DE60020547T2 - Spezifisch markierte proteine, aminosäure und biochemische vorläufer - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft regiospezifische isotopisch markierte organische Verbindungen und Verfahren für deren Herstellung. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung regiospezifische isotopisch markierte biochemische Vorläufer von Leucin, Isoleucin und Valin.
  • Desweiteren stellt die vorliegende Erfindung Herstellungsverfahren für Proteine, Proteinfragmente oder Polypeptide, die daraus gemacht werden, bereit.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Eine in jüngster Zeit entwickelte Technik zur Entdeckung neuer Arzneistoffanhaltspunkte schließt die Verwendung von nuklearer Magnetresonanz- (NMR) Spektroskopie ein, um Verbindungen zu entdecken, welche an ein spezielles Zielmolekül wie zum Beispiel ein Protein binden (siehe, zum Beispiel, United States Patent Nrn. 5,698,401 und 5,804,390, von Fesik, et al.). Die Technik schließt das Bestimmen eines ersten zweidimensionalen 15N/1H NMR-Korrelationsspektrums eines Proteins ein, in welchem Stickstoffatomstellen mit 15N isotopisch angereichert wurden. Dieses erste Korrelationsspektrum wird für das Protein in der Abwesenheit von irgendwelchen potentiellen Ligandenverbindungen erhalten. Als nächstes wird eine vermeintliche Ligandenverbindung oder eine Mischung aus solchen vermeintlichen Ligandenverbindungen mit dem isotopisch angereicherten Protein gemischt, und ein zweites NMR-Korrelationsspektrum wird erhalten. Die zwei Spektren werden verglichen, und Unterschiede zwischen den zwei Spektren geben Information über 1) die Existenz einer Bindung zwischen irgendeinem Liganden und dem Wirtsprotein, 2) die Stelle(n) der Bindung, und 3) die Stärke(n) der Bindung.
  • Die Technik, die in Fesik, et al., oben, beschrieben wurde, verwendet Zielmoleküle, die isotopisch mit dem NMR detektierbaren 15N Spin Nukleus angereichert wurden. Dieses Verfahren beruht auf der genetischen Modifikation eines geeigneten Mikroorganismus, um das gewünschte Protein, Proteinfragment, oder Polypeptid zu exprimieren, gefolgt von Kultivierung des modifizierten Mikroorganismus in einem Nährmedium, welches assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, welche 15N markierte Nährstoffe einschließen. Vergleichsweise billige kommerziell erhältliche 15N Ammoniumsalze lieferten die 15N Quelle.
  • Jedoch wurde die Anwendung dieser NMR-Arzneistoffentdeckungstechnik gegenüber Zielmolekülen, die isotopisch mit 13C-angereichert wurden, durch zwei Nachteile behindert. Zunächst ist es vergleichsweise teuer, 13C-angereicherte Zielmoleküle in irgendwelchen nützlichen Mengen herzustellen. Zum Beispiel offenbart Biochemistry, Band 31, Nr. 123, 1992, Seiten 5252–5263 die Synthese von [5,5'-13C2] Leucin über die Kondensation von Ethylacetamido-Cyanoacetat und markiertem Isobutylbromid und nachfolgende Hydrolyse in der Gesamtausbeute des Produkts von 1,6%. Die Aminosäure wurde biosynthetisch in SNase inkorporiert. Desweiteren ist die Herstellung von Proteinen durch genetisch modifizierte Mikroorganismen, die in Nährmedien gezüchtet wurden, welche kommerziell erhältliche gleichmäßig markierte Glukose enthalten (Glukose 13C6) teuer. Zum Zeitpunkt der Einreichung dieser Anmeldung waren die Kosten für Glukose-13C6 ungefähr $480 pro Gramm. Ein Beispiel für die isotopisch angereicherte Proteinproduktion wird durch Biochemistry, Band 28, Nr. 19, 1989, Seiten 7510–7516 bereitgestellt, welches ein Verfahren offenbart für die biosynthetische Herstellung der Proteine von Interesse, worin die einzige Quelle an Kohlenstoff 13C-markierte und unmarkierte Glukose ist.
