SK14322001A3 - Miestne špecificky izotopovo značené proteíny, aminokyseliny a ich biochemické prekurzory - Google Patents

Miestne špecificky izotopovo značené proteíny, aminokyseliny a ich biochemické prekurzory Download PDF

Info

Publication number
SK14322001A3
SK14322001A3 SK1432-2001A SK14322001A SK14322001A3 SK 14322001 A3 SK14322001 A3 SK 14322001A3 SK 14322001 A SK14322001 A SK 14322001A SK 14322001 A3 SK14322001 A3 SK 14322001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
methyl
amino
compound
formula
protein
Prior art date
Application number
SK1432-2001A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen W. Fesik
David J. Augeri
Original Assignee
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Publication of SK14322001A3 publication Critical patent/SK14322001A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B59/00—Introduction of isotopes of elements into organic compounds ; Labelled organic compounds per se
    • C07B59/001—Acyclic or carbocyclic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/08—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to hydrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1075—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of amino acids or peptide residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/13—Labelling of peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/05—Isotopically modified compounds, e.g. labelled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07—Optical isomers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Miestne-špecificky izotopovo označené proteíny, aminokyseliny a ich biochemické prekurzory
Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka miestne špecifických organických zlúčenín označených izotopmi a spôsobov ich prípravy. Presnejšie sa predkladaný vynález týka miestne špecifických izotopmi označených biochemických prekurzorov leucínu, izoleucínu a valínu, aminokyselín označených izotopmi ako takých, proteinov, proteínových fragmentov alebo polypeptidov vyrobených z takýchto aminokyselín, a spôsobov prípravy.
Doterajší stav techniky
Novo vyvinuté techniky na objavovanie nových liekov viedli k použitiu nukleárnej magnetickej rezonančnej (NMR) spektroskopie na objavovanie zlúčenín, ktoré sa viažu na určitú cieľovú molekulu, ako je proteín (viď napríklad US patenty č. 5698401 a 5804390, Fesik a kol.). Technika vyžaduje určenie prvého dvojrozmerného 15N/*H NMR korelačného spektra proteínu, v ktorom boli atómy dusíka izotopovo obohatené o 1SN. Toto prvé korelačné spektrum sa získa pre proteín v neprítomnosti akéhokoľvek potenciálneho ligandu. Potom sa predpokladaný ligand, alebo zmes takýchto domnelých ligandov, zmieša s proteínom obohateným o izotopy a získa sa druhé NMR korelačné spektrum. Tieto dve spektrá sa porovnajú a rozdiely medzi týmito dvoma spektrami poskytnú informáciu o: (1) existencii väzby medzi akýmkoľvek ligandom a proteínom, (2) mieste väzby, a (3) sile väzby.
Technika opísaná vo Fesik a kol., vyššie, využíva cieľové molekuly, ktoré boli izotopovo obohatené o ,SN spinové jadro detegovateľné NMR. Táto metóda spočíva v genetickej modifikácii vhodného mikroorganizmu tak, aby exprimoval požadovaný proteín, fragment proteínu alebo polypeptid, potom sa modifikovaný mikroorganizmus kultivuje v živnom médiu obsahujúcom asimi·· • · · • · ·· ·· • · · • ·· • · ···· ·· ··· ··· ·· lovateľné zdroje uhlíka a dusík, ktoré obsahuje živiny označené 1SN. Lacné komerčne dostupné 1SN amónne soli sú zdrojom 1SN.
Avšak, použitie tejto NMR techniky na objavovanie liekov na cieľové molekuly izotopovo označené 13C má dve nevýhody. Po prvé, je dosť nákladné produkovať cieľové molekuly obohatené o ,3C v akýchkoľvek použiteľných množstvách. Napríklad produkcia proteínov geneticky modifikovanými organizmami v živnom médiu obsahujúcom komerčne dostupnú uniformné označenú glukózu (glukóza-13Cô) je nákladná. V čase podania tejto prihlášky bola cena glukózy-13Ce približne 480 $/g. Alternatívne, produkcia 13C-označených proteínov pri použití 13C-označených aminokyselín v živnom médiu je podobne nákladná. Po druhé, biomolekuly produkované s použitím glukózy-13Ce alebo komerčne dostupných uniformné C-označených aminokyselín nie sú ideálne vhodné pre techniku NMR korelačných spektier. Biomolekuly exprimované mikroorganizmami kultivovanými v živnom médiu obsahujúcom uniformné Neoznačené východiskové materiály obsahujú susediace 13C-označené atómy uhlíka. Pretože NMR technika využíva detekciu kaplingu špinu v priestore (tj. jadrový Overhauserov efekt), interferuje relatívne silný spin-spin kapling susedných ,3C jadier s požadovaným pozorovaním. Preto existuje potreba vývoja miestne špecificky 13C označených aminokyselín, proteínov a polypeptidov.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález poskytuje biochemické prekurzory miestne špecificky izotopovo označených aminokyselín leucínu, izoleucínu a valínu, rovnako ako miestne špecificky izotopovo označené aminokyseliny ako také. Ďalej vynález poskytuje proteíny, proteínové fragmenty a polypeptidy obsahujúce miestne špecificky izotopovo označené aminokyselinové zvyšky odvodené od týchto aminokyselín a spôsoby na ich prípravu. Aminokyseliny a prekurzory biosyntézy aminokyselín sú izotopovo označené buď 13C alebo ,4C na atómoch uhlíka metylových skupín vzdialených od ich karboxylových skupín. V označených aminokyselinách podľa predkladaného vynálezu sú označené nesusediace atómy uhlíka. V prípade, že značkovacím činidlom je C, sú aminokyseliny • · « • ·· ···· ·· podľa predkladaného vynálezu ideálne vhodné pre NMR techniku na vyhľadávanie liekov, pretože nedochádza k interferencii s požadovanými signálmi spôsobenej ,3C-,3C spin-spin interakciami. Ďalej, pretože sú aminokyseliny označené len na metylových skupinách, poskytujú tri magneticky ekvivalentné atómy vodíka metylovej skupiny silné NMR signály na pozorovanie akýchkoľvek efektov kaplingu s 13C atómami, na ktoré sú naviazané.
Konkrétne, predkladaný vynález poskytuje zlúčeniny vzorca 1
H
R2\ ί___COOH alebo ich soli, kde R1 znamená kyslík alebo NH2, a R2 je vybrané zo skupiny zahrnujúcej:
Vo vzorcoch uvedených vyššie R3 znamená vodík alebo nCH3, čiarkovaná väzba predstavuje valenčné väzby m je 0 alebo 1, n je vždy 13 alebo 14, s podmienkou, že: (a) keď R1 znamená NH2, tak je druhá valenčná väzba znázornená čiarkovanou väzbou k R1 neprítomná a vodík naviazaný čiarkovanou väzbou je prítomný; (b) keď R1 znamená kyslík, tak je druhá valenčná väzba znázornená čiarkovanou väzbou k R1 prítomná a vodík naviazaný čiarkovanou ·· ·· » · · • ··
B··· ·· väzbou je neprítomný; (c) keď R1 znamená kyslík, tak R2 znamená B a m znamená 0; a (d) keď R1 znamená NH2, tak R3 znamená vodík alebo CH3.
