KR101219684B1

KR101219684B1 - 정량적 질량분석기법을 이용한 만성골수성 백혈병의 발병 진단방법과 약제 내성 진단방법

Info

Publication number: KR101219684B1
Application number: KR1020120044855A
Authority: KR
Inventors: 김광표
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2013-01-10
Also published as: KR20120089608A

Abstract

본 발명은 질량분석기(mass spectrometer)를 이용하여 생체시료(골수/혈액/혈장)에서 만성골수성 백혈병의 원인 단백질인 Bcr/Abl 혼성 단백질을 정량적으로 분석하는 방법, Bcr/Abl 혼성 단백질의 저해제를 이용한 치료과정에서 생성되는 Bcr/Abl의 약제 내성 돌연변이를 정량분석하는 방법과, 이를 이용한 만성 골수성 백혈병의 진단과 치료 예후 진단법 및 그 방법에 사용되는 펩타이드에 관한 것이다.

Description

정량적 질량분석기법을 이용한 만성골수성 백혈병의 발병 진단방법과 약제 내성 진단방법{Development of diagonstic and prognostic methods for chronic myelodal leukemia by measurement of expression levels of Bcr-Abl and drug-resistant Bcr-Abl mutants with quantitiative mass spectrometry}

본 발명은 동위원소 희석법을 이용한 만성골수백혈병의 원인 단백질인 Bcr-Abl의 정량적 분석법, 상기 질병의 예후에 중요한 영향을 미치는 인산화와 치료과정에서 생겨나는 약제 내성을 갖는 Bcr-Abl의 돌연변이 단백질의 양을 환자의 생체시료(혈장, 골수)에서 정량적으로 분석하는 방법과 그 방법에 사용되는 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명은 보건복지부의 암정복추진연구개발사업의 일환으로 수행된 연구로부터 도출된 것이다[과제 고유번호: 0520070-1, 과제명 : 정량적 단백질체 분석기술을 이용한 만성골수백혈병의 진단]

백혈병은 혈액 세포와 림프구를 생산하는 조혈모세포를 포함한 인체의 조혈계에서 발생하는 악성 혈액질환으로서,백혈구가 성숙하는 조혈 과정에 장애가 생겨 발생한 미성숙 악성백혈구가 골수에서 증식함으로써, 정상 적혈구, 백혈구, 혈소판의 생성이 방해되어 전체 골수 조혈모세포의 30% 이상을 악성 백혈구가 차지하는 혈액 암의 일종이다. 백혈병은 급성과 만성, 골수성과 림프구성에 따라 크게 4 가지 유형으로 분류하고 있으며, 이를 조직학적 측면에서 세분화하여 20 종류의 백혈병으로 분류한다. 모든 종류의 백혈병은 모든 연령에서 나타날 수 있으나, 소아 (2-10세)에서 주로 나타나는 것은 급성 림프구성 백혈병이고, 중년기 또는 노년기에 흔히 나타나는 것은 급성 골수성 백혈병 또는 만성 골수성 백혈병으로 알려져 있다. 우리나라에서 백혈병의 발병율은 1992년 현재 인구 10만 명당 0.96명이고, 매년 3,000-4,000 명이 신규 백혈병으로 진단되며, 2000년에는 전체사망원인의 0.54 %에 해당하는 1,306명이 백혈병으로 사망하였다(참조: 보건복지부 암 환자 조사보고서, 1996; 통계청 사망원인별 통계연보, 2000).

현재까지 알려진 백혈병 진단방법으로는 말초 혈액세포 및 골수세포를 기존의 광학 현미경과 염색에 의해 진단하는 방법이 알려져 있으나, 동일한 소견을 보이는 종양이라 하더라도 환자에 따라 매우 다른 임상결과를 나타내고 각종 치료에도 각기 다르게 반응을 보일 수 있기 때문에, 병리, 형태학적 특이성에 따른 진단 및 분류법은, 백혈병을 치료하기 위한 적합한 치료방법을 결정하는데 한계를 나타내고 있는 실정이다. 최근에는 분자유전학이 발달되고, 악성 혈액질환의 80-90% 이상에서 백혈병 특이염색체 및 유전자의 이상이 규명되면서, 염색체 이상에 의한 분자생물학적 진단방법인 고 분염법, 형광 인시튜 하이브리드법( in situ hybridization), 중합효소 연쇄반응법 등이 사용되어 진단 성공율을 향상시키고 있다. 그럼에도 불구하고, 백혈병의 종류를 판단하기 위한 진단 정확도가 30 내지 40% 정도에 불과하며, 진단에 소요되는 시간이 많다는 단점이 개선되지 않고 있다. 이에, 다양한 백혈병 특이 유전자를 보다 정확하고 신속하게 진단할 수 있고, 미세 잔류 질환 여부를 측정하여 질병치료 후 예후를 확인할 수 있는 새로운 분자 유전학적 진단법의 개발이 절실히 요구되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.

