ES2243251T3 - Proteinas y acidos aminados, isotopicamente marcados y especificos de sitios, y precursores bioquimicos destinados a estas proteinas y acidos aminados. - Google Patents
Proteinas y acidos aminados, isotopicamente marcados y especificos de sitios, y precursores bioquimicos destinados a estas proteinas y acidos aminados.Info
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Abstract
Un compuesto de fórmula Ia o una sal del mismo, en donde R3 es hidrógeno o nCH3, y n en cada caso es 13 ó 14.
Description
Proteínas y ácidos aminados, isotópicamente
marcados y específicos de sitios, y precursores bioquímicos
destinados a estas proteínas y ácidos aminados.
La presente invención se refiere a compuestos
orgánicos marcados isotópicamente,
sitio-específicos, y a procesos para su preparación.
Más concretamente, la presente invención tiene que ver con
precursores bioquímicos de leucina, isoleucina, y valina, marcados
isotópicamente, sitio-específicos.
Además, la presente invención proporciona métodos
de preparación de proteínas, fragmentos de proteínas, o polipéptidos
fabricados de ahí.
Una técnica recientemente desarrollada para
descubrir nuevos fármacos prototipo implica el empleo de
espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) para descubrir
compuestos que se unen a una molécula diana concreta tal como una
proteína (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos
N^{os} 5.698.401 y 5.804.390 según Fesik y col.). La técnica
supone la determinación de un primer espectro de correlación de RMN
^{15}N/^{1}H bidimensional de una proteína en la que los sitios
de los átomos de nitrógeno han sido isotópicamente enriquecidos con
^{15}N. Este primer espectro de correlación se obtiene para la
proteína en ausencia de cualquier compuesto(s) ligando
potencial. A continuación, un presunto compuesto ligando, o una
mezcla de tales supuestos compuestos ligando, es mezclado con la
proteína enriquecida isotópicamente, y se obtiene un segundo
espectro de correlación de RMN. Se comparan los dos espectros, y las
diferencias entre los dos espectros proporcionan información acerca
de 1) la existencia de unión entre cualquier ligando y la proteína
huésped, 2) el sitio(s) de unión, y 3) la fuerza(s)
de la unión.
La técnica descrita en Fesik y col., arriba,
emplea moléculas diana que han sido isotópicamente enriquecidas con
el núcleo ^{15}N de espín detectable por RMN. Este método cuenta
con la modificación genética de un microorganismo apropiado para
expresar la proteína, fragmento de proteína o polipéptido deseados,
seguido por cultivar el microorganismo modificado en un medio
nutriente conteniendo fuentes asimilables de carbono y nitrógeno
que incluyan nutrientes marcados con ^{15}N. Relativamente
baratas, y disponibles comercialmente, las sale de amonio ^{15}N
proporcionan la fuente de ^{15}N.
Sin embargo, la aplicación de esta técnica de
descubrimiento de fármacos por RMN, a moléculas diana enriquecidas
isotópicamente con ^{13}C, ha estado estorbada por dos
inconvenientes. En primer lugar, es relativamente caro producir
moléculas diana enriquecidas con ^{13}C en cualquier cantidad
útil.
Por ejemplo, Biochemistry, vol. 31, nº 123, 1992,
páginas 5.252-5.263, revela la síntesis de
[5,5'-^{13}C_{2}]leucina vía condensación
de acetamido-cianoacetato de etilo y bromuro de
isobutilo marcado y posterior hidrólisis, con el rendimiento global
de producto del 1'6%. El aminoácido fue biosintéticamente
incorporado en nucleasa estafilocócica. Además, la producción de
proteínas mediante microorganismos modificados genéticamente,
cultivados en medios nutrientes conteniendo glucosa marcada
uniformemente (glucosa-^{13}C_{6}), disponible
comercialmente, es cara. En el momento de registrar esta solicitud,
el coste de la glucosa-^{13}C_{6} era
aproximadamente de 480 \textdollar/g.
Un ejemplo de producción de proteínas
enriquecidas isotópicamente es proporcionado por Biochemistry, vol.
28, nº 19, 1989, páginas 7.510-7.516, el cual
revela un método para producir biosintéticamente las proteínas de
interés, en donde la única fuente de carbono es glucosa marcada con
^{13}C y no marcada.
Alternativamente, la producción de proteínas
marcadas con ^{13}C, mediante la inclusión de aminoácidos marcados
uniformemente con ^{13}C en el medio nutriente, es similarmente
cara. Segundo, las biomoléculas producidas utilizando
glucosa-^{13}C_{6} o aminoácidos enriquecidos
uniformemente con ^{13}C, disponibles comercialmente, no son
idealmente apropiadas para la técnica de espectros de correlación
de RMN. Las biomoléculas expresadas por microorganismos cultivados
en medios nutrientes conteniendo materias de partida enriquecidas
uniformemente con ^{13}C, contienen átomos de carbono adyacentes
marcados con ^{13}C. Puesto que la técnica de RMN depende de la
detección del acoplamiento espacial de espín (esto es, el efecto
nuclear Overhauser), el relativamente fuerte acoplamiento
espín-espín de núcleos ^{13}C adyacentes
interfiere con la observación deseada. De este modo, existe la
necesidad del desarrollo de aminoácidos, proteínas, y polipéptidos
enriquecidos con ^{13}C sitio-específicamente.
