ES2264930T3 - Utilizacion de resonancia magnetica nuclear 13c para detectar uniones. - Google Patents

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Abstract

Un método para detectar la unión entre un ligando putativo y una molécula diana preseleccionada, enriquecida con 13C, que comprende: a) generar un primer espectro de correlación RMN 13C/1H bidimensional de dicha molécula diana; b) formar una mezcla de dicha molécula diana con al menos un compuesto ligando putativo; c) generar un segundo espectro de correlación RMN 13C/1H bidimensional de la mezcla de la etapa b); y d) comparar el primer y segundo espectros; en donde dicha molécula diana se prepara cultivando una línea celular transformada, que contiene un vector de expresión conteniendo un polinucleótido que codifica dicha molécula diana, en un medio conteniendo un precursor biosintético de un aminoácido seleccionado del grupo que se compone de ácido -cetobutírico 4-(13C) y ácido - cetometilbutírico 4-(13C)-3-(13C).

Description

Utilización de resonancia magnética nuclear ^{13}C para detectar uniones.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al empleo de resonancia magnética nuclear para detectar la unión entre un ligando putativo y unas moléculas diana preseleccionadas, enriquecidas con ^{13}C.
Antecedentes de la invención
Una de las herramientas más poderosas para descubrir nuevos fármacos prototipo es el escrutinio aleatorio de bibliotecas de productos, sintéticos y naturales, para descubrir compuestos que se unan a una molécula diana concreta (por ejemplo, la identificación de ligandos para esa diana). Utilizando este método, los ligandos pueden ser identificados por su capacidad para formar una asociación física con una molécula diana, o por su capacidad para alterar una función de una molécula diana.
Cuando se busca la unión física, típicamente se expone una molécula diana a uno o más compuestos sospechosos de ser ligandos, y se realizan ensayos para determinar si se forman complejos entre la molécula diana y uno o más de aquellos compuestos. Tales ensayos, como se conoce en la técnica, comprueban cambios groseros en la molécula diana (por ejemplo, cambios en tamaño, carga, movilidad) que indican la formación de complejos.
Donde se midan cambios funcionales, se establecen condiciones de ensayo que permitan la medición de un suceso biológico o químico relacionado con la molécula diana (por ejemplo, una reacción catalizada enzimáticamente, la activación enzimática mediada por receptor, y otros). Para identificar una alteración, se determina la función de la molécula diana antes y después de la exposición a los compuestos de ensayo.
Se han utilizado con éxito ensayos físicos y funcionales existentes para identificar nuevos fármacos prototipo para su uso en diseñar compuestos terapéuticos. Sin embargo, hay limitaciones inherentes para aquellos ensayos que comprometen su exactitud, fiabilidad y eficacia. Un problema principal con los ensayos existentes, por ejemplo, tiene que ver con la generación de "falsos positivos". En un ensayo funcional típico, un resultado "falso positivo" es generado por un compuesto que active el ensayo, pero el cual compuesto no es eficaz para obtener la respuesta fisiológica deseada. En un ensayo físico típico, un "falso positivo" es un compuesto que, por ejemplo, se une él mismo a la diana pero de una manera no específica (por ejemplo, unión no específica). Los falso positivos son particularmente predominantes y problemáticos cuando se escrutan concentraciones más altas de ligandos putativos, porque muchos compuestos tienen efectos no específicos a aquellas concentraciones.
De modo similar, los ensayos existentes están frecuentemente acosados por el problema de los "falso negativos", que se producen cuando un compuesto da una respuesta negativa en el ensayo pero, como se descubre posteriormente mediante otro método, es realmente un ligando para la diana. Los resultados falso negativos ocurren típicamente en ensayos que utilizan concentraciones de compuestos de ensayo que son demasiado altas (produciendo toxicidad) o demasiado bajas con respecto a la constante de unión o de disociación del compuesto a la diana.
Otro problema con los ensayos existentes es la limitada cantidad de información que es proporcionada por el ensayo mismo. Aunque el ensayo pueda identificar correctamente compuestos que se unen u obtienen una respuesta de la molécula diana, típicamente aquellos ensayos no proporcionan ninguna información acerca de los sitios de unión específica en la molécula diana o de las relaciones estructura-actividad entre el compuesto a ensayar y la molécula diana. La incapacidad para proporcionar cualquiera de tales informaciones es particularmente problemática donde el ensayo de escrutinio está siendo utilizado para identificar prototipos para su estudio adicional.
Se ha sugerido recientemente que la cristalografía por rayos X puede ser utilizada para identificar los sitios de unión de disolventes orgánicos en macromoléculas. Sin embargo, este método no puede determinar las afinidades relativas de unión en sitios diferentes en la diana. Es aplicable únicamente para proteínas diana muy estables que no se desnaturalicen en presencia de concentraciones altas de disolventes orgánicos. Además, debido al mucho tiempo necesario para determinar las estructuras cristalinas individuales, este enfoque no es un método apropiado para ensayar rápidamente un gran número de compuestos que sean químicamente diversos, solamente se limita a trazar el mapa de los sitios de unión de únicamente unos pocos disolventes orgánicos.
En la Patente de los Estados Unidos Nº^{s} 5.698.401 y 5.804.390, según Fesik y col., se revelan métodos rápidos, eficaces, y fiables para determinar la unión ligando/diana, y trazar el mapa de los sitios de unión en la sustancia diana. Estas patentes revelan métodos para detectar la unión de un compuesto ligando a una biomolécula diana, generando un primer y segundo espectros de correlación por resonancia magnética nuclear de biomoléculas diana que han sido isotópicamente enriquecidas con el núcleo ^{15}N detectable mediante RMN. El primer espectro se genera a partir de los datos recogidos en la sustancia diana en ausencia de ligandos, y el segundo en presencia de uno o más ligandos. Una comparación de los dos espectros permite la determinación de qué compuestos en la mezcla de ligandos putativos se unen a la biomolécula diana, así como información específica acerca del sitio de unión. Puesto que los métodos logran información acerca de los sitios de unión en la molécula diana, los métodos se pueden utilizar para optimizar el diseño de ligandos para una diana preseleccionada.
Porque los métodos de RMN de Fesik y col., anteriores, requieren sustancias diana conteniendo nitrógeno debido a la dependencia de aquellos métodos del enriquecimiento isotópico de la molécula diana con ^{15}N, sería una contribución valiosa para la técnica proporcionar un método alternativo que emplee un tipo diferente de molécula diana enriquecida isotópicamente.
Fejzo J. y col., Protein Science, vol. 5, nº 9, 1996, páginas 1.917-1.921, revela un método para detectar la unión entre un ligando putativo (subunidad B de calcineurina: CnB) y una molécula diana preseleccionada, enriquecida con ^{13}C (un complejo FK506-FKBP.^{12/13}C).