  • Alternativ ist die Produktion von 13C-markierten Proteinen durch Einschließen von gleichmäßig 13C-markierten Aminosäuren in das Nährmedium in ähnlicher Weise teuer. Zum zweiten sind die Biomoleküle, die unter Verwendung von Glukose-13C6 oder kommerziell erhältlichen gleichmäßig 13C-angereicherten Aminosäuren produziert wurden, nicht ideal geeignet für die NMR-Korrelationsspektren-Technik. Biomoleküle, die durch Mikroorganismen exprimiert werden, die in Nährmedien gezüchtet wurden, welche gleichmäßig 13C-angereicherte Ausgangsmaterialien enthalten, enthalten angrenzende 13C-markierte Kohlenstoffatome. Da die NMR-Technik von der Detektion von voneinander beabstandeter Spin-Kopplung abhängt (d.h., dem nuklearen Overhauser Effekt), stört die relativ starke Spin-Spin-Kopplung von angrenzenden 13C-Nuklei die gewünschte Beobachtung. Es besteht somit ein Bedürfnis nach der Entwicklung von regiospezifisch 13C-angereicherten Aminosäuren, Proteinen und Polypeptiden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt biochemische Vorläufer von den regiospezifisch isotopisch angereicherten Aminosäuren, Leucin, Isoleucin, und Valin bereit, ebenso wie die regiospezifisch isotopisch angereicherten Aminosäuren per se. Zusätzlich werden auch Proteine, Proteinfragmente und Polypeptide, welche regiospezifisch isotopisch angereicherte Aminoacylreste enthalten, die von diesen Aminosäuren abgeleitet sind, und Verfahren für deren Herstellung bereitgestellt. Die Aminosäuren und die biosynthetischen Aminosäure-Vorläufer sind isotopisch angereichert mit entweder 13C oder 14C an den Kohlenstoffatomen von Methylgruppen, die am meisten entfernt liegen von ihrer Carboxylgruppe. In den markierten Aminosäuren der vorliegenden Erfindung sind nicht angrenzende Kohlenstoffatome markiert. In dem Fall, wo der Marker 13C ist, sind die Aminosäuren dieser Erfindung somit ideal geeignet für die Verwendung in der NMR-Arzneistoffentdeckungstechnik, da es keine Störung mit den gewünschten Signalen durch angrenzende Atom 13C-13C-Spin-Spin-Wechselwirkung gibt. Desweiteren, da die Aminosäuren nur an Methylgruppen markiert sind, liefern die drei magnetisch äquivalenten Wasserstoffatome an den Methylgruppe(n) starke NMR-Signale zur Beobachtung von irgendwelchen Kopplungseffekten mit den 13C-Atome(n), an welche sie angeheftet sind.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel I bereit
    Figure 00040001
    oder ein Salz davon, worin R1 NH2 ist, und R2 ist
  • Figure 00040002
  • In den oben gezeigten Formeln ist R3 Wasserstoff oder nCH3, die Bindungen der gestrichelten Linie stellen Valenzbindungen dar, m ist null und n ist bei jedem Vorkommen 13 oder 14.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die regiospezifisch 13C- und 14C-angereicherten biochemischen Vorläufer von Leucin, Isoleucin und Valin, 2-Keto-4-(nC)-buttersäure (Formel I oben, wo R1 Sauerstoff ist, R2 ist B, m ist null und R3 ist Wasserstoff) und 2-Keto-3-(nC-methyl)-4-(nC)-buttersäure (Formel I oben, wo R1 Sauerstoff ist, R2 ist B, m ist null und R3 ist nCH3) bereit. Im Vorhergehenden stellt n entweder 13 (d.h. 13C-angereicherte Verbindungen) oder 14 (d.h. 14C-angereicherte Verbindungen) dar.
  • Durch die vorliegende Erfindung werden auch chemische Verfahren zur Herstellung der regiospezifisch 13C- und 14C-markierten biochemischen Vorläufersäuren gemäß Formel Ia wie in Anspruch 1 gezeigt, oder Salze davon, bereitgestellt, was die Reaktion einer Verbindung von Formel IV
    Figure 00050001
    mit isotopisch markiertem Methyljodid (H3 nCI) einschließt, um eine Verbindung. von Formel V zu erzeugen
    Figure 00050002
    und wenn R3 Wasserstoff ist, Entfernen der schützenden tert-Butylester- und Dimethylhydrazinogruppen einer Verbindung von Formel V, um 2-Keto-4-(nC)-buttersäure herzustellen; oder weiter, wenn R3 nCH3 ist, Reagieren einer Verbindung von Formel V mit isotopisch markiertem Methyljodid (H3 nCI), wo n 13 oder 14 ist, um eine Verbindung von Formel VI herzustellen.
  • Figure 00060001
  • Entfernen der schützenden tert-Butylester- und Dimethylhydrazinogruppen, um 2-Keto-3-(nC-methyl)-4-(nC)-buttersäure zu erzeugen; und wahlweise Salzbildung der Produkte.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Verfahren bereit zur Herstellung der regiospezifisch 13C- und 14C-markierten Aminosäuren Leucin, Isoleucin und Valin. Das Verfahren involviert die genetische Modifizierung eines Mikroorganismus, um ein Polypeptid zu exprimieren, das eine Aminosäure enthält, gewählt aus Leucin, Isoleucin, Valin und Mischungen davon; Kultivieren des modifizierten Mikroorganismus in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen an Kohlenstoff und Stickstoff enthält, was 2-Keto-4-(nC)-buttersäure, 2-Keto-3-(nC-methyl)-4-(nC)-buttersäure und Salze und Mischungen davon einschließt; Isolieren des resultierenden exprimierten Polypeptids; und Fragmentieren des Polypeptids und Isolieren der einzelnen Aminosäuren. Das exprimierte Polypeptid wird durch konventionelle Verfahren fragmentiert, die im Fachgebiet bekannt sind, einschließlich Hydrolyse oder entzymatischer Spaltung.
