JPS61257190A - ２，３−ジデオキシ−４−ケトアルドン酸類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、細菌感染症の治療剤として有用な抗生物質中
に含まれる種々のデオキシ糖類（例、ペロサミン、ガロ
サミン、ロジノース、フオロサミンなど）の誘導体を製
造するための原料化合物として有用な２．３−ジデオキ
シ−４−ケトアルドン酸（以下、ＤＫＡと略称すること
もある。）類の製造法に関する。

従来の技術 ＤＫＡ類は化学的方法により２．３−ジデオキシ−アル
ド−２−エノン酸類から合成する方法が知られている（
ヘミッシェ・ベリッヒテ（Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ　Ｂｅｒ
ｉｃｈｔｅ　）第１１０巻、第１１７５−１１８２頁（
１９７７）参照。）。しかし酵素によるＤＫＡ類の製造
法は知られていない。

発明が解決しようとしている問題点 従来の化学合成法は数多くの工程が必要とされるため収
率も低く、工業的に安価にＤＫＡ類を製造する方法とし
て満足できるものではない。酵素を用いて一段階の反応
により該目的物を製造できれば、工業的に安価に大量生
産することができることとなる。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、酵素を用いてＤＫＡ類を生成する方法に
つき種々検討したところ、動物、植物および微生物の生
物材料の起源を問わず、いずれの２−ケトグルタル酸脱
水素酵素を使用した場合にも、２−ケトグルタル酸とア
ルデヒド類とからＤＫＡ類が生成されることを知り、こ
れらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明
を完成した。

本発明は、式 で表わされる２−ケトグルタル酸と一般式〔式中、ｎは
０またはｌを示す。〕で表わされるアルデヒド類との混
合物に２−ケトグルタル酸脱水素酵素またはその含有物
を作用させることを特徴とする一般式 〔式中、ｎは前記と同意義を有する。〕で表わされる２
、３−ジデオキシ−４−ケトアルドン酸類の製造法であ
る。

本発明で用いられる２−ケトグルタル酸脱水素酵素とし
ては、動物、植物および微生物のいずれが産生する酵素
をも用いることができる。

本発明で用いられる２−ケトグルタル酸脱水素酵素（酵
素番号Ｅ　Ｃ１，２，４，２，）は、生体内ではジヒド
ロリボアミドサクシニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２，
３，２，６１）とりボアミド脱水素酵素（ＥＣ１，８，
１，４）と共に複合体を形成して２−ケトグルタル酸脱
水素酵素複合体として存在することが知られている（ア
カウンツ・オプ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃｏｕｎｔ
ｓ　　ｏｆ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｒｅ５ｅａｅｅｈ
第５ｅａｅｅｈ−４６頁（１９７４）参照〕。２−ケト
グルタル酸脱水素酵素複合体は２−ケトグルタル酸とコ
エンザイムＡ　２＞＝　ラサクシニルーコエンザイムＡ
と二酸化炭素を生成する反応を触媒するが、２−ケトグ
ルタル酸脱水素酵素単独では７エリシアニドのような電
子受容体の存在下で２−ケトグルタル酸の酸化的脱炭酸
反応を触媒し、コハク酸と二酸化炭素を生成することが
知られてぃル〔メソッズ・イン・エンジモロジ−（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１３巻、第
５２−６１頁（］９６９）参照。〕。〕２−ケトグルタ
ル酸脱水素酵はまた２−ケトグルタル酸とグリオキシル
醜とから５−ヒドロキシ−４−ケトバレリン酸を生成す
る反応を触媒することが知られている〔バイオケミスト
リー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第１１巻。

第２２２５−２２２９頁（１９７２）、ジャーナル・オ
ブーバクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＢａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第６９巻、第２６５−２７３頁（
１９７１）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ５
ｔｒｙ）　　、第７巻、第３３３−３３７頁（１９６８
）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
）　。

第９巻、第１１４８−１１５３頁（１９７０）参照〕。

しかし該酵素が、本発明で基質として用いられる一般式
［１１１）で表わされるアルデヒド類と一般式（ｎ）で
表わされる２−ケトグルタル酸との反応を触媒すること
についてはこれまで全く知られていない。

