MXPA01010183A

MXPA01010183A - Proteinas marcadas isotopicamente de sitio especifico, aminoacidos y precursores bioquimicos para los mismos.

Info

Publication number: MXPA01010183A
Application number: MXPA01010183A
Authority: MX
Inventors: Stephen W Fesik
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2003-07-21
Also published as: CN1244521C; PL350889A1; DK1169282T3; AU777749B2; NZ514518A; ZA200107919B; HUP0200809A2; CO5160349A1; NO20014691L; IL145536A0; CZ20013616A3; TWI283659B; SK14322001A3; HK1044753B; BR0009664A; DE60020547T2; ATE296789T1; CA2368652A1; SI1169282T1; EP1169282A1

Abstract

La presente invención se refiere a la valina, leucina, e isoleucina marcadas isotópicamente de sitio especifico y los precursores biosintéticos para estos aminoácidos. Los aminoácidos se marcan con 13C o 14C en el (los)átomo (s) de carbono del grupo metilo más ajeno al grupo carboxilo. También se describen los precursores bioquímicos de estos aminoácidos marcados,ácido 2-keto-4-(nC)butírico yácido 2-keto-3-(nC-metil)-4-(nC)- butírico en el cual n, en cada caso, es 13 o 14. También se describen las proteínas, fragmentos de proteína y polipéptidos que contienen estos aminoácidos marcados isotópicamente de sitio específico, y los métodos para preparar los precursores bioquímicos, los aminoácidos y las proteínas, fragmentos de proteína y polipéptid

Description

PROTEÍNAS MARCADAS ISOTÓPICAMENTE DE SITIO ESPECÍFICO, AMINOÁCIDOS Y PRECURSORES BIOQUÍMICOS PARA LOS MISMOS.

