifique ese polipéptido, y cultivar la célula transformada en un medio de cultivo que contenga fuentes asimilables de 15N. Las fuentes asimilables de 15N son bien conocidas en la técnica. Una fuente preferida es 15NH4C1. Son bien conocidos en la técnica los medios para preparar vectores de expresión que contengan polinucleótidos que codifiquen polipéptidos específicos. De manera similar, también son bien conocidos en la técnica los medios para la transformación de las células anfitrionas con esos vectores, y los medios para cultivar esas células transformadas, de tal manera que se exprese el polipéptido. El proceso de clasificación empieza con la generación o adquisición de un espectro de correlación de 15N/1H bidimensional de la molécula objetivo etiquetada. En la técnica son bien conocidos los medios para la generación de espectros de correlación de 15N/1H bidimensional (Ver, por ejemplo, D.A. Egan, y colaboradores, Biochemistrv, 32:8, páginas 1920-1927 (1993); Bax, A., Grzesiek, S., Acc . Chem. Res . , 26:4, páginas 131-138 (1993) ) . Los espectros de resonancia magnética nuclear que se registran típicamente en el procedimiento de clasificación de la presente invención son espectros de correlación cuántica individual heteronuclear (HSQC) 15N/1K bidimensional . Debido a que las señales de 15N/1N que corresponden a las amidas de la estructura base de las proteínas, usualmente se resuelven bien, los cambios de permutación química para las amidas individuales se supervisan rápidamente. En la generación de esos espectros, se suprime la señal de agua grande mediante gradientes de deterioro. Para facilitar la adquisición de datos de resonancia magnética nuclear en un número grande de compuestos (por ejemplo, una base de datos de compuestos orgánicos pequeños sintéticos o naturalmente ocurrentes), se emplea un intercambiador de muestras. Usando el intercambiador de muestras, se pueden correr un total de 60 muestras sin atender. De esta manera, usando los parámetros de adquisición típicos (4 exploraciones por decaimiento de inducción libre (fid) ) , se pueden adquirir 100-120 espectros de correlaciones cuánticas individuales heteronucleares en un período de 24 horas. Para facilitar el procesamiento de los datos de la resonancia magnética nuclear, se usan programas de computación para transferir y procesar automáticamente los múltiples conjuntos de datos de resonancia magnética nuclear bidimensional, incluyendo una rutina para poner en fase automáticamente los datos de resonancia magnética nuclear bidimensional . Se puede facilitar el análisis de los datos mediante el formateo de los datos, de tal manera que los espectros individuales de correlación cuántica individual heteronuclear se vean y comparen rápidamente con el espectro de correlación cuántica individual heteronuclear de la muestra de control que contiene solamente el vehículo para el compuesto añadido (dimetilsulfóxido) , pero no el compuesto añadido. Posteriormente en la presente, en los Ejemplos, se exponen las descripciones de los medios de generación de esos espectros de correlación de 15N/1H bidimensional. En la Figura 1 se muestra un espectro de correlación de 15N/½ bidimensional representativo de una molécula (polipéptido) objetivo etiquetada con 15N (el dominio de fijación de ADN de la proteína E2) . Después de la adquisición del primer espectro, la molécula objetivo etiquetada se expone a uno o más compuestos de prueba . En donde se va a probar más de un compuesto de prueba simultáneamente, se prefiere usar una base de datos de los compuestos tal como una pluralidad de moléculas pequeñas. Estas moléculas típicamente se disuelven en dimetilsulfóxido perdeuterado . Se pueden comprar los compuestos en la base de datos de vendedores, o crearse de conformidad con las necesidades deseadas. Se pueden seleccionar los compuestos individuales inter alia sobre la base del tamaño (peso molecular = 100-300) y la actividad molecular. Los compuestos en la colección pueden tener diferentes formas (por ejemplo, anillo (s) aromático (s) plano (s), anillo (s) alifático (s) plegado (s), alifáticos rectos y ramificados con enlaces sencillos, dobles, o triples), y diferentes grupos funcionales (por ejemplo, ácidos carboxílicos, ésteres, éteres, aminas, aldehidos, cetonas, y diferentes anillos heterocíclicos) para la maximización de la posibilidad de descubrir compuestos que interactúen con sitios de fijación ampliamente diversos. El proceso de clasificación de resonancia magnética nuclear utiliza concentraciones de ligando que varían desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10.0 m . A estas concentraciones, los compuestos que son acídicos o básicos pueden cambiar significativamente el pH de soluciones de proteínas reguladas. Por lo tanto se pueden observar las desviaciones químicas son sensibles a los cambios del pH, así como a las interacciones directas de fijación, y los cambios de permutación química "positivos falsos", que no son el resultado de fijación de ligando, sino de los cambios en el pH. Por lo tanto es necesario asegurarse de que el pH de la solución regulada no cambie sobre la adición del ligando. A continuación se expone un medio para controlar el pH. Los compuestos se almacenan a 263 °K como soluciones de suministro en dimetílsulfóxido (DMSO) . Esto es necesario debido a la limitada solubilidad de los ligandos en solución acuosa.

No es posible ajustar directamente el pH de la solución de dimetilsulfóxido. En adición, el HC1 y el NaOH forman sales insolubles en el dimetilsulfóxido, de manera que se deben usar ácidos y bases alternativos. Se ha encontrado que el siguiente planteamiento da como resultado un pH estable. Las soluciones de suministro de 1.0 M en dimetilsulfóxido se diluyen al 1:10 en 50 mM de fosfato, pH de 7.0. Se mide el pH de esa solución alícuota diluida. Si el pH del alícuota no ha cambiado (es decir, permanece a 7.0), se hace una solución de trabajo mediante la disolución de la solución de suministro de dimetilsulfóxido al 1:10 para hacer una solución de 0.1 M, y se almacena esa solución. Si el pH del alícuota diluido es menor de 7.0, se añade etanolamina a la solución de suministro de dimetilsulfóxido de 1.0 M, después se diluye esa solución de suministro al 1:10 con regulador de fosfato, para hacer otro alícuota, y se vuelve a verificar el pH del alícuota. Si el pH del alícuota diluido es mayor de 7.0 , se añade ácido acético a la solución de suministro de dimetilsulfóxido de 1.0 M, después se diluye esa solución de suministro al 1:10 con regulador de fosfato, para hacer otro alícuota, y se vuelve a verificar el pH del alícuota. La etanolamina y el ácido acético son solubles en dimetilsulfóxido, y se añaden los equivalentes apropiados para asegurar que sobre la transferencia al regulador acuoso, el pH permanezca sin cambio. El ajuste del pH es un proceso interactivo, que se repite hasta que se obtiene el resultado deseado . Note que este procedimiento se realiza en diluciones de 1:10 de soluciones de suministro de 1.0 M (100 mM de ligando) para asegurar que no se observe ningún cambio de pH a las concentraciones más bajas que se usan en los experimentos (0.1 a 10 mM) o en sistemas de regulador diferentes/más débiles. Después de la exposición de la molécula objetivo etiquetada con 15N a uno o más compuestos de prueba, se genera un segundo espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional . Ese segundo espectro se genera de la misma manera que se expone anteriormente. Después se comparan el primero y segundo espectros, para determinar si hay alguna diferencia entre los dos espectros. Las diferencias en los espectros de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional que indican la presencia de un ligando, corresponden a los sitios etiquetados con 15N en la molécula objetivo. Esas diferencias se determinan usando procedimientos estándares bien conocidos en la técnica. A manera de ejemplo, las Figuras 2, 3, 4, 5, y 6 muestran comparaciones de los espectros de correlación antes y después de la exposición de diferentes moléculas objetivo a diferentes compuestos de prueba. Posteriormente en la presente, en los Ejemplos 2 y 3, se puede encontrar una descripción detallada de cómo se realizaron estos estudios. Las señales particulares en un espectro de correlación de 15N/½ bidimensional corresponden a los átomos de nitrógeno y protones específicos en la molécula objetivo (por ejemplo, amidas particulares de los residuos amino ácidos en la proteína) . A manera de ejemplo, por la Figura 2 se puede ver que las desviaciones químicas en una correlación de 15N/1H bidimensional del dominio de fijación de ADN de E2 expuesto a un compuesto de prueba ocurrieron en las posiciones de residuo 15 (115), 21 (Y21) , 22 (R22) y 23 (L23). Por la Figura 2 se puede ver que la fijación del ligando envolvió el residuo de isoleucina (lie) en la posición 15, el residuo de tirosina (Tyr) en la posición 21, el residuo de arginina (Arg) en la posición 22, y el residuo de leucina (Leu) en la posición 23. Por lo tanto, un proceso de la presente invención también se puede usar para identificar el sitio de fijación específico entre un ligando y una molécula objetivo.

