JPS61257190A - 2,3−ジデオキシ−4−ケトアルドン酸類の製造法 - Google Patents
2,3−ジデオキシ−4−ケトアルドン酸類の製造法Info
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- JPS61257190A JPS61257190A JP9743185A JP9743185A JPS61257190A JP S61257190 A JPS61257190 A JP S61257190A JP 9743185 A JP9743185 A JP 9743185A JP 9743185 A JP9743185 A JP 9743185A JP S61257190 A JPS61257190 A JP S61257190A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、細菌感染症の治療剤として有用な抗生物質中
に含まれる種々のデオキシ糖類(例、ペロサミン、ガロ
サミン、ロジノース、フオロサミンなど)の誘導体を製
造するための原料化合物として有用な2.3−ジデオキ
シ−4−ケトアルドン酸(以下、DKAと略称すること
もある。)類の製造法に関する。
に含まれる種々のデオキシ糖類(例、ペロサミン、ガロ
サミン、ロジノース、フオロサミンなど)の誘導体を製
造するための原料化合物として有用な2.3−ジデオキ
シ−4−ケトアルドン酸(以下、DKAと略称すること
もある。)類の製造法に関する。
従来の技術
DKA類は化学的方法により2.3−ジデオキシ−アル
ド−2−エノン酸類から合成する方法が知られている(
ヘミッシェ・ベリッヒテ(Chemische Ber
ichte )第110巻、第1175−1182頁(
1977)参照。)。しかし酵素によるDKA類の製造
法は知られていない。
ド−2−エノン酸類から合成する方法が知られている(
ヘミッシェ・ベリッヒテ(Chemische Ber
ichte )第110巻、第1175−1182頁(
1977)参照。)。しかし酵素によるDKA類の製造
法は知られていない。
発明が解決しようとしている問題点
従来の化学合成法は数多くの工程が必要とされるため収
率も低く、工業的に安価にDKA類を製造する方法とし
て満足できるものではない。酵素を用いて一段階の反応
により該目的物を製造できれば、工業的に安価に大量生
産することができることとなる。
率も低く、工業的に安価にDKA類を製造する方法とし
て満足できるものではない。酵素を用いて一段階の反応
により該目的物を製造できれば、工業的に安価に大量生
産することができることとなる。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、酵素を用いてDKA類を生成する方法に
つき種々検討したところ、動物、植物および微生物の生
物材料の起源を問わず、いずれの2−ケトグルタル酸脱
水素酵素を使用した場合にも、2−ケトグルタル酸とア
ルデヒド類とからDKA類が生成されることを知り、こ
れらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明
を完成した。
つき種々検討したところ、動物、植物および微生物の生
物材料の起源を問わず、いずれの2−ケトグルタル酸脱
水素酵素を使用した場合にも、2−ケトグルタル酸とア
ルデヒド類とからDKA類が生成されることを知り、こ
れらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明
を完成した。
本発明は、式
で表わされる2−ケトグルタル酸と一般式〔式中、nは
0またはlを示す。〕で表わされるアルデヒド類との混
合物に2−ケトグルタル酸脱水素酵素またはその含有物
を作用させることを特徴とする一般式 〔式中、nは前記と同意義を有する。〕で表わされる2
、3−ジデオキシ−4−ケトアルドン酸類の製造法であ
る。
0またはlを示す。〕で表わされるアルデヒド類との混
合物に2−ケトグルタル酸脱水素酵素またはその含有物
を作用させることを特徴とする一般式 〔式中、nは前記と同意義を有する。〕で表わされる2
、3−ジデオキシ−4−ケトアルドン酸類の製造法であ
る。
本発明で用いられる2−ケトグルタル酸脱水素酵素とし
ては、動物、植物および微生物のいずれが産生する酵素
をも用いることができる。
ては、動物、植物および微生物のいずれが産生する酵素
をも用いることができる。
本発明で用いられる2−ケトグルタル酸脱水素酵素(酵
素番号E C1,2,4,2,)は、生体内ではジヒド
ロリボアミドサクシニルトランスフェラーゼ(EC2,
3,2,61)とりボアミド脱水素酵素(EC1,8,
1,4)と共に複合体を形成して2−ケトグルタル酸脱
水素酵素複合体として存在することが知られている(ア
カウンツ・オプ・ケミカル・リサーチ(Account
s of Chemical Re5eaeeh
第5eaeeh−46頁(1974)参照〕。2−ケト
グルタル酸脱水素酵素複合体は2−ケトグルタル酸とコ
エンザイムA 2>= ラサクシニルーコエンザイムA
と二酸化炭素を生成する反応を触媒するが、2−ケトグ
ルタル酸脱水素酵素単独では7エリシアニドのような電
子受容体の存在下で2−ケトグルタル酸の酸化的脱炭酸
反応を触媒し、コハク酸と二酸化炭素を生成することが
知られてぃル〔メソッズ・イン・エンジモロジ−(Me
thodsin Enzymology)第13巻、第
52−61頁(]969)参照。〕。〕2−ケトグルタ
ル酸脱水素酵はまた2−ケトグルタル酸とグリオキシル
醜とから5−ヒドロキシ−4−ケトバレリン酸を生成す
る反応を触媒することが知られている〔バイオケミスト
リー(Biochemistry )第11巻。
素番号E C1,2,4,2,)は、生体内ではジヒド
ロリボアミドサクシニルトランスフェラーゼ(EC2,
3,2,61)とりボアミド脱水素酵素(EC1,8,
1,4)と共に複合体を形成して2−ケトグルタル酸脱
水素酵素複合体として存在することが知られている(ア
カウンツ・オプ・ケミカル・リサーチ(Account
s of Chemical Re5eaeeh
第5eaeeh−46頁(1974)参照〕。2−ケト
グルタル酸脱水素酵素複合体は2−ケトグルタル酸とコ
エンザイムA 2>= ラサクシニルーコエンザイムA