Predkladaný vynález poskytuje miestne špecificky 13C a 14C označené aminokyseliny izoleucín (vzorec I, kde R1 znamená amino, R2 znamená A); leucín (vzorec 1, kde R1 znamená amino, R2 znamená B, R3 znamená CH3 a m je 1); a valín (vzorec I, kde R znamená amino, R znamená B, R znamená CH3 a m je 0), a miestne špecificky 13C a ,4C označené biochemické prekurzory týchto aminokyselín, kyselinu 2-keto-4-(C)-maslovú (vzorec I, kde R1 znamená kyslík, R2 znamená B, R3 znamená H a m je 0) a kyselinu 2-keto-3-(nCmetyl)-4-(nC)-maslovú (vzorec I, kde R1 znamená kyslík, R2 znamená B, R3 znamená CH3 a m je 0). V uvedenom opise znamená n buď 13 (t.j. zlúčeniny označené C), alebo 14 (t.j. zlúčeniny označené C).
Vynález ďalej poskytuje proteíny, proteínové fragmenty a polypeptidy obsahujúce aminokyselinové zvyšky odvodené od aminokyselín vybraných zo skupiny zahrnujúcej: kyselinu L-2-amino-3-metyl-5-(I3C)-pentánovú; kyselinu L-2-amino-3-metyl-5-(I4C)-pentánovú; kyselinu L-2-amino-4-(,3C)-metyl-5(,3C)-pentánovú; kyselinu L-2-amino-4-(14C)-metyl-5-(,4C)-pentánovú; kyselinu L-2-amino-3-(13C)-metyl-5-(13C)-butánovú; a kyselinu L-2-amino-4-(14C)metyl-5-(14C)-butánovú.
Predkladaný vynález tiež poskytuje chemické spôsoby prípravy miestne špecificky *3C a 14C označených biochemických prekurzorových kyselín, kyseliny 2-keto-4-(C)-maslovej a kyseliny 3-(nC-metyl)-4-(nC)-maslovej, alebo ich solí, ktoré zahrnujú reakciu zlúčeniny vzorca IV
O xv ŕsrfrbutyl ·· ·· · · ·· • · · · · ·· · · · • ·· · · · · ···· · ···· • · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· · ŕerc-butyl s izotopovo označeným metyljodidom (H3nCI) za zisku zlúčeniny vzorca V
odstránenie chrániacej íerc-butylesterovej a dimetylhydrazínovej skupiny zlúčeniny vzorca V za zisku kyseliny 2-keto-4-(nC)-maslovej; alebo reakciu zlúčeniny vzorca V s izotopovo označeným metyljodidom (H3nCI), kde n je 13 alebo 14, za zisku zlúčeniny vzorca VI
VI;
odstránenie chrániacich íerc-butylesterových a dimetylhydrazínových skupín za zisku kyseliny 2-keto-3-(C-metyl)-4-(nC)-maslovej; a voliteľne prípravu solí uvedených zlúčenín.
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsoby prípravy miestne špecificky 13C a 14C označených aminokyselín leucínu, izoleucínu a valínu. Spôsob zahrnuje genetickú modifikáciu vhodného mikroorganizmu tak, aby exprimoval polypeptid obsahujúci aminokyselinu vybranú z leucínu, izoleucínu, valínu a ich zmesi; kultiváciu modifikovaného mikroorganizmu v živnom médiu obsahujúcom asimilovateľné zdroje uhlíka a dusíka, ktoré obsahuje kyselinu 2-keto·· ·· • · · · • ·· • · · ···· ·· ··· ··· ·· ·
4-(nC)-maslovú a kyselinu 2-keto-3-(nC-metyl)-4-(nC)-maslovú, alebo ich soli a zmesi; izoláciu exprimovaného polypeptidu; a fragmentáciu polypeptidu a izoláciu jednotlivých aminokyselín. Exprimovaný polypeptid je fragmentovaný bežnými metódami známymi v odbore vrátane hydrolýzy alebo enzymatického štiepenia.
Výťažok konkrétnej aminokyseliny môže byť maximalizovaný a náklady môžu byť minimalizované modifikáciou hostiteľského mikroorganizmu tak, aby exprimoval homopolymér aminokyseliny, a použitím vhodného izotopovo označeného prekurzoru biosyntézy v živnom médiu.
Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsob prípravy proteínu, proteínového fragmentu alebo polypeptidu obsahujúceho aminokyselinové zvyšky odvodené od aminokyselín vybraných zo skupiny zahrnujúcej kyselinu L-2amino-3-metyl-5-(13C)-pentánovú; kyselinu L-2-amino-3-metyl-5-(14C)pentánovú; kyselinu L-2-amino-4-(,3C)-metyl-5-(13C)-pentánovú; kyselinu L-2amino-4-(14C)-metyl-5-(14C)-pentánovú; kyselinu L-2-amino-3-(13C)-metyl-5(13C)-butánovú; a kyselinu L-2-amino-4-(14C)-metyl-5-(14C)-butánovú, ktorý zahrnuje genetickú modifikáciu vhodného mikroorganizmu tak, aby exprimoval vopred vybraný proteín, proteínový fragment alebo polypeptid; kultiváciu modifikovaného mikroorganizmu v živnom médiu obsahujúcom asimilovateľné zdroje uhlíka a dusíka, ktoré obsahuje kyselinu 2-keto-4-(C)-masIovú a kyselinu 2-keto-3-(nC-metyl)-4-(C)-maslovú alebo ich soli a zmesi; a izoláciu exprimovaného polypeptidu.
Podrobný opis vynálezu
Percentuálny výskyt izotopu 13C v prírode je 1,1 % a výskyt ,4C je zanedbateľné nízky. Preto je pravdepodobnosť, že akýkoľvek atóm uhlíka v organickej molekule je I3C rovná približne 0,0111 a pravdepodobnosť, že daný atóm je 14C, je úplne nízka. Keď sú cieľové proteíny pripravené na použitie v adaptovanom NMR vyhľadávanie liekov, ako je opísané vo Fesik a kol., vyššie, tak je žiaduce, aby bol ,3C NMR signál zosilnený zvýšením prirodzeného obsahu 13C v cieľovej študovanej molekule. Toto sa vykoná uniformným alebo ·· • ·
Ί ·· ·· • · · • ·· • · • · ···· ·· • ·· ·· · · · • · · • · · · · • · 9 9
999 999 99 9 selektívnym označením cieľovej molekuly l3C. Termíny uniformné obohatenie, uniformné obohatený, uniformné označenie a uniformné označený, ako sú použité v opise a v pripojených patentových nárokoch, označujú zvýšenie hodnoty pravdepodobnosti toho, že náhodne vybraný atóm v cieľovej molekule bude C, nie viac než 0,0111. Termíny špecifické obohatenie, špecificky obohatený, špecifické označenie a špecificky označený označujú zvýšenie hodnoty pravdepodobnosti toho, že atóm v určitom mieste cieľovej molekuly bude 13C, nie viac než 0,0111.