Campo de la Invención La presente invención se refiere a compuestos orgánicos marcados isotópicamente de sitio específico y procesos para su preparación. Más particularmente, la presente invención se refiere a precursores bioquímicos marcados isotópicamente de sitio específico de leucina, isoleucina, y valina, los aminoácidos marcados isotópicamente per se, proteínas, fragmentos de proteína o polipéptidos elaborados de los mismos, y métodos relacionados de preparación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una técnica recientemente desarrollada para descubrir las nuevas ventajas de medicamento incluye el uso de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR) para descubrir los compuestos que se unen a una molécula objetivo en particular tal como una proteína {ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,698,401 y 5,804,390, de Fesik, et al.). La técnica incluye la determinación de un primer espectro de correlación 15N/1H NMR de dos dimensiones de una proteína en el cual, los sitios de átomo de nitrógeno se han enriquecido con 5N. Este primer espectro de correlación se obtiene por la proteína en la ausencia de cualquier (a de los) compuesto (s) ligante (s). Seguido al presunto compuesto ligante, o una mezcla de tales compuestos ligantes putativos, se mezcla con la proteína isotópicamente enriquecida, y se obtiene un segundo espectro de correlación de NMR. Se comparan los dos espectros, y las diferencias entre los dos espectros proporcionan la información acerca de 1 ) la existencia de unión entre cualquier ligante y la proteína huésped, 2) el (los) sitio (s) de unión, y 3) la (s) resistencia (s) de unión . La técnica descrita en Fesik, et al., supra, emplea moléculas objetivo que se han enriquecido isotópicamente con el núcleo de giro 15N detectable de NMR. Este método recae en la modificación genética de un microorganismo adecuado para expresar la proteína deseada, fragmento de proteína, o polipéptido, seguido por el cultivo del microorganismo modificado en un medio nutritivo que contiene las fuentes asimilables de carbono y nitrógeno que incluyen los nutrientes marcados de 15N. Comparativamente, las sales amónicas de 15N comercialmente disponibles proporcionaron la fuente de 15N. Sin embargo, la aplicación de esta técnica de descubrimiento del medicamento NMR a las moléculas objetivo enriquecidas isotópicamente con 13C se ha dificultado por dos desventajas. Primero, es comparativamente caro producir moléculas objetivo enriquecidas de 13C en cualquiera de las cantidades útiles. Por ejemplo, la producción de proteínas mediante los microorganismos genéticamente modificados crecidos en medios nutritivos que contienen glucosa marcada uniformemente (glucosa-13C6) comercialmente disponible, es cara. En el momento de la presentación de esta solicitud, el costo de glucosa-13C6 era de aproximadamente de $480/g. Alternativamente, la producción de proteínas marcadas de 13C al incluir los aminoácidos marcados uniformemente de 3C en el med io nutritivo, de ig ual forma es cara . Segundo, las biomoléculas producidas utilizando glucosa-1 3C6 o los aminoácidos en riquecidos uniformemente de 3C comercialmente disponibles no se adecúan idealmente para la técnica de los espectros de correlación de NMR. Las biomoléculas expresadas por los microorganismos crecidos en los medios nutritivos que contienen materias primas enriquecidas uniformemente de 1 3C contienen átomos de carbono marcados de 13C adyacentes. Ya que la técnica NMR depende de la detección del acoplamiento de giro espacial (es decir, el efecto Overhauser nuclear), el acoplamiento de giro-giro relativamente resistente de los núcleos de 13C adyacentes interfiere con la observación deseada. De esta manera, existe una necesidad para el desarrollo de aminoácidos enriquecidos de 13C de sitio específicamente, proteínas y polipéptidos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona precursores bioquímicos de los aminoácidos enriquecidos isotópicamente de sitio específico, leucina , isoleucina, y valina, así como también los aminoácidos enriquecidos isotópicamente de sitio específico per se. Adicionalmente, también se proporcionan las proteínas, los fragmentos de proteína y polipéptidos que contienen residuos de aminoacilo enriquecido isotópicamente de sitio específico derivados de estos aminoácidos, y los métodos para su producción. Los aminoácidos y los precursores biosintéticos de aminoácido se enriquecen isotópicamente ya sea con 1 3C o 14C en los átomos de carbono de grupo metilo más ajenos a su grupo carboxilo. En maximizarse y el costo minimizarse al modificar el microorganismo huésped para expresar un homopolímero del aminoácido, y utilizar el precursor biosintético enriquecido isotópicamente apropiado en el medio nutritivo. La presente invención todavía además proporciona un método para preparar una proteína, fragmento de proteína, o polipéptido que contiene residuos de aminoacilo derivados de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de ácido L-2-amino-3-metil-5-(13C)-pentanóico; ácido L-2-amino-3-metil-5(1 C)-pentanóico; L-2-amino-4-(13C-metil-5-(13C)-pentanóico; ácido L-2-amino-4-(1 C-metil-5-(14C)-pentanóico; ácido L-2-amino-3-(13C-metil)-5-(13C)-butanóico; y ácido L-2-amino-3-( C-metil)-5-(14C)-butanóico que incluye modificar genéticamente un microorganismo para expresar una proteína predeterminada, fragmento de proteína o polipéptido; cultivando el microorganismo en un medio nutritivo que contiene fuentes asimilables de carbono y nitrógeno el cual incluye ácido 2-keto-4-("C)-butírico, ácido 2-keto-3-(nC-metil)-4-(nC)-butírico, y sales y mezclas de los mismos; y aislando el polipéptido expresado resultante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La abundancia isotópica natural de 3C es de 1 .1 1 %, y que de 1 C es insignificantemente baja. De esta manera, la probabilidad de que cualquier átomo de carbono dado dentro de una molécula orgánica es 13C es normalmente aproximadamente de 0.01 1 1 , y la probabilidad de que cualquier átomo de carbono dado es 14C es un poco baja. Cuando las proteínas objetivo se preparan para utilizarse en el proceso de descu brimiento de med icamento o "selección" de N R ada ptado según se describe por Fesik, et al. , supra, es deseable que la señal de N MR de 3C se mejore al aumentar el contenido de 1 3C natural de la molécula objetivo a estudiarse. Esto se efectúa al enriquecer ya sea uniforme o selectivamente la molécula objetivo con 13C. Según se utiliza a lo largo de esta especificación y las reivindicaciones anexas, los términos "enriquecimiento uniforme", "enriquecer uniformemente", "enriquecido uniformemente", "marcado uniforme" y "marcado uniformemente" sig nifican au mentar a un valor mayor a 0.01 1 1 , por medio sintético, la probabilidad de que el átomo de carbono seleccionado al azar a lo largo de la molécula objetivo sea de 13C. Los términos "enriquecimiento específico", "enriquecimiento de sitio específico", "enriquecer específicamente", "enriquecido específicamente", "marcar específicamente" y "marcado específicamente" significan aumentar a un valor mayor a 0.01 1 1 , por medio sintético, la probabilidad de que los átomos de carbono en uno o más sitios preseleccionados específicos dentro de la molécula objetivo sea de 1 3C. Por ejemplo, las biomoléculas expresadas por los microorganismos genéticamente modificados crecidos en un medio nutritivo que contiene glucosa enriquecida uniformemente de 1 3C se enriquecerán uniformemente de 13C. Una proteína expresada por un microorganismo genéticamente modificado crecido en un medio nutritivo que contiene un aminoácido que se enriquece de 13C solamente en la cadena lateral de metilo se enriquecerá específicamente por 13C en los residuos de alanilo