생물시료는 수많은 단백질들이 혼합되어 존재하는 상태이며, 1차원 SDS-PAGE 또는 액체 크로마토그래피 등의 방법으로 단백질 또는 단백질을 가수분해하여 얻은 펩타이드들을 분리한 뒤에 질량 분석기를 이용하여 펩타이드의 탠덤 질량 스펙트럼을 얻는다.　

단백질 서열 데이터베이스를 사용하면, 각각의 탠덤 질량 스펙트럼에 해당되는 펩타이드의 아미노산 서열을 찾을 수 있으며, 이들을 통합 분석하면 단백질을 동정할 수 있다.　 이러한 단백질 검색 과정에는 SEQUEST®(Eng et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5:976-989, 1994; Thermo Electron Corp.,USA), Mascot(Perkins et al., Electrophoresis, 20:3551-3567, 1999; Matrix Science Ltd., USA,http://www.matrixscience.com/search_form_select.html), Sonar(Field, H. I. et al., Proteomics, 2:36-47,2002; http://knxs.bms.umist.ac.uk/prowl/sonar/sonar_cntrl.html), X!Tandem(Craig et al.,　Bioinformatics, 20:1466-1467, 2004; Proteom Software Inc., USA), Phenyx, PeptideProphet(Keller A., et al., Anal. Chem. 2002, 74, 5383-5392), ProteinProphet(Nesvizhskii A.I., et al., Anal. Chem. 2003, 75,4646-4658), DTASelect(Tabb D. L., et al., Proteome Res. 2002, 1, 21-26) 또는 OMSSA(Syka JE, et al.,Proc Natl Acad Sci USA. 2004. Jun 29, 101(26). 9528-33) 등의 소프트웨어를 사용한다.

일반적으로 특정 단백질의 발현 양이나 특수한 전사후 수식 과정을 정량적으로 이해하는 연구는 매우 중요한 의미를 가진다. 특히 단백질은 시료 양을 증폭하는 과정이 없기 때문에 소량의 양을 측정하기 위해서 동위원소 희석법에 기반한 질량분석법이 개발되었다. 이러한 분석법은 세포내에 1000 개/세포 이하로 존재하는 소량의 단백질을 정량 분석할 수 있게 해주는데, 이는 임상 연구에서 충분한 양의 시료를 준비할 수 없다는 점에서 매우 적합한 방법이라 하겠다. 이 분석법은 타겟 단백질의 아미노산 서열만 알게 되면, 수 주내에 펩타이드 합성과 물리화학적 성질 분석 및 분석법 개발이 완료되었다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 만성 골수성 백혈병과 관련된 단백질의 정량 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 만성 골수성 백혈병 예후를 예측할 수 있는 특정한 인산화 정도에 대한 정량 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 만성 골수성 백혈병 약제 내성과 관련된 단백질의 정량 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 만성 골수성 백혈병과 관련된 단백질의 정량을 위한 표준 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 만성 골수성 백혈병 약제 내성과 관련된 단백질의 정량을 위한 표준 펩타이드를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 LGGGQHGEVYEGVWK(서열번호 1),LGGGQYGEVYEGVWK(서열번호 2), LGGGQFGEVYEGVWK(서열번호 3), LGGGQYGVVYEGVWK(서열번호 4), LGGGQYGK(서열번호 5), PPFYIITE(서열번호 6), PPFYIIIE(서열번호 7), KQSSKALQRPVASDF(서열번호 8), EEALQR(서열번호 9), 및 TGQIWPNDGEGAFHGDAEALQR(서열번호 10)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩타이드 세트를 제공한다.

상기의 펩타이드에서 서열번호 1과 2의 서열은 인산화되는 것이 바람직하며, 상기 인사화된 펩타이드는 LGGGQpYGEVYEGVWK, LGGGQYGEVpYEGVWK, LGGGQpYGEVpYEGVWK, 또는 LGGGQHGEVpYEGVWK(p는 인산화를 나타냄)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 KQSSKALQRPVASDF(서열번호 8), 및 EEALQR(서열번호 9), 및 TGQIWPNDGEGAFHGDAEALQR(서열번호 10)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 Bcr-Abl 혼성 단백질 정량 측정을 위한 펩타이드 세트를 제공한다