２−ケトグルタル酸脱水素酵素が広く動物、植物に存在
すること、広く微生物が産生ずることは、知られている
。

２−ケトグルタル酸脱水素酵素を産生ずる動物および植
物としては、臓器等の組織あるいは葉。

茎、根などの組織のいずれを材料としてもよい。

また培養細胞を材料として用いることもできる。

工業的には酵素源として微生物を用いる方法が最も有利
である。

２−ケトグルタル酸脱水素酵素を産生ずる微生物として
は、細菌、放線菌、糸状菌または酵母に属する微生物が
挙けられる。

上記微生物としては、例えば財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に保存され、同研究所発行のリスト・オブ・カルチ
ャーズ第７版１９８４年（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｆｏｒ
　　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　、　Ｏｓａｋｍ　、　
Ｌｉ５ｔｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　、　７ｔｈ　Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ　、　１９８４　）に掲ｆ２されている該酵素
を産生ずる公知の微生物菌株が挙けられる。

２−ケトグルタル酸脱水素酵素を産生ずる微生物は、広
く知ちれているが、その具体例としては、たとえばバチ
ルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ　）夏ＦＯ１３７１９，エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　）　Ｉ　Ｆ　Ｏ３３
０１、エンテロバクタ−・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ　　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ　）　　Ｉ　Ｆｏ
　　１２０１０などが挙げられる。これらの微生物は、
上記リスト・オプ・カルチャーズに掲載されている。

また上記の菌株から自然的にまたは人為的に、たとえば
紫外線、Ｘ線、ガンマ−線などの放射線の照射、Ｎ−メ
チル−ｄ−二トローＮ−二トロングアニジン、ナイトロ
ジェンマスタード、ジメチルスルホキサイド、エチルメ
タンスルホネートなどの変異剤、もしくは他の手段で変
異させて得られる変異株などであっても、本発明で用い
る酵素を産生ずる性質を有するものはすべて使用し得る
。

本発明で用いられる２−ケトグルタル酸脱水素酵素とし
ては、該酵素が含まれているたとえば上記のような微生
物の培養物でもよく、また、その処理物でもよい。もち
ろん、該培養物から該酵素を分離、精製したものを用い
てもよい。

上記微生物の培養に用いる培地は液体培地でも固状培地
でもよいが、通常は液体培地による振盪培！！または通
気攪拌培養が工業的に有利である。

液体培養する場合、前培養培地および本培養培地を用い
、前培養したのち本培養してもよいが、本培養培地だけ
で培養してもよい。培地はこれらの微生物が生育し、２
−ケトグルタル酸脱水素酵素を生成し得るものであれば
どの様なものでもよい。

たとえば炭素源としては、Ｄ−グルフース、Ｄ−７ラク
トース、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、ソルビト
ール、ラニークロース。グリセロール、糖蜜、澱粉およ
びその加水分解物、有機酸類（たとえば酢酸、クエン酸
、リンゴ酸など）、アルツーｈ　類（ｆｔ　トにハメタ
ノール、エタノールなど１１炭化水素（たとえばノルマ
ルパラフィンなど）などがあけられる。また窒孝源とし
ては、コーン・ステイープ・リカー、綿実粕、大豆粕、
酵母エキス、乾燥酵母、フイッシニミール、肉エキス、
ペプトン、カザミノ酸その他の含窒素有機質源、各種ア
ンモニウム塩（たとえば硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウムなど）、各種硝＃＃ｉ（たとえば硝酸ナトリウム
、硝酸カリウムなど）その他の有機、無機窒素化合物が
用いられる。さらに無機塩として各種リン酸塩（たとえ
ばリン酸−カリウム、リン酸二ナトリウムなど）、硫酸
マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、硫酸鉄
などを添加してもよく、まな菌の生育を促進する目的テ
ヒタミン類（たとえばビ々ミンＢ！、ビタミンＢ２．ビ
オチン、葉醋など）、核酸関連物質（たとえばアデニン
、グアニンなど）などを添加してもよい。

培養温度、培養時間、培地のｐＨなどの培養条件は特に
限定はれるものではなく、微生物の種類に応じて適宜決
定すべきである。要は２−ケトグルタル酸脱水素酵素の
含有量が最大となるように適当に選択、調節されればよ
く、多くの場合、好気的条件下に約１０〜５０℃でおよ
そ１〜９日間培養し、この間培地のｐＨを約５〜１０付
近に保つのがよい。