La región de la proteína que es responsable de la fijación a los compuestos individuales se identifica por las señales de amida particulares que cambian sobre la adición de los compuestos. Estas señales se asignan a los grupos amida individuales de la proteína mediante procedimientos estándares, usando una diversidad de experimentos de resonancia magnética nuclear multidimensional heteronuclear bien establecidos. Para descubrir las moléculas que se fijan más ajustadamente a la proteína, se seleccionan las moléculas para prueba en base a las relaciones de estructura/actividad de la clasificación inicial y/o la información estructural en los fármacos iniciales cuando se fijan a la proteína. A manera de ejemplo, la clasificación inicial puede dar como resultado la identificación de ligandos, todos los cuáles contienen un anillo aromático. La segunda ronda de clasificación usaría entonces otras moléculas aromáticas como los compuestos de prueba . Como se expone en el Ejemplo 2, un ensayo de clasificación inicial para fijación al dominio catalítico de la estromelisina identificó dos compuestos biarilo como ligandos. La segunda ronda de clasificación usó por lo tanto, una serie de derivados de biarilo como los compuestos de prueba. El segundo conjunto de compuestos de prueba se clasifican inicialmente a una concentración de 1 mM, y se miden las constantes de fijación para aquellos que muestran afinidad. Los mejores fármacos iniciales que se fijan a la proteína se comparan entonces con los resultados obtenidos en un ensayo funcional. Aquellos compuestos que son fármacos iniciales adecuados se modifican químicamente para producir análogos con la meta de descubrir un nuevo agente farmacéutico. En otro aspecto, la presente invención proporciona un proceso para determinar la constante de disociación entre una molécula objetivo y un ligando que se fija a la molécula objetivo. Ese proceso comprende los pasos de. a) generar un primer espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional de una molécula objetivo etiquetada con 15N; b) titular la molécula objetivo etiquetada con diferentes concentraciones de un ligando; c) generar un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional a cada concentración de ligando del paso (b) ; d) comparar cada espectro del paso (c) tanto con el primer espectro del paso (a) , como con todos los otros espectros del paso (c) para cuantificar las diferencias en esos espectros, como una función de los cambios en la concentración del ligando; y e) calcular la constante de disociación (KD) entre la molécula objetivo y el ligando por esas diferencias. Debido a su importancia en la química medicinal, una molécula objetivo preferida para usarse en este proceso es un polipéptido. En una modalidad preferida, se puede realizar un proceso de determinación de la constante de disociación de un ligando, en la presencia de un segundo ligando. De conformidad con esta modalidad, la molécula objetivo etiquetada con 15N se fija a ese segundo ligando antes de exponer el objetivo a los compuestos de prueba. Las constantes de fijación o disociación se miden por medio de seguir las desviaciones químicas de 15N/1H de la proteína como una función de la concentración del ligando. Una concentración conocida ( [P] 0) de la molécula objetivo se mezcla con una concentración conocida ([L]0) de un ligando identificado previamente, y se adquiere el espectro de correlación de 15N/1H bidimensional . A partir de este espectro, se obtienen los valores de permutación química observados (^obs) . El proceso se repite para diferentes concentraciones del ligando hasta el punto de saturación de la molécula objetivo, cuando es posible, en cuyo caso se mide el valor de permutación química limitante para la saturación ( sat) . En aquellas situaciones en donde se consigue la saturación de la molécula objetivo, se calcula la constante de disociación para la fijación de un ligando particular a la molécula objetivo usando la fórmula: KD = ( [P]0 - x) ( [L]0 - x) X en donde [P]0 es la concentración molar total de la molécula objetivo; [L] Q es la concentración molar total del ligando; y x es la concentración molar de la especie fijada. El valor de x se determina por la ecuación: x = ¿obs " free ? en donde <5free es la permutación química de las especies libres; 6obg es la permutación química observada; y ? es la diferencia entre el valor de la permutación química de limitación para la saturación (<5sat) y el valor de la permutación química de la molécula objetivo libre de ligando (£free) · La constante de disociación se determina entonces mediante la variación de su valor, hasta que se obtiene un mejor ajuste para los datos observados, usando métodos estadísticos de ajuste de curva estándares. En el caso en donde 5sat no se conozca directamente, se varían tanto KD como £sat, y se someten al mismo procedimiento de ajuste de curva. Posteriormente en la presente, en los Ejemplos 2 y 3, se expone el uso del proceso descrito anteriormente para determinar la afinidad de disociación o fijación de diferentes ligandos a diferentes moléculas objetivo. Las moléculas objetivo preferidas, los medios para generar los espectros, y los medios para comparar los espectros, son los mismos que se exponen anteriormente. El paso inicial en el proceso de diseño es la identificación de dos o más ligandos que se fijen a la molécula objetivo específica. La identificación de esos ligandos se hace usando espectroscopia de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional , como se expuso anteriormente.

Una vez que se identifican dos o más ligandos como fijados a la molécula objetivo en diferentes sitios, se forma un complejo entre la molécula objetivo y los ligandos. En donde existen dos ligandos, ese complejo es un complejo ternario. En donde existen tres o más ligandos se forman complejos cuaternarios y otros. Los complejos se forman por medio de mezclar la molécula objetivo simultáneamente o secuencialmente con los diferentes ligandos, bajo circunstancias que permiten a esos ligandos fijarse al objetivo. Los medios para determinar esas condiciones son bien conocidos en la técnica. Una vez que se forma un complejo, se determina su estructura tridimensional . Se puede usar cualquier medie de determinación de estructura tridimensional. Esos métodos son bien conocidos en la técnica. Los métodos ejemplares y preferidos son la resonancia magnética nuclear y la cristalografía de rayos X. Posteriormente en la presente en el Ejemplo 4, se expone en detalle el uso de doble y triple resonancia magnética nuclear tridimensional para determinar la estructura tridimensional de dos ligandos fijados al dominio catalítico de la estromelisina . Un análisis de la estructura tridimensional revela la orientación espacial de los ligandos con relación los unos con los otros, así como con la conformación de la molécula objetivo. En primer lugar, la orientación espacial de cada ligando para la molécula objetivo permite la identificación de esas porciones del ligando directamente envuelto en la fijación (es decir, esas porciones interactuando con el sitio de fijación objetivo) , y esas porciones de cada ligando que se proyectan lejos del sitio de fijación, y cuyas porciones se pueden usar en procedimientos de enlace subsecuentes . En segundo lugar, los datos de orientación espacial se usan para mapear las posiciones de cada ligando con relación unos con los otros. En otras palabras, se pueden calcular las distancias discretas entre los ligandos orientados especialmente . En tercer lugar, los datos de orientación espacial también definen las relaciones tridimensionales entre los ligandos en el objetivo. De esta manera, en adición al cálculo de las distancias absolutas entre los ligandos, también se pueden determinar las orientaciones angulares de esos ligandos.

El conocimiento de las orientaciones espaciales de los ligandos y el objetivo se usa entonces para seleccionar los enlazadores para enlazar dos o más ligandos juntos en una sola entidad que contenga todos los ligandos. El diseño de los enlazadores se basa en las distancias y la orientación angular que se necesitan para mantener cada una de las porciones de ligando de la única entidad en la orientación apropiada al objetivo. La conformación tridimensional de los enlazadores adecuados es bien conocida, o la puede averiguar rápidamente uno de experiencia ordinaria en la técnica. Aunque teóricamente es posible enlazar dos o más ligandos juntos durante a través de cualquier rango de distancia y proyección tridimensional, en la práctica se prefieren ciertas limitaciones de distancia y proyección. En una modalidad preferida, los ligandos se separan por una distancia de menos de aproximadamente 15 Angstroms (Á) , de más preferencia menos de aproximadamente 10 Angstroms y, aún de más preferencia menos de aproximadamente 5 Angstroms. Una vez que se identifica un grupo enlazador adecuado, se enlazan los ligandos con ese enlazador. Los medios para enlazar ligandos son bien conocidos en la técnica y dependen de la estructura química del ligando y del grupo enlazador mismo. Los ligandos se enlazan unos a los otros usando esas porciones del ligando no envueltas directamente en la fijación a la molécula objetivo. Posteriormente en la presente, en el Ejemplo 4, se expone una descripción detallada del diseño de un fármaco que inhibe la actividad proteolítica de la estromelisina, fármaco que se diseñó usando un proceso de la presente invención. Los siguientes Ejemplos ilustran las modalidades preferidas de la presente invención, y no son una limitación de la especificación ni las reivindicaciones de ninguna manera.