또한 본 발명은 LGGGQHGEVYEGVWK(서열번호 1),LGGGQYGEVYEGVWK(서열번호 2), LGGGQFGEVYEGVWK(서열번호 3), LGGGQYGVVYEGVWK(서열번호 4), LGGGQYGK(서열번호 5), PPFYIITE(서열번호 6), 및 PPFYIIIE(서열번호 7)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 Abl 혹은 Bcr-Abl 혼성 단백질에 일어난 약제 내성 유발 돌연변이의 정량 측정을 위한 펩타이드 세트를 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 펩타이드 서열의 타이로신 잔기가 인산화된 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 Abl 혹은 Bcr-Abl 혼성 단백질의 인산화 정도에 대한 정량 측정을 위한 펩타이드 세트를 제공한다. 상기 인사화된 펩타이드는 LGGGQpYGEVYEGVWK, LGGGQYGEVpYEGVWK, LGGGQpYGEVpYEGVWK, 또는 LGGGQHGEVpYEGVWK(p는 인산화를 나타냄)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드 서열 중 발린(Val,V), 아시소루신(Ile, I), 라이신(Lys, K) 또는 루신(Leu, L)은 동위원소로 치환된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 a) 샘플로부터 타겟 단백질을 분리하는 단계;b) 상기 단백질에 단백질 분해효소를 처리하는 단계; 및 c) 상기 처리된 펩타이드들을 질량분석하는 단계를 포함하고, 여기에 상기 본 발명의 펩타이드 세트를 첨가하는 Bcr-Abl 혼성 단백질 정량 방법을 제공한다.

본 발명의 정량방법의 일 구체예에 있어서, 상기 타겟 단백질은 Bcr-Abl 혼성단백질은 두 단백질의 다양한 exon 조합 b3a2,b2a2,e1a2에 따라 분자량이 바람직하게는 약 200kDa 내외, 더욱 바람직하게는 p190, p210, 또는 p230이나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 a) 샘플로부터 타겟 단백질을 분리하는 단계;b) 상기 단백질에 단백질 분해효소를 처리하는 단계; 및 c) 상기 처리된 펩타이드들을 질량분석하는 단계를 포함하고, 여기에 상기 본 발명의 펩타이드 세트를 첨가하는 Abl 돌연변이 단백질 정량 방법을 제공한다.

상기 타겟 단백질은 혼성이 일어나지 않은 세포내에 정상적으로 존재하는 Abl 단백질의 분자량은 145kDa 정도이므로 p145라 칭한다.

본 발명의 정량방법의 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 트립신(Trypsin) 혹은 글루시(Glu-C)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에 사용된 "백혈병"이란 용어는 만성골수 백혈병 (CML) 및 급성 림프구 백혈병 (ALL), 특히 필라델피아-염색체 양성 급성 림프구 백혈병 (Ph+ ALL) 및 이마티니브-내성 백혈병을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본

원에 개시된 방법에 의해 치료될 변형된 형태의 백혈병은 CML이다.

본 발명에 사용된 "글리벡(이마티니브)-내성 백혈병"은 특히, 이마티니브가 치료적으로 더 이상 효과적이지 않거나 또는 감소된 치료적 효과를 갖는 백혈병을 정의한다.

본 발명에 사용된 펩타이드 서열 중 발린(Val,V), 아시소루신(Ile, I) 라이신(Lys, K) 또는 루신(Leu, L)은 동위원소로 치환하는 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 이에 대해서는 대한민국 공개특허 특2001-0108475호에 부위-특이적으로 동위 원소로 강화된 아미노산인 루신, 아이소루신, 라이신 및 발린의 생화학적 전구체 뿐만 아니라, 부위-특이적으로 동위 원소로 강화된 아미노산 자체를 제공하는 내용이 자세하게 공지되어 있다.

본 발명에 사용된 Glu-C는 글루탐산 잔기 C-말단에서 펩타이드 결합을 선택적으로 절단하는 세린 프로테아제이고 Staphylococcus aureus Protease V8라고도 한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 가장 공격적이며 치명적인 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia(CML))의 병인인 Bcr-Abl 혼성 단백질의 정량을 수행하였다.

CML에서, 조혈 줄기 세포 (HSC)에서 상호 균형잡힌 염색체의 전좌는 Bcr-Abl 하이브리드 유전자를 생성한다.

Bcr-Abl 유전자란 인간의 염색체 9번과 22번 사이의 상호 전화에서 파생되는 필라델피아 염색체 양성인 환자에서 발견되는 유전자이다. 만성골수성백혈병 환자의 95%가 필라델피아 염색체 양성 반응을 보이며, 이 필라델피아 염색체는 22번 염색체의 긴 팔(long arm)과 9번 염색체의 긴 팔(long arm)의 상호 전위로 이루어진다.

9 번 염색체의 원시 종양 형성 유전자(proto-oncogene)인 ABL 유전자가 22번 염색체의 BCR과 결합하여 Bcr-Abl 융합 유전자를 형성하고, 여기서 생성되는 단백질에 의해 백혈병이 발생한다. Bcr-Abl 유전자의 이러한 재배열은 적혈구계, 과립구-단핵구계, 혈소판계 미성숙세포에서 모두 발견된다.