contenidos dentro de la proteína expresada . De igual forma, las proteínas expresadas por el método de esta invención serán enriquecidas específicamente de sitio por 3C o 4C en los g rupos metilo de terminal de la cadena latera l de leucina, isoleucina , y valina. El método de la presente invención también permite la preparación de leucina , isoleucina , y valina, marcadas específicamente de sitio, proteínas, fragmentos de proteína , o polipéptidos elaborados de estos aminoácidos marcados, y los precursores biosintéticos de aminoácido marcados con 14C así como también con 13C. Tales compuestos son útiles, por ejemplo, en estudios del metabolismo de proteína en donde es deseable seguir el curso y destino de la degradación de proteína mediante los métodos radiométricos. Además de los términos utilizados a lo largo de esta especificación y las reivindicaciones anexas tienen sus significados normalmente aceptados. Los siguientes términos específicos tienen los significados adscritos: "DTT" significa ditiotreitol. "HEPES" señala el ácido N-2-hid roxietilpiperazina-N'-2-etilsulfónico. "IPTG" significa isopropil- -D-tiogalactopiranosido. "PMSF" se refiere a fluoruro a-toluenosulfonilo. "SCD" se refiere al dominio catalítico (residuos 81 -256) de estromelisina. La preparación de una molécula objetivo de fragmento de proteína enriquecido de nC de sitio específico ejemplar se establece abajo . El ejemplo particular mostrado demuestra la preparación del tan llamado "dominio catalítico" de estromelisina humana ("SCD"), marcada con leucina valina , e isoleucina enriquecidas de 13C de sitio específico. Mientras se muestra con los precursores de aminoácido marcado de 13C, el método es igualmente aplicable comenzando con los precursores de aminoácido marcado de 14C. Un medio preferido para preparar cantidades adecuadas de moléculas objetivo que contienen polipéptido enriquecido específicamente de nC incluye la transformación de una célula huésped con un vector de expresión que contiene un polinucléotido que codifica el polipéptido deseado. La proteína o fragmento de proteína de polipéptido se expresa al cultivar la estirpe de célula transformada en un medio que contiene fuentes asimilables de carbono y nitrógeno bien conocidas en la materia y que incluyen los precursores bioquímicos enriquecidos de nC de esta invención. Para el marcado de sitio específico de la proteína o fragmento de proteína de acuerdo con la presente invención, las fuentes asimilables para el marcado de "C de un polipéptido objetivo incluyen precursores biosintéticos marcados de nC de aminoácidos. Por ejemplo, se sabe que a-keto-butirato es el precursor biosintético de isoleucina, y que a-keto-isovalerato es el precursor biosintético tanto de valina como de leucina. El esquema I de abajo muestra como los precursores biosintéticos enriquecidos específicamente de nC de leucina, isoleucina, y valina, pueden sintetizarse. El esquema emplea el yoduro de metilo enriquecido de nC comparativamente barato, H3"CI, como la fuente para el enriquecimiento isotópico para producir el ácido a-keto-butírico terminalmente marcado de "C y el ácido a-keto-isovalérico. El uso de un nutriente enriquecido uniformemente de 13C tal como la glucosa-13C6 se ha utilizado típicamente como un medio conveniente para introducir el enriquecimiento de 13C en un compuesto objetivo; sin embargo, es muy caro. Además, una vasta mayoría de los sitios de carbono en objetivos marcados uniformemente de 13C tendrá un vecino covalentemente unido que también se marca de 13C, introduciendo el acoplamiento 13C-13C que puede impactar negativamente tanto la señal de ruido y las propiedades de relajación de los sitios marcados de 13C en la biomolécula objetivo. Alternativamente, el medio nutritivo puede incluir los aminoácidos marcados uniformemente de 13C comercialmente disponibles. Mientras esta técnica reduce la "dilución" del marcado, también, es una alternativa costosa y del mismo modo sufre de la desventaja de las interacciones de giro-giro 13C-13C de átomo de carbono adyacente. Sin embargo, el método de la presente invención para el marcado de nC de una molécula objetivo de polipéptido comprende crecer la estirpe de célula genéticamente modificada en un medio nutritivo que contiene precursores biosintéticos marcados de "C de aminoácidos en particular. No solamente se encuentran ciertos de los aminoácidos en la proteína resultante, fragmento de proteína o polipéptido isotópicamente enriquecido, aquellos aminoácidos se marcan específicamente de sitio. En un método de una modalidad de la invención, los precursores de aminoácido preferidos son ácido a-keto-butírico y ácido a-keto-isovalérico marcados. Los productos biosintéticos de estos precursores son leucina, isoleucina, y valina, en cuyos grupos metilo de cadena lateral en particular se enriquecen de "C. Debido a que los grupos metilo cada uno tienen tres átomos de hidrógeno conectados a un átomo de carbono marcado de nC, en donde n es 13, las señales de NMR correspondientes son particularmente resistentes y distintivas. La síntesis para el ácido a-keto-butírico y ácido a-keto-isovalérico marcado incluye la metilación de C del átomo de carbono terminal en ácido pirúvico con yoduro de metilo enriquecido de "C. Normalmente, la alquilación de ácidos a-keto tal como el piruvato es inherentemente difícil y se acompaña por la descomposición del enolato intermedio con la formación de los numerosos productos laterales. Sin embargo, Spencer, ef al. , Tetrahedron Letters, 1 975, 3889 y Williams, ef al. , ibid. , 1990, 5881 han mostrado que la alquilación del enolato oxima correspondiente se ha llevado a cabo, a pesar de que la alquilación con los electrofilos primarios (por ejemplo, yoduro de metilo) fue problemática. D. Enders, et al. , Angew. Chem. Int. Eng._Ed. , 1992, 618 y D. Enders, ef al. , Synlett, 1992, 901 han demostrado que la alquilación de una N,N-dimetilhidrazona de piruvato es posible, pero se menciona específicamente que el éster de fenilo 2,6-dialquilo voluminoso fue necesario para prevenir la auto acilación. Los compuestos representativos de la presente invención incluyen los siguientes: ácido 2-keto-4-(13C)-butírico o una sal del mismo; ácido 2-keto-4-(14C)-butírico o una sal del mismo; ácido 2-keto-3-(13C-metil)-4-(13C)-butírico o una sal del mismo; ácido 2-keto-3-(1 C-metil)-4-(1 C)-butírico o una sal del mismo; ácido L-2-amino-3-metil-5-(13C)-pentanóico o una sal del mismo; ácido L-2-amino-3-metil-5-(1 4C)-pentanóico o una sal del mismo; ácido L-2-amino-4-(13C-metil)-5-(13C)-pentanóico o una sal del mismo; ácido L-2-amino-4-(14C-metil)-5-(14C)-pentanóico o una sal del mismo; ácido L-2-amino-3-(13C-metil)-5-( 3C)-butanóico o una sal del mismo; y ácido L-2-amino-3-(1 C-metil)-5-(14C)-butanóico o una sal del mismo. La presente invención comprende adicionalmente las proteínas, fragmentos de proteína, y polipéptidos que contienen los aminoácidos enriquecidos isotópicamente de sitio específico ácido L-2-amino-3-metil-5-(13C)-pentanóico, ácido L-2-amino-3-metil-5-( 4C)-pentanóico; L-2-amino-4-(1 C-metil)-5-( 3C)-pentanóico; ácido L-2-amino-4-(1 C-metil)-5-(14C)-pentanóico; ácido L-2-amino-3-(13C-metil)-5-(13C)-butanóico; y ácido L-2-amino-3-(14C-metil)-5-( 4C)-butanóico. A pesar de que los compuestos específicos anteriormente nombrados se han designado como que tienen isótopos 13C o 14C en sitios específicos en el compuesto, se entenderá por aquellos de experiencia ordinaria en la materia que los átomos de carbono en estos sitios en los compuestos no se marcarán completamente de 13C o 1 C. El grado de sustitución isotópica o "enriquecimiento" en cada sitio molecular depende del grado correspondiente de enriquecimiento contenido en las materias primas utilizadas en la síntesis.