  • Die Ausbeute einer speziellen Aminosäure kann maximiert werden und die Kosten können minimiert werden durch Modifizieren des Wirtsmikroorganismus, um ein Homopolymer der Aminosäure zu exprimieren, und Verwenden des geeigneten isotopisch angereicherten biosynthetischen Vorläufers in dem Nährmedium.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren bereit zur Herstellung eines Proteins, Proteinfragments oder Polypeptids, das Aminoacylreste enthält, abgeleitet von Aminosäuren gewählt aus der Gruppe bestehend aus L-2-Amino-3- methyl-5-(13C)-pentansäure; L-2-Amino-3-methyl-5-(14C)-pentansäure; L-2-Amino-4-(13C-methyl-5-(13C)-pentansäure; L-2-Amino-4-(14C-methyl-5-(14C)-pentansäure; L-2-Amino-3-(13C-methyl)-5-(13C)-butansäure; und L-2-Amino-3-(14C-methyl)-5-(14C)-butansäure, wobei das Verfahren die genetische Modifizierung eines Mikroorganismus involviert, um ein vorbestimmtes Protein, Proteinfragment oder Polypeptid zu exprimieren; Kultivieren des modifizierten Mikroorganismus in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen an Kohlenstoff und Stickstoff enthält, was 2-Keto-4-(nC)-buttersäure, 2-Keto-3-(nC-methyl)-4-(nC)-buttersäure und Salze und Mischungen davon einschließt; und Isolieren des resultierenden exprimierten Polypeptids.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die natürliche isotopische Häufigkeit von 13C ist 1,11%, und die von 14C ist vernachlässigbar gering. Somit ist die Wahrscheinlichkeit, daß irgendein gegebenes Kohlenstoffatom innerhalb eines organischen Moleküls 13C ist, normalerweise ungefähr 0,011, und die Wahrscheinlichkeit, daß irgendein gegebenes Kohlenstoffatom 14C ist, ziemlich gering. Wenn Zielproteine hergestellt werden für die Verwendung in dem angepaßten NMR-"Screening"- oder Arzneistoffentdeckungsverfahren, wie beschrieben durch Fesik, et al., oben, ist es wünschenswert, daß das 13C-NMR-Signal durch Erhöhen des natürlichen 13C-Gehalts des Zielmoleküls, welches untersucht wird, verstärkt wird. Dies wird erzielt durch entweder gleichmäßiges oder selektives Anreichern des Zielmoleküls mit 13C. Wie in dieser Beschreibung und den angehängten Ansprüchen verwendet, bedeuten die Ausdrücke "gleichmäßige Anreicherung", "gleichmäßiges Anreichern", "gleichmäßig angereichert", "gleichmäßiges Markieren" und "gleichmäßig markiert" das Erhöhen der Wahrscheinlichkeit durch synthetische Mittel auf einen Wert größer als 0,0111, daß ein Kohlenstoffatom, das zufällig in dem Zielmolekül ausgewählt wurde, 13C sein wird. Die Ausdrücke "spezifische Anreicherung", "regiospezifische Anreicherung", "spezifisch anreichern", "spezifisch angereichert", "spezifisch markieren" und "spezifisch markiert" bedeuten das Erhöhen der Wahrscheinlichkeit durch synthetische Mittel auf einen Wert größer als 0,0111, daß Kohlenstoffatome an einer oder mehreren spezifischen vorgewählten Stelle(n) innerhalb des Zielmoleküls 13C sein werden.
  • Zum Beispiel werden Biomoleküle, die durch genetisch modifizierte Mikroorganismen exprimiert werden, die in einem Nährmedium gezüchtet wurden, das gleichmäßig 13C angereicherte Glukose enthält, gleichmäßig 13C angereichert sein. Ein Protein, das durch einen genetisch modifizierten Mikroorganismus exprimiert wurde, der in einem Nährmedium gezüchtet wurde, das eine Aminosäure enthält, welche nur auf der Methylseitenkette 13C angereichert ist, würde spezifisch durch 13C an den Alanylresten angereichert sein, die in den exprimierten Protein enthalten sind. In ähnlicher Weise werden Proteine, die durch das Verfahren dieser Erfindung exprimiert wurden, regiospezifisch durch 13C oder 14C an den Seitenkettenendmethylgruppen von Leucin, Isoleucin und Valin angereichert sein.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt auch die Herstellung von regiospezifisch markiertem Leucin, Isoleucin und Valin, Proteinen, Proteinfragmenten, oder Polypeptiden, die aus diesen markierten Aminosäuren hergestellt wurden, und die Aminosäurebiosynthesevorläufer markiert mit 14C ebenso wie mit 13C. Solche Verbindungen sind zum Beispiel in Untersuchungen des Proteinmetabolismus nützlich, wo es wünschenswert ist, den Weg und das Schicksal des Proteinabbaus durch radiometrische Verfahren zu verfolgen.
  • Weiter Ausdrücke, die durch diese Beschreibung hindurch und in den angehängten Ansprüchen verwendet wurden, haben ihre üblicherweise anerkannten Bedeutungen. Die folgenden spezifischen Ausdrücke haben die folgenden zugeschriebenen Bedeutungen:
    "DTT" bedeutet Dithiothreitol.
    "HEPES" bezeichnet N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethylsulfonsäure.
    "IPTG" bedeutet Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid.
    "PMSF" bezieht sich auf α-Toluensulfonylfluorid.
    "SCD" bezieht sich auf die katalytische Domain (Reste 81–256) von Stromelysin.