만성골수성백혈병 진단은 염색체 9번과 22번 사이의 상호 전좌 (translocation)에서 파생되는 필라델피아 염색체 (필라델피아 chromosome)나 Bcr-Abl 유전자 탐지에 의해 이루어진다. Bcr-Abl 유전자는 Bcr 유전자에 존재하는 브레이크포인트 (break point)에 의한 다양한 크기의 서로 다른 융해 단백질을 생성한다. 만성골수성백혈병의 병인에 관하여 구체적인 역할을 하는 것은 BCR-ABL 암유전자로부터 만들어지는 p210 또는 p190 단백질들이며 이들이 세포의 증식 및 암성 변화에 결정적인 역할을 하게 된다. 또한 급성과 만성골수성백혈병 사이의 예후의 차이가 이러한 암 단백질의 크기 차이에서 기인할 것으로 생각되고 있다. 현재까지 구체적으로 밝혀진 Bcr-Abl mRNA의 종류를 보면, 일반적으로 Bcr 유전자는 3개의 브레이크포인트가 존재한다. 각각은 major(M-bcr: b2a2, b3a2 - P210), minor (m-bcr: e1a2 - P190), micro (μ-bcr: e19a2(or c3a2) - P230)로 나눠진다. 필라델피아 염색체 양성 만성골수성백혈병 환자들은 약 95% 이상에서 M-bcr 부분에 브레이크포인트를 지니고 있다. 2개의 중요한 브레이크포인트는 b2a2 (e13a2)와 b3a2 (e14a2) 등이며, 이들의 융합 mRNA들은 p210Bcr-Abl 단백질을 생성하게 된다. m-bcr 부분의 브레이크포인트 e1a2 결합부위는 더 작은 p190 Bcr-Abl 단백질생성을 유발하며, 이와 같은 경우는 급성 림프성 백혈병 (ALL) 환자의 2/3에서, 그리고 매우 드문 만성골수성백혈병과 급성 골수성 백혈병 환자들에게서 나타난다. 어떤 경우에는, μ-bcr 부분에 존재하는 Bcr exon19와 20 사이의 브레이크포인트가 더 큰 p230 Bcr-Abl 혼성단백질을 생성하기도 한다. 이런 브레이크포인트들에 덧붙여서, 다른 결합부위들과 함께하는 Bcr-Abl 혼성 단백질의 전사체들은 여러 가지 희귀한 경우에서 보고되어 있는 것으로 알려져 있다. 그 결과 Bcr-Abl 융합이 있을 경우는 반드시 만성골수성백혈병에 걸리게 되는 것이다.

Bcr-Abl 하이브리드 유전자는 종양유전자 Bcr-Abl 융합 단백질을 코딩한다. Abl은 단단히 조절되는 단백질 티로신 키나제를 코딩하며, 이는 세포 증식, 부착 및 세포자멸(apoptosis)을 조절하는데 근본적인 역할을 하나,Bcr-Abl융합 유전자는 구성적으로 활성화된 키나제를 코딩하며, 이는 탈조절된 클론 증식, 골수 지질에 부착하는 감소된 능력을 나타내는 표현형을 생성하도록 HSC를 형질전환시키고, 돌연변이유발성 자극에 대한 세포자멸 반응을 감소시키며, 이는 진행상 더 악성의 형질전환을 축적하는 것을 가능하게 한다. 얻어진 과립구는 성숙 림프구로 발달되지 못하고, 순환계로 방출되며, 이는 성숙 세포의 결핍 및 감염에 대한 증가된 감수성을 야기한다. 키나제가 분열유발 및 항-세포자멸 경로 (예를 들어, P-3 키나제 및 STAT5)를 활성화하지 못하도록 막아, Bcr-Abl 표현형 세포의 사멸을 야기하여 이에 의해 CML에 대한 효과적인 치료요법을 제공하는, Bcr-Abl의 ATP-경쟁적 억제제가 기재되어 있다.

2001년 5월에, N-{5-[4-(4-메틸-피페라지노-메틸)-벤조일아미도]-2-메틸페닐}-4-(3-피리딜)-2-피리미딘-아민의 메실레이트 염 (이마티니브(imatinib) 메실레이트, STI571, 이하, '글리벡®'이라 함)이 IFN-알파 치료요법으로부터의 처리에 실패한 환자에서 CML 치료용으로 FDA에 의해 승인되었다.

선택적 티로신 키나제 억제제인 이마티니브 (종래에는 STI571, 글리벡(Gleevec; 등록상표)이라고 함)는 혈소판-유래의 성장 인자 수용체 (PDGF) 알파 및 베타 및 인간 줄기 세포 인자 (SCF) c-키트에 대한 수용체뿐만 아니라 Abl 티로신 키나제 Bcr-Abl, c-Abl, v-Abl 및 Abl-관련된 유전자 (ARG)의 ATP 결합 부위를 점유함으로써 티로신 잔기의 인산화를 차단하는 것으로 알려져 왔다. 초기 만성 단계 (CP), 진행 단계 (AP) 및 골수 모구성 발증 (BC)의 환자에 대한 연구를 비롯하여 만성 골수성 백혈병 (CML)에 대한 수많은 연구를 토대로, 이마티니브는 만성 골수성 백혈병에 대한 새로운 신뢰할만한 치료 표준으로서 고려된다. 추가로, 이마티니브는 c-키트의 구성적 활성화를 나타내는 종양 실재인 위장 간질 종양 (GIST)

을 앓는 개체, 및 골수증식성 질환을 앓으며 염색체 5q33 상의 PDGF-R-베타 유전자가 재배열된 환자에서 지속된 반응을 유도한다.