Napríklad biomolekuly exprimované geneticky modifikovanými mikroorganizmami kultivovanými v živnom médiu obsahujúcom uniformné 13Coznačenú glukózu budú uniformné označené ,3C. Proteíny exprimované geneticky modifikovanými organizmami kultivovanými v živnom médiu obsahujúcom aminokyselinu, ktorá je 13C-označená len na metylovom vedľajšom reťazci, budú označené 13C len na alanylových zvyškoch obsiahnutých v exprimovanom proteíne. Podobne proteíny exprimované spôsobom podľa predkladaného vynálezu budú miestne špecificky označené 13C alebo 14C na vedľajšom reťazci koncových metylových skupín leucínu, izoleucínu a valínu.
Spôsob podľa predkladaného vynálezu tiež umožňuje prípravu miestne špecificky označeného leucínu, izoleucínu a valínu, proteínov, proteínových fragmentov alebo polypeptidov vyrobených z týchto označených aminokyselín, a prekurzorov biosyntézy aminokyselín, ktoré sú označené ,3C alebo ,4C. Takéto zlúčeniny sú užitočné napríklad v štúdiách metabolizmu proteínov, pri ktorých je žiaduce sledovať priebeh a výsledok degradácie proteínu pomocou rádiometrických metód.
Ďalšie termíny použité v tejto prihláške a pripojených patentových nárokoch majú obvyklé významy. Nasledujúce termíny majú uvedené významy:
DTT - ditiotreitol
HEPES - kyselina N-2-hydroxyetylpiperazín-N’-2-etylsulfónová
IPTG - izopropyl-p-D-tiogalaktopyranozid ·· ·· ·· • ·· · · a · • · · · · ···· • · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ·
PMSF - α-toluénsulfonylfluorid
SCD - katalytická doména (zvyšky 81-256) stromelyzínu
Príprava niektorých miestne špecificky C-označených proteínových fragmentov je opísaná ďalej. Konkrétny príklad ukazuje prípravu takzvanej katalytickej domény ľudského stromelyzínu (SCD), označenej miestne špecificky 13C-označeným leucínom, valínom a izoleucínom. Aj keď je spôsob uvedený s použitím 13C-označených prekurzorov aminokyselín, je možné ho použiť s použitím 14C-označených prekurzorov aminokyselín. Výhodný spôsob prípravy adekvátnych množstiev špecificky cieľových molekúl obsahujúcich C-označený polypeptid zahrnuje transformáciu hostiteľskej bunky expresným vektorom obsahujúcim polynukleotid kódujúci požadovaný polypeptid. Proteín, polypeptid alebo fragment proteínu je exprimovaný kultiváciou transformovanej bunkovej línie v médiu obsahujúcom asimilovateľné zdroje uhlíka a dusíka dobre známe v odbore a C-označené biochemické prekurzory podľa predkladaného vynálezu. Na miestne špecifické označenie proteínu alebo fragmentu proteínu podľa predkladaného vynálezu zahrnujú asimilovateľné zdroje pre C označenie cieľového polypeptidu C-označené biosyntetické prekurzory aminokyselín.
Napríklad je známe, že α-keto-butyrát je biosyntetickým prekurzorom izoleucínu, a že α-keto-izovalerát je biosyntetickým prekurzorom ako valínu, tak leucínu. Schéma I uvedená ďalej ukazuje, ako môžu byť syntetizované Coznačené biosyntetické prekurzory leucínu, izoleucínu a valínu. Schéma využíva lacný C-označený metyljodid, H3nCI, ako zdroj pre izotopové označenie pri produkcii C-koncovo označenej kyseliny α-keto-maslovej a a-ketoizovalérovej.
Použitie uniformné C-označených živín, ako je glukóza Ce, bolo bežným spôsobom na označenie cieľových zlúčenín l3C; avšak, tento spôsob je veľmi nákladný. Ďalej, väčšina uhlíkov v uniformné 13C označených cieľových zlúčeninách je kovalentne viazaná na susedný atóm, ktorý je tiež označený I3C, za vzniku väzby I3C-13C, ktorá negatívne ovplyvňuje ako pomer signál/šum, tak relaxáciu 13C-označených miest v cieľových biomolekulách. Alternatívne môže ·· • · · • · • · • · • · živné médium obsahovať komerčne dostupné uniformné ,3C označené aminokyseliny. Aj keď táto technika redukuje riedenie označenia, je nákladná a zrejme má tiež nevýhodu v 13C-,3C spin-spin interakciách susedných atómov uhlíka.
·· ·· • · · • ·· • · • · ···· ·· ·· ·
Avšak, spôsob podľa predkladaného vynálezu na C-označenie polypeptidovej cieľovej molekuly zahrnuje kultiváciu geneticky modifikovanej bunkovej línie v živnom médiu obsahujúcom C-označené biosyntetické prekurzory jednotlivých aminokyselín. Nie len, že sa jedná o určité aminokyseliny, ktoré sú izotopovo označené vo výslednom proteíne, proteínovom fragmente alebo polypeptide, ale tieto aminokyseliny sú tiež miestne špecificky označené.
V jednom uskutočnení predkladaného vynálezu sú výhodnými označenými prekurzormi aminokyselín kyselina α-keto-maslová a a-keto-izovalérová. Produkty biosyntézy z týchto prekurzorov sú leucín, izoleucín a valín, v ktorých sú metylové skupiny vedľajších reťazcov označené C. Pretože každá metylová skupina obsahuje tri atómy vodíka naviazané na nC atóm uhlíka, sú teda, keď n je 13, príslušné NMR signály dosť silné a odlíšiteľné.