Fesik, S. W. y col., J. Am. Chem. Soc., vol. 113, 1991, páginas 7.080-7.081, revela un método para detectar la unión entre un ligando putativo (ciclofilina) y una molécula diana preseleccionada (ciclosporina A), enriquecida con ^{13}C.
Gardner, K. H. y col., J. Am. Chem. Soc., vol. 119, 1997, páginas 7.599-7.600, revela un método para generar proteínas marcadas uniformemente con ^{13}C, vía la fuente de ^{12}C-^{2}H glucosa.
Gardner, K. H. y col., J. Am. Chem. Soc., vol. 120, 1998, páginas 11.738-11.748, revela un método para marcar proteínas uniformemente con ^{15}N, ^{13}C, y ^{2}H, y la utilidad de muestras marcadas de esta manera.
Sumario de la invención
La invención actual proporciona un método para detectar la unión entre uno o más ligandos putativos a una molécula diana preseleccionada, enriquecida con ^{13}C.
La invención actual proporciona además un método para escrutar una mezcla de compuestos para unirse a una molécula diana preseleccionada, enriquecida con ^{13}C.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra un espectro de correlación ^{13}C/^{1}H de FKBP marcada uniformemente con ^{13}C.
La Figura 2 ilustra las regiones metilo de los espectros de correlación ^{13}C/^{1}H de FKBP marcada uniformemente con ^{13}C, antes (múltiples contornos finos) y después (contornos sencillos gruesos) de la adición de 2-fenilimidazol (0'12mM).
La Figura 3 ilustra las regiones metilo de los espectros de correlación ^{13}C/^{1}H de FKBP marcada selectivamente con ^{13}C/^{15}N/^{2}H en los residuos valilo y leucilo, antes (múltiples contornos finos) y después (contornos sencillos gruesos) de la adición de 2-fenilimidazol (0'25mM).
La Figura 4 ilustra las regiones metilo de los espectros de correlación ^{13}C/^{1}H de FKBP marcada selectivamente con ^{13}C en los residuos alanilo, antes (múltiples contornos finos) y después (contornos sencillos gruesos) de la adición de 2-fenilimidazol (0'25mM).
La Figura 5 ilustra una representación por el "modelo de palos" de la estructura tridimensional de FKBP.
Descripción detallada de la invención
Los términos utilizados por toda esta especificación tienen sus significados aceptados habitualmente. Los siguientes términos específicos tienen los significados atribuidos.
"DTT" significa ditiotreitol.
"FKBP" se refiere a la proteína de unión FK.
"HEPES" representa ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etilsulfónico.
"IPTG" significa isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido.
"PMSF" se refiera a fluoruro de \alpha-toluensulfonilo.
"DCE" se refiere al dominio catalítico (residuos 81-256) de estromelisina.
En los métodos de la presente invención se puede utilizar cualquier biomolécula diana que dé un espectro de RMN de alta resolución, y que pueda ser uniforme o selectivamente enriquecida con ^{13}C. Estos métodos son aplicables, de este modo, a cualquier biomolécula diana deseada enriquecida con ^{13}C, incluyendo lipoproteínas, fragmentos de lipoproteínas, glicoproteínas, fragmentos de glicoproteínas, proteínas, fragmentos de proteínas, polipéptidos, ADN y ARN. La abundancia isotópica natural de ^{13}C es del 1'11%, Así, la probabilidad de que algún átomo de carbono dado en una molécula orgánica sea ^{13}C es, normalmente, de 0'0111.
Para aumentar la intensidad de una señal de RMN que muestre datos relacionados con el acoplamiento de espín entre el núcleo de un átomo de carbono ^{13}C y cualquiera de los átomos de hidrógeno adyacentes, es conveniente aumentar el contenido natural de ^{13}C de la molécula diana a estudiar. Esto se lleva a cabo enriqueciendo, uniforme o selectivamente, la molécula diana con ^{13}C. Como se utiliza por toda esta especificación y reivindicaciones adjuntadas, los términos "enriquecimiento uniforme", "enriqueciendo uniformemente", "enriquecida uniformemente", marcaje uniforme", y "marcada uniformemente" significan incrementar hasta un valor mayor de 0'0111, mediante medios sintéticos, la probabilidad de que un átomo de carbono, seleccionado al azar por toda la molécula diana, sea ^{13}C. Por otra parte, los términos "enriquecimiento específico", "enriqueciendo específicamente", "enriquecido específicamente", marcando específicamente" y "marcado específicamente" significan aumentar hasta un valor mayor de 0'0111, por medios sintéticos, la probabilidad de que los átomos de carbono en uno o más sitios preseleccionados específicos dentro de la molécula diana sean ^{13}C.
Por ejemplo, las biomoléculas expresadas por el crecimiento de microorganismos modificados genéticamente, en un medio nutriente conteniendo glucosa enriquecida uniformemente con ^{13}C, estarán enriquecidas uniformemente con ^{13}C. Por otra parte, una proteína expresada mediante un microorganismo modificado genéticamente, en un medio nutriente conteniendo alanina que esté enriquecida con ^{13}C únicamente en la cadena lateral metilo, estará enriquecida específicamente con ^{13}C en aquellos residuos alanina contenidos dentro de la proteína expresada.
El método de la presente invención, que emplea enriquecimiento isotópico con ^{13}C, es aplicable a cualquier molécula diana orgánica, incluyendo aquellas que contengan nitrógeno. El método también permite el análisis de moléculas diana en las que han sido enriquecidos sitios específicos de los átomos de carbono (por ejemplo, grupos metilo de residuos alanilo, leucilo, isoleucilo y valilo). Los grupos metilo tienen propiedades de relajación favorables comparados con los grupos amida, lo que es ventajoso cuando se aplica a biomoléculas diana mayores (PM > 30kDa).
Los polipéptidos y proteínas ejecutan muchos papeles fundamentales en los organismos vivientes. Los ejemplos proporcionados abajo emplean polipéptidos para ilustrar el método actual. Los fragmentos de polipéptidos y proteínas comprenden clases preferidas de sustancias diana para el método de la presente invención. Sin embargo, se comprende que el método de la presente invención es aplicable a otras sustancias diana que puedan ser enriquecidas con ^{13}C.