と二酸化炭素を生成する反応を触媒するが、2−ケトグ
ルタル酸脱水素酵素単独では7エリシアニドのような電
子受容体の存在下で2−ケトグルタル酸の酸化的脱炭酸
反応を触媒し、コハク酸と二酸化炭素を生成することが
知られてぃル〔メソッズ・イン・エンジモロジ−(Me
thodsin Enzymology)第13巻、第
52−61頁(]969)参照。〕。〕2−ケトグルタ
ル酸脱水素酵はまた2−ケトグルタル酸とグリオキシル
醜とから5−ヒドロキシ−4−ケトバレリン酸を生成す
る反応を触媒することが知られている〔バイオケミスト
リー(Biochemistry )第11巻。
第2225−2229頁(1972)、ジャーナル・オ
ブーバクテリオロジー(Journal ofBac
teriology)第69巻、第265−273頁(
1971)、バイオケミストリー(Biochemi5
try) 、第7巻、第333−337頁(1968
)、バイオケミストリー(Biochemistry
) 。
ブーバクテリオロジー(Journal ofBac
teriology)第69巻、第265−273頁(
1971)、バイオケミストリー(Biochemi5
try) 、第7巻、第333−337頁(1968
)、バイオケミストリー(Biochemistry
) 。
第9巻、第1148−1153頁(1970)参照〕。
しかし該酵素が、本発明で基質として用いられる一般式
[111)で表わされるアルデヒド類と一般式(n)で
表わされる2−ケトグルタル酸との反応を触媒すること
についてはこれまで全く知られていない。
[111)で表わされるアルデヒド類と一般式(n)で
表わされる2−ケトグルタル酸との反応を触媒すること
についてはこれまで全く知られていない。
2−ケトグルタル酸脱水素酵素が広く動物、植物に存在
すること、広く微生物が産生ずることは、知られている
。
すること、広く微生物が産生ずることは、知られている
。
2−ケトグルタル酸脱水素酵素を産生ずる動物および植
物としては、臓器等の組織あるいは葉。
物としては、臓器等の組織あるいは葉。
茎、根などの組織のいずれを材料としてもよい。
また培養細胞を材料として用いることもできる。
工業的には酵素源として微生物を用いる方法が最も有利
である。
である。
2−ケトグルタル酸脱水素酵素を産生ずる微生物として
は、細菌、放線菌、糸状菌または酵母に属する微生物が
挙けられる。
は、細菌、放線菌、糸状菌または酵母に属する微生物が
挙けられる。
上記微生物としては、例えば財団法人発酵研究所(IF
O)に保存され、同研究所発行のリスト・オブ・カルチ
ャーズ第7版1984年(In5titute For
Fermentation 、 Osakm 、
Li5tof Cu1tures 、 7th Edi
tion 、 1984 )に掲f2されている該酵素
を産生ずる公知の微生物菌株が挙けられる。
O)に保存され、同研究所発行のリスト・オブ・カルチ
ャーズ第7版1984年(In5titute For
Fermentation 、 Osakm 、
Li5tof Cu1tures 、 7th Edi
tion 、 1984 )に掲f2されている該酵素
を産生ずる公知の微生物菌株が挙けられる。
2−ケトグルタル酸脱水素酵素を産生ずる微生物は、広
く知ちれているが、その具体例としては、たとえばバチ
ルス・ズブチリス(Bacillus 5ubtil
is )夏FO13719,エシェリヒア・コリ(Es
cherichia coli ) I F O33
01、エンテロバクタ−・アエロゲネス(Entero
bacter aerogenes ) I Fo
12010などが挙げられる。これらの微生物は、
上記リスト・オプ・カルチャーズに掲載されている。
く知ちれているが、その具体例としては、たとえばバチ
ルス・ズブチリス(Bacillus 5ubtil
is )夏FO13719,エシェリヒア・コリ(Es
cherichia coli ) I F O33
01、エンテロバクタ−・アエロゲネス(Entero
bacter aerogenes ) I Fo
12010などが挙げられる。これらの微生物は、
上記リスト・オプ・カルチャーズに掲載されている。
また上記の菌株から自然的にまたは人為的に、たとえば
紫外線、X線、ガンマ−線などの放射線の照射、N−メ
チル−d−二トローN−二トロングアニジン、ナイトロ
ジェンマスタード、ジメチルスルホキサイド、エチルメ
タンスルホネートなどの変異剤、もしくは他の手段で変
異させて得られる変異株などであっても、本発明で用い
る酵素を産生ずる性質を有するものはすべて使用し得る
。
紫外線、X線、ガンマ−線などの放射線の照射、N−メ
チル−d−二トローN−二トロングアニジン、ナイトロ
ジェンマスタード、ジメチルスルホキサイド、エチルメ
タンスルホネートなどの変異剤、もしくは他の手段で変
異させて得られる変異株などであっても、本発明で用い
る酵素を産生ずる性質を有するものはすべて使用し得る
。
本発明で用いられる2−ケトグルタル酸脱水素酵素とし
ては、該酵素が含まれているたとえば上記のような微生
物の培養物でもよく、また、その処理物でもよい。もち
ろん、該培養物から該酵素を分離、精製したものを用い
てもよい。
ては、該酵素が含まれているたとえば上記のような微生
物の培養物でもよく、また、その処理物でもよい。もち
ろん、該培養物から該酵素を分離、精製したものを用い
てもよい。
上記微生物の培養に用いる培地は液体培地でも固状培地
でもよいが、通常は液体培地による振盪培!!または通
気攪拌培養が工業的に有利である。
でもよいが、通常は液体培地による振盪培!!または通
気攪拌培養が工業的に有利である。
液体培養する場合、前培養培地および本培養培地を用い
、前培養したのち本培養してもよいが、本培養培地だけ
で培養してもよい。培地はこれらの微生物が生育し、2
−ケトグルタル酸脱水素酵素を生成し得るものであれば
どの様なものでもよい。
、前培養したのち本培養してもよいが、本培養培地だけ
で培養してもよい。培地はこれらの微生物が生育し、2
−ケトグルタル酸脱水素酵素を生成し得るものであれば
どの様なものでもよい。
たとえば炭素源としては、D−グルフース、D−7ラク
トース、D−マンノース、D−マンニトール、ソルビト
ール、ラニークロース。グリセロール、糖蜜、澱粉およ
びその加水分解物、有機酸類(たとえば酢酸、クエン酸