La invención actual proporciona precursores
bioquímicos de los aminoácidos leucina, isoleucina, y valina
enriquecidos isotópicamente, sitio-específicos, así
como los aminoácidos per se, enriquecidos isotópicamente,
sitio- específicos. Adicionalmente, también se proporcionan
proteínas, fragmentos de proteínas, y polipéptidos conteniendo
residuos aminoacilo enriquecidos isotópicamente,
sitio-específicos, derivados de esos aminoácidos, y
métodos para su producción. Los aminoácidos y los precursores
biosintéticos de los aminoácidos están enriquecidos isotópicamente
con ^{13}C o ^{14}C en los átomos de carbono de los grupos
metilo más distantes de su grupo carboxilo. En los aminoácidos
marcados de la presente invención, están marcados los átomos de
carbono no adyacentes. En el caso donde el marcador sea ^{13}C,
los aminoácidos de esta invención son, de este modo, idealmente
apropiados para su uso en la técnica para descubrimiento de fármacos
por RMN, puesto que no hay interferencia con las señales deseadas
por interacción espín-espín
^{13}C-^{13}C de los átomos adyacentes. Además,
puesto que los aminoácidos están marcados únicamente en los grupos
metilo, los tres átomos de hidrógeno magnéticamente equivalentes
del grupo(s) metilo proporcionan fuertes señales de RMN para
la observación de cualquier efecto de acoplamiento con el
átomo(s) ^{13}C al que están unidos.
Específicamente, la presente invención
proporciona compuestos de fórmula I
o una sal del mismo, en donde
R^{1} es NH_{2} y R^{2}
es
En las fórmulas presentadas arriba, R^{3} es
hidrógeno o ^{n}CH_{3}, los enlaces con línea de puntos
representan enlaces de valencia, m es cero, y n, en cada caso, es
13 ó 14.
La presente invención proporciona los precursores
bioquímicos de leucina, isoleucina, y valina, enriquecidos con
^{13}C y ^{14}C, sitio-específicos, el ácido
2-ceto-4-(^{n}C)-butírico
(fórmula I anterior donde R^{1} es oxígeno, R^{2} es B, m es
cero, y R^{3} es hidrógeno) y el ácido
2-ceto-3-(^{n}C-metil)-4-(^{n}C)-butírico
(fórmula I anterior donde R^{1} es oxígeno, R^{2} es B, m es
cero, y R^{3} es ^{n}CH_{3}). En lo anterior, n representa 13
(esto es, compuestos enriquecidos con ^{13}C) ó 14 (esto es,
compuestos enriquecidos con ^{14}C).
Proporcionados también por la presente invención
son los métodos químicos para preparar los ácidos precursores
bioquímicos marcados con ^{13}C y ^{14}C,
sitio-específicos, de fórmula I dada en la
Reivindicación 1, o sales de los mismos, los cuales implican el
hacer reaccionar un compuesto de fórmula IV
con yoduro de metilo marcado
isotópicamente, (H_{3}^{n}CI), para producir un compuesto de
fórmula
V
y, cuando R^{3} sea hidrógeno,
eliminar los grupos protectores éster de
terc-butilo y dimetilhidracino de un compuesto de
fórmula V para producir ácido
2-ceto-4-(^{n}C)-butírico;
o además, cuando R^{3} sea ^{n}CH_{3},
hacer reaccionar un compuesto de fórmula V con yoduro de metilo
marcado isotópicamente (H_{3}^{n}CI), donde n es 13 ó 14, para
producir un compuesto de fórmula VI
\vskip1.000000\baselineskip
eliminar los grupos protectores
éster de terc-butilo y dimetilhidracino para
producir ácido
2-ceto-3-(^{n}C-metil)-4-(^{n}C)-butírico;
y, opcionalmente, salificar los productos.
La presente invención proporciona,
adicionalmente, métodos para preparar los aminoácidos marcados con
^{13}C y ^{14}C, sitio-específicos, leucina,
isoleucina y valina. El proceso implica modificar genéticamente un
microorganismo para expresar un polipéptido conteniendo un
aminoácido seleccionado de leucina, isoleucina, valina y mezcla de
los mismos; cultivar el microorganismo modificado, en un medio
nutriente conteniendo fuentes asimilables de carbono y nitrógeno,
que incluye ácido
2-ceto-4-(^{n}C)-butírico,
ácido
2-ceto-3-(^{n}C-metil)-4-(^{n}C)-butírico,
y sales y mezclas de los mismos; aislar el polipéptido expresado
resultante; y fragmentar el polipéptido y aislar los aminoácidos
individuales. El polipéptido expresado es fragmentado mediante
métodos convencionales conocidos en la técnica, incluyendo la
hidrólisis o la escisión enzimática.
El rendimiento de un aminoácido concreto puede
ser maximizado y el coste minimizado modificando el microorganismo
huésped para expresar un homopolímero del aminoácido, y utilizando
el apropiado precursor biosintético, enriquecido isotópicamente, en
un medio nutriente.