Ejemplo 1 Preparación de Moléculas Objetivo Etiquetadas de Manera Uniforme con 15N A. Estromelisina La estromelicina de humano es una proteína de 447 amino ácidos de la que se cree está envuelta en la degradación proteolítica del cartílago. Se cree que la proteólisis del cartílago da como resultado la pérdida degenerativa del cartílago de articulación, y el deterioro resultante de la función de la articulación que se observa tanto en la osteoartritis como en la artritis reumatoide. La proteína posee una serie de dominios que incluyen dominios latentes y de propéptido con terminal N, un homólogo de dominio con terminal C con homopexina, y un dominio catalítico interno. Estudios han mostrado que la remoción de la prosecuencia con terminal N de aproximadamente ochenta amino ácidos ocurre para convertir la proenzima a la enzima madura de 45 kDa . Además, estudios han mostrado que no se requiere el dominio homólogo de homopexina con terminal C para el doblez apropiado del dominio catalítico, ni para la interacción con un inhibidor. (Ver, por ejemplo, A.I. Marcy, Biochemistry, 30:6476-6483 (1991)) . De esta manera, se seleccionó el segmento interno de residuo de los amino ácidos 81-156 de la estromelisina, como el fragmento de proteína para usarse en la identificación de los compuestos que se fijan a, y tienen el potencial para actuar como inhibidores de la estromelisina. Para emplear el método de la presente invención, fue necesario preparar el fragmento 81-256 (SEQ ID NO:l) de la estromelisina, en el que la estructura base del péptido se enriqueció isotópicamente con 15N. Esto se hizo mediante la inserción de un plásmido que codificaba para la producción del fragmento de proteína dentro de una cepa de E. coli, y haciendo crecer la cepa bacteriana modificada genéticamente en un medio de cultivo enriquecido con 15NH4C1 y 13C-glucosa. Se aisló el fragmento de proteína enriquecido isotópicamente del medio de cultivo, se purificó, y se usó subsecuentemente como la base para evaluar la fijación de los compuestos de prueba. Posteriormente se describen los procedimientos para estos procesos. Se hicieron crecer fibroblastos de piel de humano (ATCC No. CRL 1507) , y se inducieron usando el procedimiento descrito por Clark y colaboradores, Archiv. Biochem. and Biophys . , 241:36-45 (1985) . Se aisló el ARN total de 1 gramo de células, usando un estuche Promega RNAgents® Total RNA Isolation System Kit (Cat.# Z5110, Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53711-5399) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Se desnaturalizó por calor una porción de 1 /zg del ARN a 80 °C durante cinco minutos, y después se sometió a reacción de cadena de polimerasa de transcriptasa inversa, usando un estuche GeneAmp® RNA PCR (Cat.# N808-0017, Applied Biosystems/Perkin-Elmer, 761 Main Avenue, Norwalk, CT 06859-0156), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizó la reacción de cadena de polimerasa anidada, usando los primero primeros (A) GAAATGAAGAGTC TTCAA (SEQ ID NO: 3) y (B) GCGTCCCAGGTTCTGGAG (SEQ ID NO : 4 ) y treinta y cinco ciclos de 94°C, dos minutos; 45°C, dos minutos; y 72°C tres minutos. A esto siguió la reamplificación con los primeros internos (C) ATACCATGGCCTATCCAT TGGATGGAGC (SEQ ID NO: 5) y (D) ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG (SEQ ID NO : 6 ) , usando treinta ciclos bajo las mismas condiciones descritas inmediatamente antes, para generar una codificación de ADN para los residuos amino ácidos 1-256 de la estromelisina de humano. Después se clonó el fragmento de la reacción de cadena de polimerasa en el vector de clonación de reacción de cadena de polimerasa pT7Blue (R) (Novagen, Inc., 597 Science Drive, Madison, WI 53711) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se cortó el plásmido resultante con Ncol y BamHI, y se subclonó el fragmento de estromelisina en el vector de expresión Novagen pET3d (Novagen, Inc., 597 Science Drive, Madison, WI 53711) , usando nuevamente las instrucciones del fabricante . Se generó una construcción de expresión de estromelisina madura que codificaba para los residuos amino ácidos 81-256 más una metionina de iniciación, a partir de la construcción de expresión 1-256, mediante amplificación de reacción de cadena de polimerasa. El fragmento de reacción de cadena de polimerasa resultante se clonó primeramente en el vector Novagen pT7Blue (R) , y después se subclonó en el vector Novagen pET3d, usando las instrucciones del fabricante de la manera descrita anteriormente, para producir el plásmido (pETST-83 -256 ) . Este plásmido final es idéntico a aquel descrito por Qi-Zhuang y colaboradores, Biochemistry, 31:11231-11235 (1992) con la excepción de que el presente codifica por una secuencia de péptidos que empieza dos amino ácidos antes, en la posición 81 en la secuencia de estromelisina de humano. El plásmido pETST-83 -256 se transformó en la cepa de E. coli BL21 (DE3 ) /pLysS (Novagen, Inc., 597 Science Drive, Madison, WI 53711) , de conformidad con las instrucciones del fabricante, para generar una cepa de expresión, BL21 (DE3) /pLysS/pETST-255-1. Se preparó un medio de cultivo previo por medio de disolver 1.698 gramos de Na2HP4#7H20, 0.45 gramos de KH2P04, 0.075 gramos de NaCl , 0.150 gramos de 15NH4C1, 0.300 13C-glucosa, 300 µ? de 1 M de solución acuosa de MgS04 y 15 µ?? de solución acuosa de CaCl2 en 150 mililitros de agua desionizada.

Se esterilizó la solución resultante del medio de cultivo previo, y se transfirió a un matraz desviador estéril de 500 mililitros. Inmediatamente antes de la inoculación del medio de cultivo previo con la cepa bacteriana, se añadieron 150 ?? de una solución que contenía 34 miligramos/mililitro de cloranfenicol en etanol al 100 por ciento, y 1.5 mililitros de una solución que contenía 20 miligramos/mililitro de ampicilina al contenido del matraz . Después se inoculó el contenido del matraz con 1 mililitro de existencia de glicerol de E. coli modificada genéticamente, cepa BL21 (DE3 ) /pLysS/pETST-255 - 1. Se agitó el contenido del matraz (225 revoluciones por minuto) a 37°C, hasta que se observó una densidad óptica de 0.65. Se preparó un medio nutriente de fermentación por medio de disolver 113.28 gramos de Na2HP4*7H20, 30 gramos de KH2P04, 5 gramos de NaCl, y 10 mililitros de agente antiespumante DF-60 al 1 por ciento en 9604 mililitros de agua desionizada. Se colocó esta solución en un fermentador New Brunswick Scientific Micros Fermenter (Edison, NJ) y se esterilizó a 121°C durante 40 minutos. Inmediatamente antes de la inoculación del medio de fermentación, se añadieron los siguientes componentes esterilizados previamente al contenido del recipiente de fermentación: 100 mililitros de una solución acuosa al 10 por ciento de 15NH4C1, 100 mililitros de una solución acuosa al 10 por ciento de 13C-glucosa, 20 mililitros de una solución acuosa de 1M de MgS04, 1 mililitro de una solución acuosa de 1M de CaCl2, 5 mililitros de una solución acuosa de clorhidrato de tiamina (10 miligramos/mililitro) , 10 mililitros de una solución que contenía 34 miligramos/mililitro de cloranfenicol en etanol al 100 por ciento, y 1.9 gramos de ampicilina disuelta en la solución de cloranfenicol . Se ajustó el pH de la solución resultante a 7.00 mediante la adición de una solución acuosa de 4N de H2S04. Se añadió el cultivo previo de E. coli, cepa BL21 (DE3) /pLysS/pETST-255-1 , del procedimiento de escala del matraz de agitación descrito anteriormente, al contenido del fermentador y se permitió que procediera el crecimiento celular hasta que se consiguió una densidad óptica de 0.48. Durante este proceso, el contenido del fermentador se mantuvo automáticamente a un pH de 7.0 mediante la adición de 4N de H2S04 ó 4N de KOH, según fue necesario. Se mantuvo el contenido de oxígeno disuelto del contenido del fermentador sobre 55 por ciento de saturación de aire, a través de un ciclo en cascada que incrementó la velocidad de agitación cuando el contenido de oxígeno disuelto cayó por debajo del 55 por ciento. Se alimentó aire al contenido del termentador a 7 litros estándares por minuto (SLPM) , y se mantuvo la temperatura del cultivo a 37°C a lo largo del proceso. Se cosecharon las células mediante centrifugación a 17,000 x gramo durante 10 minutos a 4°C, y se recolectaron los gránulos de célula resultantes, y se almacenaron a -85 °C. El rendimiento celular húmedo fue de 3.5 gramos/litro. El análisis de las fracciones soluble e insoluble de los lisatos celulares mediante electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) reveló que aproximadamente el 50 por ciento de la 15N-estromelisina se encontró en la fase soluble . Se purificó el fragmento de estromelisina etiquetado isotópicamente, preparado como se describió anteriormente, empleando una modificación de la técnica descrita por Ye, y colaboradores, Biochemistrv , 31:11231-11235 (1992) . Se suspendieron las células cosechadas en 20 mM de regulador Tris-HCl (pH 8.0) , solución de azida de sodio que contenía lmM de MgCl2, 0.5 mM de ZnCl2/ 25 unidades/mililitro de enzima Benzonase®, y una mezcla inhibidora constituida por fluoruro de 4- (2-aminoetil) -bencensulfonilo ("AEBSF") , Leupeptin®, Aprotinin®, y Pepstatin® (todos a concentraciones de 1 . El fluoruro de 4- (2-aminoetil) -bencensulfonilo, el Leupeptin®, el Aprotinin®, y el Pepstatin® están disponibles con American International Chemical, 17 Strathmore Road, Natick, MA 01760) . Se agitó suavemente la mezcla resultante durante una hora, y después se enfrió a 4°C. Después se rompieron sónicamente las células, usando un ciclo de trabajo al 50 por ciento. Se centrifugó el lisato resultante a 14,000 revoluciones por minuto durante 30 minutos, y se congeló el granulo de la fracción insoluble a -80°C para procesamiento subsecuente (ver posteriormente) . Se añadió sulfato de amonio sólido al sobrenadante hasta el punto de 20 por ciento de saturación, y se cargó la solución resultante sobre una columna de flujo rápido ( "Q-Sepharose FF") de sefarosa de fenilo de 700 mililitros (Pharmacia Biotech., 800 Centennial Ave., P.O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855) . Antes de cargarla, se equilibró la columna de sefarosa con 50 m de regulador Tris-HCl (pH de 7.6 a 4°C) , 5 mM de CaCl2, y 1 M de ( H4)2S04. Se lixivió la columna cargada con un gradiente lineal de concentraciones decrecientes de (NH4)2S04 acuoso (desde 1 hacia abajo hasta 0 M) , y concentraciones incrementadas de CaCl2 acuoso (desde 5 hasta 20 mM) en regulador Tris-HCl a un pH de 7.6. Se recolectaron las fracciones activas del eluido, y se concentraron en una celda agitada Amicon (Amicon, Inc., 72 Cherry Hill Drive, Beverly, MA 01915) . Se dializó la muestra concentrada durante la noche en el regulador de partida que se usó con la columna Q-Sepharose FF, 50 mM de Tris-HCl (pH de 8.2 a 4°C) con 10 mM de CaCl2. Después se cargó la muestra dializada en la columna Q-Sepharose FF, y se lixivió con un gradiente lineal que comprendía el regulador de partida y 200 mM de NaCl . Se concentró la fracción soluble purificada del fragmento de estromelisina etiquetado isotópicamente, y se almacenó a 4°C.