、リンゴ酸など)、アルツーh 類(ft トにハメタ
ノール、エタノールなど11炭化水素(たとえばノルマ
ルパラフィンなど)などがあけられる。また窒孝源とし
ては、コーン・ステイープ・リカー、綿実粕、大豆粕、
酵母エキス、乾燥酵母、フイッシニミール、肉エキス、
ペプトン、カザミノ酸その他の含窒素有機質源、各種ア
ンモニウム塩(たとえば硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウムなど)、各種硝##i(たとえば硝酸ナトリウム
、硝酸カリウムなど)その他の有機、無機窒素化合物が
用いられる。さらに無機塩として各種リン酸塩(たとえ
ばリン酸−カリウム、リン酸二ナトリウムなど)、硫酸
マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、硫酸鉄
などを添加してもよく、まな菌の生育を促進する目的テ
ヒタミン類(たとえばビ々ミンB!、ビタミンB2.ビ
オチン、葉醋など)、核酸関連物質(たとえばアデニン
、グアニンなど)などを添加してもよい。
トース、D−マンノース、D−マンニトール、ソルビト
ール、ラニークロース。グリセロール、糖蜜、澱粉およ
びその加水分解物、有機酸類(たとえば酢酸、クエン酸
、リンゴ酸など)、アルツーh 類(ft トにハメタ
ノール、エタノールなど11炭化水素(たとえばノルマ
ルパラフィンなど)などがあけられる。また窒孝源とし
ては、コーン・ステイープ・リカー、綿実粕、大豆粕、
酵母エキス、乾燥酵母、フイッシニミール、肉エキス、
ペプトン、カザミノ酸その他の含窒素有機質源、各種ア
ンモニウム塩(たとえば硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウムなど)、各種硝##i(たとえば硝酸ナトリウム
、硝酸カリウムなど)その他の有機、無機窒素化合物が
用いられる。さらに無機塩として各種リン酸塩(たとえ
ばリン酸−カリウム、リン酸二ナトリウムなど)、硫酸
マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、硫酸鉄
などを添加してもよく、まな菌の生育を促進する目的テ
ヒタミン類(たとえばビ々ミンB!、ビタミンB2.ビ
オチン、葉醋など)、核酸関連物質(たとえばアデニン
、グアニンなど)などを添加してもよい。
培養温度、培養時間、培地のpHなどの培養条件は特に
限定はれるものではなく、微生物の種類に応じて適宜決
定すべきである。要は2−ケトグルタル酸脱水素酵素の
含有量が最大となるように適当に選択、調節されればよ
く、多くの場合、好気的条件下に約10〜50℃でおよ
そ1〜9日間培養し、この間培地のpHを約5〜10付
近に保つのがよい。
限定はれるものではなく、微生物の種類に応じて適宜決
定すべきである。要は2−ケトグルタル酸脱水素酵素の
含有量が最大となるように適当に選択、調節されればよ
く、多くの場合、好気的条件下に約10〜50℃でおよ
そ1〜9日間培養し、この間培地のpHを約5〜10付
近に保つのがよい。
本発明において培養物とは、上記の各微生物を生育可能
な培地で培養したときの全培養液そのものが挙げられ、
本発明方法で用いられる2−ケトグルタル酸脱水素酵素
を含有するものが挙げられる。
な培地で培養したときの全培養液そのものが挙げられ、
本発明方法で用いられる2−ケトグルタル酸脱水素酵素
を含有するものが挙げられる。
培養物の処理物とは、培養生成物を遠心分離。
濾過、洗浄、乾燥、破砕、不溶化または酵素精製などの
適宜の処理をして得られる生菌体、乾燥菌体、包括菌体
、菌体磨砕物、粗酵素あるいは精製酵素または不溶化酵
素など、原料物質からDKA類〔工〕を生成せしめる反
応に関係する2−ケトグルタル酸脱水素酵素を含有する
標品をいう。
適宜の処理をして得られる生菌体、乾燥菌体、包括菌体
、菌体磨砕物、粗酵素あるいは精製酵素または不溶化酵
素など、原料物質からDKA類〔工〕を生成せしめる反
応に関係する2−ケトグルタル酸脱水素酵素を含有する
標品をいう。
精製された酵素として用いる場合、該酵素を分離、精製
する方法としては公知の方法によればよい。すなわち、
動物、植物あるいは培養液から遠心分離等により得られ
た微生物菌体を超音波処理、フレンチプレス、ダイノミ
ル、乳鉢磨砕、もしくはリゾチームその他の溶菌酵素処
理等によって細胞を破砕後、遠心分離により細胞片を除
去し、細胞抽出液を得、これを硫酸ストレプトマイシン
または硫酸プロタミン処理を行い、さらにはポリエチレ
ングリコール沈澱、ア七トン沈澱、硫安沈澱、超遠心法
による分画、 pH処理による等電点分画等を行い、精
製するために、DEAE−セルロースカラム等のイオン
交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトカラム
等の吸着クロマトグラフィー、セファデックスカラム等
のゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマト
グラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせて行う
ことができる〔メソッズ・イン・エンチモロジ−(Me
thods in Enzymology ) 、第1
3巻、第52−61頁(1969)および同誌第89巻
、第513−515頁(1982)参照。〕。
する方法としては公知の方法によればよい。すなわち、
動物、植物あるいは培養液から遠心分離等により得られ
た微生物菌体を超音波処理、フレンチプレス、ダイノミ
ル、乳鉢磨砕、もしくはリゾチームその他の溶菌酵素処
理等によって細胞を破砕後、遠心分離により細胞片を除
去し、細胞抽出液を得、これを硫酸ストレプトマイシン
または硫酸プロタミン処理を行い、さらにはポリエチレ
ングリコール沈澱、ア七トン沈澱、硫安沈澱、超遠心法
による分画、 pH処理による等電点分画等を行い、精
製するために、DEAE−セルロースカラム等のイオン
交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトカラム
等の吸着クロマトグラフィー、セファデックスカラム等
のゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマト
グラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせて行う