  • Die Herstellung eines beispielhaften regiospezifischen nC-angereicherten Proteinfragment-Zielmoleküls wird unten bekannt gemacht. Das spezielle gezeigte Beispiel demonstriert die Herstellung der so genannten "katalytischen Domain" von menschlichem Stromelysin ("SCD"), markiert mit regiospezifisch 13C-angereichertem Leucin, Valin und Isoleucin. Obwohl das Verfahren mit 13C-markierten Aminosäurevorläufern gezeigt ist, ist es gleichsam anwendbar beginnend mit 14C-markierten Aminosäurevorläufern. Ein bevorzugtes Mittel zur Herstellung von adäquaten Mengen von spezifisch nC-angereicherten Polypeptidenthaltenden Zielmolekülen schließt die Transformation einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor ein, der ein Polynukleotid enthält, das das gewünschte Polypeptid kodiert. Das Protein oder Polypeptidproteinfragment wird exprimiert durch Kultivieren der transformierten Zell-Linie in einem Medium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff enthält, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, und einschließlich der nC-angereicherten biochemischen Vorläufer dieser Erfindung. Für die regiospezifische Markierung des Proteins oder des Proteinfragments in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, schließen assimilierbare Quellen für die nC-Markierung eines Zielpolypeptids nC-markierte biosynthetische Vorläufer von Aminosäuren ein.
  • Zum Beispiel ist es bekannt, daß α-Keto-butyrat der biosynthetische Vorläufer von Isoleucin ist, und daß α-Keto-isovalerat der biosynthetische Vorläufer von sowohl Valin als auch Leucin ist. Schema I unten zeigt wie die spezifisch nC-angereicherten biosynthetischen Vorläufer von Leucin, Isoleucin und Valin synthetisiert werden können. Das Schema verwendet das vergleichsweise billige nC-angereicherte Methyljodid, H3 nCI, als die Quelle für die isotopische Anreicherung, um nC-terminal markierte α-Keto-Buttersäure und α-Keto-Isovaleriansäure zu erzeugen.
  • Die Verwendung eines gleichmäßig 13C-angereicherten Nährstoffs wie zum Beispiel Glukose-13C6 wurde typischerweise als ein übliches Mittel verwendet, um 13C Anreicherung in eine Zielverbindung einzuführen; allerdings ist es sehr teuer. Desweiteren wird eine große Mehrheit der Kohlenstoffstellen in gleichmäßig 13C-markierten Zielen einen kovalent gebundenen Nachbar haben, der auch 13C-markiert ist, wodurch eine 13C-13C-Kopplung eingeführt wird, welche sowohl die Eigenschaften von Signal-gegenüber-Geräusch (signal-to-noise) als auch die Eigenschaften der Relaxation von 13C-markierten Stellen in dem Zielbiomolekül negativ beeinflussen kann. Alternativ kann das Nährstoffmedium kommerziell erhältliche gleichmäßig 13C-markierte Aminosäuren einschließen. Während diese Technik die "Verdünnung" der Markierung reduziert, ist es auch eine kostspielige Alternative und leidet in gleicher Weise an dem Nachteil von angrenzenden Kohlenstoffatom 13C-13C-Spin-Spin-Wechselwirkungen.
  • Jedoch umfaßt das Verfahren der vorliegenden Erfindung für die nC-Markierung eines Polypeptid-Zielmoleküls das Züchten der genetisch modifizierten Zell-Linie in einem Nährstoffmedium, das nC-markierte biosynthetische Vorläufer von speziellen Aminosäuren enthält. Es sind nicht nur bestimmte der Aminosäuren in dem resultierenden Protein, Proteinfragment oder Polypeptid isotopisch angereichert, diese Aminosäuren sind auch regiospezifisch markiert.
  • Genauer sind die Aminosäurevorläufer der Erfindung markierte α-Keto-Buttersäure und α-Keto-Isovaleriansäure. Die biosynthetischen Produkte dieser Vorläufer sind Leucin, Isoleucin, und Valin, in welchen spezielle Seitenketten-Methylgruppen nC-angereichert sind. Weil die Methylgruppen jeweils drei Wasserstoffatome angeknüpft an ein nC-markiertes Kohlenstoffatom haben, wenn n 13 ist, sind die entsprechenden NMR-Signale besonders stark und unterscheidungskräftig.
  • Die Synthese für markierte α-Keto-Buttersäure und α-Keto-Isovaleriansäure schließt die C-Methylierung des terminalen Kohlenstoffatoms in Brenztraubensäure mit nC-angereichertem Methyljodid ein. Normalerweise ist die Alkylierung von α-Ketosäuren, wie zum Beispiel Pyruvat schon an sich schwierig und wird begleitet von der Zersetzung des Enolatintermediats mit der Bildung von zahlreichen Nebenprodukten. Jedoch haben Spencer, et al., Tetrahedron Leiters, 1975, 3889 und Williams, et al., ibid., 1990, 5881 gezeigt, daß die Alkylierung des entsprechenden Oximenolats ausgeführt wurde, obwohl die Alkylierung mit primären Elektrophilen (zum Beispiel Methyljodid) problematisch war. D. Enders, et al., Angew. Chem. Int. Eng. Ed., 1992, 618 und D. Enders, et al., Synlett, 1992, 901 haben gezeigt, daß die Alkylierung eines N,N-Dimethylhydrazons von Pyruvat möglich ist, haben aber insbesondere erwähnt, daß der sperrige 2,6-Dialkylphenylester notwendig war, um die Selbstacylierung zu verhindern. Repräsentative Verbindungen der vorliegenden Erfindung schließen die folgenden ein:
    2-Keto-4-(13C)-buttersäure oder ein Salz davon;
    2-Keto-4-(14C)-buttersäure oder ein Salz davon;
    2-Keto-3-(13C-methyl)-4-(13C)-buttersäure oder ein Salz davon;
    2-Keto-3-(14C-methyl)-4-(14C)-buttersäure oder ein Salz davon;
  • Obwohl die spezifischen Verbindungen, die oben genannt sind, als solche bezeichnet worden sind, die 13C- oder 14C-Isotope an spezifischen Stellen in der Verbindung haben, wird es von denjenigen mit durchschnittlichem Fachwissen verstanden werden, daß die Kohlenstoffatome an diesen Stellen in den Verbindungen nicht vollständig 13C- oder 14C-markiert sind. Der Grad an isotopischer Substitution oder "Anreicherung" an jeder molekularen Stelle hängt von dem entsprechenden Grad der Anreicherung ab, der in den Ausgangsmaterialien, die in der Synthese verwendet wurden, enthalten ist.