La presente invención proporciona todavía un
método para preparar una proteína, fragmento de proteína, o
polipéptido conteniendo residuos aminoacilo derivados de
aminoácidos seleccionados del grupo que se compone de ácido
L-2-amino-3-metil-5-(^{13}C)-pentanoico,
ácido
L-2-amino-3-metil-5-(^{14}C)-pentanoico,
ácido
L-2-amino-4-(^{13}C-metil)-5-(^{13}C)-pentanoico,
ácido
L-2-amino-4-(^{14}C-metil)-5-(^{14}C)-pentanoico,
ácido
L-2-amino-3-(^{13}C-metil)-5-(^{13}C)-butanoico,
y ácido
L-2-amino-3-(^{14}C-metil)-5-(^{14}C)-butanoico,
el cual supone modificar genéticamente un microorganismo para
expresar una proteína, fragmento de proteína o polipéptido
predeterminados, cultivar el microorganismo modificado, en un medio
nutriente conteniendo fuentes asimilables de carbono u nitrógeno,
que incluye ácido
2-ceto-4-(^{n}C)-butírico,
ácido
2-ceto-3-(^{n}C-metil)-4-(^{n}C)-butírico,
y sales y mezclas de los mismos, y aislar el polipéptido expresado
resultante.
La abundancia isotópica natural de ^{13}C es el
1'11%, y la de ^{14}C es insignificantemente baja. De este modo,
la probabilidad de que cualquier átomo de carbono dado dentro de
una molécula sea ^{13}C es, normalmente, un 0'0111, y la
probabilidad de que cualquier átomo de carbono dado sea ^{14}C es
bastante baja. Cuando se preparan proteínas diana para su uso en el
"escrutinio" por RMN adaptado o proceso de descubrimiento de
fármacos como se describió por Fesik y col., arriba, es conveniente
que la señal de RMN-^{13}C sea intensificada
aumentando el contenido natural de ^{13}C de la molécula diana a
estudiar. Esto se lleva a cabo enriqueciendo, uniforme o
selectivamente, la molécula diana con ^{13}C. Como se utiliza por
toda esta especificación y las reivindicaciones adjuntadas, los
términos "enriquecimiento uniforme", "enriqueciendo
uniformemente", "enriquecido uniformemente", "marcaje
uniforme" y "marcado uniformemente" significan aumentar por
medios sintéticos, a un valor mayor de 0'0111, la probabilidad de
que los átomos de carbono en uno o más sitios preseleccionados
específicos, dentro de la molécula diana, sean ^{13}C.
Por ejemplo, las biomoléculas expresadas por
microorganismos modificados genéticamente, cultivados en un medio
nutriente conteniendo glucosa enriquecida con ^{13}C
uniformemente, serán uniformemente enriquecidas con ^{13}C. Una
proteína expresada mediante un microorganismo modificado
genéticamente, cultivado en un medio nutriente conteniendo un
aminoácido que esté enriquecido con ^{13}C únicamente en la
cadena secundaria metilo, sería enriquecida específicamente con
^{13}C en los residuos alanilo contenidos dentro de la proteína
expresada. De manera similar, las proteínas expresadas por el
método de esta invención, serán enriquecidas
sitio-específicamente con ^{13}C o ^{14}C en
los grupos metilo terminales de la cadena secundaria de leucina,
isoleucina, y valina.
El método de la presente invención también
permite la preparación de leucina, isoleucina, y valina marcados
sitio-específicamente, proteínas, fragmentos de
proteína, o polipéptidos fabricados a partir de estos aminoácidos
marcados, y los precursores biosintéticos de aminoácidos marcados
con ^{14}C así como con ^{13}C. Tales compuestos son útiles,
por ejemplo, en estudios de metabolismo de proteínas donde sea
conveniente seguir el curso y el destino de la degradación de las
proteínas por métodos radiométricos.
Los términos adicionales utilizados por toda esta
especificación y reivindicaciones adjuntadas tienen sus
significados generalmente aceptados. Los siguientes términos
específicos tienen los significados atribuidos:
"DTT" significa ditiotreitol.
"HEPES" representa ácido
N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico.
"IPTG" significa
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido.
"PMSF" se refiere a fluoruro de
\alpha-toluensulfonilo.
"DCE" se refiere al domino catalítico
(residuos 81-256) de estromelisina.
Abajo se expone la preparación de una molécula
diana fragmento de proteína, enriquecida con ^{n}C,
sitio-específica, ejemplar. El ejemplo concreto
mostrado demuestra la preparación del denominado "domino
catalítico" de estromelisina humana ("DCE"), marcado con
leucina, valina, e isoleucina enriquecidas con ^{13}C,
sitio-específicas. Mientras que se demuestra con
precursores de aminoácidos marcados con ^{13}C, el método es
igualmente aplicable partiendo de precursores de aminoácido marcados
con ^{14}C. Un método preferido para preparar cantidades
adecuadas de moléculas diana, conteniendo específicamente
polipéptido enriquecido con ^{n}C, implica la transformación de
una célula huésped con un vector de expresión conteniendo un
polinucleótido que codifica el polipéptido deseado. La proteína o
fragmento de proteína polipeptídico es expresado cultivando, la
línea celular transformada, en un medio conteniendo fuentes
asimilables de carbono y nitrógeno conocidas en la técnica, e
incluyendo los precursores bioquímicos enriquecidos con ^{n}C de
esta invención. Para el marcaje sitio-específico de
la proteína o fragmento de proteína según la presente invención,
las fuentes asimilables para marcaje con ^{n}C de un polipéptido
diana incluyen precursores biosintéticos de aminoácidos marcados con
^{n}C.