Se solubilizó el gránulo en 8M de guanidina-HCl . Se centrifugó la solución durante 20 minutos a 20,000 revoluciones por minuto, y se añadió por goteo el sobrenadante a un regulador de doblez que comprendía 50 mM de Tris-HCl (pH de 7.6), 10 mM de CaCl2, 0.5 mM de ZnCl2, y el cóctel inhibidor de fluoruro de 4- (2-aminoetil) -bencensulfonilo, Leupeptin®, Aprotinin®, y Pepstatin® (todos a concentraciones de 1 /xg/mililitro) . El volumen del regulador de doblez era diez veces aquel del sobrenadante. Se centrifugó la mezcla de sobrenadante y regulador de doblez a 20,000 revoluciones por minuto durante 30 minutos. Se almacenó el sobrenadante de esta centrifugación a 4°C, y se sometió el granulo dos veces a los pasos descritos anteriormente de solubilización en guanidina-HCl , volver a doblar en el regulador, y centrifugación. Se combinaron los sobrenadantes finales de cada una de las tres centrifugaciones, y se añadió sulfato de amonio sólido hasta el punto de 20 por ciento de saturación. Se sometió a purificación la solución resultante así derivada de la fracción insoluble, sobre sefarosa de fenilo y Q-Sepharose, como se describió anteriormente para la fracción soluble . Se combinaron las fracciones soluble e insoluble para producir aproximadamente 1.8 miligramos del fragmento 81-256 de estromelisina purificado, etiquetado isotópicamente por gramo de la pasta celular original.

B. Inhibidores de papilomavirus (HPV) E2 de Humano Los papilomavirus son una familia de virus de ADN pequeños que causan verrugas genitales y carcinomas cervicales. La proteína E2 del HPV regula la transcripción viral, y se requiere para la réplica viral. De esta manera, las moléculas que bloquean la fijación de E2 a ADN pueden ser agentes terapéuticos útiles contra el HPV. Se escogió la proteína más bien que el ADN como un objetivo, porque se esperaría que se encontrara que los agentes con mayor selectividad se fijan a la proteína más bien que al ADN. Se clonó el dominio de fijación de ADN del papilomavirus E2 de humano de la longitud completa de ADN que codifica para E2, usando reacción de cadena de polimerasa, y se sobreexpresa en las bacterias usando el sistema de expresión T7. Se aisló la proteína etiquetada de manera uniforme con 15N de las bacterias que crecieron en un medio mínimo que contenía cloruro de amonio etiquetado con 15N. Se purificó la proteína del lisato celular bacteriano usando una columna de S-sepharose FastFlow equilibrada previamente con regulador (50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH = 8.3) . Se lixivió la proteína con un gradiente lineal de 100-500 mM de NaCl en regulador, se agrupó, y se aplicó a una columna de Mono-S a un pH = 7.0. Se lixivió la proteína con un gradiente de sal (100-500 mM) , concentrado a 0.3 mM, y se intercambió en una solución regulada (H20/D20 (9/1) de TRIS (50 mM, pH = 7.0), que contenía azida de sodio (0.5 por ciento) .

C. RAF Se preparó el dominio de fijación Ras etiquetado de manera uniforme con 15N de la proteína RAF , como se describe en Emerson y colaboradores, Biochemistry, 34 (21) : 6911-6918 (1995) .

D . FKBP Se preparó la proteína de fijación FK (FKBP) de humano recombinante, etiquetada de manera uniforme con 15N, como se describe en Logan, y colaboradores, J. Mol . Biol . , 236:637-648 (1994) .

Ejemplo 2 Clasificación de Compuestos Usando Análisis Espectral de Correlación NMR 15N/1H Bldimensional Se preparó el dominio catalítico de la estromelisina, de conformidad con los procedimientos del Ejemplo 1. Las soluciones de proteína usadas en el ensayo de clasificación contenían el dominio catalítico etiquetado de manera uniforme con 15N de la estromelisina (0.3 mM) , ácido acetohidroxámico (500 mM) , CaCl2 (20 mM) , y azida de sodio (0.5 por ciento) en una solución regulada (50 mM, pH = 7.0) de TRIS de H20/D20 (9/1) . Se generaron los espectros de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional a 29°C en un espectómetro de resonancia magnética nuclear Bruker AMX500, equipado con una sonda de resonancia triple e intercambiador de muestra Bruker. Se adquirieron los espectros de correlación cuántica individual heteronuclear de 15N/1H como 80 x 1024 puntos de complejo, usando anchuras de barrido de 2000 Hz (15N, t1) y 8333 Hz (½, t2) . Se emplearon un retraso de 1 segundo entre las exploraciones y 8 exploraciones por decaimiento de inducción libre (fid) en la recolección de datos. Se procesaron todos los espectros de resonancia magnética nuclear, y se analizaron en computadoras Silicon Graphics, usando software escrito en casa. Se adquirió un primer espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional para la molécula objetivo de estromelisina etiquetada con 15N, como se describió anteriormente. La estromelisina objetivo se expuso entonces a una base de datos de compuestos de prueba. Se hicieron las soluciones de existencia de los compuestos a 100 mM y 1 M. En adición, se preparó una genoteca de combinación que contenía 8-10 compuestos por muestra, a una concentración de 100 mM por cada compuesto. Se ajustó el pH de 1 M de la solución de suministro con ácido acético y etanolamina, de tal manera que no se observó ningún cambio de pH sobre una dilución al 1/10 con 100 mM de una solución regulada de fosfato (pH = 7.0). Es importante ajustar el pH, porque los pequeños cambios en el pH pueden alterar las desviaciones químicas de las biomoléculas , y complicar la interpretación de los datos de la resonancia magnética nuclear. Se seleccionaron los compuestos en la base de datos sobre la base del tamaño (peso molecular = 100-300) y la diversidad molecular. Las moléculas en la colección tenían diferentes formas (por ejemplo, anillo (s) aromático (s) plano(s), anillo(s) alifático(s) plegado(s), alifáticos de cadena recta y ramificada con enlaces sencillos, dobles, o triples) , y diferentes grupos funcionales (por ejemplo, ácidos carboxílicos, ásteres, éteres, aminas, aldehidos, cetonas, y diferentes anillos heterocíclicos) para la maximización de la posibilidad de descubrir compuestos que interactuaran con sitios de fijación ampliamente diversos. Las muestras de la resonancia magnética nuclear se prepararon mediante la adición de 4 µ? de la solución de suministro de dimetilsulfóxido de las mezclas de compuestos que contenían cada compuesto a una concentración de 100 mM a la solución regulada de 0.4 mililitros de H20/D20 (9/1) de la proteína etiquetada de manera uniforme con 15N. La concentración final de cada uno de los compuestos en la muestra de resonancia magnética nuclear fue de aproximadamente 1 mM. En una clasificación inicial, se encontraron dos compuestos que se fijaron al dominio catalítico de la estromelisina . Ambos compuestos contenían una fracción biarilo. En base a estos aciertos iniciales, se probaron compuestos estructuralmente similares contra la estromelisina. La estructura de esos compuestos biarilo está representada por la estructura I, a continuación. (Ver la Tabla 1 para las definiciones de R1-K3 y A-^Aj) .

En la segunda ronda de clasificación, se ensayó la fijación tanto en la ausencia como en la presencia de cantidades de saturación de ácido acetohidroxámico (500 mM) .

Se encontró que muchos de los compuestos biarilo se fijan al dominio catalítico de la estromelisina . La Figura 4 muestra un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 1SN/1H bidimensional representativo, antes y después de la exposición de la estromelisina a un compuesto de prueba biarilo. Por la Figura 4 se puede ver que el compuesto ocasionó desviaciones químicas de los sitios 15N, tales como aquellos designados W124, T187, A199 y G204. Estos sitios corresponden a un residuo de triptófano (Trp) en la posición 124, una treonina (thr) en la posición 187, una alanina (Ala) en la posición 199, y una glicina (Gly) en la posición 204 de la SEQ ID NO : 1. La Figura 9 muestra la correlación entre los datos de fijación de la resonancia magnética nuclear y una vista de la estructura tridimensional derivada de la resonancia magnética nuclear del dominio catalítico de la estromelisina. La capacidad para localizar el sito de fijación específico de un ligando particular es una ventaja de la presente invención.