  • Schema I Chemische Synthese von markierten Vorläufern
    Figure 00120001
  • In Schema I wird tert-Butylpyruvat, 1, umgewandelt in das entsprechende N,N-Dimethylhydrazon, 2, durch Reaktion mit N,N-Dimethylhydrazin in Diethylether bei Raumtemperatur. Das resultierende Hydrazon, 2, wird in einer Tetrahydrofuranlösung auf –78°C gekühlt, und mit Lithiumbromid behandelt, gefolgt von Lithiumdiisopropylamid, um das intermediäre Aza-Allylenolat zu bilden. Das Enolat wird mit nC-markiertem Methyljodid alkyliert, um Hydrazon 3 herzustellen. Ein zweiter Alkylierungsdurchgang von 3 erzeugt das markierte dimethylierte Hydrazon, 4. Die Behandlung von 3 und 4 zuerst mit wässeriger 1N HCl in Tetrahydrofuran oder Diethylether (um Hydrazon zu entfernen), gefolgt von der Behandlung mit Chlorwasserstoffgas in Methylenchlorid (um den t-Butylester zu entfernen) ergibt die entsprechenden nC-terminal markierten α-Ketosäuren, 5 und 6.
  • Schemata II, III bzw. IV veranschaulichen wie diese α-Ketosäuren, biosynthetisch in nC-Leucin, Isoleucin und Valin umgewandelt werden. In allen dieser Schemata sind die Stellen der isotopischen Anreicherung durch * (Sternchen) gekennzeichnet.
  • Schema II Biochemische Synthese von markiertem Isoleucin
    Figure 00140001
  • Schema III Biochemische Synthese von markiertem Leucin
    Figure 00150001
  • Schema IV Biochemische Synthese von Valin
    Figure 00160001
  • Ein Mittel zur Herstellung von Expressionsvektoren, die Polynukleotidsequenzen enthalten, die spezifische Polypeptide kodieren, und Mittel zum Umwandeln von Wirtszellen mit diesen Vektoren, sind im Fachgebiet wohl bekannt. (Siehe, zum Beispiel R. W. Old, et al., Techniques of Gene Manipulation, Blackwell Science, London, 1994, und ähnliche Abhandlungen in dem Fachgebiet). In ähnlicher Weise sind Verfahren zur Kultivierung der transformierten Zellen, um das kodierte Polypeptid zu exprimieren, und zur Isolierung, Reinigung und Wieder-Faltung des Polypeptids im Fachgebiet ebenfalls wohl bekannt. Die Beispiele, die unten gezeigt sind, beschreiben die Herstellung von 13C-angereicherten Proben der 81–256 Aminosäure katalytischen Region von menschlichem Stromelysin (SCD) aus modifiziertem E. coli.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Herstellung von gleichmäßig 13C-angereicherter katalytischer Domain von menschlichem Stromelysin (SCD)
  • Das 81–256 Fragment (Sequenzidentifikationsnr.: 1) von Stromelysin (SCD) wird hergestellt durch Einführen eines Plasmids, welches für die Produktion des Proteinfragments in einen E. coli Stamm kodiert, und Züchten des genetisch modifizierten bakteriellen Stamms in einem geeigneten Kulturmedium. Das Proteinfragment wird aus dem Kulturmedium isoliert, gereinigt, und danach in der zweidimensionalen NMR-Analyse seiner Affinität mit Testverbindungen in Übereinstimmung mit dem Verfahren dieser Erfindung verwendet. Die Verfahren für die Herstellungsprozesse sind unten beschrieben.
  • Menschliche Hautfibroblasten (ATCC Nr. CRL 1507) werden gezüchtet und induziert unter Verwendung des Verfahrens, das von Clark, et al., Archiv. Biochem. and Biophys., 241: 36 (1985) beschrieben ist. Die Gesamt-RNA wird aus 1 g Zellen isoliert unter Verwendung eines RNAgents® Total RNA Isolationssystem-Kits (Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53711, USA) gemäß den Angaben des Herstellers. Ein 1 μg Teil der RNA wird durch Erhitzen auf 80°C für fünf Minuten denaturiert und dann einer reversen Transkriptase PCR unterworfen, unter Verwendung eines GenAmp® RNA PCR Kits (Applied Biosystem/Perkin-Elmer) gemäß den Angaben des Herstellers.