Abajo se expone la preparación de moléculas diana polipeptídicas ejemplares, uniforme y específicamente enriquecidas con ^{13}C. Un medio de preparar cantidades adecuadas de moléculas diana conteniendo polipéptidos, uniforme y específicamente enriquecidos con ^{13}C, supone la transformación de una célula huésped con un vector de expresión conteniendo un polinucleótido que codifica para el polipéptido deseado. La proteína o fragmento de proteína polipeptídica es expresada cultivando la línea celular transformada, en un medio conteniendo fuentes asimilables de ^{13}C conocidas en la técnica. Una fuente asimilable preferida para marcaje uniforme con ^{13}C es glucosa marcada uniformemente con ^{13}C, o U-^{13}C-glucosa, disponible por Cambridge Isotope Laboratories. Para el marcaje sitio-específico, las fuentes asimilables para el marcaje de un polipéptido diana con ^{13}C incluyen aminoácidos marcados específicamente con ^{13}C disponibles comercialmente. Conforme a la presente invención para el enriquecimiento específico, las fuentes asimilables de ^{13}C contenidas en el medio nutriente son precursores biosintéticos, marcados con ^{13}C, de aminoácidos que constan de \alpha-cetobutirato, que es el precursor biosintético de isoleucina, y \alpha-cetoisovalerato que es el precursor biosintético de valina y leucina. El Esquema I abajo muestra cómo se pueden sintetizar los precursores biosintéticos, enriquecidos específicamente con ^{13}C, de leucina, isoleucina, y valina. El comparativamente barato yoduro de metilo enriquecido con ^{13}C (H_{3}^{13}CI) puede ser empleado como fuente para el enriquecimiento isotópico, y producir ácido \alpha-cetobutírico y ácido \alpha-cetoisovalérico marcados terminalmente con C.
El uso comparativo de un nutriente enriquecido uniformemente con ^{13}C, tal como glucosa enriquecida con ^{13}C, es un medio conveniente para introducir el enriquecimiento con ^{13}C en una sustancia diana; sin embargo, es muy caro. Además, una abrumadora mayoría de los sitios carbono en dianas marcadas uniformemente con ^{13}C tendrán un vecino covalentemente unido que también está marcado con ^{13}C, introduciendo acoplamiento ^{13}C-^{13}C que puede afectar negativamente a la señal-ruido y a las propiedades de relajación de los sitios marcados con ^{13}C en la biomolécula diana. Se consigue una ventaja particular marcando sitio-específicamente el polipéptido diana con ^{13}C. Como se estableció antes, esto se puede llevar a cabo incluyendo en el medio nutriente aminoácidos marcados con ^{13}C, disponibles comercialmente. Esto también, sin embargo, es una alternativa costosa, pero puede ser conveniente en algunas circunstancias cuando se necesite el marcaje de ciertos tipos de residuos aminoacilo en el polipéptido diana. Conforme a la presente invención, el método para marcar con ^{13}C una molécula diana polipeptídica comprende el cultivar la línea celular, modificada genéticamente, en un medio nutriente conteniendo precursores biosintéticos, marcados con ^{13}C, de aminoácidos que consten de ácido \alpha-cetobutírico con ^{13}C y ácido \alpha-cetoisovalérico con ^{13}C. Los productos biosintéticos de estos precursores son leucina, isoleucina y valina, en los que grupos metilo concretos de la cadena lateral están enriquecidos con ^{13}C. Debido a que los grupos metilo tienen cada uno tres átomos de hidrógeno conectados a un átomo de carbono marcado con ^{13}C, las correspondientes señales de RMN son particularmente fuertes y distintas.
La secuencia sintética para el ácido \alpha-cetobutírico y el ácido \alpha-cetoisovalérico marcados implica la metilación del átomo de carbono terminal en ácido pirúvico con yoduro de metilo enriquecido con ^{13}C. Normalmente, la alquilación de \alpha-cetoácidos, tales como piruvato, es inherentemente difícil y está acompañada de descomposición del intermedio enolato, con la formación de numerosos subproductos. Sin embargo, T. Spencer y col., Tetrahedron Letters, 1975, 3.889, y D. R. Williams y col., ibídem, 1990, 5.881, han demostrado que se puede llevar a cabo fácilmente la alquilación de la oxima correspondiente; y D. Enders y col., Angew. Chem. Int. Eng. Ed., 1992, 618, y D. Enders y col., Synlett, 1992, 901, han demostrado que la hidrazona también se alquila fácilmente sin descomposición.
En el Esquema I, el piruvato de terc-butilo 1 es transformado en la correspondiente N,N-dimetilhidrazona 2, mediante reacción con N,N-dimetilhidrazina en éter dietílico a temperatura ambiente. La hidrazona 2 resultante es enfriada en solución de tetrahidrofurano a -78ºC, y tratada con bromuro de litio, seguido por diisopropilamida de litio para formar el enolato azaalílico intermedio. El enolato es alquilado con yoduro de metilo marcado con ^{13}C, para producir la hidrazona 3. Un segundo desarrollo de alquilación de 3 produce la hidrazona dimetilada 4 marcada. El tratamiento de 3 y 4 con ácido trifluoroacético, en cloruro de metileno a 0ºC, escinde la hidracina y los grupos éster para producir los correspondientes \alpha-cetoácidos 5 y 6, marcados terminalmente con C, [ácido \alpha-cetobutírico 4-(^{13}C) y ácido \alpha-cetometilbutírico 4-(^{13}C)-3-(^{13}C), respectivamente].
Esquema I
Síntesis Química de Precursores Marcados
1
Los Esquemas de Reacción II, III y IV ilustran, respectivamente, cómo estos \alpha-cetoácidos son transformados biosintéticamente en ^{13}C-leucina, ^{13}C-isoleucina y ^{13}C-valina. En todos los Esquemas, los sitios de enriquecimiento isotópico están indicados mediante asteriscos.
Esquema II
Síntesis Bioquímica de Isoleucina Marcada
2 
\newpage
Esquema III
Síntesis Bioquímica de Leucina Marcada
3 
\newpage
Esquema IV
Síntesis Bioquímica de Valina
4
En la técnica se conocen métodos para preparar vectores de expresión que contengan secuencias polinucleotídicas que codifiquen polipéptidos específicos, y para transformar células huésped con aquellos vectores (ver, por ejemplo, R. W. Old y col., "Techniques of Gene Manipulation", Blackwell Science, Londres, 1994, y tratados en el campo). Asimismo, también se conocen en la técnica métodos para cultivar las células transformadas para expresar el polipéptido codificado y para aislar, purificar y replegar el polipéptido. Los ejemplos presentados abajo describen la producción, a partir de E. coli modificado, de muestras enriquecidas con ^{13}C de la región catalítica, de los aminoácidos 81-256, de estromelisina humana y proteína de unión FK (FKBP), y el empleo en los métodos actuales de estos polipéptidos enriquecidos isotópicamente.