특히 CP에서의 이러한 유망한 결과에도 불구하고, 이마티니브에 대한 내성은 흔히 AP 및 BC에서 발생하며, 소강 상태(remission)는 일반적으로 단지 6 내지 12 개월 동안만 지속된다. 따라서, 특히 말기 단계의 질환의 경우, 상승작용성 (synergistic) 치료 전략에 대한 보장이 긴급하게 요구된다.

치료적 성공을 보다 강화하기 위해, 상승작용성 치료 접근법에 대한 신규 스크리닝 전략을 확립할 필요가 있다. 비처리 Bcr-Abl 양성 세포주와 대비되는 것으로서 이마티니브-처리된 세포주의 차별적인 단백질 발현분석은, Bcr-Abl 발현에 의해 조절되며 잠재적으로 상승작용성 치료적 개입을 위한 신규 표적으로서의 역할을 하는 단백질을 검출할 목적으로 사용된다.

만성 골수성 백혈병은 혈액암의 일종으로 Bcr-Abl 혼성 단백질의 타이로신 인산화효소(Tyrosine kinase) 활성이 항상 항진되어 있는 특징을 보인다. Bcr-Abl 혼성 단백질의 CML 세포에서 발현 정도와 급성기로의 전이와는 밀접한 관계가 있다고 보고된다. Bcr-Abl 혼성 단백질은 염색체 22에 존재하는 Bcr exon b2, b3, b19 과 염색체 9의 Abl exon a2, a3 사이의 전이(translocation)에 의하여 8개 이상의 다양한 혼성 단백질로 존재한다.

CML은 분자적 표적 치료제 중에 하나인 글리벡(Gleevec)이 도입되면서 사망률이 2% 이하로 크게 줄었지만, 이 약을 장기 투여하게 되면. Bcr-Abl 단백질에 돌연변이가 일어나서 약에 대한 감수성이 현저히 감소하여 병이 악화된다.

한국인 CML 환자들에서 가장 흔히 나타나는 글리벡 내성은 Bcr-Abl 혼성단백질의 T315I와 Y253H 점 돌연변이에 의해 형성되는데(도 2), 이 돌연변이 단백질의 발현양을 정량분석 하였다.

Bcr-Abl 돌연변이 단백질에 해당하는 표준 펩타이드를 합성하여, 표준 펩타이드들의 질량 분석기에서 보이는 특성을 연구하여 얻어진 조건과, Bcr-Abl 단백질이 발현되는 CML 세포주인 K562, BaF3 세포를 이용하여 Bcr-Abl 혼성단백질과 돌연변이 단백질의 정량적 분석을 위한 ex-vivo 분석조건을 확립하였다.

이러한 분석법을 이용하여 CML로 진단받은 환자들의 골수 시료에서 Bcr-Abl 단백질의 발현량을 정량 분석함으로써 CML의 발병과 예후의 상관관계를 분석하여 환자의 예후에 합당한 치료법의 조기 선택을 가능케 하여 환자의 생존율을 향상시키고자 한다.

본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 Bcr/Abl 혼성 단백질의 특이 아미노산 서열을 선정하여, 서열에 포함된 발린(Val,V), 아시소루신(Ile, I) 혹은 루신(Leu, L)을 동위원소로 치환하여 정량용 표준 펩타이드를 합성한다. 합성된 펩타이드는 생체 시료내에 존재하는 타겟 단백질을 트립신과 같은 특성 단백질 분해효소로 처리하였을 때 생성될 수 있는 펩타이드 아미노산 서열을 기준으로 제작되었다. 합성된 표준 펩타이드는 타겟 단백질에서 생성될 수 있는 펩타이드와 분자량을 제외하고는 다른 질량분석기와 HPLC에서 보이는 물리적 성질이 동일하다. 합성된 표준 펩타이드를 이용하여 펩타이드의 HPLC에서의 분석조건, 질량분석기에서의 분석조건(이온화 에너지, ms/ms 조건, CID 조건(collison induced dissociation))을 최적화한다. 확립된 최적 분석조건을 이용하여, 선별 반응 모니터링(Selective Reaction Monitoring, SRM)분석법을 확립한다.

본 발명을 통하여 제시한 발암 관련 단백질(혼성 단백질) 및 그 단백질의 돌연변이형을 질량 분석기를 이용하여 femtomole 범위에서 정량 분석한 방법은 매우 독창적이며, 현재까지 전혀 보고된 바 없는 매우 우수한 결과이며, 앞으로 종양 생물학 연구에 광범위하게 이용될 것으로 기대된다.