本発明において培養物とは、上記の各微生物を生育可能
な培地で培養したときの全培養液そのものが挙げられ、
本発明方法で用いられる２−ケトグルタル酸脱水素酵素
を含有するものが挙げられる。

培養物の処理物とは、培養生成物を遠心分離。

濾過、洗浄、乾燥、破砕、不溶化または酵素精製などの
適宜の処理をして得られる生菌体、乾燥菌体、包括菌体
、菌体磨砕物、粗酵素あるいは精製酵素または不溶化酵
素など、原料物質からＤＫＡ類〔工〕を生成せしめる反
応に関係する２−ケトグルタル酸脱水素酵素を含有する
標品をいう。

精製された酵素として用いる場合、該酵素を分離、精製
する方法としては公知の方法によればよい。すなわち、
動物、植物あるいは培養液から遠心分離等により得られ
た微生物菌体を超音波処理、フレンチプレス、ダイノミ
ル、乳鉢磨砕、もしくはリゾチームその他の溶菌酵素処
理等によって細胞を破砕後、遠心分離により細胞片を除
去し、細胞抽出液を得、これを硫酸ストレプトマイシン
または硫酸プロタミン処理を行い、さらにはポリエチレ
ングリコール沈澱、ア七トン沈澱、硫安沈澱、超遠心法
による分画、　ｐＨ処理による等電点分画等を行い、精
製するために、ＤＥＡＥ−セルロースカラム等のイオン
交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトカラム
等の吸着クロマトグラフィー、セファデックスカラム等
のゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマト
グラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせて行う
ことができる〔メソッズ・イン・エンチモロジ−（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　）　、第１
３巻、第５２−６１頁（１９６９）および同誌第８９巻
、第５１３−５１５頁（１９８２）参照。〕。

本発明方法は、原料化合物［ＩＩ］と［Ｉ［［］との混
合物に２−ケトグルタル酸脱水素酵素またはその含有物
を作用きせることにより行なわれる。

本発明において、原料物質に微生物の培養物を接触させ
る方法によりＤＫＡ類（Ｉ）を生成させてもよく、この
場合、培養物として微生物を培養して得られた培養生成
物を用いてもよいが、微生物の培養過程で培地中に原料
物質を適当な濃度で添加し、微生物の培養と反応とを並
行して行わせることもできる。この場合その添加時期は
培養開始前、あるいは培養途上の適当な時期、あるいは
培養終了後が選ばれる。原料物質は液体のまま、あるい
は粉末として、また水などの適当な培液あるいは懸濁液
として、一時的あるいは一定期間にわたり連続的にまた
は間歇的に添加される。

原料物質を微生物の処理物と接触させる方法によりＤＫ
Ａ類〔工〕を生成させる場合、通常微生物の処理物と基
質溶液とを接触させることにより行われる。基質溶液に
さらに２−ケトグルタル酸脱水素酵素が要求するチアミ
ンピロリン酸、あるいはマグネシウムイオンを塩として
存在させたものを用いることが好ましい。その他必要に
応じてＳＨ基保護剤（システィン残基の保護剤）である
２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトール、
また有害金属イオンを除去するためのキレート剤として
エチレンジアミン四酢＃（ＥＤＴＡ）の塩などを少量添
加してもよい。

基質の化合物（Ｉｔ）としては、そのまま用いても良い
し、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩その他の金
民塩として用いても良い。培地に添加されるマグネシウ
ムイオンの塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネ
シウムなどがあげられる。

反応液中の基質の濃度は、培養物や処理物の活性を阻害
しない範囲で可能な限り高くするのが有利である。場合
によっては両基質を一定時間おきに分別添加し、あるい
は連続的に添加することもできる。

基質溶液中の２−ケトグルタル酸［■］の濃度は、約０
．０１〜１．０Ｍが好適である。

基質溶液中の化合物（ＩＩ［］の濃度は、約０．０１〜
１．０Ｍが好適である。

基質溶液に添加してもよいチアミンピロリン酸の濃度は
約０．Ｏ１〜１０ｍＭが好適であり、マグネシウムイオ
ンの濃には約０．１〜１００ｍＭが好適である。

上記の基質と反応させる酵素の量は、反応液中の蛋白質
量として約０．１〜１０η／−になるように加えると、
ＤＫＡｍ（Ｉ）の生成に好適である。

基質溶液と精製された酵素あるいは前記の方法により調
製した微生物培養物またはその処理物とを反応はせる方
法は特に限定されないが、反応は、静置、振盪、攪拌の
いずれの方法で行ってもよく、また固定化した菌体ある
いは酵素液をカラムに充填し、基質溶液をカラム上部か
ら流すことにより行ってもよい。