ことができる〔メソッズ・イン・エンチモロジ−(Me
thods in Enzymology ) 、第1
3巻、第52−61頁(1969)および同誌第89巻
、第513−515頁(1982)参照。〕。
本発明方法は、原料化合物[II]と[I[[]との混
合物に2−ケトグルタル酸脱水素酵素またはその含有物
を作用きせることにより行なわれる。
合物に2−ケトグルタル酸脱水素酵素またはその含有物
を作用きせることにより行なわれる。
本発明において、原料物質に微生物の培養物を接触させ
る方法によりDKA類(I)を生成させてもよく、この
場合、培養物として微生物を培養して得られた培養生成
物を用いてもよいが、微生物の培養過程で培地中に原料
物質を適当な濃度で添加し、微生物の培養と反応とを並
行して行わせることもできる。この場合その添加時期は
培養開始前、あるいは培養途上の適当な時期、あるいは
培養終了後が選ばれる。原料物質は液体のまま、あるい
は粉末として、また水などの適当な培液あるいは懸濁液
として、一時的あるいは一定期間にわたり連続的にまた
は間歇的に添加される。
る方法によりDKA類(I)を生成させてもよく、この
場合、培養物として微生物を培養して得られた培養生成
物を用いてもよいが、微生物の培養過程で培地中に原料
物質を適当な濃度で添加し、微生物の培養と反応とを並
行して行わせることもできる。この場合その添加時期は
培養開始前、あるいは培養途上の適当な時期、あるいは
培養終了後が選ばれる。原料物質は液体のまま、あるい
は粉末として、また水などの適当な培液あるいは懸濁液
として、一時的あるいは一定期間にわたり連続的にまた
は間歇的に添加される。
原料物質を微生物の処理物と接触させる方法によりDK
A類〔工〕を生成させる場合、通常微生物の処理物と基
質溶液とを接触させることにより行われる。基質溶液に
さらに2−ケトグルタル酸脱水素酵素が要求するチアミ
ンピロリン酸、あるいはマグネシウムイオンを塩として
存在させたものを用いることが好ましい。その他必要に
応じてSH基保護剤(システィン残基の保護剤)である
2−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトール、
また有害金属イオンを除去するためのキレート剤として
エチレンジアミン四酢#(EDTA)の塩などを少量添
加してもよい。
A類〔工〕を生成させる場合、通常微生物の処理物と基
質溶液とを接触させることにより行われる。基質溶液に
さらに2−ケトグルタル酸脱水素酵素が要求するチアミ
ンピロリン酸、あるいはマグネシウムイオンを塩として
存在させたものを用いることが好ましい。その他必要に
応じてSH基保護剤(システィン残基の保護剤)である
2−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトール、
また有害金属イオンを除去するためのキレート剤として
エチレンジアミン四酢#(EDTA)の塩などを少量添
加してもよい。
基質の化合物(It)としては、そのまま用いても良い
し、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩その他の金
民塩として用いても良い。培地に添加されるマグネシウ
ムイオンの塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネ
シウムなどがあげられる。
し、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩その他の金
民塩として用いても良い。培地に添加されるマグネシウ
ムイオンの塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネ
シウムなどがあげられる。
反応液中の基質の濃度は、培養物や処理物の活性を阻害
しない範囲で可能な限り高くするのが有利である。場合
によっては両基質を一定時間おきに分別添加し、あるい
は連続的に添加することもできる。
しない範囲で可能な限り高くするのが有利である。場合
によっては両基質を一定時間おきに分別添加し、あるい
は連続的に添加することもできる。
基質溶液中の2−ケトグルタル酸[■]の濃度は、約0
.01〜1.0Mが好適である。
.01〜1.0Mが好適である。
基質溶液中の化合物(II[]の濃度は、約0.01〜
1.0Mが好適である。
1.0Mが好適である。
基質溶液に添加してもよいチアミンピロリン酸の濃度は
約0.O1〜10mMが好適であり、マグネシウムイオ
ンの濃には約0.1〜100mMが好適である。
約0.O1〜10mMが好適であり、マグネシウムイオ
ンの濃には約0.1〜100mMが好適である。
上記の基質と反応させる酵素の量は、反応液中の蛋白質
量として約0.1〜10η/−になるように加えると、
DKAm(I)の生成に好適である。
量として約0.1〜10η/−になるように加えると、
DKAm(I)の生成に好適である。
基質溶液と精製された酵素あるいは前記の方法により調
製した微生物培養物またはその処理物とを反応はせる方
法は特に限定されないが、反応は、静置、振盪、攪拌の
いずれの方法で行ってもよく、また固定化した菌体ある
いは酵素液をカラムに充填し、基質溶液をカラム上部か
ら流すことにより行ってもよい。
製した微生物培養物またはその処理物とを反応はせる方
法は特に限定されないが、反応は、静置、振盪、攪拌の
いずれの方法で行ってもよく、また固定化した菌体ある
いは酵素液をカラムに充填し、基質溶液をカラム上部か
ら流すことにより行ってもよい。
反応の至適pHは使用する微生物の菌株の種類によって
多少異るが、通常約6〜10程度である。
多少異るが、通常約6〜10程度である。
pHの調整は緩衝液(例ニドリス緩衝液、リン酸緩衝液
、クエン酸緩衝液など)、酸またはアルカリによって行
われる。
、クエン酸緩衝液など)、酸またはアルカリによって行
われる。
反応温度は、通常約20〜50℃程度で反応は効率よく
進む。反応の進行度は酵素の量、培養物またはその処理
物中に含有される酵素の量、使用する微生物の種類、原
料物質の濃度1反応の様式ないし反応の条件などによっ
て変動するので、反応時間はこれらの諸条件を勘案して
適宜選択されるが、特に約1〜24時間が好ましい。
進む。反応の進行度は酵素の量、培養物またはその処理