Por ejemplo, se sabe que el
\alpha-ceto-butirato es el
precursor biosintético de la isoleucina, y que el
\alpha-ceto-isovalerato es el
precursor biosintético de la valina y la leucina. El Esquema I
abajo muestra cómo se pueden sintetizar los precursores
biosintéticos de la leucina, isoleucina, y valina, enriquecidos con
^{n}C. El Esquema emplea el relativamente barato yoduro de metilo
enriquecido con ^{n}C, H_{3}^{n}CI, como fuente para el
enriquecimiento isotópico para producir ácido
\alpha-ceto-butírico y ácido
\alpha-ceto-isovalérico marcados
terminalmente con ^{n}C.
El empleo de un nutriente enriquecido
uniformemente con ^{13}C, tal como
glucosa-^{13}C_{6}, ha sido utilizado
típicamente como medio apropiado para introducir el enriquecimiento
con ^{13}C en un compuesto diana; sin embargo, es muy caro.
Además, una abrumadora mayoría de los sitios de carbono en dianas
marcadas uniformemente con ^{13}C tendrán un vecino unido
covalentemente que está también marcado con ^{13}C, introduciendo
acoplamiento ^{13}C-^{13}C que puede afectar
negativamente a la señal-ruido y a las propiedades
de relajación de sitios marcados con ^{13}C en la biomolécula
diana. Alternativamente, el medio nutriente puede incluir
aminoácidos marcados uniformemente con ^{13}C, disponibles
comercialmente. Mientras que esta técnica reduce la "dilución"
del marcaje, también es una alternativa costosa y, asimismo, padece
el inconveniente de las interacciones espín-espín
^{13}C-^{13}C de los átomos de carbono
adyacentes.
Sin embargo, el método de la presente invención
para marcaje con ^{n}C de una molécula diana polipeptídica
comprende el cultivar la línea celular, modificada genéticamente, en
un medio nutriente conteniendo precursores biosintéticos, marcados
con ^{n}C, de aminoácidos concretos. No solamente están algunos de
los aminoácidos en la proteína, fragmento de proteína o
polipéptido resultantes enriquecidos isotópicamente, esos
aminoácidos están marcados
sitio-específicamente.
Específicamente, los precursores de aminoácidos
de la invención son el ácido
\alpha-ceto-butírico y el ácido
\alpha-ceto-isovalérico marcados.
Los productos biosintéticos de estos precursores son la leucina,
isoleucina, y valina, en los que los grupos metilo concretos de las
cadenas secundarias están enriquecidos con ^{n}C. Debido a que
los grupos metilo tienen cada uno tres átomos de hidrógeno
conectados a un átomo de carbono marcado con ^{n}C, cuando n sea
13, las correspondientes señales de RMN son particularmente fuertes
y distintas.
La síntesis del ácido
\alpha-ceto-butírico y el ácido
\alpha-ceto-isovalérico marcados
implica la C-metilación del átomo de carbono
terminal, en el ácido pirúvico, con yoduro de metilo enriquecido con
^{n}C. Normalmente, la alquilación de los
\alpha-cetoácidos, tal como el piruvato, es
inherentemente difícil y está acompañada por descomposición del
intermedio enolato, con la formación de numerosos productos
secundarios. Sin embargo, Spencer y col., Tetrahedron
Letters, 1975, 3.889, y Williams y col., ibid., 1990,
5.881, han demostrado que se ha llevado a cabo la alquilación de la
correspondiente oxima enolato, aunque la alquilación con
electrófilos primarios (por ejemplo, yoduro de metilo) fue
problemática. D. Enders y col., Angew. Chem. Int. Eng.-Ed.,
1992, 618, y D. Enders y col., Synlett, 1992, 901, han
demostrado que es posible la alquilación de una
N,N-dimetilhidrazona de piruvato, pero
específicamente mencionado que fue necesario el voluminoso
2,6-dialquil fenil éster para evitar la
autoacilación. Los compuestos representativos de la presente
invención incluyen los siguientes:
ácido
2-ceto-4-(^{13}C)-butírico
o una sal del mismo,
ácido
2-ceto-4-(^{14}C)-butírico
o una sal del mismo,
ácido
2-ceto-3-(^{13}C-metil)-4-(^{13}C)-butírico
o una sal del mismo,
ácido
2-ceto-3-(^{14}C-metil)-4-(^{14}C)-butírico
o una sal del mismo.