反応の至適ｐＨは使用する微生物の菌株の種類によって
多少異るが、通常約６〜１０程度である。

ｐＨの調整は緩衝液（例ニドリス緩衝液、リン酸緩衝液
、クエン酸緩衝液など）、酸またはアルカリによって行
われる。

反応温度は、通常約２０〜５０℃程度で反応は効率よく
進む。反応の進行度は酵素の量、培養物またはその処理
物中に含有される酵素の量、使用する微生物の種類、原
料物質の濃度１反応の様式ないし反応の条件などによっ
て変動するので、反応時間はこれらの諸条件を勘案して
適宜選択されるが、特に約１〜２４時間が好ましい。

以上の様にして培養液あるいζｉ反応媒体中に生成した
ＤＫＡ類〔■〕は、その化学的性質を利用して一般的な
分離、精製の方法を適当に組み合せることによって容易
に単離することができる。たとえばメタノール、エタノ
ール、ｎ−ブタノール。

アセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒による抽出方法、
活性炭、陰イオン交換樹脂、粉末セルロース、シリカゲ
ルによるクロマトグラフィーなどの方法が単独あるいは
組み合せて利用される。

培養経過あるいは反応経過に伴うＤＫＡ類〔工〕ノ生成
過程は、たとえばｎ−ブタノール−エタノール−水（５
：３：２）混合溶媒を展開剤とするペーパークロマトグ
ラフィーによりＲｆ値０．２０または０．１８の部位に
、アルカリ性トリフェニルテトラゾリウムクロリドによ
る発色により赤色を呈するスポットの消長をもって追跡
することができる。また培養液中、反応液中などのＤＫ
Ａ類〔Ｉ〕の含有量の定量は、高速液体クロマトグラフ
ィーにより定量することができる。すなわち、これらの
溶液の一定量を、６５℃に加温した陰イオン交換樹脂カ
ラム（シンパックＩ　ＳＡ　−０７／５２５０４、島津
製作所製）に注入し、０．０４ＭＮａＣｌを含む０．４
Ｍホウ酸バー／７７　　（ｐＨ９，０）をＬＣ−５Ａ送
液ポンプ（島津製作所製）を用いて溶出し、溶出液は１
％アルギニン含有３％ホウ酸溶液と共に１５０℃に加熱
して生ずる螢光を螢光々変針により測定すればよい（分
析化学、第３２巻、第２２０７〜８２１０頁（１９８３
）参照）。

２−ケトグルタル酸とグリコールアルデヒドを基質とし
た反応による後述の実施例１で得られた結晶のペーパー
クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、比旋光
度、融点１元素分析、水素核磁気共鳴スペクトル、１３
ｃ−核磁気共鳴スペクトル、赤外吸収スペクトル、過ヨ
ウ素酸酸化反応による分析により、反応生成物が２，３
−ジデオキシ−４−ヘキスロン酸であることを確認した
。

２．３−ジデオキシ−４−へキスロン酸の理化学的性状
を示すと下記の通りである。

（１）　　外観：無色柱状結晶。

（２）　　ペーパークロマトグラフィー（東洋濾祇陽。

５１１Ｒｆ値０．２０（ｎ−ブタ／−ルーエタノール−
水＝５：３：２）。アルカリ性硝酸銀反応、ＶＪＡ性；
アルカリ性トリフェニルテトラゾリウムクロリド反応、
陽性；２，６−シクロロフエノールインドフエノール反
応、陽性；バニリン−過塩素酸反応、陰性。

（３）　　薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレフ
ーテドＴＬＣプレート、メルク社）：ＲｆＯ，１８（ｎ
−ブタノール−エタノール−水＝５：３：２）。