Syntéza označenej kyseliny α-keto-maslovej a α-keto-izovalérovej zahrnuje C-metyláciu terminálneho atómu uhlíka v kyseline pyrohroznovej pomocou C-označeného metyljodidu. Obvykle je alkylácia α-keto kyselín, ako je kyselina pyrohroznová, dosť problematická a je sprevádzaná rozkladom enolového medziproduktu s tvorbou mnohých vedľajších produktov. Avšak, Spencer a kol., Tetrahedron Letters, 1975, 3889, a Williams a kol., v tom istom, 1990, 5881, dokázali, že alkylácia príslušného oximenolátu môže byť uskutočnená, aj keď bola alkylácia s primárnymi elektrofilnými činidlami (ako je napríklad metyljodid) problematická. D. Enders a kol., Angew. Chem. Int. Eng. Ed. 1992, 618, a D. Ebders a kol., Synlett, 1992, 901, dokázali, že alkylácia N,Ndimetylhydrazónu pyruvátu je možná, ale výslovne uviedli, že je treba zabrániť acylácii 2,6-dialkylfenylesteru. Reprezentatívnymi zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu sú nasledujúce zlúčeniny:
kyselina 2-keto-4-(,3C)-maslová alebo jej soľ;
·· • · • ·· • · ·· • ·· • • ·· • ·· • · · • ·
• • · • • • ·
···· ·· ··· ··· ·· ·
kyselina 2-keto-4-(,4C)-maslová alebo jej soľ;
kyselina 2-keto-3-(13C-metyl)-4-(13C)-maslová alebo jej soľ;
kyselina 2-keto-3-(14C-metyl)-4-(14C)-maslová alebo jej soľ;
kyselina L-2-amino-3-metyl-5-(I3C)-pentánová alebo jej soľ;
kyselina L-2-amino-3-metyl-5-(14C)-pentánová alebo jej soľ;
kyselina L-2-amino-4-(I3C-metyl)-5-(,3C)-pentánová alebo jej soľ;
kyselina L-2-amino-4-(,4C-metyl)-5-(14C)-pentánová alebo jej soľ;
kyselina L-2-amino-3-(13C-metyl)-5-(13C)-butánová alebo jej soľ; a kyselina L-2-amino-4-(14C-metyl)-5-(14C)-butánová alebo jej soľ.
Predkladaný vynález ďalej zahrnuje proteíny, proteínové fragmenty alebo polypeptidy obsahujúce miestne špecificky označené aminokyseliny, kyselinu L-2-amino-3-metyl-5-(I3C)-pentánovú; kyselinu L-2-amino-3-metyl-5-(14C)pentánovú; kyselinu L-2-amino-4-(13C-metyl)-5-(13C)-pentánovú; kyselinu L-2amino-4-(I4C-metyl)-5-(I4C)-pentánovú; kyselinu L-2-amino-3-(13C-metyl)-5(13C)-butánovú a kyselinu L-2-amino-4-(l4C-metyl)-5-(14C)-butánovú.
Je treba si uvedomiť, že aj keď boli špecifické zlúčeniny uvedené vyššie pripravené tak, že obsahujú 13C- alebo 14C-izotopy v špecifických miestach zlúčeniny, nemusia byť atómy uhlíka v týchto miestach všetky označené 13C alebo ,4C. Stupeň izotopového označenia alebo obohatenia v každom mieste molekuly závisí na príslušnom stupni označenia východiskových materiálov použitých v syntéze.
·· • · • ·· • · ·· • ·· • • ·· • ··
• • • · •
• • · • • • •
···· ·· ··· ··· ·· ·
Schéma I: Chemická syntéza označených prekurzorov
Ν,Ν-Dimetylhydrazín
Cyklohexán, teplo
COOH ch3
PCH·, O CH33
1. (voliteľne) LiBr LDA
2. H3CI, THF. -78°C
1. INaqHCI/THF alebo Et2O
2. HCl plyn/CHjClj
. CHa
Ha-C'V00™
O
• · ·· ·· · · ·· • · · · ·· ·· · • ·· · · · · ···· · · · · · • · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· «
V schéme I sa ferc-butyl-pyruvat 1 premení na príslušný N,Ndimetylhydrazón 2 reakciou s Ν,Ν-dimetylhydrazínom v dietylétery pri teplote okolia. Získaný hydrazón 2 sa ochladí v roztoku tetrahydrofuránu na -78 °C a spracuje sa bromidom lítnym a potom lítium-diizopropylamidom, za zisku azaalyl-enolátového medziproduktu. Enolát sa alkyluje C-označeným metyljodidom za zisku hydrazónu 3. Druhá alkylácia zlúčeniny 3 vedie k zisku označeného dimetylovaného hydrazónu 4. Reakcia 3 a 4 najprv s IN vodným roztokom HCl v tetrahydrofuráne alebo dietylétery (na odstránenie hydrazónu) a potom s plynným chlorovodíkom v metylénchloride (na odstránenie Zerc-butylesteru) vedie k zisku príslušných C-koncovo označených a-ketokyselín 5 a 6. Schémy II, III, resp. IV ilustrujú, ako sú tieto α-keto kyseliny biosynteticky premenené na C-leucín, izoleucín a valín. Vo všetkých schémach je miesto izotopového označenia označené hviezdičkou.
• 9 • · ·
Schéma II: Biochemická syntéza označeného izoleucínu h3 • v ·· • · · · · • ·· • · · · ···· ·· ·
O CH,
COOH Acctolaktátsyn^za Η3·0^ψ'
Pyruvát CO2
1. Dihydroxy acid Dehydratáza
2- Reduktáza
CHa
Rozvetvený-reťazec Acid transamináza
L-Glutamát 2-Oxoglutamát • ·· ···
COOH
OH
Ketol-Acid
Reduktoizomeráza
OH,
CHa
NADH
NAD*
COOH
Izoleucin
Schéma III: Biochemická syntéza označeného leucínu ·· ·· • · · · • ·· • · · ···· ··
Leucín
Transamináza
L-Glutamat
2-Oxo-glutamat
Ha C
H2N COOH lá,
Leucm ·· ·· · • · · · ·· · • ·· · • · · · · • · · · ···· ·· ··· · ··
Schéma IV: Biochemická syntéza valínu
Valin-Pyruvát
Transamináza
TV
L-Alanm Pyruvát
L-Valín
Prostriedky na prípravu expresných vektorov, ktoré obsahujú polynukleotidové sekvencie kódujúce špecifické polypeptidy, a na transformovanie hostiteľských buniek týmito vektormi, sú dobre známe v odbore. (Viď napr. R.W. Old a kol., Techniques of Gene Manipulation, Blackwell Science, London, 1994, a podobné práce). Podobne, spôsoby na kultiváciu transformovaných buniek tak, aby exprimovali kódovaný polypeptid, a na izoláciu, prečistenie a zloženie polypeptidu, sú tiež dobre známe v odbore. Príklady uvedené ďalej opisujú produkciu 13C-označených vzoriek katalytického regiónu ľudského stromelyzínu (SCD, aminokyseliny 81-256) v modifikovanej E. coli.
·· e · • ·· • · ·· • ·· • • ·· • ·· • · • t • ·· •
• • · • • • · •
···· ·· ··· ··· ·· ···
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Príprava uniformné >3-označenej katalytickej domény ľudského stromelyzínu (SCD)
81-256 fragment (SEQ ID NO: 1) stromelyzínu (SCD) sa pripraví inzerciou plazmidu kódujúceho proteínový fragment do E. coli a kultiváciou geneticky modifikovaného bakteriálneho kmeňa vo vhodnom kultivačnom médiu. Proteínový fragment sa izoluje z kultivačného média, prečistí sa a potom sa použije v dvojrozmernej NMR analýze na určenie jeho afinity k testovaným zlúčeninám s použitím spôsobu podľa predkladaného vynálezu. Postupy prípravy sú opísané ďalej.