  • Verschachtelte (nested) PCR wird durchgeführt unter Verwendung von ersten Primern (a) GAAATGAAGAGTCTTCAA (Sequenzidentifikationsnr.: 2) und (b) GCGTCCCAGGTTCTGGAG (Sequenzidentifikationsnr.: 3) und fünfunddreißig Zyklen von 94°C, zwei Minuten; 45°C, zwei Minuten; und 72°C, drei Minuten. Darauf folgt eine Re-Amplifikation mit internen Primern (c) TACCATGGCCTATCCATTGGATGGAGC (Sequenzidentifikationsnr.: 4) und (d) ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG (Sequenzidentifikationsnr.: 5) unter Verwendung von dreißig Zyklen unter denselben Bedingungen, die unmittelbar oben beschrieben sind, um eine DNA- Sequenz zu erzeugen, die für Aminosäurereste 1–256 von menschlichem Stromelysin kodiert.
  • Das PCR-Fragment wird dann in den PCR Klonierungsvektor pT7BIue® (Novagen, Inc.) gemäß den Angaben des Herstellers kloniert. Das resultierende Plasmid wird mit NcoI und BamHI geschnitten und das Stromelysinfragment wird in den Expressionsvektor pET3d (Novagen, Inc.), wiederum gemäß den Angaben des Herstellers subkloniert.
  • Ein reifes Stromelysinexpressionskonstrukt, das für Aminosäurereste 81–256 plus einem startenden Methioninaminoacylrest kodiert, wird aus dem 1–256 Expressionskonstrukt durch PCR-Amplifikation erzeugt. Das resultierende PCR-Fragment wird zuerst in den pT7BIue® Vektor (Novagen, Inc.) kloniert, und dann in den pET3d Vektor (Novagen, Inc.) subkloniert, gemäß den Angaben des Herstellers in der Art und Weise, die oben beschrieben ist, um das Plasmid pETST-83-256 herzustellen. Dieses finale Plasmid ist identisch mit dem, das von Qi-Zhuang, et al., Biochemistry, 31: 11231 (1992) beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß das vorliegende Plasmid für eine Peptidsequenz kodiert, die zwei Aminosäuren früher beginnt, genauer an Position 81, in der Sequenz von menschlichem Stromelysin. Plasmid pETST-83-256 wird in den E. coli StammBL21 (DE3)/pLysS (Novagen, Inc.) transformiert, in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers, um einen Expressionsstamm, BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1 zu erzeugen.
  • Ein Vor-Kulturmedium wird hergestellt durch Auflösen von 1,698 g NaH1PO4·7H2O, 0,45 g KH2PO4, 0,075 g NaCl, 0,150 g NH4Cl, 0,3 g U-13C-Glukose, 300 μl 1M wässerige MgSO4 Lösung, und 15 ml wässerige CaCl2 Lösung in 150 ml deionisiertem Wasser. Die resultierende Lösung des Vor-Kulturmediums wird sterilisiert und in einen sterilen 500 ml Prallkolben überführt. Unmittelbar vor der Inokulation des Vor-Kulturmediums mit dem bakteriellen Stamm werden 150 ml einer Lösung, die 34 mg/ml Chloramphenicol in 100 Ethanol enthält, und 1,5 ml einer Lösung, die 20 mg/ml Ampicillin enthält, zu den Kolbeninhalten hinzugefügt. Die Kolbeninhalte werden dann mit 1 ml Glycerol-Stock von genetisch modifiziertem E. coli Stamm BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1 inokuliert. Die Kolbeninhalte werden geschüttelt (225 rpm) bei 37°C bis eine optische Dichte von 0,65 beobachtet wird.
  • Ein Fermentationsnährmedium wird hergestellt durch Auflösen von 113,28 g Na2HPO4·7H2O, 30 g KH2PO4, 5 g NaCl und 10 ml 1% DF-60 Antischaummittel in 9604 ml deionisiertem Wasser. Diese Lösung wird in einen New Brunswick Scientific Micros Fermenter platziert (Edison, NJ) und bei 121°C für 40 Minuten sterilisiert. Unmittelbar vor der Inokulation des Fermentationsmediums werden die folgenden vorsterilisierten Komponenten zu den Inhalten des Fermentationsgefäßes hinzugefügt: 100 ml einer 10% wässerigen Lösung von NH4Cl, 15 g gleichmäßig 13C-angereicherte Glukose, 20 ml einer wässerigen 1M Lösung von MgSO4, 1 ml einer wässerigem 1M CaCl2 Lösung, 5 ml einer wässerigen Lösung von Thiaminhydrochlorid (10 mg/ml), 10 ml einer Lösung, die 34 mg/ml Chloramphenicol enthält in 100 Ethanol, und 1,9 g Ampicillin, aufgelöst in der Chloramphenicollösung. Der pH der resultierenden Lösung wird auf pH 7,00 eingestellt durch die Zugabe einer wässerigen Lösung von 4N H2SO4.
  • Die Vor-Kultur des E. coli Stamms BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1 aus dem Schüttelkolbenverfahren, das oben beschrieben wurde, wird zu den Fermenterinhalten hinzugefügt, und man läßt das Zellwachstum fortschreiten, bis eine optische Dichte von 0,48 erreicht ist. Während dieses Verfahrens werden die Fermenterinhalte automatisch bei pH 7,0 gehalten durch die Zugabe von 4N H2SO4 oder 4N KOH, wie benötigt. Der Sauerstoffgehalt in Lösung der Fermenterinhalte wird oberhalb 55% Luftsättigung gehalten durch eine Kaskadenschleife, welche die Bewegungsgeschwindigkeit erhöhte, wenn der Sauerstoffgehalt in Lösung unter 55% abfiel. Luft wird den Fermenterinhalten bei 7 Standardlitern pro Minute (SLPM) zugeführt und die Kulturtemperatur wird bei 37°C während des Verfahrens gehalten.