物中に含有される酵素の量、使用する微生物の種類、原
料物質の濃度1反応の様式ないし反応の条件などによっ
て変動するので、反応時間はこれらの諸条件を勘案して
適宜選択されるが、特に約1〜24時間が好ましい。
以上の様にして培養液あるいζi反応媒体中に生成した
DKA類〔■〕は、その化学的性質を利用して一般的な
分離、精製の方法を適当に組み合せることによって容易
に単離することができる。たとえばメタノール、エタノ
ール、n−ブタノール。
DKA類〔■〕は、その化学的性質を利用して一般的な
分離、精製の方法を適当に組み合せることによって容易
に単離することができる。たとえばメタノール、エタノ
ール、n−ブタノール。
アセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒による抽出方法、
活性炭、陰イオン交換樹脂、粉末セルロース、シリカゲ
ルによるクロマトグラフィーなどの方法が単独あるいは
組み合せて利用される。
活性炭、陰イオン交換樹脂、粉末セルロース、シリカゲ
ルによるクロマトグラフィーなどの方法が単独あるいは
組み合せて利用される。
培養経過あるいは反応経過に伴うDKA類〔工〕ノ生成
過程は、たとえばn−ブタノール−エタノール−水(5
:3:2)混合溶媒を展開剤とするペーパークロマトグ
ラフィーによりRf値0.20または0.18の部位に
、アルカリ性トリフェニルテトラゾリウムクロリドによ
る発色により赤色を呈するスポットの消長をもって追跡
することができる。また培養液中、反応液中などのDK
A類〔I〕の含有量の定量は、高速液体クロマトグラフ
ィーにより定量することができる。すなわち、これらの
溶液の一定量を、65℃に加温した陰イオン交換樹脂カ
ラム(シンパックI SA −07/52504、島津
製作所製)に注入し、0.04MNaClを含む0.4
Mホウ酸バー/77 (pH9,0)をLC−5A送
液ポンプ(島津製作所製)を用いて溶出し、溶出液は1
%アルギニン含有3%ホウ酸溶液と共に150℃に加熱
して生ずる螢光を螢光々変針により測定すればよい(分
析化学、第32巻、第2207〜8210頁(1983
)参照)。
過程は、たとえばn−ブタノール−エタノール−水(5
:3:2)混合溶媒を展開剤とするペーパークロマトグ
ラフィーによりRf値0.20または0.18の部位に
、アルカリ性トリフェニルテトラゾリウムクロリドによ
る発色により赤色を呈するスポットの消長をもって追跡
することができる。また培養液中、反応液中などのDK
A類〔I〕の含有量の定量は、高速液体クロマトグラフ
ィーにより定量することができる。すなわち、これらの
溶液の一定量を、65℃に加温した陰イオン交換樹脂カ
ラム(シンパックI SA −07/52504、島津
製作所製)に注入し、0.04MNaClを含む0.4
Mホウ酸バー/77 (pH9,0)をLC−5A送
液ポンプ(島津製作所製)を用いて溶出し、溶出液は1
%アルギニン含有3%ホウ酸溶液と共に150℃に加熱
して生ずる螢光を螢光々変針により測定すればよい(分
析化学、第32巻、第2207〜8210頁(1983
)参照)。
2−ケトグルタル酸とグリコールアルデヒドを基質とし
た反応による後述の実施例1で得られた結晶のペーパー
クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、比旋光
度、融点1元素分析、水素核磁気共鳴スペクトル、13
c−核磁気共鳴スペクトル、赤外吸収スペクトル、過ヨ
ウ素酸酸化反応による分析により、反応生成物が2,3
−ジデオキシ−4−ヘキスロン酸であることを確認した
。
た反応による後述の実施例1で得られた結晶のペーパー
クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、比旋光
度、融点1元素分析、水素核磁気共鳴スペクトル、13
c−核磁気共鳴スペクトル、赤外吸収スペクトル、過ヨ
ウ素酸酸化反応による分析により、反応生成物が2,3
−ジデオキシ−4−ヘキスロン酸であることを確認した
。
2.3−ジデオキシ−4−へキスロン酸の理化学的性状
を示すと下記の通りである。
を示すと下記の通りである。
(1) 外観:無色柱状結晶。
(2) ペーパークロマトグラフィー(東洋濾祇陽。
511Rf値0.20(n−ブタ/−ルーエタノール−
水=5:3:2)。アルカリ性硝酸銀反応、VJA性;
アルカリ性トリフェニルテトラゾリウムクロリド反応、
陽性;2,6−シクロロフエノールインドフエノール反
応、陽性;バニリン−過塩素酸反応、陰性。
水=5:3:2)。アルカリ性硝酸銀反応、VJA性;
アルカリ性トリフェニルテトラゾリウムクロリド反応、
陽性;2,6−シクロロフエノールインドフエノール反
応、陽性;バニリン−過塩素酸反応、陰性。
(3) 薄層クロマトグラフィー(シリカゲルプレフ
ーテドTLCプレート、メルク社):RfO,18(n
−ブタノール−エタノール−水=5:3:2)。
ーテドTLCプレート、メルク社):RfO,18(n
−ブタノール−エタノール−水=5:3:2)。
(4) 安定性:pH1〜10で安定。
(5) 1解性:水、メタノール、エタノール、アセ
トンに易溶。クロロホルムに不溶。
トンに易溶。クロロホルムに不溶。
(6)比旋光度:〔α)+0.2°(C=1.水中)。
(7)融点=93〜96℃。
(8)元素分析: C,Hl。O6として計算値 C,
44,45; H,6,22実測値 C,43,94;
H,6,24%(9)水素核磁気共鳴スペクトル(9
0MHz 、p2o) :(δ):2.8〜3.2(合
計3H,マルチプレット)、4.12(2H,ダブレッ
ト)、4.6(IH。
44,45; H,6,22実測値 C,43,94;
H,6,24%(9)水素核磁気共鳴スペクトル(9
0MHz 、p2o) :(δ):2.8〜3.2(合
計3H,マルチプレット)、4.12(2H,ダブレッ
ト)、4.6(IH。
トリプレット)0
(、、) I 3 c−核磁気共鳴スペクト/’ (
25,2MHz。
25,2MHz。
D、0 ) :第1表に示す。なお、比較物質として2
.3−ジデオキシ−し−グリセロ−4−へキスロン酸メ
チルエステルの13(−核磁気共鳴スペクトルの結果(
ヘミッシニeペリツヒテ(CbemischeBeri
chte ) 、第110巻、第1175〜1182頁
(1977)参照)も第1表に示す。