Algunos compuestos solamente se fijaron a la estromelisina en la presencia de ácido hidroxámico. Por lo tanto, se mejoró la afinidad de fijación de algunos compuestos en la presencia del ácido hidroxámico (es decir cooperativa) . Estos resultados ejemplifican otra capacidad importante del presente ensayo de clasificación: la capacidad para identificar compuestos que se fijan a la proteína en la presencia de otras moléculas . Se probaron diferentes compuestos biarilo de la estructura I para ver su fijación a la estromelisina a diferentes concentraciones. Se evaluaron los espectros de 15N/1H generados a cada concentración, para cuantificar las diferencias en los espectros como una función de la concentración del compuesto. Se calculó una constante de fijación o disociación (KD) , usando procedimientos estándares bien conocidos en la técnica, a partir de esas diferencias. En la Tabla 1 se muestran los resultados de este estudio. Los valores para R1-R3 y A1-A3 en la Tabla 1 se refieren a las posiciones correspondientes en la estructura I, anterior.

Tabla 1 Los datos en la Tabla 1 muestran la utilidad de un proceso de la presente invención en la determinación de las constantes de disociación o fijación entre un ligando y una molécula objetivo. Otra ventaja de un ensayo de clasificación de resonancia magnética nuclear de la presente invención es la capacidad para correlacionar las desviaciones químicas observadas de los espectros de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional con otros espectros o proyecciones de configuración de molécula objetivo. En la Figura 9 se muestran los resultados de una de esas correlaciones representativas, que ilustra las regiones adentro del polipéptido en el que es más probable que ocurra la fijación con la molécula del sustrato. En esta Figura, se muestran las regiones de fijación aparentes en la estromelisina para el Compuesto 1 (de la Tabla l) .

Se clasificaron los compuestos de la base de datos de una manera similar para la fijación al dominio de fijación del ADN de la proteína E2. Esos compuestos tenían la estructura II a continuación, en donde Ri"R4 y A se definen en la Tabla 2.

Los experimentos de resonancia magnética nuclear se realizaron a 29°C en un espectómetro de resonancia magnética nuclear Bruker A X500, equipado con una sonda de resonancia triple e intercambiador de muestra Bruker. Se adquirieron los espectros de correlación cuántica individual heteronuclear de 15N/XH como 80 x 1024 puntos de complejo, usando anchuras de barrido de 2000 Hz (15N, t1) y 8333 Hz (lH, t2) . Se emplearon un retraso de 1 segundo entre las exploraciones y 4 exploraciones por decaimiento de inducción libre (fid) en la recolección de datos. Se procesaron todos los espectros de resonancia magnética nuclear, y se analizaron en computadoras Silicon Graphics . Las Figuras 2 y 3 muestran espectros de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/½, antes y después de la exposición del dominio de fijación de ADN de E2 a un primero y segundo compuestos de prueba, respectivamente. Por la Figura 2 se puede ver que el primer compuesto de prueba ocasionó desviaciones químicas de los sitios de 15N, tales como aquellos designados 115, Y21, R22 y L23. Esos sitios corresponden a un residuo de isoleucina (lie) en la posición 15, un residuo de tirosina (Tyr) en la posición 21, un residuo de arginina (Arg) en la posición 22, y un residuo de leucina (Leu) en la posición 23 de la SEQ ID NO : 6. Por la Figura 3 se puede ver que el segundo compuesto de prueba ocasionó desviaciones químicas en los sitios de 15N particulares designados 16, Gil, H38 y T52. Esos sitios corresponden a un residuo de isoleucina (lie) en la posición 6, un residuo de glicina (Gly) en la posición 11, un residuo de histidina (His) en la posición 38, y un residuo de treonina (Thr) en la posición 52 de la SEQ ID NO : 6. Las Figuras 7 y 8 muestran la correlación entre esos datos de fijación de resonancia magnética nuclear, y una vista de la estructura tridimensional derivada de la resonancia magnética nuclear del dominio de fijación de ADN de E2. Muchos compuestos estructuralmente similares ocasionaron cambios de permutación química de las señales de la proteína, cuando se clasificaron a una concentración de 1 mM. Se encontró que dos conjuntos distintos de resonancias de amida cambiaron sobre la adición de los compuestos: un conjunto de señales que correspondían a las amidas localizadas en el barril ß formado entre los dos monómeros, y un segundo conjunto que correspondía a las amidas localizadas cerca del sitio de fijación del ADN.

Por ejemplo, los compuestos que contenían dos anillos fenilo con un ácido carboxílico unido al carbono que enlazaba los dos anillos solamente ocasionaron cambios de permutación química a las amidas en el sitio de fijación del ADN. En contraste, los compuestos que contenían benzofenonas y fenoxifenilo solamente se fijaron al barril ß. Otros compuestos ocasionaron cambios de permutación química de ambos conjuntos de señales, pero desviaron las señales en cada conjunto en cantidades diferentes, sugiriendo la presencia de dos sitios de fijación distintos. Mediante la supervisión de los cambios de permutación química como una función de la concentración del ligando, también se midieron las constantes de fijación para los dos sitios de fijación. En la Tabla 2 se resumen los resultados de esos estudios.

Tabla 2 Comp. A R. R3 ADN barril ß Ensayo de ñjación No. KD(mM) KD(mM) de filtro 13 CO H H H OH >50 0.6 - 14 0 H H H CH2OH >50 2.0 - 15 a H H COO H 2.0 >50 + 16 a Cl Cl COO H 0.1 >50 + 17 a H H CH2COO H 4.2 4.9 + 18 _a H H CH=CHCOO H 1.2 6.2 + 19 0 H H CH2CH2CH(CH3) H 0.5 0.2 + -CH2COO 20 0 H H COCH2CH2COO H 2.7 4.8 + a un guión (-) para A indica ningún átomo (es decir, enlace bifenilo) .

Se preparó el dominio de fijación Ras etiquetado de manera uniforme con 15N de la proteína RAF como se describe en el Ejemplo 1, y se clasificó usando análisis espectrales de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional , de conformidad con los procedimientos de resonancia magnética nuclear descritos anteriormente. En la Figura 5 se muestran los resultados de un estudio representativo, que ilustra los espectros de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional, tanto antes como después de la exposición a un compuesto de prueba.

Se preparó FKBP etiquetado de manera uniforme con 15N como se describe en el Ejemplo 1, y se clasificó usando análisis espectrales de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional, de conformidad con los procedimientos de resonancia magnética nuclear descritos anteriormente. En la Figura 6 se muestran los resultados de un estudio representativo, que ilustra los espectros de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional , tanto antes como después de la exposición a un compuesto de prueba.

Ejemplo 3 Comparación de Ensayos de Clasificación de NMR, Enzimáticos, de Fijación de Filtro v de Permutación de Gel Se realizaron estudios para comparar las constantes de fijación de los ligandos a diferentes biomoléculas , determinadas mediante el método de resonancia magnética nuclear de la presente invención, con resultados similares obtenidos de los métodos de la técnica anterior. En un primer estudio, se determinaron las constantes de fijación, tanto mediante el método de resonancia magnética nuclear de la presente invención, como mediante un ensayo enzimático de la técnica anterior. La molécula objetivo fue el dominio catalítico de la estromelisina preparada de conformidad con los procedimientos del Ejemplo 1. Las constantes de fijación de resonancia magnética nuclear, KD, se derivaron usando espectroscopia de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional, como se describe en el Ejemplo 2. Se compararon los valores KD así obtenidos con una constante de inhibición Kx, según se determinó en un ensayo enzimático.

El ensayo enzimático midió la velocidad de disociación de un sustrato fluorogénico, por medio de seguir el incremento de fluorescencia sobre la disociación del péptido, que ocasiona una separación entre el fluoróforo y el templador. Se midió la actividad enzimática usando una matriz de diferentes concentraciones de ácido acetohidroxámico y compuestos biarilo. El ensayo es una modificación del método descrito por H. Weingarten, y colaboradores, en Anal . Biochem . , 147:437-440 (1985) , empleando las propiedades del sustrato fluorogénico descritas por E. Matayoshi, y colaboradores, en Science, 247 : 954-958 (1990) . Se usaron ocho concentraciones de ácido acetohidroxámico que variaban desde 0.0 a 1.0 M, y se usaron seis concentraciones del compuesto, dando como resultado un total de 48 puntos. La concentración del compuesto individual varió debido a solubilidad y potencia. Todas las mediciones de resonancia magnética nuclear se realizaron en la presencia de 500 mM de ácido acetohidroxámico, excepto por la titulación del ácido acetohidroxámico mismo. Se obtuvieron las constantes de disociación por la dependencia de los cambios de permutación química observados sobre el ligando añadido. Después se obtuvieron las constantes de inhibición por los datos de inhibición, usando procedimientos estándares. En la Tabla 3 a continuación se resumen los resultados de estos estudios, que muestra la comparación de las constantes de disociación (KD) derivadas de la resonancia magnética nuclear, con las constantes de inhibición medidas en el ensayo de enzima (?t) usando un sustrato fluorogénico.