  • Die Zellen werden geerntet durch Zentrifugation bei 17,000 × g für 10 Minuten bei 4°C und die resultierenden Zellpellets werden gesammelt und bei –85°C gelagert. Die feuchte Zellausbeute ist 3,5 g/l. Analyse der löslichen und unlöslichen Fraktionen von Zelllysaten durch Natriumdidecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) deckt auf, daß ungefähr 50% des Stromelysins in der löslichen Phase gefunden wurde.
  • Das Stromelysinfragment, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, wird gereinigt unter Verwendung einer Modifikation der Technik, welche durch Ye, et al., Biochemistry, 31: 11231 (1992) beschrieben wurde. Die geernteten Zellen werden suspendiert in 20 mM Tris-HCl Puffer (pH 8,0), Natriumazidlösung enthaltend 1mM MgCl2, 0,5 mM ZnCl2, 25 Einheiten/ml Benzonase® Enzym (Benzon Pharma A/S Roskilde, Denmark), und eine Inhibitormischung, hergestellt aus 4-(2-Aminoethyl) benzensulfonylfluorid ("AEBSF") Leupeptin®, Aprotinin® und Pepstatin® (alle bei Konzentrationen von 1 mg/ml). AEBSF, Leupeptin®, Aprotinin® und Pepstatin® sind erhältlich von American International Chemical). Die resultierende Mischung wird vorsichtig gerührt für eine Stunde und dann auf 4°C abgekühlt. Die Zellen werden dann durch Schall zerstört unter Verwendung eines 50% Leistungszyklus. Das resultierende Lysat wird bei 14,000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert und das Pellet der unlöslichen Fraktion wird bei –80°C für die weitere Verarbeitung eingefroren.
  • Festes Ammoniumsulfat wird zu dem Überstand hinzugefügt bis zu dem Punkt von 20% Sättigung und die resultierende Lösung wird auf eine 700 ml Phenyl Sepharose fast flow ("Q-Sepharose FF) Säule geladen (Pharmacia Biotech.). Vor dem Aufladen wird die Sepharose-Säule ins Gleichgewicht gebracht mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6 bei 4°C), 5 mM CaCl2, und 1M (NH4)2SO4. Die beladene Säule wird mit einem linearen Gradienten von absteigenden Konzentrationen von wässeriger (NH4)2SO4 (von 1M hinab zu 0M) und ansteigenden Konzentrationen von wässerigem CaCl2 (von 5 mM bis 20 mM) in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,6 eluiert. Die aktiven Fraktionen von Eluat werden gesammelt und in einem Amicon stirred cell (Amicon Inc.) konzentriert. Die konzentrierte Probe wird über Nacht dialysiert in dem Ausgangspuffer, der mit der Q-Sepharose FF-Säule verwendet wurde, 50 mM Tris-HCl (pH 8,2 bei 4°C) mit 10 mM CaCl2.
  • Die dialysierte Probe wird dann auf die Q-Sepharose FF- Säule geladen und mit einem linearen Gradienten eluiert, der den Ausgangspuffer und 200 nM NaCl umfaßte. Die gereinigte lösliche Fraktion des Stromelysinfragments wird konzentriert und bei 4°C gelagert. Das Pellet wird in 8M Guanidin-HCl aufgelöst. Die Lösung wird für 20 Minuten bei 20,000 rpm zentrifugiert und der Überstand wird tropfenweise zu einem faltenden Puffer hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM CaCl2, 0,5 mM ZnCl2 und den Inhibitorcocktail aus AEBSF, Leupeptin(R) Aprotinin (R) und Pepstatin(R) umfaßte (alle bei Konzentrationen von 1 g/ml). Das Volumen des faltenden Puffers ist zehn mal das des Überstands. Die Mischung des Überstands und des faltenden Puffers wird bei 20,000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand aus dieser Zentrifugation wird bei 4°C gelagert und das Pellet wird zwei mal den oben beschriebenen Schritten der Auflösung in Guanidin-HCl, Wiederfalten in Puffer, und Zentrifugation, unterworfen. Die endgültigen Überstände von jeder der drei Zentrifugationen werden kombiniert und festes Ammoniumsulfat wird bis zu dem Punkt einer 20% Sättigung hinzugefügt. Die restliche Lösung, die somit von der unlöslichen Fraktion abgeleitet ist, wird einer Reinigung auf Phenylsepharose und Q-Sepharose wie oben für die lösliche Fraktion beschrieben unterworfen. Die gereinigten löslichen und unlöslichen Fraktionen werden kombiniert, um ungefähr 1,8 mg gereinigtes Stromelysin 81–256 Fragment (SCD) pro Gramm ursprünglicher Zellpaste, gleichmäßig mit 13C angereichert, herzustellen.