（４）　　安定性：ｐＨ１〜１０で安定。

（５）　　１解性：水、メタノール、エタノール、アセ
トンに易溶。クロロホルムに不溶。

（６）比旋光度：〔α）＋０．２°（Ｃ＝１．水中）。

（７）融点＝９３〜９６℃。

（８）元素分析：　Ｃ，Ｈｌ。Ｏ６として計算値　Ｃ，
４４，４５；　Ｈ，６，２２実測値　Ｃ，４３，９４；
　Ｈ，６，２４％（９）水素核磁気共鳴スペクトル（９
０ＭＨｚ　、ｐ２ｏ）　：（δ）：２．８〜３．２（合
計３Ｈ，マルチプレット）、４．１２（２Ｈ，ダブレッ
ト）、４．６（ＩＨ。

トリプレット）０ （、、）　　Ｉ　３　ｃ−核磁気共鳴スペクト／’　（
２５，２ＭＨｚ。

Ｄ、０　）　：第１表に示す。なお、比較物質として２
．３−ジデオキシ−し−グリセロ−４−へキスロン酸メ
チルエステルの１３（−核磁気共鳴スペクトルの結果（
ヘミッシニｅペリツヒテ（ＣｂｅｍｉｓｃｈｅＢｅｒｉ
ｃｈｔｅ　）　、第１１０巻、第１１７５〜１１８２頁
（１９７７）参照）も第１表に示す。

第１表 化　　学　　シ　　フ　　ト　（ｐｐｍ）２．３−ジデ
オキシ　　　２．３−ジデオキシ−し−炭素番号　　−
４−ヘキスロン　　　グリ七ロー４−へキスロン酸　　
　　　　　　　　酸メチルエステル黄 Ｃ−１１７７，５ｇ　　　　　１７３．３　　　５Ｃ−
２３４，４ｔ　　　　　　３３．０　　　　ｔＣ−３２
８，４ｔ　　　　　　２７．３　　　　ｔＣ−４２１２
，８ｓ　　　　　２０９．４　　　５Ｃ−５７８，３ａ
　　　　　　７７．８　　　　ｄＣ−６６３，６ｔ　　
　　　　６３．５　　　　ｔメチル基　　　　−５１，
７ｑ 黄　オフレゾーナンス　デカプリングによる開裂数Ｓ、
シングレット；ｄ、ダブレット：ｔ。

トリプレット；ｑ、カルチット。

Ｑｌ）　　赤外吸収スペクトル（ｎ−パラフィン）：３
３９０１−”（ＯＨ）、１７２０１″″１（ＣＯＯＨ）
。

１６９０α−１ｃ＝ｏ）。

（２）過ヨウ素酸酸化反応：該物質の１モルについて２
モル相当の過ヨウ素酸が消費され、反応生成物として各
１モルずつのホルムアルデヒＦ、ギ酸、フハク酸が生成
された。

次に２−ケトグルタル酸とＤ−グリ七ルアルデヒドを基
質とした反応に関する実施例２で得られた精製シロップ
のペーパークロマトグラフィー。

薄層クロマトグラフィー、元素分析、比旋光度。

水素核磁気共鳴スペクトル、赤外吸収スペクトル、過ヨ
ウ素＠酸化反応による分析により、反応生成物が２．３
−ジデオキシ−４−ヘプッロン酸であることを確認した
。

２．３−ジデオキシ−４−ヘプッロン酸の理化学的性状
を示すと下記の通りである。

（１）　　外観：無色シロップ。

（２）　　ペーパークロマトグラフィー（東洋ｉｌｌ　
ｇ　Ｎ　ｏ。

ｒ％　１　）：Ｄｆｆ１１ＱＩｖ＋　　　４ｈｉ　　　
Ｊ、　　ｗ　ｂ　　／−ルー水＝５：３：２）。アルカ
リ性硝酸銀反応。

陽性；アルカリ性トリフェニルテトラゾリウムクｏ　！
ｊ　ト反応、　＠性；　２　、６−シクロロフエノール
インドフエノール反応、陽性；バニリン−過塩素酸反応
；陽性（赤褐色）０ （３）　　ＩＦＷクロマトグラフィー（シリカゲルプレ
フーテドＴＬＣプレート、メルク社）；Ｒｆｏ、１６（
ｎ−ブタノール−エタノール−水＝５：３：２）。