.3−ジデオキシ−し−グリセロ−4−へキスロン酸メ
チルエステルの13(−核磁気共鳴スペクトルの結果(
ヘミッシニeペリツヒテ(CbemischeBeri
chte ) 、第110巻、第1175〜1182頁
(1977)参照)も第1表に示す。
第1表
化 学 シ フ ト (ppm)2.3−ジデ
オキシ 2.3−ジデオキシ−し−炭素番号 −
4−ヘキスロン グリ七ロー4−へキスロン酸
酸メチルエステル黄 C−1177,5g 173.3 5C−
234,4t 33.0 tC−32
8,4t 27.3 tC−4212
,8s 209.4 5C−578,3a
77.8 dC−663,6t
63.5 tメチル基 −51,
7q 黄 オフレゾーナンス デカプリングによる開裂数S、
シングレット;d、ダブレット:t。
オキシ 2.3−ジデオキシ−し−炭素番号 −
4−ヘキスロン グリ七ロー4−へキスロン酸
酸メチルエステル黄 C−1177,5g 173.3 5C−
234,4t 33.0 tC−32
8,4t 27.3 tC−4212
,8s 209.4 5C−578,3a
77.8 dC−663,6t
63.5 tメチル基 −51,
7q 黄 オフレゾーナンス デカプリングによる開裂数S、
シングレット;d、ダブレット:t。
トリプレット;q、カルチット。
Ql) 赤外吸収スペクトル(n−パラフィン):3
3901−”(OH)、17201″″1(COOH)
。
3901−”(OH)、17201″″1(COOH)
。
1690α−1c=o)。
(2)過ヨウ素酸酸化反応:該物質の1モルについて2
モル相当の過ヨウ素酸が消費され、反応生成物として各
1モルずつのホルムアルデヒF、ギ酸、フハク酸が生成
された。
モル相当の過ヨウ素酸が消費され、反応生成物として各
1モルずつのホルムアルデヒF、ギ酸、フハク酸が生成
された。
次に2−ケトグルタル酸とD−グリ七ルアルデヒドを基
質とした反応に関する実施例2で得られた精製シロップ
のペーパークロマトグラフィー。
質とした反応に関する実施例2で得られた精製シロップ
のペーパークロマトグラフィー。
薄層クロマトグラフィー、元素分析、比旋光度。
水素核磁気共鳴スペクトル、赤外吸収スペクトル、過ヨ
ウ素@酸化反応による分析により、反応生成物が2.3
−ジデオキシ−4−ヘプッロン酸であることを確認した
。
ウ素@酸化反応による分析により、反応生成物が2.3
−ジデオキシ−4−ヘプッロン酸であることを確認した
。
2.3−ジデオキシ−4−ヘプッロン酸の理化学的性状
を示すと下記の通りである。
を示すと下記の通りである。
(1) 外観:無色シロップ。
(2) ペーパークロマトグラフィー(東洋ill
g N o。
g N o。
r% 1 ):Dff11QIv+ 4hi
J、 w b /−ルー水=5:3:2)。アルカ
リ性硝酸銀反応。
J、 w b /−ルー水=5:3:2)。アルカ
リ性硝酸銀反応。
陽性;アルカリ性トリフェニルテトラゾリウムクo !
j ト反応、 @性; 2 、6−シクロロフエノール
インドフエノール反応、陽性;バニリン−過塩素酸反応
;陽性(赤褐色)0 (3) IFWクロマトグラフィー(シリカゲルプレ
フーテドTLCプレート、メルク社);Rfo、16(
n−ブタノール−エタノール−水=5:3:2)。
j ト反応、 @性; 2 、6−シクロロフエノール
インドフエノール反応、陽性;バニリン−過塩素酸反応
;陽性(赤褐色)0 (3) IFWクロマトグラフィー(シリカゲルプレ
フーテドTLCプレート、メルク社);Rfo、16(
n−ブタノール−エタノール−水=5:3:2)。
(4)安定性:pH4〜10で安定。強酸性で還元性を
失い、分子内無水体となる。
失い、分子内無水体となる。
(5) 溶解性:水、メタノール、エタノール、アセ
トンに易容。クロロホルムに不溶。
トンに易容。クロロホルムに不溶。
(6)比旋光度:[α] + 2.5 (C=1
、水中)。
、水中)。
(7)元素分析” 7H12011として計算値 C,
47,06,; H,5,88実測値 C,47,15
; H,5,90%(8)水素核磁気共鳴スペクトル(
90MH2,D20):(δ):2.8〜3.2(合計
3H,マルチプレット)、4.12(2H,ダブレット
)、4.4〜4.6(IH,マルチプレット)。
47,06,; H,5,88実測値 C,47,15
; H,5,90%(8)水素核磁気共鳴スペクトル(
90MH2,D20):(δ):2.8〜3.2(合計
3H,マルチプレット)、4.12(2H,ダブレット
)、4.4〜4.6(IH,マルチプレット)。
(9) 赤M&収スペクトル(n−パラフィン):3
390cx−” (OH)、1720α−”(COOH
)。
390cx−” (OH)、1720α−”(COOH
)。
169001−” (C=O)。
OQ 過ヨウ素酸酸化反応:該物質の1モルについて
3モル相当の過ヨウ素酸が消費され、反応生成物として
各1モルずつのホルムアルデヒドとコへり酸、および2
モルのギ酸が生成された。
3モル相当の過ヨウ素酸が消費され、反応生成物として
各1モルずつのホルムアルデヒドとコへり酸、および2
モルのギ酸が生成された。
このようにして得られた化合物(I)は、前記したとお
り、細菌感染症の治療剤として用いることのできる抗生
物質中に含まれる種々のデオキシ糖類(例:ペロサミン
、ガロサミン、ロンノース。
り、細菌感染症の治療剤として用いることのできる抗生
物質中に含まれる種々のデオキシ糖類(例:ペロサミン
、ガロサミン、ロンノース。
フオロサミンなど)の誘導体を製造するための原料化合
物として有用である。
物として有用である。
実施例 ・
次に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例1゜
バチルス・ズブチリスfFOI3719をペナッ七イー
プロス(Penassay broth ) 培地(
ディフコラボラトリ−社製、米国)20−に接種し、2
00−三角フラスコ中で37℃、16時間培養した。得
られた培養物の全量を、同組成から成る培地11に移植
し、これを5本の11三角フラスコ中で37℃、8時間
培養した。得られた培養液より菌体を遠心分離して集め
、0.1mMEDTA、0.1mM塩化マグネシウム、
1.43mM2−メルカプトエタノール、2μMチアミ
ンピロリン酸を含有する0、°1Mリン酸カリウム緩衝