Esquema I Síntesis Química de Precursores Marcados En el Esquema I , piruvato de tert-butilo, 1 , se convierte en la ? , ?-dimetílhid razona correspondiente, 2, por la reacción con N, N-dimetilhidrazina en éter de dietilo a temperatura ambiente. La hidrazona resultante, 2, se enfría en una solución de tetrahidrofurano a -78°C, y se trata con bromuro de litio, seguida por diisopropilamida de litio para formar el enolato aza-alilo intermedio. El enolato se alquilata con yoduro de metilo marcado de nC para producir la hidrazona 3. Un segundo curso de alquilación de 3 produce la hidrazona dimetilada marcada, 4. El tratamiento de 3 y 4 primero con 1 N HCI acuoso en éter de dietilo o tetrahidrofurano (para remover la hidrazona) seguido por el tratamiento con gas de cloruro de hidrógeno en cloruro de metileno (para remover el éster de t-butilo) da los a-ketoácidos terminalmente marcados de "C correspondientes, 5 y 6. Los esquemas II, I I I, y IV ilustran , respectivamente, como estos a-ketoácidos se convierten biosintéticamente en leucina, isoleucina y valina de nC. En todos los Esquemas, el (los) sitio (s) del enriquecimiento isotópico se indica (n) por asteriscos.