Aunque los compuestos específicos mencionados
arriba han sido nombrados por tener isótopos ^{13}C o ^{14}C en
sitios específicos en el compuesto, se comprenderá por aquellos de
destreza ordinaria en la técnica que los átomos de carbono en estos
sitios en los compuestos no estarán completamente marcados con
^{13}C o ^{14}C. El grado de sustitución isotópica o
"enriquecimiento" en cada sitio molecular depende del
correspondiente grado de enriquecimiento contenido en las materias
de partida utilizadas en la síntesis.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
I
Síntesis Química de Precursores
Marcados
En el Esquema I, el piruvato de
terc-butilo es transforma en la correspondiente
N,N-dimetilhidrazona 2 mediante reacción con
N,N-dimetilhidracina en éter dietílico a temperatura
ambiente. La hidrazona 2 resultante es enfriada en una solución de
tetrahidrofurano a -78ºC y tratada con bromuro de litio, seguido por
diisopropilamida de litio para formar el intermedio
aza-alil enolato. El enolato se alquila con yoduro
de metilo marcado con ^{n}C, para producir la hidrazona 3. Una
segunda ruta de alquilación de 3 produce la hidrazona dimetilada
marcada 4. El tratamiento de 3 y 4 en primer lugar con ClH acuoso 1N
en tetrahidrofurano o éter dietílico (para eliminar la hidrazona),
seguido por tratamiento con gas cloruro de hidrógeno en cloruro de
metileno (para eliminar el éster de terc-butilo), da
los correspondientes \alpha-cetoácidos 5 y 6
marcados terminalmente con ^{n}C. Los Esquemas II, III, y IV
ilustran, respectivamente, cómo estos
\alpha-cetoácidos son transformados
biosintéticamente en ^{n}C-leucina,
^{n}C-isoleucina, y
^{n}C-valina. En todos los Esquemas, el
sitio(s) de enriquecimiento isotópico está indicado por
asteriscos.
Esquema
II
Síntesis Bioquímica de
Isoleucina
Marcada
\newpage
Esquema
III
Síntesis Bioquímica de Leucina
Marcada
\newpage
Esquema
IV
Síntesis Bioquímica de
Valina
En la técnica se conocen métodos para preparar
vectores de expresión que contengan secuencias polinucleotídicas que
codifiquen polipéptidos específicos, y para transformar células
huésped con esos vectores. (Ver, por ejemplo, R. W. Old y col.,
Techniques of Gene Manipulation, Blackwell Science, Londres,
1994, y tratados similares en el campo). Asimismo, en la técnica
también se conocen métodos para cultivar las células transformadas
para expresar el polipéptido codificado, y para aislar, purificar y
replegar el polipéptido. Los ejemplos presentados a continuación
describen la producción de muestras, enriquecidas con ^{13}C, de
la región catalítica de los aminoácidos 81-256 de
estromelisina humana (DCE) a partir de E. coli
modificado.
Se prepara el fragmento 81-256
(ID SEC Nº: 1) de estromelisina (DCE) insertando un plásmido, que
codifica para la producción del fragmento de proteína, dentro de
una cepa de E. coli, y cultivando la cepa bacteriana,
genéticamente modificada, en un medio de cultivo adecuado. El
fragmento de proteína es aislado del medio de cultivo, purificado,
y posteriormente utilizado, en el análisis RMN bidimensional de su
afinidad, con compuestos de ensayo según el método de esta
invención. A continuación se describen los procedimientos para los
procesos de preparación.
Se cultivan e inducen fibroblastos de piel humana
(ATCC Nº CRL 1507) utilizando el procedimiento descrito por Clark y
col., Archiv. Biochem. and Biophys., 241: 36 (1985). Se
aísla ARN total de 1 g de células utilizando un kit de RNAgents®
Total RNA Isolation System (Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road,
Madison, WI 53711, EEUU), siguiendo las instrucciones del
fabricante. Se desnaturaliza una porción de 1 \mug del ARN
calentando a 80ºC durante cinco minutos, y se somete luego a PCR
con transcriptasa inversa utilizando un kit de GenAmp® RNA PCR
(Applied Biosystems/Perkin-Elmer) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Se realiza un PCR anidado utilizando cebadores
primarios (a) GAAATGAAGAGTCTTCAA (ID SEC Nº: 2) y (b)
GCGTCCCAGGTTCTGGAG (ID SEC Nº: 3) y treinta y cinco ciclos de 94ºC,
dos minutos; 45ºC, dos minutos; y 72ºC, tres minutos. Esto es
seguido por reamplificación con cebadores internos (c)
TACCATGGCCTATCCATT
GGATGGAGC (ID SEC Nº: 4) y (d) ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG (ID SEC Nº: 5) utilizando treinta ciclos, bajo las mismas condiciones descritas inmediatamente antes, para generar una secuencia de ADN que codifique para residuos de aminoácidos 1-256 de estromelisina humana.
GGATGGAGC (ID SEC Nº: 4) y (d) ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG (ID SEC Nº: 5) utilizando treinta ciclos, bajo las mismas condiciones descritas inmediatamente antes, para generar una secuencia de ADN que codifique para residuos de aminoácidos 1-256 de estromelisina humana.