Donde se emplee el método para escrutar más de un compuesto para unirse a la molécula diana, por ejemplo una mezcla o una biblioteca de compuestos, y donde surja una diferencia entre el primer espectro generado de la molécula diana sola y el generado de la molécula diana en presencia de compuesto(s), se realizan etapas adicionales para identificar qué compuesto o compuestos específicos contenidos en la mezcla se están uniendo realmente a la molécula diana. Aquellas etapas adicionales incluyen el exponer la molécula diana, enriquecida con ^{13}C, individualmente a cada compuesto de la mezcla; generar un espectro de correlación RMN ^{13}C/^{1}H bidimensional de la molécula diana marcada, que ha sido expuesta individualmente a cada compuesto; y comparar cada espectro al primer espectro generado de la molécula diana sola, para determinar las diferencias en alguno de aquellos espectros comparados. Las diferencias en los espectros facilitan la identificación de un compuesto que sea un ligando.
Los valores de desplazamiento químico de las señales ^{13}C/^{1}H concretas en el espectro de correlación bidimensional corresponden a ubicaciones específicas conocidas de agrupamientos atómicos en la molécula diana (por ejemplo, los átomos de carbono de un residuo de aminoácido concreto en la molécula diana o, en el caso de un polipéptido marcado específicamente a los grupos metilo de residuos alanilo, leucilo, isoleucilo y valilo). El proceso de escrutinio de esta invención permite, de este modo, no solamente la identificación de qué compuesto(s) se une a una molécula diana concreta, sino que también permite la determinación de los aminoácidos particulares que están afectados por la unión del compuesto a la molécula diana. Los valores de desplazamiento químico pueden reflejar un cambio en la conformación de la molécula diana, o pueden reflejar la unión del compuesto ligando en el sitio que corresponde a esa señal concreta.
Además, mediante este proceso se puede determinar la constante de disociación K_{D} para un ligando dado y su molécula diana, si se desea, generando un primer espectro de correlación RMN ^{13}C/^{1}H bidimensional de una molécula diana marcada con ^{13}C; exponiendo la molécula diana marcada a diversas concentraciones de un ligando; generando un espectro de correlación RMN ^{13}C/^{1}H bidimensional a cada concentración de ligando empleado; comparando los espectros generados con el primer espectro de la molécula diana; y calculando la constante de disociación entre la molécula diana y el ligando a partir de aquellas diferencias, utilizando la Ecuación 1:
K_{D} = \frac{([P_{0}]-x)([L_{0}]-x)}{x}
donde [P_{0}] es la concentración molar total de la molécula diana, [L_{0}] es la concentración molar total del ligando, y x es la concentración molar de las especies unidas. El valor de x se determina a partir de los datos de desplazamiento químico en RMN conforme a la Ecuación 2:
x = \frac{\delta _{observado} \ - \ \delta _{libre}}{\Delta}
donde \delta_{observado} es el valor de desplazamiento químico observado, \delta_{libre} es el valor de desplazamiento químico para las especies libres, y \Delta es la diferencia entre el valor de desplazamiento químico limitante para saturación (\delta_{saturación}) y el valor de desplazamiento químico de la molécula diana libre de ligando unido (\delta_{libre}).
Después se determina la constante de disociación variando su valor hasta que se obtenga el mejor ajuste con los datos observados, utilizando métodos estadísticos estándar de ajuste de curvas. En aquellas situaciones donde el valor de \delta_{saturación} no sea directamente conocido se varían K_{D} y \delta_{saturación}, y los datos resultantes se someten al mismo método estadístico de ajuste de curvas.
Una habilidad ventajosa del método de escrutinio es la capacidad para determinar la constante de disociación de un ligando de la molécula diana en presencia de una segunda molécula ya unida al ligando. Generalmente, esto no es posible con otros métodos que empleen métodos analíticos por "vía húmeda" para determinar la unión de un ligando a un sustrato molécula diana.
El proceso para determinar la constante de disociación de un ligando se puede realizar en presencia de un segundo ligando unido. De acuerdo con esto, la molécula diana marcada con ^{13}C se une a ese segundo ligando antes de exponer esa diana a los compuestos de ensayo. El método de escrutinio es capaz, adicionalmente, de proporcionar información con respecto a la unión de un segundo o subsiguiente ligando a la molécula diana. Este segundo ligando puede ser unido químicamente al primer ligando unido a la molécula diana, proporcionando así una nueva molécula compuesta para su uso en influir en la molécula diana.
El método de escrutinio de la presente invención empieza con la generación o captación de un espectro de correlación ^{13}C/^{1}H bidimensional de la molécula diana enriquecida isotópicamente. Como se estableció antes, la molécula diana puede ser enriquecida uniformemente con ^{13}C o puede ser enriquecida específicamente mediante la incorporación de grupos metilo-^{13}C en los residuos alanilo, leucilo, valilo, e isoleucilo. En la técnica se conocen medios para generar espectros de correlación ^{13}C/^{1}H bidimensionales. Los espectros de RMN que son registrados típicamente son espectros de correlación cuántica simple heteronuclear (HSQC) ^{13}C/^{1}H bidimensionales, aunque se pueden utilizar otras técnicas conocidas por aquellos especializados en la técnica. Debido a que las señales ^{13}C/^{1}H correspondientes a la proteína son bien resueltas generalmente, los cambios de desplazamiento químico para parejas ^{13}C/^{1}H por separado pueden ser fácilmente monitorizados. En la Figura 1 se muestra un espectro de correlación ^{13}C/^{1}H bidimensional representativo de un polipéptido diana (FKBP) marcado con ^{13}C. En la Figura 3 se muestra un espectro de correlación ^{13}C/^{1}H bidimensional representativo de una FKBP enriquecida específicamente con ^{13}C.
Después de la exposición de la molécula diana marcada con ^{13}C a un o más compuestos de ensayo, se genera un segundo espectro de correlación RMN ^{13}C/^{1}H bidimensional. Ese espectro es generado de la misma manera expuesta antes. Después se comparan el primer y segundo espectros para determinar si existen diferencias entre los dos espectros. Las diferencias en los espectros de correlación RMN ^{13}C/^{1}H bidimensionales que indiquen la presencia de un ligando, corresponden a los sitios marcados con ^{13}C en la molécula diana. Aquellas diferencias son determinadas utilizando procedimientos estándar bien conocidos en la técnica. La Figura 2 muestra las regiones metilo de FKBP marcada uniformemente con ^{13}C, antes (múltiples contornos finos) y después (contornos sencillos gruesos) de la adición de 2-fenilimidazol (0'12 mM).