Esquema II Síntesis Bioquímica de Isoteucina Marcada Ácido-Ketol Reductoisomerasa Dehidratasa de ácido dihidroxi Cadena Ramificada Transaminasa Ácida L-Glutamato 2-Oxoglutamato 10 Isoleucina Esquema III Síntesis Bioquímica de Leucina Marcada 16 Leucina Esq uema IV Síntesis Bioquímica de Valina L-Valina Los medios para preparar los vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucléotido que codifican los polipéptidos específicos y para transformar las células huésped con aquellos vectores se conocen bien en la materia. (Ver, por ejemplo, R. W. Oíd, et al. , Techniques of Gene Manipulation, Blackwell Science , Londres, 1 994 , y tratados similares en el campo). Del mismo modo , los métodos para cultivar las células transformadas a fin de expresar el polipéptido codificado y para aislar, purificar y replegar el polipéptido, también se conocen bien en la materia . Los ejemplos presentados abajo describen la producción de las muestras enriquecidas de 13C de la región catalítica del aminoácido 81 -256 de estromelisina humana (SCD) de E. coli modificado .

EJ EMPLOS Ejemplo 1 Preparación del Dominio Catalítico Enriquecido Uniformemente de i 3C de Estromelisina Humana (SCD) El fragmento 81 -256 (S EQ I D NO: 1 ) de estromelisina (SCD) se prepara al insertar un plásmido que se codifica para la producción del fragmento de proteína en una cepa E. coli y al crecer la cepa bacteriana genéticamente modificada en un medio de cultivo adecuado. El fragmento de proteína se aisla del medio de cultivo, se purifica , y se utiliza subsecuentemente en el análisis de NMR de dos dimensiones de su afinidad con los compuestos de prueba de acuerdo con el método de esta invención . Los procedimientos para los procesos de preparación se describen abajo. Los fibroblastos de piel humana (ATCC No. CRL 1 507) se crecen y se inducen utilizando el procedimiento descrito por Clark, et al. , Archiv. Biochem. and Biophys. , 241 : 36 (1 985). El RNA total se aisla de 1 g de células utilizando un Equipo de Sistema de Aislamiento de RNA Total RNAgents® (Promega Corp. , 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wl 5371 1 , USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Una parte de 1 µg del RNA se desnaturaliza al calentarse a 80°C por cinco minutos y someterse así a PCR de transcriptasa inversa utilizando un equipo de PCR RNA GenAmp® (Biosistemas Aplicados/Perkin-Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante. El PCR envuelto se realiza utilizando primero los primeros (a) GAAATGAAGAGTCTTCAA (SEQ ID NO: 2) y (b) GCGTCCCAGGTTCTGGAG (SEQ ID NO: 3) y treinta cinco ciclos de 94°C, dos minutos; 45°C, dos minutos; y 72°C, tres minutos. Esto se sigue por la reamplificación con los primeros internos (c) TACCATGGCCTATCCATTGGATGGAGC (SEQ I D NO: 4) y (d) ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG (SEQ ID NO: 5) utilizando treinta cinco ciclos bajo las mismas condiciones descritas inmediatamente arriba para generar una secuencia de ADN codificadora para los residuos de aminoácido 1 -256 de estromelisina humana. El fragmento de PCR se clona así en el vector de clonación PCR pT7Blue® (Novagen, Inc.) de acuerdo las instrucciones del fabricante. El plásmido resultante se corta con Ncol y BamHI y el fragmento de estromelisina se subclona en el vector de expresión pET3d (Novagen, Inc.), utilizando nuevamente las instrucciones del fabricante. Una construcción de expresión de estromelisina madura codificadora para residuos de aminoácido 81 -256 más un residuo de aminoacilo de metionina iniciadora se genera de la construcción de expresión 1 -256 mediante la amplificación de PCR. El fragmento de PCR resultante se clona primero en el vector pT7Blue® (Novagen, Inc.), y después se subclona en el vector pET3d (Novagen, Inc.), anteriormente descrito, para producir el plásmido pETST-83-256. Este plásmido final es idéntico a aquel descrito por Qi-Zhuang, er al. , Biochemistry, 31 : 1 1231 (1992) con la excepción de que el plásmido presente se codifica para una secuencia de péptido comenzando dos aminoácidos más temprano, específicamente en la posición 81 , en la secuencia de estromelisina humana. El plásmido pETST-83-256 se transforma en cepa E. coli BL21 (DE3)/pLysS (Novagen, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para generar una cepa de expresión, BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1 . Un medio de pre-cultivo se prepara al disolver 1 .698 g de NaH2PO H20, 0.45 g de KH2P04, 0.075 g de NaCI, 0.1 50 g de NH4CI , 0.3 g de U- 3C-glucosa , 300 µ\ de 1 M de solución MgS0 acuoso, y 1 5 mi de solución CaCI2 acuoso en 150 mi de agua desmineralizada. La solución resultante del medio de pre-cultivo se esteriliza y se transfiere a un matraz deflector de 500 mi estéril. Inmediatamente antes de la inoculación del medio de pre-cultivo con la cepa bacteriana , 1 50 mi de una solución que contiene 34 mg/ml, de cloranfenicol en 1 00% de etanol y 1 .5 mi de una solución que contiene 20 mg/ml de ampicillina se agrega a los contenidos del matraz. Los contenidos del matraz se inoculan así con 1 mi de cepa de glicerol de la cepa E. coli genéticamente modificada BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1 . Los contenidos del matraz se agitan (225 rpm) a 37°C hasta que se observa una densidad óptica de 0.65. Se prepara un medio nutritivo de fermentación al disolver 1 1 3.28 g de Na2HP04»7H20, 30 g de KH2P04, 5 g de NaCI y 10 mi de 1 % de DF-60 agente antiespuma en 9604 mi de agua desmineralizada. Esta solución se coloca en un Fermentador Micros Científico New Brunswick (Edison, NJ) y se esteriliza a 121 °C por 40 minutos. Inmediatamente antes de la inoculación del medio de fermentación , los siguientes compuestos pre-esterilizados se agregan a los contenidos del recipiente de fermentación: 100 mi de un 10% de solución acuosa de NH CI, 1 5 g de glucosa enriquecida uniformemente de 13C, 20 mi de una solución de 1 M acuosa de MgS04, 1 mi de una solución CaCI2 de 1 M acuosa, 5 mi de una solución acuosa de hidrocloruro de tiamina (1 0 mg/ml), 1 0 mi de una solución que contiene 34 mg/ml de cloranfenicol en 1 00% de etanol, y 1 .9 g de ampicillina disuelta en la solución de cloranfenicol. El pH de la solución resu ltante se ajusta al pH 7.00 por la adición de una solución acuosa de 4N H2S0 . El pre-cultivo de la cepa E. coli BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1 del procedimiento de escala del matraz de agitación anteriormente descrito se agrega a los contenidos del termentador, y el crecimiento celular se permite para proceder hasta que se logra una densidad óptica de 0.48. Durante este proceso, los contenidos del termentador se mantienen automáticamente en pH 7.0 por la adición de 4N H2S04 o 4N KOH según sea necesario. El contenido de oxígeno disuelto de los contenidos del termentador se mantiene arriba del 55% de saturación de aire a través de un ciclo en cascada que aumentó la velocidad de agitación cuando el contenido de oxígeno disuelto se goteó abajo del 55%. El aire se alimenta en los contenidos del termentador en 7 litros estándares por minuto (SLPM) y la temperatura de cultivo se mantiene a 37°C a lo largo del proceso. Las células se recolectan mediante la centrifugación a 17,000 x g por 10 minutos a 4°C y los gránulos de célula resultantes se colectan y se almacenan a -85°C. La producción de célula húmeda es de 3.5 g/L. El análisis de las fracciones solubles e insolubles de los lisatos de célula mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sodio (SDS-PAGE) revela que aproximadamente un 50% de la estromelisina se encontró en la fase soluble. El fragmento de estromelisina preparado según se describe anteriormente se purifica empleando una modificación de la técnica descrita por Ye, ef a/. , Biochemistry, 31 : 1 1231 (1 992). Las células colectadas se suspenden en 20 mM del regulador de Tris-HCI (pH 8.0) , solución de azida de sodio que contiene 1 mM de MgCI2, 0.5 mM de ZnCI2, 25 unidades/ml de enzima Benzonasa® (Benzon Pharma A/S Roskilde, Dinamarca), y una mezcla inhibidora elaborada de fluoruro 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo ("AEBSF") Leupeptin®, Aprotinin®, y Pepstatin® (todos en concentraciones de 1 mg/ml. AEBSF, Leupeptin®, Aprotinin®, y Pepstatin® se encuentran disponibles de American International Chemical). La mezcla resultante se agita suavemente por una hora y después se enfría a 4°C. Las células se rompen así sónicamente en un 50% del período de aceleración . El lisato resultante se centrífuga a 14, 000 rpm por 30 minutos y el gránulo de la fracción congelada se congela a -80°C para procesamiento subsecuente. El sulfato de amonio sólido se agrega al sobrenadante en el punto de 20% de saturación y la solución resultante se cargó en un flujo rápido de fenilo de 700 mi ("A-Sefarosa FF) columna de Sefarosa (Pharmacia Biotech . ). Antes de la carga, la columna de Sefarosa se equilibra con 50 mM de regulador de Tris-HCI (pH 7.6 a 4°C), 5 mM de CaCI2, y 1 M de (NH4)2S0 . La columna cargada se eluye con un gradiente lineal de concentraciones de reducción de (NH4)2S04 acuoso (de 1 M abajo de 0M) y las concentraciones de aumento de CaCI2 acuoso (de 5 mM a 20 mM) en el regulador de Tris-HCI en pH 7.6. Las fracciones activas de eluato se colectan y se concentran en una célula agitada Amicon (Amicon Inc. ). La muestra concentrada se dializa durante la noche en el regulador de inicio utilizado con la columna Q. -Sefarosa FF, 50 mM de Tris-HCI (pH 8.2 a 4°C) con 1 0 mM de CaCI2.