Después se clona el fragmento PCR en el vector de
clonación pT7Blue® para PCR (Novagen Inc.), según las instrucciones
del fabricante. El plásmido resultante se corta con NcoI y BamHI,
y se subclona el fragmento de estromelisina dentro del vector de
expresión pET3d (Novagen Inc.), utilizando nuevamente las
instrucciones del fabricante.
A partir de la construcción de expresión
1-256, mediante amplificación por PCR, se genera una
construcción de expresión de estromelisina madura que codifica para
los residuos de aminoácidos 81-256 más un residuo
iniciador aminoacilo de metionina. El fragmento PCR resultante es
primero clonado en el vector pT7Blue® (Novagen Inc.) y subclonado
después en el vector pET3d (Novagen Inc.) utilizando las
instrucciones del fabricante, de la manera descrita anteriormente,
para producir el plásmido
pETST-83-256. Este plásmido final es
idéntico al descrito por Qi-Zhuang y col.,
Biochemistry, 31: 11.231 (1992), con la excepción de que el
presente plásmido codifica para una secuencia peptídica que empieza
por dos aminoácidos más tempranamente, específicamente en la
posición 81, en la secuencia de la estromelisina humana. El plásmido
pETST-83-256 es transformado dentro
de la cepa BL21 (DE3)/pLysS de E. coli (Novagen Inc.)
conforme a las instrucciones del fabricante, para generar una cepa
de expresión, BL21
(DE3)/pLysS/pETST-255-1.
Se prepara un medio de precultivo disolviendo
1'698 g de PO_{4}H_{2}Na\cdot7H_{2}O, 0'45 g de
PO_{4}H_{2}K, 0'075 g de ClNa, 0'150 g de ClNH_{4}, 0'3 g de
U-^{13}C-glucosa, 300 \mul de
solución acuosa 1M de SO_{4}Mg, y 15 ml de solución acuosa de
Cl_{2}Ca en 150 ml de agua desionizada. La solución resultante
del medio de precultivo es esterilizada y transferida a un matraz
estéril de 500 ml con deflectores. Inmediatamente antes de la
inoculación del medio de precultivo con la cepa bacteriana, al
contenido del matraz se añade 150 ml de una solución conteniendo 34
mg/ml de cloranfenicol en etanol del 100%, y 1'5 ml de una solución
conteniendo 20 mg/ml de ampicilina. Después, el contenido del matraz
es inoculado con 1 ml de solución madre de glicerina de cepa BL21
(DE3)/pLysS/pETST-255-1 de E.
coli genéticamente modificada. Se sacude el contenido del
matraz (225 rpm) a 37ºC, hasta que se observe una densidad óptica
de 0'65.
Se prepara un medio nutriente para fermentación
disolviendo 113'28 g de PO_{4}HNa_{2}\cdot7H_{2}O, 30 g de
PO_{4}H_{2}K, 5 g de ClNa, y 10 ml de agente antiespumante
DF-60 al 1% en 9.604 ml de agua desionizada. Se
pone esta solución en un fermentador New Brunswick Scientific Micros
(Edison, NJ) y se esteriliza a 121ºC durante 40 minutos.
Inmediatamente antes de la inoculación del medio de fermentación,
al contenido del recipiente de fermentación se añaden los
siguientes componentes preesterilizados: 100 ml de una solución
acuosa al 10% de ClNH_{4}, 15 g de glucosa enriquecida
uniformemente con ^{13}C, 20 ml de una solución acuosa 1M de
SO_{4}Mg, 1 ml de una solución acuosa 1M de Cl_{2}Ca, 5 ml de
una solución acuosa de clorhidrato de tiamina (10 mg/ml), 10 ml de
una solución conteniendo 34 mg/ml de cloranfenicol en etanol del
100%, y 1'9 g de ampicilina disuelta en la solución de
cloranfenicol. Se ajusta el pH de la solución resultante a pH 7'00,
mediante la adición de una solución acuosa de SO_{4}H_{2}
4N.
El precultivo de cepa BL21
(DE3)/pLysS/pETST-255-1 de E.
coli del procedimiento a escala de matraz descrito anteriormente
se añade al contenido del fermentador, y se deja que el crecimiento
celular proceda hasta que se alcance una densidad óptica de 0'48.
Durante este proceso, el contenido del fermentador es
automáticamente mantenido a pH 7'0 mediante la adición de
SO_{4}H_{2} 4N o KOH 4N según se necesite. El contenido en
oxígeno disuelto del contenido del fermentador es mantenido por
encima del 55% de saturación del aire mediante un bucle en cascada,
que aumentaba la velocidad de agitación cuando el contenido en
oxígeno disuelto caía por debajo del 55%. Se alimenta aire al
contenido del fermentador a 7 litros estándar por minuto (SLPM) y
la temperatura del cultivo se mantiene a 37ºC por todo el
proceso.
Las células se recolectan por centrifugación a
17.000xg durante 10 minutos a 4ºC, y los gránulos de células
resultantes son recogidos y almacenados a -85ºC. El rendimiento
celular en húmedo es 3'5 g/l. El análisis de las fracciones soluble
e insoluble de los lisados celulares mediante electroforesis en gel
de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
(SDS-PAGE) revela que, aproximadamente el 50% de la
estromelisina, se encontraba en la fase soluble.