（４）安定性：ｐＨ４〜１０で安定。強酸性で還元性を
失い、分子内無水体となる。

（５）　　溶解性：水、メタノール、エタノール、アセ
トンに易容。クロロホルムに不溶。

（６）比旋光度：［α］　　＋　２．５　　（Ｃ＝１　
、水中）。

（７）元素分析”　７Ｈ１２０１１として計算値　Ｃ，
４７，０６，；　Ｈ，５，８８実測値　Ｃ，４７，１５
；　Ｈ，５，９０％（８）水素核磁気共鳴スペクトル（
９０ＭＨ２，Ｄ２０）：（δ）：２．８〜３．２（合計
３Ｈ，マルチプレット）、４．１２（２Ｈ，ダブレット
）、４．４〜４．６（ＩＨ，マルチプレット）。

（９）　　赤Ｍ＆収スペクトル（ｎ−パラフィン）：３
３９０ｃｘ−”　（ＯＨ）、１７２０α−”（ＣＯＯＨ
）。

１６９００１−”　（Ｃ＝Ｏ）。

ＯＱ　　過ヨウ素酸酸化反応：該物質の１モルについて
３モル相当の過ヨウ素酸が消費され、反応生成物として
各１モルずつのホルムアルデヒドとコへり酸、および２
モルのギ酸が生成された。

このようにして得られた化合物（Ｉ）は、前記したとお
り、細菌感染症の治療剤として用いることのできる抗生
物質中に含まれる種々のデオキシ糖類（例：ペロサミン
、ガロサミン、ロンノース。

フオロサミンなど）の誘導体を製造するための原料化合
物として有用である。

実施例　　　・ 次に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１゜ バチルス・ズブチリスｆＦＯＩ３７１９をペナッ七イー
プロス（Ｐｅｎａｓｓａｙ　　ｂｒｏｔｈ　）　培地（
ディフコラボラトリ−社製、米国）２０−に接種し、２
００−三角フラスコ中で３７℃、１６時間培養した。得
られた培養物の全量を、同組成から成る培地１１に移植
し、これを５本の１１三角フラスコ中で３７℃、８時間
培養した。得られた培養液より菌体を遠心分離して集め
、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、
１．４３ｍＭ２−メルカプトエタノール、２μＭチアミ
ンピロリン酸を含有する０、°１Ｍリン酸カリウム緩衝
液（ＰＨ６，０）を用いて洗浄後、同緩衝液に懸濁した
。上記懸濁液をリゾチーム（シグマ社製、米国）を５０
０μｇ／−に、デオキシリボヌクレアーゼＩ（シグマ社
製、米国）を５μダ／−になるようそれぞれ添加して３
７℃で３０分保温して菌体を溶かした。これを遠心分離
して上清液を得た。

２−ケトグルタル酸１００ｍＭ、グリコールアルデヒド
１００ｍＭ、塩化マグネシウム５　ｍ　Ｍ　。

チアミンピロリン酸０．５ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭを含有
する０、０４Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）９０
−に上記上清液１０−（蛋白量２１９η）を加え、３７
℃、１６時間静置して反応させた。

反応終了後、２００−のエタノールを加え、遠心分離し
て沈澱物を除いた上清液を１Ｏ１ｎｌに濃縮した。この
濃縮液に２０．＋７のメタノールを加え、遠心分離して
沈澱物を除いた上清液をシロップ状にまで濃縮した。次
いでメタノールを加えて抽出し、不溶性物質を遠心分離
して除いた上清液を濃縮することにより得られたシロッ
プを、陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ　１　　（ギ酸型）
のカラムに注入した。

カラムを水洗後、１Ｍギ酸で溶出し、このギ酸溶出画分
を濃縮後、残渣にア七トンを加えて不溶性物質を遠心分
離して除き、得られた上清液を濃縮することによって、
２．３−ジデオキシ−４−へキスロン酸の結晶１９５■
を得た。

実施例２゜ エシェリヒア・コリＩＦＯ３３０１を実施例１と同様の
方法で培養を行い、得られた菌体を溶解し、遠心分離し
て上清液を得た。

２−ケトグルタル１１１００ｍＭ、Ｄ−グリセルアルデ
ヒド１００ｍＭ、塩化マグネシウム５ｍＭ、チアミンピ
ロリン’６１０．５　ｍＭ　、　　ＥＤＴＡ　２　ｍＭ
を含有する０、０４Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
）９０−に上記上清液１０−（蛋白量１８０■）を加え
、３７℃６１６時間静冒して反応させた。