Fibroblasty ľudskej kože (ATCC č. CRL 1507) sa kultivujú a indukujú s použitím postupu opísaného v Clark a kol., Archív. Biochem. and Biophys. 241: 36 (1985). Celková RNA sa izoluje z 1 g buniek s použitím RNAgents® Total RNA Isolation System kitu (Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53711, USA) podľa návodu výrobcu. 1 gg RNA sa denaturuje zahrievaním pri 80 °C po dobu 5 minút a potom sa spracuje RT-PCR s použitím GenAmp® RNA PCR kitu (Applied Biosystems/Perkin-Elmer) podľa návodu výrobcu.
Nested PCR sa vykoná s použitím prvých primérov (a) GAAATGAAGAGTCTTCAA (SEQ ID č.: 2) a (b) GCGTCCCAGGTTCTGGAG (SEQ ID č.: 3) a tridsiatich cyklov pri 94 °C, 2 minúty; 45 °C, 2 minúty; a 72 °C, 3 minúty. Potom sa vykoná reamplifikácia s vnútornými primérmi (c) TACCATGGCCTATCCATTGGATGGAGC (SEQ ID č: 4) a (d) ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG (SEQ ID č: 5) s použitím tridsiatich cyklov za rovnakých podmienok ako vyššie, za zisku DNA sekvencie kódujúcej aminokyselinové zvyšky 1 - 256 ľudského stromelyzínu.
PCR fragment sa potom klonuje do PCR klonovacieho vektora pT7Blue® (Novagen, Inc.) podľa návodu výrobcu. Získaný plazmid sa trávi Ncol a BamHI ·· ·· · · ·· · • · · · ·· ·· · · ·· • ·· · · · · β • · · · · ···· · ··· · · · · 4 ···· ·· ··· ··· ·· ·· 17 a stromelyzínový fragment sa subklonuje do expresného vektora pET3d (Novagen, Inc.) podľa návodu výrobcu.
Hotový stromelyzínový expresný konštrukt kódujúci aminokyselinové zvyšky 81 - 256 plus iniciačný metionínový aminokyselinový zvyšok sa pripraví z 1 - 256 expresného konštruktu PCR amplifikáciou. Získaný PCR. fragment sa najprv klonuje do pT7Blue® vektora (Novagen, Inc.) a potom sa subklonuje do pET3d vektora (Novagen, Inc.), podľa návodu výrobcu spôsobom opísaným vyššie, za zisku plazmidu pETST-83-256. Tento konečný plazmid je identický s plazmidom opísaným v Qi-Zhuang a kol., Biochemistry 31: 11231 (1992) s tým rozdielom, že tento plazmid kóduje peptidovú sekvenciu začínajúcu o dve aminokyseliny skôr, konkrétne v pozícii 81, v sekvencii ľudského stromelyzínu. Plazmid pETST-83-256 sa transformuje do E. coli kmeňa BL21(DE3)/pLysS (Novagen, Inc.) podľa návodu výrobcu, za zisku expresného kmeňa BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-l.
Prekultivačné médium sa pripraví rozpustením 1,698 g NaH2PO4»7H2O, 0,45 g KH2PO4, 0,075 g NaCI, 0,150 g NH4C1, 0,3 g U-I3C-glukózy, 300 μΐ IM vodného roztoku MgSO4 a 15 ml vodného roztoku CaCÍ2 vo 150 ml deionizovanej vody. Získaný roztok prekultivačného média sa sterilizuje a prenesie sa do sterilnej 500 ml banky s prepážkou. Bezprostredne pred inokuláciou prekultivačného média bakteriálnym kmeňom sa do obsahu banky pridá 150 ml roztoku obsahujúceho 34 mg/ml chlóramfenikolu vo 100% etanolu a 1,5 ml roztoku obsahujúceho 20 mg/ml ampicilínu. Obsah banky sa potom naočkuje 1 ml glycerolového zásobného roztoku modifikovaného kmeňa E. coli BL21(DE3)/pLysS/ pETST-255-1. Obsah banky sa trepe (225 rpm) pri 37 °C do dosiahnutia optickej hustoty 0,65.
Fermentačné živné médium sa pripraví rozpustením 113,28 g NaH2PO4«7H2O, 30 g KH2PO4, 5 g NaCI a 10 ml 1% DF-60 protipenivého činidla v 9604 ml deionizovanej vody. Tento roztok sa vloží do New Brunswick Scientific Micros Fermenter (Edison, NJ) a sterilizuje sa pri 121 °C po dobu 40 minút. Bezprostredne pred naočkovaním fermentačného média sa do obsahu fermentačného tanku pridajú nasledujúce presterilizované zložky: 100 ml 10% vodného roztoku NH4CI, 15 g uniformné 13C-označenej glukózy, 20 ml vodného ·· • · · • · ···· ·· • · · • β • · · • · ·· · • · ·· ·
IM roztoku MgSO4, 1 ml vodného roztoku CaCl2, S ml vodného roztoku tiamínhydrochloridu (10 mg/ml), 10 ml roztoku obsahujúceho 34 mg/ml chlóramfenikolu vo 100% etanolu a 1,9 g ampicilínu rozpusteného v roztoku chlóramfenikolu. pH získaného roztoku sa upraví na pH 7,0 pridaním vodného roztoku 4N H2SO4.
Kultúra E. coli kmeňa BL21(DE3)/pLysS/pETST-255-l získaná spôsobom opísaným vyššie sa pridá do fermentačného tanku a bunky sa kultivujú do dosiahnutia optickej hustoty 0,48. Počas tohto procesu sa pH obsahu fermentačného tanku automaticky udržuje na hodnote 7,0 pridávaním 4N H2SO4 alebo 4N KOH podľa potreby. Obsah rozpusteného kyslíka vo fermentačnom tanku sa udržuje na 55% saturácii vzduchu pomocou stočenej kľučky, ktorá zvyšuje rýchlosť miešania, keď obsah kyslíka klesne pod 55 %. Vzduch sa dodáva do obsahu fermentačného tanku rýchlosťou 7 štandardných litrov za minútu (SLPM) a kultivačná teplota sa udržuje počas procesu na 37 °C.
Bunky sa získajú odstredením pri 17 000 x g počas 10 minút pri 4 °C a získané bunkové pelety sa odoberú a uskladnia sa pri -85 °C. Výťažok vlhkých buniek je 3,5 g/1. Analýza rozpustených a nerozpustených frakcií bunkových lyzátov pomocou elektroforézy na dodecylsíran sodný-polyakrylamidovom gély (SDS-PAGE) ukázala, že približne 50 % stromelyzínu sa nachádza v rozpustnej fáze.