El fragmento de estromelisina, preparado como se
describió arriba, se purifica empleando una modificación de la
técnica descrita por Ye y col., Biochemistry, 31: 11.231
(1992). Las células recolectadas son suspendidas en tampón
Tris-ClH 20mM (pH 8'0), solución de azida sódica
conteniendo Cl_{2}Mg 1mM, Cl_{2}Zn 0'5mM, 25 unidades/ml de
enzima Benzonase® (Benzon Pharma A/S Roskilde, Dinamarca), y una
mezcla de inhibidores compuesta por fluoruro de
4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo
("AEBSF"), Leupeptin®, Aprotinin® y Pepstatin® (todos a
concentraciones de 1 mg/ml). AEBSF, Leupeptin®, Aprotinin® y
Pepstatin® están disponibles por American International Chemical).
La mezcla resultante es agitada suavemente durante una hora, y
enfriada después a 4ºC. Luego, las células se rompen por sonicación
utilizando un ciclo de servicio del 50%. El lisado resultante es
centrifugado a 14.000 rpm durante 30 minutos, y el gránulo de
fracción insoluble congelado a -80ºC para el subsiguiente proceso de
fabricación.
Se añade sulfato amónico sólido al sobrenadante
hasta el punto de saturación del 20%, y la solución resultante se
carga en una columna (Pharmacia Biotech.) de flujo rápido
Fenil-Sepharosa (Q-Sepharosa FF) de
700 ml. Antes de cargar, la columna de Sepharosa es equilibrada con
tampón Tris-ClH 50mM (pH 7'6 a 4ºC), Cl_{2}Ca
5mM, y SO_{4}(NH_{4})_{2} 1M. La columna cargada
se eluciona con un gradiente lineal de concentraciones decrecientes
de SO_{4}(NH_{4})_{2} acuoso (desde 1M hasta
0M) y concentraciones crecientes de Cl_{2}Ca acuoso (desde 5mM
hasta 20mM) en tampón Tris-ClH a pH 7'6. Las
fracciones activas de eluato son recogidas y concentradas en una
célula de cubeta agitada Amicon (Amicon Inc.). La muestra
concentrada es dializada durante la noche en el tampón de partida
utilizado con la columna Q-Sepharosa FF,
Tris-ClH 50mM (pH 8'2 a 4ºC) con Cl_{2}Ca
10mM.
Después, la muestra dializada se carga en la
columna Q-Sepharosa FF y se eluciona con un
gradiente lineal constando del tampón de partida y de ClNa 200nM.
La fracción soluble purificada del fragmento de estromelisina es
concentrada y almacenada a 4ºC. Se solubiliza el gránulo en
guanidina-HCl 8M. Se centrifuga la solución durante
20 minutos a 20.000 rpm, y se añade el sobrenadante, gota a gota, a
un tampón de plegamiento constando de Tris-ClH 50mM
(pH 7'6), Cl_{2}Ca 10mM, Cl_{2}Zn 0'5mM, y del combinado
inhibidor de AEBSF, Leupeptin®, Aprotinin® y Pepstatin® (todos a
concentraciones de 1 \mug/ml). El volumen de tampón de
plegamiento es diez veces el de sobrenadante. La mezcla de
sobrenadante y tampón de plegamiento es centrifugada a 20.000 rpm
durante 30 minutos. El sobrenadante de esta centrifugación es
almacenado a 4ºC, y el gránulo sometido dos veces a las etapas
descritas arriba de solubilización en
guanidina-HCl, replegamiento en tampón, y
centrifugación. Se combinan los sobrenadantes finales de cada una
de las tres centrifugaciones, y se añadió sulfato amónico sólido
hasta el punto de saturación del 20%. De este modo, la solución
resultante obtenida a partir de la fracción insoluble es sometida a
purificación en Fenil-Sepharosa y
Q-Sepharosa, como se describió arriba para la
fracción soluble. Se combinan las fracciones purificadas soluble e
insoluble para producir aproximadamente 1'8 mg de fragmento
81-256 de estromelisina purificado (DCE) por gramo
de pasta celular, enriquecido uniformemente con ^{13}C.
El DCE se expresa cultivando la cepa modificada
de E. coli, BL21
(DE3)/pLysS/pETST-255-1, en un medio
constando de ácido
2-ceto-4-(^{13}C)-butírico,
o una sal del mismo, y ácido
2-ceto-3-(^{13}C-metil)-4-(^{13}C)-butírico,
o una sal del mismo. Los métodos utilizados para la preparación de
la cepa de E. coli lograda genéticamente, y para expresar,
aislar, y purificar el fragmento de proteína son como se describió
antes, excepto para el empleo de
U-^{12}C-glucosa en lugar de
U-^{13}C-glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Abbott Laboratories
\hskip1cmAugeri, David J.