La muestra dializada se carga así en la columna Q-Sefarosa FF y se eluye con un gradiente lineal que contiene el regulador de inicio y 200 nM de NaCI. La fracción soluble purificada del fragmento de estromelisina se concentra y se almacena a 4°C. El gránulo se solubiliza en 8 M de HCI de guanidina. La solución se centrífuga por 20 minutos a 20,000 rpm y el sobrenadante se agrega gota a gota a un regulador de repliegue que comprende 50 mM de Tris-HCI (pH 7.6), 10 mM de CaCI2, 0.5 mM de ZnCI2, y el cóctel inhibidor de AEBSF, Leupeptin(R), Aprotinin (R) y Pepstatin (R) (todos en concentraciones de 1 /¿g/ml). El volumen del regulador de repliegue es diez veces de aquel del sobrenadante. La mezcla del sobrenadante y el regulador de repliegue se centrifugan a 20,000 rpm por 30 minutos. El sobrenadante de esta centrifugación se almacena a 4°C y el gránulo se sometió dos veces a las etapas anteriormente descritas de solubilización en HCI de guanidina, repliegue en el regulador, y la centrifugación. Los sobrenadantes finales de cada una de estas tres centrifugaciones se combinan y se agrega sulfato de amonio sólido al punto de 20% de saturación. La solución resultante derivada de esta manera de la fracción insoluble se somete a la purificación en Sefarosa de fenilo y Q-Sefarosa según se describe anteriormente por la fracción soluble. Las fracciones solubles e insolubles se combinan para producir aproximadamente 1 .8 mg del fragmento 81 -256 de estromelisina purificada (SCD) por gramo de pasta de célula original, enriquecida uniformemente con 13C. Ejemplo 2 Preparación del Dominio Catalítico Enriquecido Específicamente de 13C de Estromel isina H umana (SCD) SCD se expresa al cultivar la cepa de E. coli modificada BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1 en un medio que comprende ácido 2-keto-4-(13C)-butírico, o una sal del mismo, y ácido 2-keto-3-(13C-metil)-4-(13C)-butírico, o una sal del mismo. Los métodos utilizados para la preparación de la cepa genéticamente elaborada de E. coli, y para expresar, aislar, y purificar el fragmento de proteína son según se describen anteriormente, excepto para el uso de U-12C-glucosa, en lugar de U-1 C-glucosa. Será aparente por alguien de experiencia ordinaria en la materia que pueden hacerse diversas modificaciones en las modalidades ilustradas sin alejarse del alcance de la presente invención.