Las señales concretas en un espectro de correlación ^{13}C/^{1}H bidimensional corresponden a átomos de carbono y protónicos en la molécula diana (por ejemplo, grupos metilo concretos de los residuos de aminoácidos en la proteína). A modo de ejemplo, en la Figura 3 se puede ver que los desplazamientos químicos observados en espectros de correlación ^{13}C/^{1}H bidimensionales de FKBP expuesta a un compuesto de ensayo ocurrieron en las posiciones de los residuos 97 (leucina) y 55 (valina). La región de la proteína que es responsable para unirse a los compuestos individuales es identificada a partir de las parejas de átomos de carbono y protónicos concretas que cambian con la adición de compuesto.
Ejemplos
Las preparaciones 1 y 2 son ejemplos comparativos.
Preparación 1
Preparación de Dominio Catalítico de Estromelisina Humana (DCE), enriquecido uniformemente con ^{13}C
El fragmento 81-256 (ID SEC Nº: 1) de estromelisina (DCE) se prepara insertando un plásmido que codifique para la producción del fragmento de proteína dentro de una cepa de E. coli y cultivando la cepa bacteriana, modificada genéticamente, en un medio de cultivo apropiado. El fragmento de proteína es aislado del medio de cultivo, purificado, y utilizado posteriormente en el análisis de RMN bidimensional de su afinidad con compuestos de ensayo, conforme al método de esta invención. Abajo se describe los procedimientos para los procesos de prepara-
ción.
Se cultivan e inducen fibroblastos de piel humana (ATCC Nº CRL 1507) utilizando el procedimiento descrito por Clark y col., Archiv. Biochem. and Biophys., 241: 36 (1985). Se aísla el ARN total de 1 g de células, utilizando un RNAgents® Total RNA Isolation System Kit (Promega Corp.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se desnaturaliza una porción de 1 \mug del ARN mediante calentamiento a 80ºC durante cinco minutos, y después se somete a PCR con transcriptasa inversa utilizando un GenAmp® RNA PCR kit (Applied Biosystems/Perkin-Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se realiza PCR anidado utilizando los primeros cebadores (a) GAAATGAAGAGTCTTCAA (ID SEC Nº: 2) y (b) GCGTCCCAGGTTCTGGAG (ID SEC Nº: 3), y treinta y cinco ciclos de 94ºC, dos minutos; 45ºC, dos minutos; y 72ºC, tres minutos. Esto es seguido por reamplificación con los cebadores internos (c) TACCATGGCCTATCCATTG
GATGGAGC (ID SEC Nº: 4) y (d) ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG (ID SEC Nº: 5), utilizando treinta ciclos bajo las mismas condiciones descritas inmediatamente arriba, para generar una secuencia de ADN que codifique para los residuos de aminoácidos 1-256 de estromelisina humana.
El fragmento PCR es después clonado en el vector de clonación pT7Blue® para PCR (Novagen Inc.), conforme a las instrucciones del fabricante. El plásmido resultante es cortado con NcoI y BamHI, y se subclona el fragmento de estromelisina dentro del vector pET3d (Novagen Inc.).
A partir de la construcción de expresión 1-256 se genera, mediante amplificación por PCR, una construcción de expresión de estromelisina madura que codifica para los residuos de aminoácidos 81-256 más un residuo aminoacilo con metionina iniciadora. El fragmento PCR resultante es primero clonado en el vector pT7BIue® (Novagen Inc.) y subclonado después en el vector pET3d (Novagen Inc.) utilizando las instrucciones del fabricante, de la manera descrita anteriormente, para producir el plásmido pETST-83-256. Este plásmido final es idéntico al descrito por Qi-Zhuang y col., Biochemistry, 31: 11.231 (1992), con la excepción de que el presente plásmido codifica para una secuencia peptídica que empieza dos aminoácidos más tempranamente, en la posición 81, en la secuencia de la estromelisina humana. El plásmido pETST-83-256 es transformado dentro de la cepa BL21 (DE3)/pLysS de E. coli (Novagen Inc.) conforme a las instrucciones del fabricante, para generar una cepa de expresión, BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1.
Se prepara un medio de precultivo disolviendo 1'698 g de PO_{4}H_{2}Na\cdot7H_{2}O, 0'45 g de PO_{4}H_{2}K, 0'075 g de ClNa, 0'150 g de ClNH_{4}, 0'3 g de U-^{13}C-glucosa, 300 \mul de solución acuosa 1M de SO_{4} Mg, y 15 ml de solución acuosa de Cl_{2}Ca en 150 ml de agua desionizada. La solución resultante del medio de precultivo es esterilizada y transferida a un matraz estéril de 500 ml con deflectores. Inmediatamente antes de la inoculación del medio de precultivo con la cepa bacteriana, al contenido del matraz se añade 150 ml de una solución conteniendo 34 mg/ml de cloranfenicol en etanol del 100%, y 1'5 ml de una solución conteniendo 20 mg/ml de ampicilina. Después, el contenido del matraz es inoculado con 1 ml de solución madre en glicerina de cepa BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1 de E. coli genéticamente modificada. Se sacude el contenido del matraz (225 rpm) a 37ºC, hasta que se observe una densidad óptica de 0'65.
Se prepara un medio nutriente para fermentación disolviendo 113'28 g de PO_{4}HNa_{2}\cdot7H_{2}O, 30 g de PO_{4}H_{2}K, 5 g de ClNa, y 10 ml de agente antiespumante DF-60 al 1% en 9.604 ml de agua desionizada. Se pone esta solución en un fermentador New Brunswick Scientific Micros y se esteriliza a 121ºC durante 40 minutos. Inmediatamente antes de la inoculación del medio de fermentación, al contenido del recipiente de fermentación se añaden los siguientes componentes preesterilizados: 100 ml de una solución acuosa al 10% de ClNH_{4}, 15 g de glucosa enriquecida uniformemente con ^{13}C, 20 ml de una solución acuosa 1M de SO_{4} Mg, 1 ml de una solución acuosa 1M de Cl_{2}Ca, 5 ml de una solución acuosa de clorhidrato de tiamina (10 mg/ml), 10 ml de una solución conteniendo 34 mg/ml de cloranfenicol en etanol del 100%, y 1'9 g de ampicilina disuelta en la solución de cloranfenicol. Se ajusta el pH de la solución resultante a pH 7'00, mediante la adición de una solución acuosa de SO_{4}H_{2} 4N.
El precultivo de cepa BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1 de E. coli del procedimiento a escala de matraz descrito anteriormente se añade al contenido del fermentador, y se deja que el crecimiento celular proceda hasta que se alcance una densidad óptica de 0'48. Durante este proceso, el contenido del fermentador es automáticamente mantenido a pH 7'0 mediante la adición de SO_{4}H_{2} 4N o KOH 4N según se necesite. El contenido en oxígeno disuelto del contenido del fermentador es mantenido por encima del 55% de saturación del aire mediante un bucle en cascada, que aumentaba la velocidad de agitación cuando el contenido en oxígeno disuelto caía por debajo del 55%. Se alimenta aire al contenido del fermentador a 7 litros estándar por minuto (SLPM), y la temperatura del cultivo se mantiene a 37ºC durante todo el proceso.