Fragment stromelyzínu pripravený spôsobom opísaným vyššie sa prečisti s použitím modifikácie techniky opísanej v Ye a kol., Biochemistry 31: 11231 (1992). Získané bunky sa suspendujú v 20 mM Tris-HCl pufry (pH 8,0), roztoku azidu sodného obsahujúcom 1 mM MgCl2, 0, mM ZnCl2, 25 jednotiek/ml Benzonasy® (Benzon Pharma AúS Roskilde, Dánsko) a medzi inhibičnú zmes pripravenú z 4-(2-aminoetyl)benzénsulfonylfluoridu (AEBSF), Leupeptinu®, Aprotininu® a Pepstatinu® (všetky v koncentráciách 1 mg/ml). AEBSF, Leupeptin®, Aprotinin® a Pepstatin® sú dostupné od American International Chemical). Získaná zmes sa mierne mieša po dobu 1 hodiny a potom sa ochladí na 4 °C. Bunky sa potom rozrušia ultrazvukom s použitím 50% cyklu zapnutia prístroja. Získaný lyzát sa odstredí pri 14 000 rpm počas 30 minút a peleta nerozpustnej frakcie sa zmrazí pri -80 °C na ďalšie spracovanie.
·· • · • · • · • · ·· ···· ·· ·
Pevný síran amónny sa pridá k supernatantu v množstve dostatočnom na 20% nasýtenie a získaný roztok sa vnesie do 700 ml fenyl-Sepharózovej kolóny s rychlým prietokom (Q-Sepharóza FF) (Pharmacia Biotech). Pred naplnením sa Sepharózová kolóna uvedie do rovnováhy 50 ml Tris-HCl puframi (pH 7,6 pri 4 ®C), 5 mM CaCl2 a 1 M (NH^SO^ Naplnená kolóna sa eluuje lineárnym gradientom znižujúcej sa koncentrácie vodného roztoku (NH^SC^ (od 1 M do 0 M) a zvyšujúcej sa koncentrácie vodného roztoku CaCl2 (od 5 mM do 20 mM) v Tris-HCl pufry pri pH 7,6. Aktívne frakcie eluátu sa odoberú a zahustia sa na Amicon kyvete (Amicon Inc.). Zahustená vzorka sa dialyzuje cez noc vo východiskovom pufry použitom v Q-Sepharózovej FF kolóne, 50 mM Tris-HCl (pH 8,2 pri 4 °C) s 10 mM CaCl2.
Dialyzovaná vzorka sa potom vnesie do Q-Sepharózovej FF kolóny a eluuje sa lineárnym gradientom obsahujúcim východiskový pufor a 200 nM NaCl. Prečistená rozpustná frakcia stromelyzínového fragmentu sa zahustí a uskladní sa pri 4 °C. Peleta sa solubilizuje v 8 M guanidín-HCl. Roztok sa odstredí pri 20 000 rpm počas 20 minút a supernatant sa pridá po kvapkách k pufru obsahujúcemu 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM CaCl2, 0,5 mM ZnCl2 a inhibičnú zmes pripravenú z AEBSF, Leupeptinu®, Aprotininu® a Pepstatinu® (všetky v koncentráciách 1 pg/ml). Objem pufru je desaťkrát väčší než objem supernatantu. Zmes supernatantu a pufru sa odstredí pri 20 000 rpm počas 30 minút. Supernatant z tohto odstredenia sa uskladní pri 4 °C a peleta sa dvakrát solubilizuje v guanidín-HCl, v pufry a odstredí sa. Výsledné supernatanty z každého z troch odstredení sa zmiešajú a pevný síran amónny sa pridáva do dosiahnutia 20 % nasýtenia. Výsledný roztok získaný z nerozpustnej frakcie sa prečistí na fenyl-Sepharóze a Q-Sepharóze spôsobom opísaným vyššie pre rozpustnú frakciu. Prečistená rozpustná a nerozpustná frakcia sa zmieša za zisku približne 1,8 mg prečisteného 81-256 fragmentu stromelyzínu (SCD) na gram pôvodnej bunkovej pasty, ktorý je uniformné označený 13C.
·· ·· · · ·· • · · ·· ·· · · · • ·· · · · · ···· · ···· • · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ·
Príklad 2: Príprava špecificky ,3C-označenej katalytickej domény ľudského stromelyzínu (SCD)
SCD sa exprimuje kultiváciou BL21(DE3)/pLysS/pETST-255-l modifikovaného kmeňa E. coli v médiu obsahujúcom kyselinu 2-keto-4-(13C)-maslovú alebo jej soľ, a 2-keto-3-(13C-metyl)-4-(13C)-maslovú, alebo jej soľ. Spôsoby použité na prípravu geneticky upraveného kmeňa E. coli, a na expresiu, izoláciu a prečistenie proteínového fragmentu, sú rovnaké, ako boli opísané vyššie, s tým rozdielom, že miesto U-13C-glukózy sa použije U-12C-glukóza.
Odborníkom v odbore bude jasné, že existujú rôzne modifikácie uvedených uskutočnení, ktoré spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu.

Claims (13)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY ·· ·· · · ·· ···· ·· ·· ··· • ·· · · t · ···· ·· ··· ··· ·· ···
    1. Zlúčenina vzorca I
    RX^COOH
    X
    R1 alebo jej soľ, kde
    R1 znamená kyslík alebo NH2;
    R2 je vybrané zo skupiny zahrnujúcej:
    kde R3 znamená vodík alebo Clh;
    čiarkovaná väzba predstavuje druhú valenčnú väzbu;
    m je 0 alebo l;
    n je vždy 13 alebo 14;
    s podmínkou, že:
    ·· «
    • 9 ··
    99 99 · 9 • · 9 9 • · · 9999 99 • · 9 ·
    999 9·· 99 (i) keď R1 znamená NH2, tak je druhá valenčná väzba znázornená čiarkovanou väzbou k R1 neprítomná a vodík naviazaný čiarkovanou väzbou je prítomný;
    (ii) keď R1 znamená kyslík, tak je druhá valenčná väzba znázornená čiarkovanou väzbou k R1 prítomná a vodík naviazaný čiarkovanou väzbou je neprítomný;
    (iii) keď R1 znamená kyslík, tak R2 znamená B a m je 0;
    (iv) keď R1 znamená NH2, tak R3 znamená vodík alebo CH3.
  2. 2. Proteín, fragment proteínu alebo polypeptid obsahujúci aminokyselinový zvyšok odvodený zo zlúčeniny podľa nároku 1, kde R1 znamená -NH2.
  3. 3. Zlúčenina vzorca la
    R3
    COOH la alebo jej soľ, kde R3 znamená vodík alebo nCH3, a n je vždy 13 alebo 14.