LISTADO DE SECUENCIAS <110 AbbotC Laboratories Auge i, David J. Fesik, Stephen F. PROTEÍNAS MARCADAS ISOTÓPICAMENTE DE SITIO ESPECÍFICO AMINOÁCIDOS Y PRECURSORES BIOQUÍMICOS PARA LOS MISMOS <130> 6470. US . OI <140> US 09/289,517 <141> 1999-04-09 <160> 5 <170> FastSEQ for Windows Versión 3.0 <210> 1 <211=» 174 <212> PRT <213 > Secuencia Artificial <220> c223» 81-2S6 Catalytic región of human stromelysin c400> 1 Phe Arg Thr Phe Pro Gly lie Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu Thr 1 5 10 15 Tyr Arg lie Val Asn Tyr Thr Pro sp Leu Pro Lys Asp Ala Val Asp 20 25 30 Ser Ala Val Glu Lys Ala Leu Lys Val Trp Glu Glu Val Thr Pro Leu 35 40 45 Thr Phe Ser Arg Leu Tyr Glu Gly Glu Ala Asp lie Met lie Ser Phe 50 55 60 Ala Val Arg Glu His Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Gly Asn 65 70 75 80 Val Leu Ala His Ala Tyr Ala Pro Gly Pro Gly lie Asn Gly Asp Ala 85 90 95 His Phe Asp Asp Asp Glu Gln Trp Thr Lys Asp Thr Thr Gly Thr Asn 100 105 110 Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu lie Gly His Ser Leu Gly Leu Phe 115 120 125 His Ser Ala Asn Thr Glu Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr His Ser Leu 130 135 140 Thr Asp Leu Thr Arg Phe Arg Leu Ser Gln Asp Asp lie Asn Gly lie 145 150 155 160 Qln Ser Leu Tyr Gly Pro Pro Pro Asp Ser Pro Glu Thr Pro 165 170 <210» 2 <2ii> ia <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> r223 a Primer <400» 2 gaaatgaaga gtcttcaa <210> 3 «211» 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Carga de Inicio <400> 3 gcgtcccagg ttctggag <210> 4 <211> 27 <212 ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Carga de Inicio 100> 4 taccatggcc tatccattgg atggagc <210> 5 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223 > Carga de Inicio <400> 5 ataggatcct taggtctcag gggagtcagg