Tabla 3 Los datos en la Tabla 3 muestran que un proceso de resonancia magnética nuclear de la presente invención proporciona una manera rápida, eficiente y exacta para la determinación de las constantes de disociación o fijación de los ligandos a las biomoléculas objetivo. La comparación de las constantes de fijación determinadas mediante los dos métodos da como resultado el mismo rango de potencias de los compuestos probados. Esto es, aunque los valores para un sustrato dado como se determinan mediante los dos métodos, no son iguales, éstos son proporcionales uno con el otro. En un segundo estudio, los resultados para la fijación del dominio de fijación de ADN de E2 a su ADN objetivo se obtuvieron mediante los métodos de la técnica anterior, y se compararon con los resultados obtenidos mediante el método de la presente invención. El objetivo fue el dominio de fijación de ADN de E2, preparado de conformidad con los procedimientos del Ejemplo 1. Se realizaron ensayos de clasificación de resonancia magnética nuclear, y procesos de resonancia magnética nuclear para la determinación de las constantes de disociación del ligando, como se expone anteriormente en el Ejemplo 2. La constante de fijación del proceso de resonancia magnética nuclear se comparó con los resultados de un ensayo de fijación de filtro, físico que midió la fijación de ADN al objetivo. Se realizó el ensayo de fijación de filtro de alto rendimiento usando E2 , preparado de conformidad con el Ejemplo 2 anterior. La construcción de ADN etiquetado con 33P comprendió un plásmido de 10,329 pares de bases formado mediante la inserción del genoma HPV-11, que contenía tres sitios de fijación de E2 de alta afinidad y uno de baja afinidad, en el plásmido PSP-65 (Promega, Madison, WI) . Se compararon las afinidades de fijación en los diferentes sitios, según se determinaron mediante resonancia magnética nuclear, para un subconjunto de los compuestos para la inhibición de la fijación de E2 al ADN, según se midió en el ensayo de fijación de filtro. Como se muestra en la Tabla 2 anterior, las actividades determinadas en el ensayo de fijación de filtro se correlacionaron cercanamente con las afinidades de fijación calculadas por las amidas del sitio de fijación de ADN, pero no con las afinidades medidas para el sitio de barril ß. Esto es consistente con las ubicaciones relativas de cada sitio.

En un estudio alternativo, se hizo una comparación de los resultados de fijación determinados por resonancia magnética nuclear, con resultados similares obtenidos mediante un ensayo de permutación de gel de la técnica anterior, usando técnicas bien conocidas en la técnica. El ensayo de permutación de gel se realizó usando una proteína de fusión GST que contenía E2 de longitud completa y un fragmento de ADN de 62 pares de bases etiquetado con 33P, que contenía dos sitios de fijación a E2. El método identificó numerosos compuestos que dieron resultados positivos en el ensayo de permutación de gel. Se cree, sin embargo, que algunos de estos resultados positivos son debido a la fijación al ADN, puesto que en estos casos, no se observó ninguna fijación a la proteína E2 usando el método de resonancia magnética nuclear de esta invención. Se mostró que estos compuestos efectivamente se fijan al ADN más bien que a E2 , como es evidente por los cambios en las permutaciones químicas del ADN más bien que de la proteína sobre la adición de los compuestos. Estos datos muestran que todavía otra ventaja de la presente invención es la capacidad para minimizar la ocurrencia de positivos falsos.

Ejemplo 4 Diseño de un inhibidor potente, no péptido de estromelisina Se realizaron estudios para diseñar nuevos ligandos que se fijen al dominio catalítico de la estromelisina . Debido a que la estromelisina pasa por la autodestrucción por acción de las lisinas, se buscó un inhibidor para bloquear la degradación de la estromelisina. Ese inhibidor facilitaría la clasificación de otros ligandos potenciales que se fijaran a otros sitios en la enzima. Los criterios que se usaron para la selección de los compuestos en la clasificación para otros sitios de fijación se basaron principalmente en el tamaño del ligando. Se buscó el ligando más pequeño que tuviera suficiente solubilidad para saturar (>98 por ciento de ocupación de la enzima) e inhibir la enzima. Se consiguió la clonación, expresión, y purificación del dominio catalítico de la estromelisina usando los procedimientos expuestos en el Ejemplo 1. Un paso inicial en el diseño del nuevo ligando fue la identificación de un primer ligando que se fijara al objetivo estromelisina. Esta identificación se llevó a cabo de conformidad con un proceso de clasificación de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional , como se describió anteriormente. Se clasificaron una diversidad de ácidos hidroxámicos de la fórmula general R-(CO)NHOH por su fijación a la estromelisina, usando los procedimientos expuestos en el Ejemplo 2. De los compuestos probados, el ácido acetohidroxámico [CH3 (CO) HOH] satisfizo mejor los criterios de selección: éste tuvo una afinidad de fijación por la estromelisina de 17 mM y tuvo muy buena solubilidad en agua. A una concentración de 500 mM, el ácido acetohidroxámico inhibió la degradación de la enzima, permitiendo la clasificación de otros ligandos potenciales. El segundo paso en el proceso de diseño fue la identificación de un segundo ligando que se fijara a la estromelisina objetivo en un sitio diferente del sitio de fijación del ácido acetohidroxámico. Esto se consiguió mediante la clasificación de los compuestos por su capacidad para fijarse a la estromelisina en la presencia de cantidades de saturación de ácido acetohidroxámico. Los detalles de los procedimientos y resultados de este segundo paso de identificación se exponen anteriormente en el Ejemplo 2. El compuesto identificado como un segundo ligando por estos estudios, y que se usó en los pasos de diseño subsecuentes, fue el compuesto designado como Compuesto #4 en la Tabla 1 (Ver el Ejemplo 2) . El siguiente paso en el proceso de diseño fue construir un complejo ternario de la estromelisina objetivo, el primer ligando y el segundo ligando. Esto se logró mediante la exposición del objetivo estromelisina a los dos ligandos, bajo condiciones que dieron como resultado la formación del complejo. Entonces se determinó la estructura tridimensional del complejo ternario usando espectroscopia de resonancia magnética nuclear, como se describe posteriormente. Se asignaron las resonancia de estructura base XH, 13C, y 15N de la estromelisina en el complejo ternario, por un análisis de muchos espectros de resonancia magnética nuclear de tercera dimensión de resonancia doble y triple (A. Bax, y colaboradores, Acc. Chem. Res., 26:131-138 (1993)) . Se identificaron las resonancias Ca de sistemas de giro adyacentes por un análisis de HNCA tridimensional (3D) (L. Kay, y colaboradores, J. Magn. Reson. , 89:496-514 (1990)) y se registraron los espectros de HN(CO)CA (A. Bax, y colaboradores, J. Bio. NMR, 1:99 (1991)) con anchuras espectrales idénticos de 1773 Hz (35.0 ppm) , 3788 Hz (30.1 ppm) , y 8333 Hz (16.67 ppm) en las dimensiones FX(15N), F2(13C) y F3(1H) , respectivamente.