\hskip1cmFesik, Stephen F.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROTEÍNAS, AMINOÁCIDOS, Y PRECURSORES
BIOQUÍMICOS DE LOS MISMOS, MARCADOS ISOTÓPICAMENTE,
SITIO-ESPECÍFICOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 6470.US.01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> US 09/289.517
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-04-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región catalítica
81-256 de estromelisina humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaatgaaga gtcttcaa
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtcccagg ttctggag
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskiptaccatggcc tatccattgg atggagc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataggatcct taggtctcag gggagtcagg
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Un compuesto de fórmula Ia
o una sal del mismo, en donde
R^{3} es hidrógeno o ^{n}CH_{3}, y n en cada caso es 13 ó
14.
2. Un compuesto según la Reivindicación 1,
seleccionado del grupo que se compone de:
ácido
2-ceto-4-(^{13}C)-butírico,
ácido
2-ceto-3-(^{13}C-metil)-4-(^{13}C)-butírico,
ácido
2-ceto-4-(^{14}C)-butírico,
y
ácido
2-ceto-3-(^{14}C-metil)-4-(^{14}C)-butírico,
o sales de los mismos.
3. Un método para preparar un compuesto de
fórmula Ia
o una sal del mismo, en donde
R^{3} se selecciona del grupo que se compone de hidrógeno y
^{n}CH_{3}, y n en cada caso es 13 ó 14, el cual
comprende
- a)
- hacer reaccionar un compuesto de fórmula IV
- con yoduro de metilo marcado isotópicamente (H_{3}^{n}CI), para producir un compuesto de fórmula V
y, cuando R^{3} sea
hidrógeno,
- b)
- eliminar los grupos éster de terc-butilo y dimetilhidracino para producir ácido 2-ceto-4-(^{n}C)-butírico;
o, cuando R^{3} sea ^{n}CH_{3},
- c)
- hacer reaccionar el producto de la etapa a) con yoduro de metilo marcado isotópicamente (H_{3}^{n}CI), donde n es 13 ó 14, para producir un compuesto de fórmula VI
y
- d)
- eliminar los grupos éster de terc-butilo y dimetilhidracino para producir ácido 2-ceto-3-(^{n}C-metil)-4-(^{n}C)-butírico
4. Un método según la Reivindicación 3, el cual
comprende además el salificar el producto de reacción de la etapa b)
o etapa d).
5. Un método para preparar una proteína,
fragmento de proteína o polipéptido conteniendo al menos un residuo
aminoacilo seleccionado del grupo que se compone de
4-(^{n}C-metil)-5-(^{n}C)-leucilo,
5-(^{n}C)-isoleucilo, y
3-(^{n}C-metil)-4-(^{n}C)-valilo,
el cual comprende
a) modificar genéticamente un microorganismo
adecuado para expresar dicha proteína, fragmento de proteína, o
polipéptido;
b) cultivar dicho microorganismo modificado
genéticamente, en un medio nutriente conteniendo un compuesto de
fórmula Ia
o sal del mismo, en donde n en cada
caso es 13 ó 14, y R^{3} es hidrógeno o ^{n}CH_{3};
y
c) aislar dicha proteína, fragmento de proteína,
o polipéptido.
6. El método de la Reivindicación 5, en donde la
proteína, fragmento de proteína o polipéptido, conteniendo al menos
un residuo aminoacilo, es seleccionado de
5-(^{n}C)-isoleucilo y R^{3} es hidrógeno.
7. Un método para preparar un aminoácido
seleccionado del grupo que se compone de ácido
2-amino-3-(^{n}C-metil)-4-(^{n}C)-butírico,
ácido
2-amino-4-(^{n}C-metil)-5-(^{n}C)-pentanoico
y ácido
2-amino-3-metil-5-(^{n}C)-pentanoico,
el cual comprende
a) modificar genéticamente un microorganismo
adecuado para expresar un homopolímero de dicho aminoácido;
b) cultivar dicho microorganismo modificado
genéticamente, en un medio nutriente conteniendo un compuesto de
fórmula Ia'
o una sal del mismo, cuando dicho
aminoácido sea ácido
2-amino-3-(^{n}C-metil)-4-(^{n}C)-butírico
y ácido
2-amino-4-(^{n}C-metil)-5-(^{n}C)-pentanoico,
donde n en cada caso es 13 ó
14,
o de fórmula Ia''
o una sal del mismo, cuando dicho
aminoácido sea ácido
2-amino-3-metil-5-(^{n}C)-pentanoico;
c) aislar el homopolímero de dicho aminoácido
expresado por dicho microorganismo modificado genéticamente; y
d) fragmentar dicho homopolímero para producir
dicho aminoácido.
8. El método de la Reivindicación 7, en donde
dicho aminoácido es ácido
2-amino-3-(^{n}C-metil)-4-(^{n}C)-butírico.
9. El método de la Reivindicación 7, en donde
dicho aminoácido es ácido
2-amino-4-(^{n}C-metil)-5-(^{n}C)-pentanoico.
10. El método de la Reivindicación 7, en donde
dicho aminoácido es ácido
2-amino-3-metil-5-(^{n}C)-pentanoico.
Applications Claiming Priority (2)
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---|---|---|---|
US28951799A | 1999-04-09 | 1999-04-09 | |
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---|---|---|---|
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