또한 임상 환자들에 대한 시간적인 분석(발병 시점부터 치료 중, 내성 발현 시점의 전과 후)의 연구 가능성을 열어줌으로써 임상적인 진단과 예후를 수행할 수 있는 효과가 있다,

도 1은 동위 원소 희석법을 이용한 만성 골수백혈병의 원인 단백질인 Bcr-Abl의 정량적 분석 과정을 설명한 그림이다.
도 2는 CML 병인인 Bcr-Abl 혼성 단백질과 글리벡 내성에 의해 생성되는 Bcr-Abl 돌연변이 단백질을 나타낸 그림이다.
도 3은 AQAU 펩타이드의 질량 분석 조건을 확립한 그립이다(예시 T315I 펩타이다). 왼쪽의 스펙트럼은 precursor ion이고, 오른쪽을 스펙트럼은 fragment ion이다(@, Collision energy).
도 4는 BaF3 세포주의 단백질 각각 100ug(마이크로그램), 50ug, 25ug, 10ug 을 SDS-PAGE을 이용하여 분리한 것이다. 혼성 단백질은 분자량이 210 kDa이고, 정상단백질(Wild type)은 145 kDa 이다.
도 5는 K562 세포주를 이용한 Bcr-Abl 혼성단백질 정량 분석이다. 아래 패널은 K562 세포주 안에 존재하는 Bcr-Abl 혼성단백질이고, 위의 패널은 K562 세포주에 합성한 B3A2를 1pmol/ul 로 넣었을 때 그 합성 펩타이드에 대한 스펙트럼이다.
도 6은 BaF(Y253H type) 세포주를 이용한 Bcr-Abl 혼성 타입의 돌연변이 단백질의 정량 분석이다. 아래 패널은 K562 세포주 안에 존재하는 Bcr-Abl 혼성단백질이고, 위의 패널은 BaF 세포주에 합성한 Y253H 펩타이드를 1pmol/ul 로 넣었을 때 그 합성 펩타이드에 대한 스펙트럼이다.
도 7은 T315I 표준 펩타이드의 정량 곡선을 나타낸다.
도 8은 BaF3 세포주에 존재하는 T315I 돌연변이 단백질과 T315T(Wild type) 단백질의 양을 Mass spectrometry를 통해 분석하였다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명의 범위가 하기 실시 예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

실시예 1: 정량 분석용 표준 펩타이드 합성 및 특성 연구

CML을 일으키는 혼성단백질 Bcr-Abl의 다양한 exon 조합 b3a2,b2a2,e1a2와 CML 치료제인 Gleevec에 대하여 내성이 생긴 Abl의 돌연변이 Y253H, T315I의 돌연변이와 Y253과 Y257의 인산화를 정량하기 위한 정량 분석용 표준 펩타이드를 고안하였다(표 1).

대부분의 정량 분석용 표준 펩타이드 고안 시, 대부분 트립신(trypsin) 효소(enzyme)에 의해 생성되는 펩타이드로 선택되는데, 트립신이 염기성 아미노산(Lysine, Arginine)의 C-말단이 잘라지므로 펩타이드 조각 당 양이온을 만드는 곁가지가 포함되게 되므로 이온화를 도와줄 뿐만 아니라 정량화도 가능하게 해주기 때문이다. 하지만, T315I 돌연변이 분석용 표준 펩타이드의 경우 트립신을 사용할 경우 펩타이드의 길이가 길어지고 너무 소수성(hydrophobic)의 성질을 띠므로, LC에서의 분해능과 Retention time이 불안정하고 이온화 효율도 좋지 못해서 Glu-C 효소를 사용하여 제작하였다.

표 1은 Bcr-Abl 혼성, 돌연변이 단백질 정량 측정을 위한 표준 펩타이드를 디자인하여 합성한 것이다. [ p, phosphorylation(mass shift of +79 Da) on tyrosine ; *, isotope labeled 13C/15N ]

실시예2 : 합성된 표준 펩타이드의 질량 분석 확립

위의 표 1에 보인 표준펩타이드를 이용하여 질량분석 조건을 확립하였다. 합성한 표준 펩타이드를 직접 분사법(syringe)을 이용하여, 표준 펩타이드의 precursor ion의 m/z을 선택하고 선택한 ion에 적절한 에너지로 fragmentation을 하여 그 중 가장 강한 신호를 나타내는 fragment ion의 ms/ms 조건을 확립하였다(도 3). 얻어진 ms/ms 조건을 이용하여 선택적인 precursor ion의 fragmentation을 관찰하는 분석법인 선별반응분석(selective reaction monitoring, SRM)을 결정하였다.