Las células se recolectan por centrifugación a 17.000xg durante 10 minutos a 4ºC, y los gránulos de células resultantes son recogidos y almacenados a -85ºC. El rendimiento celular en húmedo es 3'5 g/l. El análisis de las fracciones soluble e insoluble de los lisados celulares mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) revela que, aproximadamente el 50% de la estromelisina, se encuentra en la fase soluble.
El fragmento de estromelisina, preparado como se describió arriba, se purifica empleando una modificación de la técnica descrita por Ye y col., Biochemistry, 31: 11.231 (1992). Las células recolectadas son suspendidas en tampón Tris-ClH 20 mM (pH 8'0), solución de azida sódica conteniendo Cl_{2} Mg 1 mM, Cl_{2}Zn 0'5 mM, 25 unidades/ml de enzima Benzonase® (Benzon Pharma), y una mezcla de inhibidores compuesta por fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo ("AEBSF"), Leupeptin®, Aprotinin® y Pepstatin® (todos a concentraciones de 1 mg/ml). AEBSF, Leupeptin®, Aprotinin® y Pepstatin® están disponibles por American International Chemical. La mezcla resultante es agitada suavemente durante una hora, y enfriada después a 4ºC. Luego, las células se rompen por sonicación utilizando un ciclo de servicio del 50%. El lisado resultante es centrifugado a 14.000 rpm durante 30 minutos, y el gránulo de fracción insoluble congelado a -80ºC para el subsiguiente proceso de fabricación.
Se añade sulfato amónico sólido al sobrenadante hasta el punto de saturación del 20%, y la solución resultante se carga en una columna (Pharmacia Biotech.) de flujo rápido Fenil-Sepharosa (Q-Sepharosa FF) de 700 ml. Antes de cargar, la columna de Sepharosa es equilibrada con tampón Tris-ClH 50 mM (pH 7'6 a 4ºC), Cl_{2}Ca 5 mM, y SO_{4}(NH_{4})_{2} 1M. La columna cargada se eluciona con un gradiente lineal de concentraciones decrecientes de SO_{4}(NH_{4})_{2} acuoso (desde 1M hasta 0M) y concentraciones crecientes de Cl_{2}Ca acuoso (desde 5 mM hasta 20 mM) en tampón Tris-ClH a pH 7'6. Las fracciones activas de eluato son recogidas y concentradas en una célula de cubeta agitada Amicon (Amicon Inc.). La muestra concentrada es dializada durante la noche en el tampón de partida utilizado con la columna Q-Sepharosa FF, Tris-ClH 50 mM (pH 8'2 a 4ºC) con Cl_{2}Ca 10 mM.
Después, la muestra dializada se carga en la columna Q-Sepharosa FF y se eluciona con un gradiente lineal constando del tampón de partida y de ClNa 200 nM. La fracción soluble purificada del fragmento de estromelisina es concentrada y almacenada a 4ºC. Se solubiliza el gránulo en guanidina-HCl 8M. Se centrifuga la solución durante 20 minutos a 20.000 rpm, y se añade el sobrenadante, gota a gota, a un tampón de plegamiento constando de Tris-ClH 50 mM (pH 7'6), Cl_{2}Ca 10 mM, Cl_{2}Zn 0'5 mM, y del combinado inhibidor de AEBSF, Leupeptin®, Aprotinin® y Pepstatin® (todos a concentraciones de 1 \mug/ml). El volumen de tampón de plegamiento es diez veces el de sobrenadante. La mezcla de sobrenadante y tampón de plegamiento es centrifugada a 20.000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante de esta centrifugación es almacenado a 4ºC, y el gránulo sometido dos veces a las etapas descritas arriba de solubilización en guanidina-HCl, replegamiento en tampón, y centrifugación. Se combinan los sobrenadantes finales de cada una de las tres centrifugaciones, y se añadió sulfato amónico sólido hasta el punto de saturación del 20%. De este modo, la solución resultante obtenida a partir de la fracción insoluble es sometida a purificación en Fenil-Sepharosa y Q-Sepharosa, como se describió arriba para la fracción soluble. Se combinan las fracciones purificadas soluble e insoluble para producir aproximadamente 1'8 mg de fragmento 81-256 de estromelisina purificado (DCE) por gramo de pasta celular original, enriquecido uniformemente con ^{13}C.
Preparación 2
Preparación de Dominio Catalítico de Estromelisina Humana (DCE), enriquecido específicamente con ^{13}C
El DCE se expresa cultivando la cepa modificada de E. coli, BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1, en un medio constando de ácido \alpha-cetobutírico y ácido \alpha-cetoisovalérico enriquecidos con ^{13}C. Los métodos utilizados para la preparación de la cepa de E. coli lograda genéticamente, y para expresar, aislar, y purificar el fragmento de proteína son como se describió antes, excepto para el empleo de U-^{12}C-glucosa en lugar de U-^{13}C-glucosa.
Preparación 3
Preparación de FKBP enriquecida Uniforme y Específicamente con ^{13}C A. Preparación de Val/Leu FKBP enriquecida específicamente con ^{13}C
Células transformadas con un plásmido que codifica para FKBP humana [como se describió en Egan y col., Biochemistry 32: 1.920-1.927 (1993)] fueron cultivadas en un medio de cultivo con D_{2}O al 100% conteniendo ^{15}NH_{4}Cl (Cambridge Isotope) como única fuente de nitrógeno (1'0 g/l), y glucosa perdeuterada (1'5 g/l) como fuente de carbono (Cambridge Isotope). Se cultivaron las células a 37ºC, y se sacudió el contenido del matraz hasta que se obtuvo una densidad óptica de 1'0. Una hora antes de la inducción, se añadió 80 mg de L-valina-U-^{13}C_{5}-^{15}N-2,3-d_{2} (Cambridge Isotope) al medio de cultivo. El cultivo fue inducido con IPTG 1mM durante 12 horas.
Las células se recolectaron por centrifugación a 17.000xg durante 10 minutos a 4ºC, y los gránulos de células resultantes fueron suspendidos en tampón de fosfato 50 mM (pH 7'4) conteniendo DTT 5 mM y PMSF 1 mM, y lisadas mecánicamente utilizando una prensa francesa. El lisado resultante fue centrifugado a 25.000 rpm durante 30 minutos. Se añadió sulfato amónico sólido al sobrenadante hasta el punto de saturación del 40%, y se centrifugó a 18.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante fue dializado en HEPES 10 mM (pH 8'0) durante 12 horas a 4ºC. La solución resultante fue después cargada en una columna de flujo rápido Q-Sepharosa (Sigma) de 10 ml, preequilibrada con el tampón de diálisis. Se recogieron las fracciones, se combinaron, y se concentraron utilizando una celda de flujo Amicon. Después, la solución fue dializada en tampón de fosfato 20 mM (pH 6'5) conteniendo DTT 10 mM y 0'01% de azida sódica.