La matriz de datos fue 38 (tx) x 48 (t2) x 1024 (t3) puntos de complejo para el espectro de HNCA, y 32 (tx) x 40 (t2) x 102 (t3) puntos de complejo para el espectro HN(CO)CA. Ambos espectros se adquirieron con 16 exploraciones por incremento. Se recolectó un espectro de CBCA(CO)NH tridimensional (S. Grzesiek, y colaboradores, J . Am . Chem . Soc . , 114:6261-6293 (1992)) con 32 (tx, 15N) x 48 (t2, 13C) x 1024 (t3, ½í) puntos de complejo y 32 exploraciones por incremento. Las anchuras espectrales fueron 1773 Hz (35.0 ppm), 7575.8 Hz (60.2 ppm), y 8333 Hz (16.67 ppm) en las dimensiones 15N, 13C, y 1H, respectivamente . Para los tres espectros, se estableció la frecuencia portadora 1H en la resonancia de agua, y la frecuencia portadora 15N fue a 119.1 ppm. La frecuencia portadora 13C se estableció a 55.0 ppm en los experimentos HNCA y HN(C0)CA, y a 46.0 ppm en el experimento CBCA(CO)NH. Las asignaciones de estructura base se confirmaron por un análisis de los picos cruzados que se observaron en un espectro NOESY-HSQC tridimensional separado en 15N, y un espectro HNHA-J tridimensional. Se recolectó el espectro NOESY-HSQC tridimensional separado en 15N (S. Fesik, y colaboradores, J. Maan. Reson. , 87:588-593 (1988); D. Marión, y colaboradores, J . Am . Chem . Soc . , 111:1515-1517 (1989)) con un tiempo de mezclado de 80 minutos. Se recolectaron un total de 68 (t1( 15N) x 96 (t2, ½) x 1024 (t3, 1H) puntos de complejo con 16 exploraciones por incremento, y las anchuras espectrales fueron 1773 Hz (35.0 ppm) para la dimensión 15N, 6666.6 Hz (t2, 1H, 13.3 ppm), y 8333 Hz (16.7 ppm) para la dimensión 1H. El espectro de HNHA-J tridimensional (G. Vuister, y colaboradores, J . Am . Chem . Soc . , 115:7772-7777 (1993)), que también se usó para obtener las constantes de acoplamiento de 3JHNHa, se adquirió con 35 (t1( 15N) x 64 (t2, LH) x 1024 (t3, ½) puntos de complejo y 32 exploraciones por incremento. Las anchuras espectrales y las frecuencias portadoras fueron idénticas a aquellas del espectro NOESY-HSQC separado en 15N. Muchas de las señales H se asignaron usando el experimento HNHB . Las anchuras de barrido fueron las mismas que en el espectro NOESY-HSQC separado en 15N que se adquirió con 32 (tx, 15N) x 96 (t2, ½) x 1024 (t3, ½) puntos de complejo. Las permutaciones químicas de 1H y 13C se asignaron para casi todas las resonancias de cadena lateral. Se adquirió un espectro de HCCH-TOCSY tridimensional (L. Kay, y colaboradores, J . Magn . Reson . , 101b:333-337 (1993)) con un tiempo de mezclado de 13 minutos, usando la secuencia DIPSI-2 (S. Rucker, y colaboradores, Mol . Phvs . , 68:509 (1989)) para el mezclado isotrópico de 13C. Se recolectaron un total de 96 (t1, 13C) x 96 (t2, ½) x 1024 (t3, 1H) puntos de datos de complejo, con 16 exploraciones por incremento, usando una anchura espectral de 10638 Hz (70.8 ppm. WL) , 4000 Hz (6.67 ppm, w2) , y 4844 (8.07 ppm, w3) . Las posiciones portadoras fueron 40 ppm, 2.5 ppm, y a la frecuencia del agua para las dimensiones 13C, ½ detectada indirectamente, y ½ observada, respectivamente. Se realizó otro estudio HCCH-TOCSY tridimensional con el portador 13C a 122.5 ppm para asignar los residuos aromáticos. Se recolectaron los espectros con 36 (tlr 13C) x 48 (t2/ ¾ x 1024 (t3, ½) puntos de complejo, con anchuras espectrales de 5263 Hz (35.0 ppm. wx) , 3180 Hz (5.30 ppm, w2) , y 10,000 (16.7 ppm, w3) . Las posiciones portadoras fueron 122.5 ppm, 7.5 ppm, y a la frecuencia del agua para las dimensiones 13C, ½ detectada indirectamente, y 1H observada, respectivamente . Se registró un espectro de NOESY-HMQC tridimensional separado en 13C (S. Fesik, y colaboradores, J. Maan. Reson. , 87:588-593 (1988); D. Marión, y colaboradores, J . Am . Chem . Soc . , 111:1515-1517 (1989)) usando un tiempo de mezclado de 75 minutos. Se recolectaron un total de 80 (tx, 13C) x 72 (t2, LH) x 1024 (t3, ½) puntos de datos de complejo con 16 exploraciones por incremento, sobre las anchuras espectrales de 10638 Hz (70.49 ppm, W-L) , 6666.6 Hz (13.3 ppm, w2) , y 8333.3 Hz (16.67 ppm, w3) . Las frecuencias portadoras ½ se establecieron a la resonancia del agua, y la frecuencia portadora 13C se colocó a 40.0 ppm. Las asignaciones estereoespecíficas de los grupos metilo de los residuos de valina y leucina se obtuvieron usando un planteamiento biosintético (Neri y colaboradores, Biochem.. 28:7510-7516 (1989)) sobre la base del patrón de acoplamiento de un enlace 13C-13C, observado en un espectro de ½, 13C-HSQC de alta resolución (G. Bodenhausen, y colaboradores, J . Chem . Phvs . Lett . , 69:185-189 (1980)) de una muestra de proteína etiquetada de manera fraccionaria con 13C. El espectro se adquirió con 200 (13C, tx) x 2048 (½, t2) puntos de complejo sobre anchuras espectrales de 5000 Hz (39.8 ppm, 13C) y 8333 Hz (16.7 ppm, LH) . Las posiciones portadoras fueron 20.0 ppm para la dimensión 13C, y a la frecuencia del agua para la dimensión ½. Para detectar los efectos nucleares de Overhauser entre los dos ligandos y la proteína, se recolectó el espectro NOESY editado por 13C, filtrado en 12C tridimensional. El esquema de impulso consistió de una secuencia de filtro en 13C doble (A. Gemmeker, y colaboradores, J. Magn. Reson. , 96:199-204 (1992)) concatenado con una secuencia NOESY-HMQC (S. Fesik, y colaboradores, J . Magn . Reson . , 87:588-593 (1988); D. Marión, y colaboradores, J . Am . Chem . Soc . , 111:1515-1517 (1989)). Se registró el espectro con un tiempo de mezclado de 80 minutos, y un total de 80 (tlf 13C) x 80 (t2, ½) x 1024 (t3, ??) puntos de complejo con 16 exploraciones por incremento. Las anchuras espectrales fueron 8865 Hz (17.33 ppm, w-_) , 6667 Hz (13.33 ppm, w2) , y 8333 Hz (16.67 ppm, w3) , y las posiciones portadoras fueron 40.0 ppm para la dimensión del carbono, y a la frecuencia del agua para ambas dimensiones del protón. Para identificar los grupos amida que se intercambiaron lentamente con el solvente, se registraron una serie de espectros de 1H, 15N-HSQC (G. Bodenhausen, y colaboradores, J. Chem. Phys. Lett., 69:185-189 (1980)) a 25°C a intervalos de 2 horas, después que la proteína se intercambió en D20. La adquisición del primer espectro HSQC empezó 2 horas después de la adición de D20. Se registraron todos los espectros de resonancia magnética nuclear a 25°C en un espectómetro de resonancia magnética nuclear Bruker AMX500 ó AMX600. Se procesaron los datos de la resonancia magnética nuclear, y se analizaron en computadoras Silicon Graphics. En todos los experimentos de resonancia magnética nuclear, se aplicaron gradientes de campo impulsados en donde era apropiado según se describe (A. Bax, y colaboradores, J. Magn. Reson. , 99:638 (1992)) para producir la supresión de la señal del solvente y los artefactos espectrales. Se consiguió la detección de cuadratura en las dimensiones detectadas de manera indirecta mediante el uso del método States-TPPI (D. Marión, y colaboradores, J . Am . Chem . Soc . , 111:1515-1517 (1989)). Se empleó predicción lineal según se describe (E. Olejniczak, y colaboradores, J. Magn. Reson. , 87:628-632 (1990) ) . Después se usó la estructura tridimensional derivada del complejo ternario para definir la orientación espacial del primero y segundo ligandos uno con el otro, así como con la molécula objetivo de estromelisina . Se clasificaron las restricciones de distancia por los datos del efecto nuclear de Overhauser en seis categorías basadas en la intensidad de pico cruzado del efecto nuclear de Overhauser, dados un enlace inferior de 1.8 Angstroms y enlaces superiores de 2.5 Angstroms, 3.0 Angstroms, 3.5 Angstroms, 4.0 Angstroms, 4.5 Angstroms, y 5.0 Angstroms, respectivamente. Las restricciones para los ángulos de torsión f se derivaron de las constantes de acoplamiento de 3JHNHOÍ medidas del espectro de HNHA-J tridimensional (G. Vuister, y colaboradores, J. Am. Chem . Soc . , 115:7772-7777 (1993)). Se restringió el ángulo f a 120 por ciento ± 40 por ciento para 3JHNHa>8.5 Hz, y 60 por ciento ± 40 por ciento para 3JHNHa<5 Hz . Se definieron los enlaces de hidrógeno, identificados para amidas que se intercambiaban lentamente, en base a las estructuras iniciales, mediante dos restricciones: 1.8-2.5 Amstrongs para la distancia H-0 y 1.8-3.3 Amstrongs para la distancia N-O. Se calcularon las estructuras con el programa X-PLOR 3.1 (A. Brünger, "XPLOR 3.1 Manual", Yale University Press, New Haven, 1992) en computadoras Silicon Graphics, usando un planteamiento de recocido simulado por geometría de distancia híbrida (M. Nilges, y colaboradores, FEBS Lett . , 229 :317-324 (1988) ) . Se derivaron un total de 1032 restricciones de distancia entre protones aproximadas de los datos NOE . En adición, se derivaron 21 restricciones de distancia intermolecular no ambiguas de un espectro NOESY editado por 13C, filtrado en 12C tridimensional. De las 1032 restricciones NOE que envolvieron la proteína, 341 fueron intra-residuo, 410 fueron secuenciales o de rango corto entre residuos separados en la secuencia primaria, por menos de cinco amino ácidos, y 281 fueron de rango largo que envolvían residuos separados por cuando menos cinco residuos. En adición a las restricciones de distancia NOE, se incluyeron 14 restricciones de ángulo diedro f en los cálculos de estructura que se derivaron de las constantes de acoplamiento de tres enlaces (3JNHNa) determinadas por un espectro H HA-J (G. Viioster, y colaboradores, J . Am . Chem. Soc . , 115:7772-7777 (1993)). Las restricciones experimentales también incluyeron 120 restricciones de distancia que correspondían a 60 enlaces de hidrógeno. Las amidas envueltas en los enlaces de hidrógeno se identificaron en base a su velocidad de intercambio característicamente lenta, y los asociados del enlace de hidrógeno de las estructuras de resonancia magnética nuclear iniciales calculadas sin las restricciones del enlace de hidrógeno. El número total de restricciones no redundantes, derivadas de manera experimental, fue de 1166. Las estructuras estuvieron en excelente acuerdo con las restricciones experimentales de resonancia magnética nuclear. No hubo violaciones de distancia mayores de 0.4 Amstrongs, y no hubo ninguna violación de ángulo diedro mayor de 5 grados. En adición, la energía simulada para el término de repulsión de van der Waals fue pequeña, indicando que las estructuras estaban exentas de malos contactos interatómicos . Las estructuras de resonancia magnética nuclear también exhibieron buena geometría de enlace covalente, como se indica por las pequeñas desviaciones de longitud de enlace y ángulo de enlace de los parámetros idealizados correspondientes. La desviación media de raíz cuadrada atómica promedio de las 8 estructuras para los residuos 93-247 de las coordinadas medias fue de 0.93 Amstrongs para los átomos de la estructura base (Ca, , y C ) , y 1.43 Amstrongs para todos los átomos no de hidrógeno . En la Figura 10 se muestra una gráfica de bandas de un complejo ternario que envolvía la estromelisina, el ácido acetohidroxámico (el primer ligando) , y el segundo ligando. La estructura es muy similar al doblez global de otras metaloproteinasas de matriz, y consiste de una hoja ß de cinco cadenas y tres hélices a. El zinc catalítico se localizó en la cavidad de fijación. Este se coordinó con tres histidinas y los dos átomos de oxígeno del ácido acetohidroxámico. Se localizó un grupo biarilo del segundo ligando en la cavidad SI' entre la segunda hélice y el círculo formado de los residuos 218-223. Esta cavidad profunda y estrecha está recubierta con residuos hidrofóbicos que hacen contactos favorables con el ligando. En base a la estructura tridimensional del complejo ternario, como se determinó anteriormente, y las relaciones de estructura/actividad observadas para la fijación a la estromelisina de los análogos estructurales del segundo ligando (es decir, otros compuestos biarilo) , se diseñaron nuevas moléculas que enlazaban juntos el ácido acetohidroxámico a los biarilos . Como se muestra en la Tabla 4 a continuación, los biarilos iniciales escogidos contenían un enlazador de oxígeno y la ausencia o presencia de CN para el enlace biarilo. Los enlazadores iniciales contenían longitudes variables de unidades de metileno. En la técnica son bien conocidos los medios para enlazar compuestos con los enlazadores que tienen longitudes variables de unidades de metileno.