反応終了後、実施例１と同様の方法によりエタノール処
理、メタ／−ル処理および陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ
　１　　（ギ酸型）のカラムにより精製を行って、シロ
ップ状の２．３−ジデオキシ−４−ヘプツロン酸２２０
■を得た。

実施例３゜ エンテロバクタ−〇アエロゲネス　ＩＦＯ］２０１０を
肉汁（ブイヨン）２．０％、酵母エキス０．１％（ｐＨ
７，０）から成る培地２０−に接種し、３７℃、２４時
間培養した。得られた培養物の全量を同組成の培地１１
に移植して３７℃で２４時間振盪した。培養液を遠心分
離して、得られた菌体を凍結乾燥することにより乾燥菌
体ｏ、ｓｓｇを得た。

実施例１と同様の組成から成る反応液１００＋ｄに上記
乾燥菌体０．５Ｆを加え、３７℃で２４時間振盪して反
応させたところ、１２０■の２．３−ジデオキシ−４−
へキスロン酸が生成された。

実施例４゜ 実施例２．の基質溶液においてＤ−グリセルアルデヒド
の代わりにＬ−グリセルアルデヒドを用いる他は同様の
組成の基質溶液９０−に、実施例１゜で得られたバチル
ス−ズブチリス　ＩＦＯ１３７１９の上清液を１〇−加
え、３７℃で１６時間反応させた。得られた反応液から
実施例１と同様の方法で精製を行うことにより、シロッ
プ状の２゜３−ジデオキシ−４−ヘブッロン酸９５■が
得られた。

実施例５゜ 実施例２．の基質溶液においてＤ−グリセルアルデヒド
の代わりにＤＬ−グリセルアルデヒドを用いる他は同様
の組成の基質溶液９０ｒｎｌに、実施例２、で得られた
エシェリヒア・コリ　ＩＦＯ３３０１の上清液１０．．
Ｌ／を加え、３７℃で１６時間反応させることにより、
８０■の２．３−ジデオキシ−４−ヘプツロン酸が生成
された。

実施例６゜ 牛心臓１００ｇを細かくきざみ、実施例１と同様の組成
の緩衝液２０．ｎｌに懸濁した。この懸濁液をセルホモ
ジナイザーで冷却しながら１０分間処理し、これを遠心
分離して上清液を得た。この上清液に対して０．１２容
量の３５％ポリエチレングリフールを加えて攪拌後、遠
心分離して沈澱部を上記の緩衝液２０−に溶かした。こ
の溶液をセファロースＣＩ、−２Ｂカラム（３Ｘ８０ｃ
ｍ）にのせ、クロマトグラフィーを行って精製酵素液２
５ｒｎｌを得た０ ２−ケトグルタル酸、グリフールアルデヒドおよびその
他を含む実施例１と同様の組成の反応液９０−に上記精
製酵素液１０ｍ／を加え、３７℃で２４時間反応させた
ところ、８５■の２．３−ジデオキシ−４−へキスロン
酸が生成した。

実施例７゜ ホウレン草の葉１００ｇを実施例６と同様の方法で処理
し、精製酵素液１０−を得た。

２−ケトグルタル酸、Ｄ−グリセルアルデヒドその他を
含む実施例２と同様の組成の反応液４５−に上記精製酵
素液５−を加えて３７℃、２４時間反応させたところ、
３５■の２．３−ジデオキシ−４−ヘプツロン酸が生成
された。

発明の効果 本発明方法によれば、式［ＩＩ）で示される２−ケトグ
ルタル酸と式（ＩＩ）で表わされるアルデヒド類とを酵
素を用いて一段階の反応で式［１］で表わされる２、３
−ジデオキシ−４−ケトアルドン酸類に変換することが
できる。このように、本発明方法によると目的化合物を
、反応工程数の少ない反応で製造することができるので
、工業的に大量に生産する際に有利である。

特許出願人　　財団法人　発酵研究所 、・、予＼

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる２−ケトグルタル酸と一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎは０または１を示す。〕で表わされるアルデ
   ヒド類との混合物に２−ケトグルタル酸脱水素酵素また
   はその含有物を作用させることを特徴とする一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎは前記と同意義を有する。〕で表わされる２
   ，３−ジデオキシ−４−ケトアルドン酸類の製造法。