  • Beispiel 2
  • Herstellung von spezifisch 13C-angereicherter katalytischer Domain von menschlichem Stromelysin (SCD)
  • SCD wird exprimiert durch Kultivieren des BL21(DE3) (pLysS/pETST-255-1 modifizierten E. coli Stamms in einem Medium, das 2-Keto-4-(13C)-buttersäure, oder ein Salz davon, und 2-Keto-3-(13C-methyl)-4-(13C)-buttersäure, oder ein Salz davon umfaßte. Die Verfahren, die für die Herstellung des genetisch verarbeiteten Stamms von E. coli, und für die Expression, Isolierung und Reinigung des Proteinfragments verwendet wurden, sind wie oben beschrieben, außer der Verwendung von U-12C-Glukose anstatt von U-13C-Glukose.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00230001
  • Figure 00240001
  • Figure 00250001

Claims (10)

  1. Eine Verbindung von Formel Ia
    Figure 00260001
    oder ein Salz davon, worin R3 Wasserstoff oder nCH3 ist und n, jedesmal wenn es vorkommt ist 13 oder 14.
  2. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus: 2-Keto-4-(13C)-buttersäure; 2-Keto-3-(13C-Methyl)-4-(13C)-buttersäure; 2-Keto-4-(14C)-buttersäure; und 2-Keto-3-(14C-Methyl)-4-(14C)-buttersäure; oder Salze davon.
  3. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung von Formel Ia
    Figure 00260002
    oder ein Salz davon, worin R3 gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und nCH3, und n, jedesmal wenn es vorkommt ist 13 oder 14, welches folgendes umfaßt a) Reagieren einer Verbindung von Formel IV
    Figure 00270001
    mit isotopisch markiertem Methyljodid (H3 nCI), um eine Verbindung von Formel V herzustellen
    Figure 00270002
    und, wenn R3 Wasserstoff ist, b) Entfernen des tert-Butylesters und Dimethylhydrazinogruppen, um 2-Keto-4 (nC)-buttersäure herzustellen oder, wenn R3 nCH3 ist, c) Reagieren des Produkts von Schritt a) mit isotopisch markiertem Methyljodid (H3 nCI), worin n 13 oder 14 ist, um eine Verbindung der Formel VI herzustellen
    Figure 00270003
    und d) Entfernen des tert-Butylesters und Dimethylhydrazinogruppen, um 2-Keto-3-(nC-methyl 4-(nC)- buttersäure zu bilden.
  4. Ein Verfahren gemäß Anspruch 3, welches weiter die Überführung des Reaktionsprodukts aus Schritt b) oder Schritt d) in ein Salz umfaßt.
  5. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, Proteinfragments oder Polypeptids, das mindestens einen Aminoacylrest enthält, gewählt aus der Gruppe bestehend aus 4-(nC-Methyl)-5-(nC) leucyl, 5-(nC)-Isoleucyl und 3-(nC-Methyl)-4-(nC)-valyl, welches folgendes umfaßt: a) genetisches Modifizieren eines geeigneten Mikroorganismus, um das Protein, Proteinfragment oder Polypeptid zu exprimieren; b) Züchten des genetisch modifizierten Mikroorganismus in einem Nährmedium, das eine Verbindung der Formel Ia
    Figure 00280001
    oder ein Salz davon enthält, worin n, jedesmal, wenn es vorkommt, 13 oder 14 ist und R3 Wasserstoff oder nCH3 ist; und c) Isolieren des Proteins, Proteinfragments oder Polypeptids.
  6. Das Verfahren von Anspruch 5, worin das Protein, Proteinfragment oder Polypeptid, das mindestens einen Aminoacylrest enthält, gewählt ist aus 5-nC-Isoleucyl, und R3 Wasserstoff ist.
  7. Ein Verfahren zur Herstellung einer Aminosäure, gewählt aus der Gruppe bestehend aus 2-Amino-3-(nC-methyl)-4-(nC)-buttersäure, 2-Amino-4-(nC-methyl)-5-(nC)-pentansäure und 2- Amino-3-methyl-5-(nC)-pentansäure, welches folgendes umfaßt a) genetisches Modifizieren eines geeigneten Mikroorganismus, um ein Homopolymer der Aminosäure zu exprimieren; b) Kultivieren des genetisch modifizierten Mikroorganismus in einem Nährmedium, das eine Verbindung der Formel Ia'
    Figure 00290001
    oder ein Salz davon enthält, wenn die Aminosäure 2-Amino-3-(nC-methyl)-4-(nC)-buttersäure und 2-Amino-4-(nC-methyl)-5-(nC)-pentansäure ist, worin n, jedesmal, wenn es vorkommt, 13 oder 14 oder Formel Ia''
    Figure 00290002
    oder ein Salz davon ist, wenn die Aminosäure 2-Amino-3-methyl-5-(nC)-pentansäure ist; c) Isolieren des Homopolymers der Aminosäure, exprimiert durch den genetisch modifizierten Mikroorganismus; und d) Fragmentieren des Homopolymers, um die Aminosäure herzustellen.
  8. Das Verfahren von Anspruch 7, worin die Aminosäure 2-Amino-3-(nC-methyl)-4-(nC)-buttersäure ist.
  9. Das Verfahren von Anspruch 7, worin die Aminosäure 2-Amino-4-(nC-methyl)-5-(nC)-pentansäure ist.
  10. Das Verfahren von Anspruch 7, worin die Aminosäure 2-Amino-3-methyl-5-(nC)-pentansäure ist.
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