    Zlúčenina podľa nároku 3 vybraná zo skupiny zahrnujúcej: kyselinu 2-keto-
  4. 4-(,3C)-maslovú;
    ·· ·· · · ·· ···· · ·· ··· • ·· · · 9 · ··· · · ··· ···· ·· ··· ··· ·· ··· kyselinu 2-keto-3-(’3C-metyl)-4-(I3C)-maslovú;
    kyselinu 2-keto-4-(,4C)-maslovú;
    kyselinu 2-keto-3-(l4C-metyl)-4-(l4C)-maslovú;
    alebo jej soľ.
  5. 5. Zlúčenina vzorca Ib
    H NH2
    COOH
    Ik>
    kde
    R2 je vybrané zo skupiny zahrnujúcej kde R3 znamená vodík alebo ’CHj; m je 0 alebo 1; a n je vždy 13 alebo 14.
    Zlúčenina podľa nároku 5 vybraná zo skupiny zahrnujúcej: kyselinu L-2-amino-3-metyl-5-(l3C)-pentánovú;
    ·· ·· • ·· kyselinu L-2-amino-3-metyl-5-(14C)-pentánovú; kyselinu L-2-amino-3-(13C-metyl)-5-(,3C)-butánovú; kyselinu L-2-amino-3-(14C-metyl)-5-(14C)-butánovú; kyselinu L-2-amino-4-(,3C-metyl)-5-(I3C)-pentánovú a kyselinu L-2-amino-4-(,4C-metyl)-5-(,4C)-pentánovú a ich soli.
  6. 7. Proteín, fragment proteínu alebo polypeptid obsahujúci jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov, kde uvedený jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov obsahuje zlúčeninu vzorca Ilb:
    Ilb kde im
    R je vybraný zo skupiny zahrnujúcej • ·· ·· · · · • · · ·· ·· · • · · · ·· • ·· · • · · · · • · · · ···· ·· ··· • · · · ··· ·· ··· kde R3 znamená vodík alebo CH3; m je 0 alebo 1 a n je vždy 13 alebo
    14.
  7. 8. Spôsob prípravy zlúčeniny vzorca la
    H3 nC
    Ra
    COOH la alebo jej soli, kde R3 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej vodík a CH3, a n je vždy 13 alebo 14, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:
    (a) reakciu zlúčeniny vzorca IV s izotopovo značeným metyljodidom (H3nCI) za zisku zlúčeniny vzorca V
    IV ·· • · · • · ·· ·· • · · · • · · ···· ·· ··· ··· • · · ·· ··· ch3 a
    (b) odstránenie ferc-butylesterovej a dimetylhydrazínovej skupiny za zisku kyseliny 2-keto-4-(C)-maslovej.
  8. 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že d’alej zahrnuje prípravu soli reakčného produktu zo stupňa (b).
  9. 10. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje:
    (c) reakciu produktu zo stupňa (b) s izotopovo značeným metyljodidom (H3nCI), kde n je 13 alebo 14, za zisku zlúčeniny vzorca VI
    O vi
    ·· • · • ·· • · ·· • ·· • • ·· • ·· • · • · • ·· • • • ň • • • · • ···· ·· ··· ··· ·· ···
    (d) odstránenie /erc-butylesterovej a dimetylhydrazínovej skupiny za zisku kyseliny 2-keto-3-(nC-metyl)-4-(nC)-maslovej.
  10. 11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje prípravu soli reakčného produktu zo stupňa (d).
  11. 12. Spôsob prípravy proteínu, fragmentu proteínu alebo polypeptidu obsahujúceho aspoň jeden aminokyselinový zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej 4-(nC-metyl)-5-(C)-leucyl, 5-(C)-izoleucyl a 3-(C-metyl)-4(C)-valyl, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje (a) genetickú modifikáciu vhodného mikroorganizmu tak, aby exprimoval uvedený proteín, fragment proteínu alebo polypeptid;
    (b) kultiváciu uvedeného geneticky modifikovaného mikroorganizmu v živnom médiu obsahujúcom zlúčeninu vzorca la
    H3 nCT3 .CH
    COOH la alebo jej soľ, kde n je v každom prípade 13 alebo 14, a R3 znamená vodík alebo CH3; a (c) izoláciu uvedeného proteínu, proteínového fragmentu alebo polypeptidu.
    ·· • · • · ·· ·· ··
  12. 13. Spôsob prípravy proteínu, fragmentu proteínu alebo polypeptidu obsahujúceho aspoň jeden 3-metyl-5-(C)-izoleucylový aminokyselinový zvyšok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje (a) genetickú modifikáciu vhodného mikroorganizmu tak, aby exprimoval uvedený proteín, fragment proteínu alebo polypeptid;
    (b) kultiváciu uvedeného geneticky modifikovaného mikroorganizmu v živnom médiu obsahujúcom zlúčeninu vzorca la
    COOH la alebo jej soľ, kde n je v každém prípade 13 alebo 14; a (c) izoláciu uvedeného proteínu, proteínového fragmentu alebo polypeptidu.
  13. 14. Spôsob prípravy kyseliny 2-amino-3-(nC-metyl)-4-(C)-maslovej, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:
    (a) genetickú modifikáciu vhodného mikroorganizmu tak, aby exprimoval homopolymér valínu;
    (b) kultiváciu uvedeného geneticky modifikovaného mikroorganizmu v živnom médiu obsahujúcom zlúčeninu vzorca la' ·· • · • · · · • · · ··· ·· ·
    Ο
    H3 nC
    η.
    COOH
    CH3 la' alebo jej soľ, kde n je v každom prípade 13 alebo 14;
    (c) izoláciu homopolyméru valínu exprimovaného uvedeným geneticky modifikovaným mikroorganizmom;
    (d) fragmentáciu uvedeného homopolyméru za zisku kyseliny 2-amino-3(C-metyl)-4-(nC)-maslovej.
    5. Spôsob prípravy kyseliny 2-amino-4-(C-metyl)-5-(nC)-pentánovej, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje (a) genetickú modifikáciu vhodného mikroorganizmu tak, aby exprimoval homopolymér leucínu;
    (b) kultiváciu uvedeného geneticky modifikovaného mikroorganizmu v živnom médiu obsahujúcom zlúčeninu vzorca la'
    COOH 'ch3 • · ·· ·· • · · • ·· • · • · · ···· ·· ·· • · · • β • · · • · • ·· · alebo jej soľ, kde n je v každom prípade 13 alebo 14;
    (c) izoláciu homopolyméru leucínu exprimovaného uvedeným geneticky modifikovaným mikroorganizmom;
    (d) fragmentáciu uvedeného homopolyméru za zisku kyseliny 2-amino-4(C-metyl)-5-(nC)-pentánovej.
    16.