AQUA peptide 분석 조건을 확립한 후 각 peptide 마다 '측정 가능 농도(Limit Of Detection, LOD)'와 정량 가능 농도(Limit Of Quantitation, LOQ)'를 LC-MS를 통해 분석하였다(표 2). 각 peptide는 다른 sequence와 길이를 가지므로 이온화 정도가 다르므로 Mass가 측정할 수 있는 농도가 다르다.

표 2는 AQUA 펩타이드 종류에 따른 최소 검출 가능 농도(Limit Of Dectection,LOD), 최소 정량 가능 농도(Limit Of Qauntication, LOQ)를 Mass spectrometry를 통해 확인하였다.

실시예3 : 시료의 분리( In - gel digestion )와 LC - MS / MS 분석

백혈병 세포주(K562, BaF3) 1X10⁷개나 그에 상응하는 환자 시료 단백질을 SDS-PAGE Gel(4-12% Bis-Tris Gel,invitrogen)에서 분리한 후(도 4), 타켓 단백질(p210, p145) 부위를 잘라낸다. 잘라낸 gel에서 단백질의 농도와 시각화를 위해 염색한 Coomassie blue를 mass 분석을 위해 없애준 후, 100% Acetonitrile(ACN)을 이용하여 gel을 탈수(dehydration)한다. Dehydration한 gel에 Trypsin이나 Glu-C enzyme을 넣어주고 이 때 합성한 AQUA peptide를 1 pmol/ul의 농도로 희석한 후 같이 넣어 준다. 이 sample을 37℃에 overnight 으로 incubation 한다. Gel 안의 단백질을 추출하기 위해서 incubation한 gel에 Harvest solution(50%ACN/5% formic acid)를 넣어준다. 이렇게 얻은 sample(enzyme에 의해 단백질이 잘려서 peptide 형태를 이룸)은 solvent를 완전히 말려서 건조 시킨 후 보관한다. 완전히 건조된 sample을 Mass 분석을 위해 solvent A(Water/ 1% formic acid) 3ul로 녹인 후, nano-flow LC-MS로 분석한다. Sample 분석을 위해 Ultimate 3000 system(Dionex) HPLC와 Thermo의 LTQ linear ion trap mass spectrometry를 이용하였다. C₁₈(5um)을 충진 한 12 cm 길이의 homemade analytic column으로 sample을 분리하였다.

실시예4 : Mass spectrometry 를 통한 Bcr - Abl 혼성 단백질과 내성 단백질의 정량 분석

합성한 표준 펩타이드를 이용하여 발암 유전자인 Bcr-Abl 그리고 Abl의 돌연변이를 정량적으로 분석하였다(참고. AQUA 정량 분석).

실시예4 -1: Bcr - Abl 의 혼성 단백질의 정량 분석( b3a2 type )

결정한 LC-SRM-MS/MS 법을 이용하여 Bcr-Abl 혼성 단백질의 양을 세포주(K562)에서 확인하였다(도 5). 백혈병 세포주인 K562의 경우 Bcr-Abl 혼성 단백질 중 b3a2의 단백질 형태가 존재하며, 1 pmol의 b3a2 표준 펩타이드 면적과의 비율을 통해 총 25ug 단백질 중에 b3a2 혼성 단백질은 3.4 fmol(650 femtogram)이 있다는 것을 알 수 있었다.

이러한 분석법을 이용하여 CML 환자의 골수 시료를 이용하여 Bcr-Abl 혼성 단백질의 정량 분석을 수행하였는데, 이 환자의 경우 b2a2 혼성 단백질이 AQUA 분석법을 통해 총 120ug 단백질 중 18.5 fmol(3.7 picogram)의 혼성단백질이 존재함을 알 수 있었다(표 3).

참고로 본 발명에서 사용된 AQUA ( Absolute Quantification of protein )법 정량 분석에 대하여 간단하게 설명한다.

AQUA ( Absolute Quantification of protein )법은 2003년 하바드 의과대학의 Steve Gygi 교수그룹은 세포내에 존재하는 단백질의 발현 정도와 원하는 단백질의 특정위치에 존재하는 전사 후수식 정도를 정량적으로 측정하는 분석법을 개발하였다.

이 방법은 측정하고자하는 단백질에 특이적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖는 tryptic 펩타이드를 선택하여 동위원소로 치환된 아미노산(C13/N15-Ile, Leu, Val. Pro)을 포함한 AQUA 펩타이드를 합성한다. 합성된 펩타이드는 세포내에 존재하는 분석하고자하는 단백질과 질량만을 제외하고는 모든 특성이 동일하다. 합성한 AQUA 펩타이드의 LC-Mass spectrometer에서의 물리화학적 특성을 조사한 후, 생물학적인 시료에 정해진 양만큼(보통 500 femto mole)투여하여, LC-Mass spectrometer결과 나타나는 AQUA 펩타이드에서 유래된 peak과 시료에서 나타나는 peak의 상대적양을 측정함으로 분석 시료내에 존재하는 단백질의 양을 측정하는 방법이다. 이 방법은 부분 정제된 단백질의 경우 수백 atto-mole정도의 단백질까지도 측정할 수 있으며, 단백질 혼합물인 경우 3ppm (3,000,000 개의 단백질 혼합물에 3개 존재하는 단백질의 양을 측정) 정도의 선택성을 보이는 매우 우수한 단백질 정량 분석법이다. 이 분석법은 가장 우수한 단백질 분석법인 Western Analysis법보다 더욱 우수한 분석법이며, real-time PCR을 이용한 mRNA발현분석법과 거의 유사한 정도의 sensitivity를 갖는 분석법이다. 또한, 이 분석법은 단백질의 활성을 나타내는 전사후 수식을 동정하고, 정량하는 데도 응용된다.