B. Preparación de Val/Leu/Ile FKBP enriquecida específicamente con ^{13}C
Células transformadas con un plásmido que codifica para FKBP humana [como se describió en Egan y col., Biochemistry 32: 1.920-1.927 (1993)] se cultivan en un medio de cultivo conteniendo NH_{4}Cl como única fuente de nitrógeno (1'0 g/l), y glucosa (1'5 g/l) como fuente de carbono. Se cultivan las células a 37ºC, y se sacude el contenido del matraz hasta que se obtiene una densidad óptica de 1'0. Una hora antes de la inducción, se añaden 100 mg de ácido \alpha-cetobutírico y ácido \alpha-cetoisovalérico al medio de cultivo. El cultivo es inducido con IPTG 1 mM durante 12 horas. La expresión, aislamiento, y purificación de la proteína expresada son como se describió antes.
C. Preparación de FKBP enriquecida uniformemente con ^{13}C
Células transformadas con un plásmido que codifica para FKBP humana [como se describió en Egan y col., Biochemistry 32: 1.920-1.927 (1993)] fueron cultivadas en un medio de cultivo conteniendo ^{15}NH_{4}Cl (Cambridge Isotope) como única fuente de nitrógeno (1'0 g/l), y glucosa enriquecida uniformemente con ^{13}C (1'5 g/l) como fuente de carbono (Cambridge Isotope). La expresión, aislamiento, y purificación de la proteína expresada son como se describió antes.
Ejemplo 1 Escrutinio para Ligandos utilizando Espectros de Correlación RMN ^{13}C/^{1}H y utilizando FKBP enriquecida uniformemente con ^{13}C
Se preparó FKBP, enriquecida uniformemente con ^{13}C, conforme a los procedimientos detallados antes. Las soluciones de proteína utilizadas en el ensayo de escrutinio contenían la FKBP (0'2 mM) enriquecida uniformemente con ^{13}C y azida sódica (0'05%) en una solución, tamponada con fosfato (20 mM, pH 6'5) de H_{2}O/D_{2}O (9/1).
Se generaron espectros de RMN ^{13}C/^{1}H bidimensionales a 30ºC, en un espectrómetro de RMN Bruker DRX500 equipado con una sonda de triple resonancia y un cambiador de muestras Bruker. Los espectros HSQC ^{13}C/^{1}H fueron captados como puntos complejos de 64x1.024 utilizando amplitudes de barrido de 3.771 Hz (^{13}C, t_{1}) y 8.333 Hz (^{1}H, t_{2}). En la recolección de datos se emplearon una demora de 1 segundo entre barridos, y 8 barridos por caída de inducción libre (fid). Todos los espectros de RMN fueron procesados y analizados en ordenadores Silicon Graphics.
Se captó un primer espectro de correlación RMN ^{13}C/^{1}H bidimensional para la molécula diana FKBP marcada con ^{13}C, como se describió antes. La diana FKBP fue expuesta después a una mezcla de compuestos de ensayo de la biblioteca. Se fabricaron soluciones madre de los compuestos a 100 mM y 1M. Además, se preparó una biblioteca combinatorial que contenía 8-10 compuestos por muestra, a una concentración 100 mM para cada compuesto.
Se ajustó el pH de la solución madre 1M con ácido acético y etanolamina, a fin de que no se observara cambio de pH en la dilución 1/10 con una solución tamponada con fosfato 100 mM (pH 7'0). Es importante ajustar el pH porque pequeños cambios en el pH pueden alterar los desplazamientos químicos de las biomoléculas y complicar la interpretación de los datos de RMN.
Los compuestos en la biblioteca fueron seleccionados partiendo de la base del tamaño (peso molecular = 100-300) y diversidad molecular. Las moléculas en la recolección tenían formas diferentes (por ejemplo, anillo(s) aromático plano, anillo(s) alifático arrugado, alifáticos de cadena lineal y ramificada con enlaces sencillos, dobles o triples) y diversos grupos funcionales (por ejemplo, ácidos carboxílicos, ésteres, éteres, aminas, aldehídos, cetonas, y varios anillos heterocíclicos) para maximizar la posibilidad de descubrir compuestos que interaccionen con sitios de unión extensamente diversos.
Las muestras para RMN se prepararon añadiendo 1'25 \mul de la solución madre en dimetilsulfóxido de las mezclas de compuestos que contenían cada compuesto a una concentración de 100 mM para 0'5 ml de solución tamponada de H_{2}O/D_{2}O (9/1) de la proteína marcada uniformemente con ^{13}C. La concentración final de cada uno de los compuestos en la muestra para RMN fue aproximadamente 0'25 mM.
En el experimento de escrutinio, se descubrió que un compuesto, 2-fenilimidazol, se unía a la FKBP. La Figura 1 muestra el espectro de correlación ^{13}C/^{1}H de la FKBP marcada uniformemente con ^{13}C. El espectro (128 puntos complejos, 4 barridos/fid) fue captado en una muestra 0'1 mM de FKBP en fosfato 20 mM (pH 6'5), 0'01% de azida sódica y 10% de óxido de deuterio (D_{2}O).
La Figura 1 muestra un espectro de correlación ^{13}C/^{1}H de FKBP marcada uniformemente con ^{13}C. El espectro (128 puntos complejos, 4 barridos/fid) fue captado en una muestra 0'1 mM de FKBP en fosfato 20 mM (pH 6'5), 0'01% de azida sódica y 10% de óxido de deuterio (D_{2}O). La Figura 2 muestra las regiones metilo de los espectros de correlación ^{13}C/^{1}H (64 puntos complejos, 8 barridos/fid) de FKBP marcada uniformemente con ^{13}C (0'2 mM), antes (múltiples contornos finos) y después (contornos sencillos gruesos) de la adición de 2-fenilimidazol (0'25 mM). Están indicados los cambios en los desplazamientos químicos en los residuos aminoacilo Leu^{97}, Val^{55}, Ile^{56} e Ile^{90}.
La Figura 3 muestra espectros de correlación ^{13}C/^{1}H (48 puntos complejos, 8 barridos/fid) de FKBP marcada selectivamente con ^{13}C/^{15}N/^{2}H en los residuos valilo y leucilo, antes (múltiples contornos finos) y después (contornos sencillos gruesos) de la adición de 2-fenilimidazol (0'25 mM). Todas las otras condiciones son las mismas que aquellas empleadas para generar los espectros ilustrados en la Figura 1. Están indicados los residuos seleccionados que muestran cambios significativos en la unión. Nuevamente, los cambios en los valores de desplazamiento químico indican que está ocurriendo la unión en o cerca de los residuos Leu^{97} y Val^{55}.