液(PH6,0)を用いて洗浄後、同緩衝液に懸濁した
。上記懸濁液をリゾチーム(シグマ社製、米国)を50
0μg/−に、デオキシリボヌクレアーゼI(シグマ社
製、米国)を5μダ/−になるようそれぞれ添加して3
7℃で30分保温して菌体を溶かした。これを遠心分離
して上清液を得た。
プロス(Penassay broth ) 培地(
ディフコラボラトリ−社製、米国)20−に接種し、2
00−三角フラスコ中で37℃、16時間培養した。得
られた培養物の全量を、同組成から成る培地11に移植
し、これを5本の11三角フラスコ中で37℃、8時間
培養した。得られた培養液より菌体を遠心分離して集め
、0.1mMEDTA、0.1mM塩化マグネシウム、
1.43mM2−メルカプトエタノール、2μMチアミ
ンピロリン酸を含有する0、°1Mリン酸カリウム緩衝
液(PH6,0)を用いて洗浄後、同緩衝液に懸濁した
。上記懸濁液をリゾチーム(シグマ社製、米国)を50
0μg/−に、デオキシリボヌクレアーゼI(シグマ社
製、米国)を5μダ/−になるようそれぞれ添加して3
7℃で30分保温して菌体を溶かした。これを遠心分離
して上清液を得た。
2−ケトグルタル酸100mM、グリコールアルデヒド
100mM、塩化マグネシウム5 m M 。
100mM、塩化マグネシウム5 m M 。
チアミンピロリン酸0.5mM、EDTA2mMを含有
する0、04M)リス−塩酸緩衝液(pH8,0)90
−に上記上清液10−(蛋白量219η)を加え、37
℃、16時間静置して反応させた。
する0、04M)リス−塩酸緩衝液(pH8,0)90
−に上記上清液10−(蛋白量219η)を加え、37
℃、16時間静置して反応させた。
反応終了後、200−のエタノールを加え、遠心分離し
て沈澱物を除いた上清液を1O1nlに濃縮した。この
濃縮液に20.+7のメタノールを加え、遠心分離して
沈澱物を除いた上清液をシロップ状にまで濃縮した。次
いでメタノールを加えて抽出し、不溶性物質を遠心分離
して除いた上清液を濃縮することにより得られたシロッ
プを、陰イオン交換樹脂Dowex 1 (ギ酸型)
のカラムに注入した。
て沈澱物を除いた上清液を1O1nlに濃縮した。この
濃縮液に20.+7のメタノールを加え、遠心分離して
沈澱物を除いた上清液をシロップ状にまで濃縮した。次
いでメタノールを加えて抽出し、不溶性物質を遠心分離
して除いた上清液を濃縮することにより得られたシロッ
プを、陰イオン交換樹脂Dowex 1 (ギ酸型)
のカラムに注入した。
カラムを水洗後、1Mギ酸で溶出し、このギ酸溶出画分
を濃縮後、残渣にア七トンを加えて不溶性物質を遠心分
離して除き、得られた上清液を濃縮することによって、
2.3−ジデオキシ−4−へキスロン酸の結晶195■
を得た。
を濃縮後、残渣にア七トンを加えて不溶性物質を遠心分
離して除き、得られた上清液を濃縮することによって、
2.3−ジデオキシ−4−へキスロン酸の結晶195■
を得た。
実施例2゜
エシェリヒア・コリIFO3301を実施例1と同様の
方法で培養を行い、得られた菌体を溶解し、遠心分離し
て上清液を得た。
方法で培養を行い、得られた菌体を溶解し、遠心分離し
て上清液を得た。
2−ケトグルタル11100mM、D−グリセルアルデ
ヒド100mM、塩化マグネシウム5mM、チアミンピ
ロリン’610.5 mM 、 EDTA 2 mM
を含有する0、04M)リス−塩酸緩衝液(pH8,0
)90−に上記上清液10−(蛋白量180■)を加え
、37℃616時間静冒して反応させた。
ヒド100mM、塩化マグネシウム5mM、チアミンピ
ロリン’610.5 mM 、 EDTA 2 mM
を含有する0、04M)リス−塩酸緩衝液(pH8,0
)90−に上記上清液10−(蛋白量180■)を加え
、37℃616時間静冒して反応させた。
反応終了後、実施例1と同様の方法によりエタノール処
理、メタ/−ル処理および陰イオン交換樹脂Dowex
1 (ギ酸型)のカラムにより精製を行って、シロ
ップ状の2.3−ジデオキシ−4−ヘプツロン酸220
■を得た。
理、メタ/−ル処理および陰イオン交換樹脂Dowex
1 (ギ酸型)のカラムにより精製を行って、シロ
ップ状の2.3−ジデオキシ−4−ヘプツロン酸220
■を得た。
実施例3゜
エンテロバクタ−〇アエロゲネス IFO]2010を
肉汁(ブイヨン)2.0%、酵母エキス0.1%(pH
7,0)から成る培地20−に接種し、37℃、24時
間培養した。得られた培養物の全量を同組成の培地11
に移植して37℃で24時間振盪した。培養液を遠心分
離して、得られた菌体を凍結乾燥することにより乾燥菌
体o、ssgを得た。
肉汁(ブイヨン)2.0%、酵母エキス0.1%(pH
7,0)から成る培地20−に接種し、37℃、24時
間培養した。得られた培養物の全量を同組成の培地11
に移植して37℃で24時間振盪した。培養液を遠心分
離して、得られた菌体を凍結乾燥することにより乾燥菌
体o、ssgを得た。
実施例1と同様の組成から成る反応液100+dに上記
乾燥菌体0.5Fを加え、37℃で24時間振盪して反
応させたところ、120■の2.3−ジデオキシ−4−
へキスロン酸が生成された。
乾燥菌体0.5Fを加え、37℃で24時間振盪して反
応させたところ、120■の2.3−ジデオキシ−4−
へキスロン酸が生成された。
実施例4゜
実施例2.の基質溶液においてD−グリセルアルデヒド
の代わりにL−グリセルアルデヒドを用いる他は同様の
組成の基質溶液90−に、実施例1゜で得られたバチル
ス−ズブチリス IFO13719の上清液を1〇−加
え、37℃で16時間反応させた。得られた反応液から
実施例1と同様の方法で精製を行うことにより、シロッ
プ状の2゜3−ジデオキシ−4−ヘブッロン酸95■が
得られた。
の代わりにL−グリセルアルデヒドを用いる他は同様の
組成の基質溶液90−に、実施例1゜で得られたバチル
ス−ズブチリス IFO13719の上清液を1〇−加
え、37℃で16時間反応させた。得られた反応液から
実施例1と同様の方法で精製を行うことにより、シロッ
プ状の2゜3−ジデオキシ−4−ヘブッロン酸95■が
得られた。
実施例5゜
実施例2.の基質溶液においてD−グリセルアルデヒド
の代わりにDL−グリセルアルデヒドを用いる他は同様
の組成の基質溶液90rnlに、実施例2、で得られた
エシェリヒア・コリ IFO3301の上清液10..