    Spôsob prípravy kyseliny 2-amino-3-metyl-5-(nC)-pentánovej, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje (a) genetickú modifikáciu vhodného mikroorganizmu tak, aby exprimoval homopolymér izoleucínu;
    (b) kultiváciu uvedeného geneticky modifikovaného mikroorganizmu v živnom médiu obsahujúcom zlúčeninu vzorca la
    H3 nC
    COOH la alebo jej soľ, kde n je v každom prípade 13 alebo 14;
    (c) izoláciu homopolyméru izoleucínu exprimovaného uvedeným geneticky modifikovaným mikroorganizmom;
    (d) fragmentáciu uvedeného homopolyméru za zisku kyseliny 2-amino-3metyl-5-(C)-pentánovej.
SK1432-2001A 1999-04-09 2000-04-07 Miestne špecificky izotopovo značené proteíny, aminokyseliny a ich biochemické prekurzory SK14322001A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28951799A 1999-04-09 1999-04-09
PCT/US2000/009296 WO2000061525A1 (en) 1999-04-09 2000-04-07 Site-specific isotopically-labeled proteins, amino acids, and biochemical precursors therefor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK14322001A3 true SK14322001A3 (sk) 2002-02-05

Family

ID=23111884

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1432-2001A SK14322001A3 (sk) 1999-04-09 2000-04-07 Miestne špecificky izotopovo značené proteíny, aminokyseliny a ich biochemické prekurzory

Country Status (29)

Country Link
EP (1) EP1169282B1 (sk)
JP (1) JP2002541228A (sk)
KR (1) KR100708225B1 (sk)
CN (1) CN1244521C (sk)
AR (1) AR029747A1 (sk)
AT (1) ATE296789T1 (sk)
AU (1) AU777749B2 (sk)
BG (1) BG106043A (sk)
BR (1) BR0009664A (sk)
CA (1) CA2368652C (sk)
CO (1) CO5160349A1 (sk)
CZ (1) CZ20013616A3 (sk)
DE (1) DE60020547T2 (sk)
DK (1) DK1169282T3 (sk)
ES (1) ES2243251T3 (sk)
HK (1) HK1044753B (sk)
HU (1) HUP0200809A3 (sk)
IL (2) IL145536A0 (sk)
MX (1) MXPA01010183A (sk)
NO (1) NO20014691L (sk)
NZ (1) NZ514518A (sk)
PL (1) PL350889A1 (sk)
PT (1) PT1169282E (sk)
SI (1) SI1169282T1 (sk)
SK (1) SK14322001A3 (sk)
TR (1) TR200102842T2 (sk)
TW (1) TWI283659B (sk)
WO (1) WO2000061525A1 (sk)
ZA (1) ZA200107919B (sk)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10053396B2 (en) 2010-01-06 2018-08-21 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Process for the specific isotopic labeling of methyl groups of Val, Leu and Ile
JP5752147B2 (ja) * 2010-01-06 2015-07-22 コミサリア ア レネルジィ アトミーク エ オ ゼネ ルジイ アルテアナティーフＣｏｍｍｉｓｓａｒｉａｔａ Ｌ’Ｅｎｅｒｇｉｅ Ａｔｏｍｉｑｕｅ Ｅｔ Ａｕｘ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅのメチル基の特異的同位体標識化のための方法
KR101219684B1 (ko) * 2012-04-27 2013-01-10 건국대학교 산학협력단 정량적 질량분석기법을 이용한 만성골수성 백혈병의 발병 진단방법과 약제 내성 진단방법
EP2695873B1 (en) * 2012-08-08 2016-10-26 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Labeled chiral alpha-hydroxy ketoacid derivatives, a process for preparing said derivatives and their use
CN107793209A (zh) * 2016-08-30 2018-03-13 泰生科技香港有限公司 稳定性同位素标记植物的专用培养基、其制备方法及用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698401A (en) * 1995-11-14 1997-12-16 Abbott Laboratories Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules

Also Published As

Publication number Publication date
AR029747A1 (es) 2003-07-16
MXPA01010183A (es) 2003-07-21
EP1169282B1 (en) 2005-06-01
CZ20013616A3 (cs) 2002-04-17
CN1244521C (zh) 2006-03-08
CA2368652A1 (en) 2000-10-19
AU777749B2 (en) 2004-10-28
DK1169282T3 (da) 2005-10-03
PL350889A1 (en) 2003-02-10
IL145536A0 (en) 2002-06-30
JP2002541228A (ja) 2002-12-03
CA2368652C (en) 2009-11-10
SI1169282T1 (en) 2005-10-31
NZ514518A (en) 2003-10-31
ZA200107919B (en) 2003-03-26
BG106043A (en) 2002-05-31
NO20014691L (no) 2001-12-10
KR20010108475A (ko) 2001-12-07
KR100708225B1 (ko) 2007-04-17
TR200102842T2 (tr) 2002-03-21
WO2000061525A1 (en) 2000-10-19
DE60020547D1 (de) 2005-07-07
AU4212100A (en) 2000-11-14
ATE296789T1 (de) 2005-06-15
PT1169282E (pt) 2005-10-31
CN1353678A (zh) 2002-06-12
EP1169282A1 (en) 2002-01-09
HUP0200809A2 (en) 2002-06-29
DE60020547T2 (de) 2006-05-04
ES2243251T3 (es) 2005-12-01
HUP0200809A3 (en) 2004-11-29
TWI283659B (en) 2007-07-11
HK1044753A1 (en) 2002-11-01
NO20014691D0 (no) 2001-09-27
IL145536A (en) 2010-05-31
HK1044753B (zh) 2006-03-24
BR0009664A (pt) 2002-01-08
CO5160349A1 (es) 2002-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5627044A (en) Compositions and methods for protein structural determinations
Baalmann et al. A Bioorthogonal Click Chemistry Toolbox for Targeted Synthesis of Branched and Well‐Defined Protein–Protein Conjugates
US20060293229A1 (en) Site-specific isotopically-labeled proteins, amino acids, and biochemical precursors therefor
CN107119084B (zh) 一种利用转氨酶和乙烯合成酶生产l-草铵膦的方法
JP4723094B2 (ja) 結合を検出するための１３ｃ−ｎｍｒの使用
SK14322001A3 (sk) Miestne špecificky izotopovo značené proteíny, aminokyseliny a ich biochemické prekurzory
JP6503370B2 (ja) シクロプロペンアミノ酸及び方法
Baumann et al. Orthogonal protein translation using pyrrolysyl-tRNA synthetases for single-and multiple-noncanonical amino acid mutagenesis
Agrawal et al. Site-specific chemical modifications of proteins
JP2869794B2 (ja) Ｄ−アミノアシラーゼ活性誘導剤
JPS59106298A (ja) ペプチド又はペプチド誘導体の合成法
JPS58146539A (ja) ペプチド又はペプチド誘導体の合成法
JPS60196196A (ja) ペプチドの合成法
Kay Alanine Probes of Supra-Molecular Structure and Dynamics
JPS6296097A (ja) ペプチド又はペプチド誘導体の製造方法