La Figura 4 muestra espectros de correlación ^{13}C/^{1}H de FKBP marcada selectivamente con ^{13}C en los residuos alanilo, antes (múltiples contornos finos) y después (contornos sencillos gruesos) de la adición de 2-fenilimidazol (0'25 mM). La superposición de los valores de desplazamiento químico, antes (contornos múltiples leves) y después (contorno simple grueso) de la adición del ligando, indican que ninguno de los residuos alanilo está implicado en la unión.
La Figura 5 muestra una representación por el "modelo de palos" de la estructura tridimensional de la FKBP. Los residuos seleccionados están numerados para ayuda en la visualización. Los residuos aminoacilo implicados en el sitio de unión en la proteína han sido mostrados en negrita.
<110> Abbott Laboratories
\hskip1cm
Fesik, S. W. 
\hskip1cm
Hajduk, P. J. 
\vskip1.000000\baselineskip
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<120> USO DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR ^{13}C PARA DETECTAR LA UNIÓN A BIOMOLÉCULAS DIANA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 5816.US.P3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> US 09/288.924
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 1999-04-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/241.184
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999-02-01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 08/744.701
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1996-10-31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 08/678.903
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1996-07-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 08/558.633
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<151> 1995-11-04
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<160> 5
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<170> FastSEQ para Windows, versión 3.0
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<210> 1
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<211> 174
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Región Catalítica de Estromelisina Humana
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<400> 1
5 
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<210> 2
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 2
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gaaatgaaga gtcttcaa 
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18 
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<210> 3
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcgtcccagg ttctggag 
\hfill
18 
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<210> 4
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<400> 4
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taccatggcc tatccattgg atggagc 
\hfill
27 
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<210> 5
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia artificial
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<400> 5
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ataggatcct taggtctcag gggagtcagg 
\hfill
30

Claims (2)

1. Un método para detectar la unión entre un ligando putativo y una molécula diana preseleccionada, enriquecida con ^{13}C, que comprende:
a)
generar un primer espectro de correlación RMN ^{13}C/^{1}H bidimensional de dicha molécula diana;
b)
formar una mezcla de dicha molécula diana con al menos un compuesto ligando putativo;
c)
generar un segundo espectro de correlación RMN ^{13}C/^{1}H bidimensional de la mezcla de la etapa b); y
d)
comparar el primer y segundo espectros;
en donde dicha molécula diana se prepara cultivando una línea celular transformada, que contiene un vector de expresión conteniendo un polinucleótido que codifica dicha molécula diana, en un medio conteniendo un precursor biosintético de un aminoácido seleccionado del grupo que se compone de ácido \alpha-cetobutírico 4-(^{13}C) y ácido
\alpha-cetometilbutírico 4-(^{13}C)-3-(^{13}C).
2. Un método para escrutar una mezcla de compuestos por su unión a una molécula diana preseleccionada, enriquecida con ^{13}C, que comprende:
a)
generar un primer espectro de correlación RMN ^{13}C/^{1}H bidimensional de dicha molécula diana;
b)
formar una mezcla de dicha molécula diana con al menos un compuesto ligando putativo;
c)
generar un segundo espectro de correlación RMN ^{13}C/^{1}H bidimensional de la mezcla de la etapa b); y
d)
comparar el primer y segundo espectros;
en donde dicha molécula diana se prepara cultivando una línea celular transformada, que contiene un vector de expresión conteniendo un polinucleótido que codifica dicha molécula diana, en un medio conteniendo un precursor biosintético de un aminoácido seleccionado del grupo que se compone de ácido \alpha-cetobutírico 4-(^{13}C) y ácido
\alpha-cetometilbutírico 4-(^{13}C)-3-(^{13}C).
ES00918228T 1999-04-09 2000-03-21 Utilizacion de resonancia magnetica nuclear 13c para detectar uniones. Expired - Lifetime ES2264930T3 (es)

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US288924 1999-04-09

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AU (1) AU776165B2 (es)
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CO (1) CO5241342A1 (es)
CY (1) CY1107474T1 (es)
DE (1) DE60028196T2 (es)
DK (1) DK1169648T3 (es)
ES (1) ES2264930T3 (es)
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IL (1) IL145135A (es)
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10139465A1 (de) * 2001-08-10 2003-02-20 Bayer Cropscience Ag Selektive Herbizide auf Basis von substituierten, cayclischen Ketoenolen und Safenern
DE10160177A1 (de) * 2001-12-07 2003-06-26 Novaspin Biotech Gmbh Verfahren zur Auffindung von Liganden die an ein drug target binden mittels 1H,1H-Kernresonanzspektroskopie
US20030148391A1 (en) * 2002-01-24 2003-08-07 Salafsky Joshua S. Method using a nonlinear optical technique for detection of interactions involving a conformational change
DE10221158A1 (de) * 2002-05-13 2004-02-19 Novaspin Biotech Gmbh Verfahren zur Auffindung von Liganden, die an ein drug target binden, mittels heteronuklearer Kernresonanzspektroskopie
KR100901309B1 (ko) * 2002-06-15 2009-06-09 크리스탈지노믹스(주) 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법
US20040132102A1 (en) * 2002-10-29 2004-07-08 Maurizio Pellecchia Use of selective labeling to detect and characterize molecular interactions by nuclear magnetic resonance spectroscopy
NO20025738D0 (no) 2002-11-29 2002-11-29 Amersham Health As Metode
JPWO2006082963A1 (ja) * 2005-02-07 2008-06-26 三菱化学株式会社 標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物との結合検出方法
US9182406B2 (en) 2008-08-04 2015-11-10 Biodesy, Inc. Nonlinear optical detection of molecules comprising an unnatural amino acid possessing a hyperpolarizability
WO2012129347A1 (en) 2011-03-21 2012-09-27 Biodesy, Llc Classification of kinase inhibitors using nonlinear optical techniques
WO2016106286A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Biodesy, Inc. Attachment of proteins to interfaces for use in nonlinear optical detection

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0856067A4 (en) * 1995-10-19 2005-09-21 Smithkline Beecham Corp BINARY CODING METHOD FOR USE IN COMBINATION CHEMISTRY
US5698401A (en) * 1995-11-14 1997-12-16 Abbott Laboratories Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules
DK0870197T4 (da) * 1995-11-14 2007-02-26 Abbott Lab Anvendelse af nuclear magnetisk resonans til design af ligander rettet mod biomolekyler

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