표 3은 환자 시료와 BaF3 세포주 내에 존재하는 Bcr-Abl 혼성 단백질의 양을 분석한 것이다.

실시예 4-2: Gleevec 내성을 보이는 Abl 혹은 Bcr - Abl 돌연변이( Y253H , T315I ) 단백질

실시예 4-2-1: Y253H 돌연변이 단백질

Y253H 돌연변이 Bcr-Abl을 발현하는 세포주인 BaF3_Y253H를 이용하여 정량분석법의 분석 범위를 결정하였다(도 6). Y253H 표준 펩타이드를 세포 sample에 넣은 후, Y253H 돌연변이 단백질을 정량하였는데 총 100ug 단백질 중 9.92fmol(1.8ng)이 존재하였다. CML 환자 중 Bcr-Abl 혼성 단백질 중 Y253H 돌연변이에 의해 Gleevec 내성을 나타낸 시료를 중심으로 분석해 보았다(표 4).측정 결과 이 분석법은 attomole부터 picomole 범위 내에서 정량성을 보임을 확인할 수 있었다.

표 4는 CML 환자 골수를 이용한 Bcr-Abl 돌연변이 단백질의 정량 분석이다.

실시예 4-2-2: T315I 돌연변이 단백질

새로운 방식으로 제작한 T315I의 표준 펩타이드의 분석 감도를 측정한 결과 10 femtomole 보다 낮은 농도에서도 우수한 정량성을 보인다(도 7).

기존의 trypsin에 의해 생성되는 표준 펩타이드에 비해서 Glu-C 효소에 의해 생성된 펩타이드는 hydrobphobic한 성질을 극복할 수 있어서 LC에서의 분리능과 ESI에서의 이온화 효율이 증가하였다. 표준 펩타이드으로 SRM 조건을 확립한 후, 백혈병 세포주인 BaF3-T315I에 존재하는 T315I 돌연변이 단백질을 정량하였다. 새로 확립한 LC_SRM-MS/MS 분석 방식은 실험방법에 제시한 농도 gradient 조건에서 좋은 retention time을 보인다. 세포의 total cell lysate 200ug에서 T315I 돌연변이 495 femtomole과 T315T(wild type) 단백질 7 femtomole을 정량하였다(도 8).

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a) 샘플로부터 타겟 단백질을 분리하는 단계;
b) 상기 단백질에 단백질 분해효소를 처리하는 단계; 및
c) 상기 처리된 펩타이드들을 질량분석하는 단계를 포함하고,
상기 c) 단계에서 LGGGQHGEVYEGVWK(서열번호 1) 및 PPFYIIIE(서열번호 7)로 구성된 펩타이드 조성물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 글리벡에 대해서 내성이 생긴 315번째 잔기가 트레오닌에서 아이소류신으로 치환된 Bcr-Ab 혼성 또는 253번째 잔기가 티로신에서 히스티딘으로 치환된 Abl 돌연변이 단백질 정량 방법
제 4항에 있어서,
상기 타겟 단백질은 p145인 것을 특징으로 하는 글리벡에 대해서 내성이 생긴 315번째 잔기가 트레오닌에서 아이소류신으로 치환된 Bcr-Ab 혼성 또는 253번째 잔기가 티로신에서 히스티딘으로 치환된 Abl 돌연변이 단백질 정량 방법.
제 4항에 있어서,
상기 단백질 분해 효소는 트립신(Trypsin) 혹은 글루시(Glu-C)인 것을 특징으로 하는 글리벡에 대해서 내성이 생긴 315번째 잔기가 트레오닌에서 아이소류신으로 치환된 Bcr-Ab 혼성 또는 253번째 잔기가 티로신에서 히스티딘으로 치환된 Abl 돌연변이 단백질 정량 방법.
제 4항에 있어서,
상기 단백질 분해 효소는 글루시(Glu-C)인 것을 특징으로 하는 글리벡에 대해서 내성이 생긴 315번째 잔기가 트레오닌에서 아이소류신으로 치환된 Bcr-Ab 혼성 또는 253번째 잔기가 티로신에서 히스티딘으로 치환된 Abl 돌연변이 단백질 정량 방법.