L/を加え、37℃で16時間反応させることにより、
80■の2.3−ジデオキシ−4−ヘプツロン酸が生成
された。
の代わりにDL−グリセルアルデヒドを用いる他は同様
の組成の基質溶液90rnlに、実施例2、で得られた
エシェリヒア・コリ IFO3301の上清液10..
L/を加え、37℃で16時間反応させることにより、
80■の2.3−ジデオキシ−4−ヘプツロン酸が生成
された。
実施例6゜
牛心臓100gを細かくきざみ、実施例1と同様の組成
の緩衝液20.nlに懸濁した。この懸濁液をセルホモ
ジナイザーで冷却しながら10分間処理し、これを遠心
分離して上清液を得た。この上清液に対して0.12容
量の35%ポリエチレングリフールを加えて攪拌後、遠
心分離して沈澱部を上記の緩衝液20−に溶かした。こ
の溶液をセファロースCI、−2Bカラム(3X80c
m)にのせ、クロマトグラフィーを行って精製酵素液2
5rnlを得た0 2−ケトグルタル酸、グリフールアルデヒドおよびその
他を含む実施例1と同様の組成の反応液90−に上記精
製酵素液10m/を加え、37℃で24時間反応させた
ところ、85■の2.3−ジデオキシ−4−へキスロン
酸が生成した。
の緩衝液20.nlに懸濁した。この懸濁液をセルホモ
ジナイザーで冷却しながら10分間処理し、これを遠心
分離して上清液を得た。この上清液に対して0.12容
量の35%ポリエチレングリフールを加えて攪拌後、遠
心分離して沈澱部を上記の緩衝液20−に溶かした。こ
の溶液をセファロースCI、−2Bカラム(3X80c
m)にのせ、クロマトグラフィーを行って精製酵素液2
5rnlを得た0 2−ケトグルタル酸、グリフールアルデヒドおよびその
他を含む実施例1と同様の組成の反応液90−に上記精
製酵素液10m/を加え、37℃で24時間反応させた
ところ、85■の2.3−ジデオキシ−4−へキスロン
酸が生成した。
実施例7゜
ホウレン草の葉100gを実施例6と同様の方法で処理
し、精製酵素液10−を得た。
し、精製酵素液10−を得た。
2−ケトグルタル酸、D−グリセルアルデヒドその他を
含む実施例2と同様の組成の反応液45−に上記精製酵
素液5−を加えて37℃、24時間反応させたところ、
35■の2.3−ジデオキシ−4−ヘプツロン酸が生成
された。
含む実施例2と同様の組成の反応液45−に上記精製酵
素液5−を加えて37℃、24時間反応させたところ、
35■の2.3−ジデオキシ−4−ヘプツロン酸が生成
された。
発明の効果
本発明方法によれば、式[II)で示される2−ケトグ
ルタル酸と式(II)で表わされるアルデヒド類とを酵
素を用いて一段階の反応で式[1]で表わされる2、3
−ジデオキシ−4−ケトアルドン酸類に変換することが
できる。このように、本発明方法によると目的化合物を
、反応工程数の少ない反応で製造することができるので
、工業的に大量に生産する際に有利である。
ルタル酸と式(II)で表わされるアルデヒド類とを酵
素を用いて一段階の反応で式[1]で表わされる2、3
−ジデオキシ−4−ケトアルドン酸類に変換することが
できる。このように、本発明方法によると目的化合物を
、反応工程数の少ない反応で製造することができるので
、工業的に大量に生産する際に有利である。
特許出願人 財団法人 発酵研究所
、・、予\
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる2−ケトグルタル酸と一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、nは0または1を示す。〕で表わされるアルデ
ヒド類との混合物に2−ケトグルタル酸脱水素酵素また
はその含有物を作用させることを特徴とする一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、nは前記と同意義を有する。〕で表わされる2
,3−ジデオキシ−4−ケトアルドン酸類の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9743185A JPS61257190A (ja) | 1985-05-08 | 1985-05-08 | 2,3−ジデオキシ−4−ケトアルドン酸類の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9743185A JPS61257190A (ja) | 1985-05-08 | 1985-05-08 | 2,3−ジデオキシ−4−ケトアルドン酸類の製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61257190A true JPS61257190A (ja) | 1986-11-14 |
Family
ID=14192203
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9743185A Pending JPS61257190A (ja) | 1985-05-08 | 1985-05-08 | 2,3−ジデオキシ−4−ケトアルドン酸類の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61257190A (ja) |
-
1985
- 1985-05-08 JP JP9743185A patent/JPS61257190A/ja active Pending
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