Tabla 4 Como se esperaba en base a la mejor fijación de los biarilos sustituidos con CN a la estromelisina, los derivados de CN exhibieron mejor inhibición de la estromelisina. El compuesto que exhibió la mejor inhibición de estromelisina contenía un enlazador con dos unidades de metileno. Se ha descrito la presente invención con referencia a las modalidades preferidas. Esas modalidades no son limitantes de las reivindicaciones ni de la especificación de ninguna manera. Uno de experiencia ordinaria en la técnica puede prever rápidamente cambios, modificaciones y alteraciones a esas modalidades, que no se apartan del alcance y el espíritu de la presente invención.

LISTADOS DE SECUENCIA (1) INFORMACION GENERAL: (i) SOLICITANTE: Fesik, Stephen W.

Hajduk, Philip J. (ii) TITULO DE LA INVENCION : Uso de Resonancia Magnética Nuclear para Identificar Ligandos Dirigidos a Biomoléculas (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 6 (iv) DIRECCION PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Steven F. Weinstock, Dept. 377 AP6D, Abbott Laboratories (B) CALLE: 100 Abbott Park Road (C) CIUDAD: Abbott Park (D) ESTADO: Illinois (E) PAIS: Estados Unidos de Norteamérica (F) CODIGO POSTAL: 60064-3500 (vi) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS ACTUALES DE SOLICITUD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACION: (C) CLASIFICACION: (viii) INFORMACION DEL ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Janssen, Jerry F.

(B) NUMERO DE REGISTRO: 29,175 (ix) INFORMACION DE TELECOMUNICACION: (A) TELEFONO: (708) 937-4558 (B) TELEFAX: (708) 938-7742 INFORMACION PARA LA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 174 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: péptido (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 : Phe Arg Thr Phe Pro Gly lie Pro Lys Trp Arg Lys Thr 1 5 10 His Leu Thr Tyr Arg lie Val Asn Tyr Thr Pro Asp Leu 15 20 25 Pro Lys Asp Ala Val Asp Ser Ala Val Glu Lys Ala Leu 30 35 Lys Val Trp Glu Glu Val Thr Pro Leu Thr Phe Ser Arg 40 45 50 Leu Tyr Glu Gly Glu Ala Asp lie Met lie Ser Phe 55 60 Ala Val Arg Glu His Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly 65 70 75 Pro Gly Asn Val Leu Ala His Ala Tyr Ala Pro Gly Pro 80 85 90 Gly lie Asn Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Gln 95 100 Trp Thr Lys Asp Thr Thr Gly Thr Asn Leu Phe Leu Val 105 110 115 Ala Ala His Glu lie Gly His Ser Leu Gly Leu Phe 120 125 His Ser Ala Asn Thr Glu Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr 130 135 140 His Ser Leu Thr Asp Leu Thr Arg Phe Arg Leu Ser Gln 145 150 Asp Asp lie Asn Gly lie Gln Ser Leu Tyr Gly Pro Pro 155 160 165 Pro Asp Ser Pro Glu Thr Pro 170 INFORMACION PARA LA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 83 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: péptido (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : Met Ala Thr Thr Pro lie lie His Leu Lys Gly Asp Ala 5 10 Asn lie Leu Leu Cys Leu Arg Tyr Arg Leu Ser Lys Tyr 15 20 25 Lys Gln Leu Tyr Glu Gln Val Ser Ser Thr Trp His Trp 30 35 Thr Cys Thr Asp Gly Lys His Lys Asn Ala lie val Thr 40 45 50 Leu Thr Tyr lie Ser Thr Ser Gln Arg Asp Asp Phe Leu 55 60 65 Asn Thr Val Lys lie Pro Asn Thr val ser val Ser Thr 70 75 Gly Tyr Met Thr lie 80 INFORMACION PARA LA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 GAAATGAAGA GTCTTCAA 18 INFORMACION PARA LA SEQ ID NO : : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 4 GCGTCCCAGG TTCTGGAG 18 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 5 : ATACCATGGC CTATCCATTG GATGGAGC 28 (2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO : 6 : (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGIA: lineal (ii) TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6: ATAGGATCCT TAGGTCTCAG GGGAGTCAGG 30

Claims (7)

L 76 REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la clasificación de compuestos para identificar compuestos que sean ligandos que se fijen a una molécula objetivo específica, que comprende los pasos de: a) generar un primer espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional de una molécula objetivo etiquetada de manera uniforme con 15N; b) exponer la molécula objetivo etiquetada a un compuesto químico o una mezcla de compuestos químicos; c) generar un segundo espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/½ bidimensional de la molécula objetivo etiquetada que se ha expuesto a un compuesto o una mezcla de compuestos en el paso (b) ; y d) comparar el primero y segundo espectros de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional para determinar las diferencias entre el primero y segundo espectros, las diferencias identificando la presencia de uno o más compuestos que son ligandos que se han fijado a la molécula objetivo.

2. El proceso de la reivindicación 1, en donde la molécula objetivo etiquetada con 15N que se expone a una mezcla de compuestos químicos en el paso (b) , también comprende los pasos subsecuentes al paso d) de e) exponer la molécula objetivo etiquetada con 15N 77 individualmente a cada compuesto de la mezcla, f) generar un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional de la molécula objetivo etiquetada, que se ha expuesto individualmente a cada compuesto,- y g) comparar cada espectro generado en el paso f) con el primer espectro, para determinar las diferencias en cualquiera de esos espectros comparados, las diferencias identificando la presencia de un compuesto que es un ligando que se ha fijado a la molécula objetivo.

3. El proceso de la reivindicación 1, en donde las diferencias en los espectros de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional son permutaciones químicas en los sitios particulares etiquetados con 15N en la molécula objetivo, y permutaciones químicas en los protones unidos a esos sitios etiquetados con 15N.

4. El proceso de la reivindicación 1, en donde la molécula objetivo es un polipéptido.

5. Un proceso para determinar la constante de disociación entre una molécula objetivo y un ligando que se fija a esa molécula objetivo, que comprende los pasos de: a) generar un primer espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H bidimensional de una molécula objetivo etiquetada con 15N; b) exponer la molécula objetivo etiquetada a I 78 diferentes concentraciones de un ligando; c) generar un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear de 15N/1H tridimensional a cada concentración de ligando en el paso (b) ; d) comparar cada espectro del paso (c) tanto con el primer espectro del paso (a) , como con todos los otros espectros del paso (c) , para cuantificar las diferencias en esos espectros como una función de los cambios en la concentración del ligando; y e) calcular la constante de disociación entre la molécula objetivo y el ligando por esas diferencias, de conformidad con la ecuación: en donde [P] 0 es la concentración molar total de la molécula objetivo; [L] 0 es la concentración molar total del ligando; y x es la concentración molar de las especies fijadas, determinada de conformidad con la ecuación: x = ¿obs " 5free ? en donde 5obs y ¿free son °s valores de las permutaciones químicas para la molécula objetivo, determinados a cada concentración del ligando, y para la molécula objetivo en la ausencia del ligando, respectivamente, y ? es la diferencia entre la permutación química a las cantidades de saturación del ligando y 6free.

6. El proceso de la reivindicación 5, en donde la molécula objetivo es un polipéptido.

7. El proceso de la reivindicación 5, caracterizado porque además comprende el paso de fijar la molécula objetivo etiquetada a un segundo ligando antes del paso (a) .