Claims

REIVI ND ICAC IONES 1 . Un compuesto de la fórmula I I o una sal del mismo, en donde R1 es oxígeno o N H2; R2 se selecciona del grupo q ue consiste de A B en donde R3 es hidrógeno o nCH3; el enlace de línea de puntos representa un segundo enlace de valencia; m es cero o uno; y n, en cada caso, es 1 3 o 14; con las condiciones de que i) cuando R1 es NH2, el segundo enlace de valencia representado por el enlace de línea de puntos a R1 se ausenta y el hidrógeno unido al enlace de línea de puntos se presenta; cuando R1 es ox ígeno, el segundo en lace de valencia representado por el enlace de línea de puntos a R1 se presenta y el átomo de hidrógeno unido al enlace de línea de puntos se ausenta ; iii) cuando R es oxígeno, R2 es B y m es cero; y iv) cuando R1 es NH2, R3 es hidrógeno o nCH3. 2. Una proteína, fragmento de proteína , o polipéptido que contiene un residuo de aminoacilo derivado de un compuesto según la reivindicación 1 , caracterizada porque R1 es -N H2. 3. Un compuesto de la fórmula la la o una sal del mismo, en donde R3 es hidrógeno o nCH3 y n, en cada caso es 1 3 o 14. 4. Un compuesto según la reivindicación 3 seleccionado del grupo que consiste de: ácido 2-keto-4-(13C)-butírico; ácido 2-keto-3-(13C-metil)-4-(1 3C)-butírico; ácido 2-keto-4-(14C)-butírico; y ácido 2-keto-3-(14C-metil)-4-(1 C)-butírico ; o sales de los mismos. 5. U n compuesto de la fórmula Ib Ib en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de en donde R es hidrógeno o nCH3; m es cero o uno; y n, en cada caso, es 13 o 14. 6. Un compuesto según la reivindicación 5 seleccionado del grupo que consiste de: ácido L-2-amino-3-metil-5-(1 3C)-pentanóico; ácido L-2-amino-3-metil-5-( C)-pentanóico; ácido L-2-amino-3-(13C-metil)-5-(13C)-butanóico; ácido L-2-amino-3-(1 C-metil)-5-(14C)-butanóico; ácido L-2-amino-4-(13C-metil-5-( 3C)-pentanóico; y ácido L-2-amino-4-(14C-metil-5-(14C)-pentanóico; o sales de los mismos. 7. Una proteína, fragmento de proteína, o polipéptido que contiene uno o más residuos de aminoacilo , caracterizada porque uno o más residuos de am inoacilo co m prenden u n com puesto de la fórmula l lb. I lb en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de A B en donde R3 es hidrógeno o nCH3; m es cero o uno; y n, en cada caso, es 13 o 14. ^ 8. Un método para preparar un compuesto de la fórmula la 0 la o una sal del mismo, en donde R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y nCH3, y n en cada caso es 13 o 14, el cual comprende a) reaccionar un compuesto de la fórmula IV 5 ferf- butilo IV con yoduro de metilo (H3nCI) isotópicamente marcado para producir un compuesto de la fórmula V V ; b) remover los grupos de éster de tert-butilo y dimetilhidrazino para producir ácido 2-keto-4-(nC)-butírico. 9. Un método según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende además salificar el producto de reacción de la etapa b). 10. Un método según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende además c) reaccionar el producto de la etapa b) con yoduro de metilo (H3nCI) isotópicamente marcado, en donde n es 13 o 14, para producir un compuesto de la fórmula VI N 'tert- butilo 5 VI ; d) remover los grupos de éster de tert-butilo y dimetilhidrazino para producir el ácido 2-keto-3-(nC-metil)-4-("C)-butírico. 1 1 . Un método según la reivindicación 10, caracterizado ^ porque comprende además salificar el producto de reacción de la etapa d). 12. Un método para preparar una proteína, fragmento de proteína, o polipéptido que contiene al menos un residuo de aminoacilo seleccionado del grupo que consiste de 4-(nC-metil)-5-(nC)-leucilo, 5-(nC)- isoleucilo, y 3-("C-metil)-4-(nC)-valilo, caracterizado porque comprende a) modificar genéticamente un microorganismo adecuado para expresar dicha proteína, fragmento de proteína, o polipéptido; b) cultivar dicho microorganismo genéticamente modificado en un medio nutritivo que contiene un compuesto de la fórmula 0 la 5 la o una sal del mismo, en donde, en cada caso es 1 3 o 14, y R3 es hidrógeno o nCH3; y c) aislar dicha proteina, fragmento de proteína, o polipéptido. 1 3. Un método para preparar una proteína, fragmento de proteína o polipéptido que contiene al menos un residuo de aminoacilo 3-metil-5-(nC)-iso!eucilo, caracterizado porque comprende a) modificar genéticamente un microorganismo adecuado para expresar dicha proteína , fragmento de proteína, o polipéptido; b) cultivar dicho microorganismo genéticamente modificado en un medio nutritivo que contiene un compuesto de la fórmula la la" o una sal del mismo, en donde n, en cada caso es 13 o 14; y c) aislar dicha proteína, fragmento de proteína, o polipéptido. 14. Un método para preparar ácido 2-amino-3-(nC-metil)-4-(nC)-butírico, caracterizado porque comprende a) modificar genéticamente un microorganismo adecuado para expresar un homopolímero de valina; b) cultivar dicho microorganismo genéticamente modificado en un medio nutritivo que contiene un compuesto de la fórmula la' la' o una sal del mismo, en donde n, en cada caso, es 13 o 14; c) aislar el homopolímero de valina expresado por dicho microorganismo genéticamente modificado; y d) fragmentar dicho homopolímero para producir ácido 2-amino-3-("C-metil)-4-(nC)-butírico. 1 5. Un método para preparar ácido 2-amino-4-(nC-metil)-5-("C)-pentanóico, caracterizado porque comprende a) modificar genéticamente un microorganismo adecuado para expresar un homopolímero de leucina; b) cultivar dicho microorganismo genéticamente modificado en un medio nutritivo que contiene un compuesto de la fórmula la' Ia' o una sal del mismo, en donde n, en cada caso, es 1 3 o 14; c) aislar el homopolímero de leucina expresada por dicho microorganismo genéticamente modificado; y d) fragmentar dicho homopolímero para producir ácido 2-amino-4-(nC-metil)-5-(nC)-pentanóico. 16. Un método para preparar ácido 2-amino-3-metil-5-(nC)-pentanóico, caracterizado porque comprende a) modificar genéticamente un microorganismo adecuado para expresar un homopolímero de isoleucina; b) cultivar el microorganismo genéticamente modificado en un medio nutritivo que contiene un compuesto de la fórmula la" la" o una sal del mismo, en donde n, en cada caso, es 1 3 o 14; c) aislar el homopolímero de isoleucina expresada por dicho microorganismo genéticamente modificado; y d) fragmentar dicho homopolímero para producir ácido 2-amino-3-metil-5-(nC)-pentanóico. RESUME N Se proporcionan la valina , leucina, e isoleucina marcadas isotópicamente de sitio específico y los precursores biosintéticos para estos aminoácidos. Los aminoácidos se marcan con 1 3C o 14C en el (los) átomo (s) de carbono dei grupo metilo más ajeno al grupo carboxilo. También se describen los precursores bioqu ímicos de estos aminoácidos marcados, ácido 2-keto-4-(nC)butírico y ácido 2-keto-3-("C-metil)-4-(nC)-butírico en el cual n , en cada caso, es 13 o 14. También se describen las proteínas, fragmentos de proteína, y polipéptidos que contienen estos aminoácidos marcados isotópicamente de sitio específico, y los métodos para preparar los precursores bioquímicos, los aminoácidos, y las proteínas, fragmentos de proteína, y polipéptidos.