TWI223710B - The use of 13C nuclear magnetic resonance to detect binding to target molecules - Google Patents
The use of 13C nuclear magnetic resonance to detect binding to target molecules Download PDFInfo
- Publication number
- TWI223710B TWI223710B TW089105696A TW89105696A TWI223710B TW I223710 B TWI223710 B TW I223710B TW 089105696 A TW089105696 A TW 089105696A TW 89105696 A TW89105696 A TW 89105696A TW I223710 B TWI223710 B TW I223710B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- target molecule
- ligand
- target
- spectrum
- binding
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title abstract description 27
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 title description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 40
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 44
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 15
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- ZCUJYXPAKHMBAZ-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1h-imidazole Chemical compound C1=CNC(C=2C=CC=CC=2)=N1 ZCUJYXPAKHMBAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 6
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 6
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 6
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical compound CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- RHUYHJGZWVXEHW-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dimethyhydrazine Chemical compound CN(C)N RHUYHJGZWVXEHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 2-oxobutanoic acid Chemical compound CCC(=O)C(O)=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 3
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- -1 isopropyl Chemical group 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QHXDTLYEHWXDSO-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n,4-n,4-n-tetraethyl-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(Cl)=NC(N(CC)CC)=N1 QHXDTLYEHWXDSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 2
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012106 screening analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- RNQHMTFBUSSBJQ-CRCLSJGQSA-N (2R,3S)-3-isopropylmalic acid Chemical compound CC(C)[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)C(O)=O RNQHMTFBUSSBJQ-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H]1NCCC1 BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108010048295 2-isopropylmalate synthase Proteins 0.000 description 1
- KDSNLYIMUZNERS-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropanamine Chemical compound CC(C)CN KDSNLYIMUZNERS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPULXFNPTWGJQH-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-4-oxo-4-propan-2-yloxybutanoic acid Chemical compound CC(C)OC(=O)C(O)CC(O)=O KPULXFNPTWGJQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RNQHMTFBUSSBJQ-UHFFFAOYSA-N 3-isopropylmalate Natural products CC(C)C(C(O)=O)C(O)C(O)=O RNQHMTFBUSSBJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039636 3-isopropylmalate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- OPZJWMJPCNNZNT-DCAQKATOSA-N Ala-Leu-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N OPZJWMJPCNNZNT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- AENHOIXXHKNIQL-AUTRQRHGSA-N Ala-Tyr-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)CC1=CC=C(O)C=C1 AENHOIXXHKNIQL-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- IYKVSFNGSWTTNZ-GUBZILKMSA-N Ala-Val-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IYKVSFNGSWTTNZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RIQBRKVTFBWEDY-RHYQMDGZSA-N Arg-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RIQBRKVTFBWEDY-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZUFPUBYQYWCMDB-NUMRIWBASA-N Asn-Thr-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZUFPUBYQYWCMDB-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ala-Val Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- WCFCYFDBMNFSPA-ACZMJKKPSA-N Asp-Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O WCFCYFDBMNFSPA-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N Asp-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 150000000918 Europium Chemical class 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- OQXDUSZKISQQSS-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OQXDUSZKISQQSS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- RPLLQZBOVIVGMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Asp-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RPLLQZBOVIVGMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LPCKHUXOGVNZRS-YUMQZZPRSA-N Gly-His-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LPCKHUXOGVNZRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FKESCSGWBPUTPN-FOHZUACHSA-N Gly-Thr-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FKESCSGWBPUTPN-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- LVWIJITYHRZHBO-IXOXFDKPSA-N His-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LVWIJITYHRZHBO-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- RLAOTFTXBFQJDV-KKUMJFAQSA-N His-Phe-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CN=CN1 RLAOTFTXBFQJDV-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- KAXZXLSXFWSNNZ-XVYDVKMFSA-N His-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KAXZXLSXFWSNNZ-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N L-valyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBCHMHROGNUXMK-DLOVCJGASA-N Leu-Ala-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 PBCHMHROGNUXMK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- LZHJZLHSRGWBBE-IHRRRGAJSA-N Leu-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LZHJZLHSRGWBBE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- YRRCOJOXAJNSAX-IHRRRGAJSA-N Leu-Pro-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N YRRCOJOXAJNSAX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004318 Matrilysin Human genes 0.000 description 1
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 description 1
- PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N N-L-methionyl-L-tyrosine Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- ZWJKVFAYPLPCQB-UNQGMJICSA-N Phe-Arg-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccccc1)C(O)=O ZWJKVFAYPLPCQB-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- MMJJFXWMCMJMQA-STQMWFEESA-N Phe-Pro-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=CC=C1 MMJJFXWMCMJMQA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- ZCXQTRXYZOSGJR-FXQIFTODSA-N Pro-Asp-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZCXQTRXYZOSGJR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- UEHYFUCOGHWASA-HJGDQZAQSA-N Pro-Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 UEHYFUCOGHWASA-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- IQAGKQWXVHTPOT-FHWLQOOXSA-N Pro-Lys-Trp Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O IQAGKQWXVHTPOT-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- HBZBPFLJNDXRAY-FXQIFTODSA-N Ser-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HBZBPFLJNDXRAY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UTSWGQNAQRIHAI-UNQGMJICSA-N Thr-Arg-Phe Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 UTSWGQNAQRIHAI-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- NLSNVZAREYQMGR-HJGDQZAQSA-N Thr-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NLSNVZAREYQMGR-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- ABWNZPOIUJMNKT-IXOXFDKPSA-N Thr-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ABWNZPOIUJMNKT-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- NDXSOKGYKCGYKT-VEVYYDQMSA-N Thr-Pro-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NDXSOKGYKCGYKT-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- CZWIHKFGHICAJX-BPUTZDHNSA-N Trp-Glu-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 CZWIHKFGHICAJX-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- DYIXEGROAOVQPK-VFAJRCTISA-N Trp-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O DYIXEGROAOVQPK-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- JHORGUYURUBVOM-KKUMJFAQSA-N Tyr-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JHORGUYURUBVOM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BIWVVOHTKDLRMP-ULQDDVLXSA-N Tyr-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BIWVVOHTKDLRMP-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- RCMWNNJFKNDKQR-UFYCRDLUSA-N Tyr-Pro-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 RCMWNNJFKNDKQR-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- IQQYYFPCWKWUHW-YDHLFZDLSA-N Val-Asn-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N IQQYYFPCWKWUHW-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N Val-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O DVLWZWNAQUBZBC-ZNSHCXBVSA-N 0.000 description 1
- YGTAAWZKDDQUQN-ZSJPKINUSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(3r)-4-[[3-(2-ethylsulfanylethylamino)-3-oxopropyl]amino]-3-hydroxy-2,2-dimethyl-4-oxobutyl] hydrogen phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 YGTAAWZKDDQUQN-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 1
- ZLUOHLNAAZHALG-UHFFFAOYSA-N acetyl 2-hydroxypropanoate Chemical compound CC(O)C(=O)OC(C)=O ZLUOHLNAAZHALG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 108010045350 alanyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010007483 arginyl-leucyl-tyrosyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010059459 arginyl-threonyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229910052797 bismuth Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- ZAZUOXBHFXAWMD-UHFFFAOYSA-N butyl 2-oxopropanoate Chemical compound CCCCOC(=O)C(C)=O ZAZUOXBHFXAWMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-AZXPZELESA-N butyric acid-1-13c Chemical compound CCC[13C](O)=O FERIUCNNQQJTOY-AZXPZELESA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-UKLRSMCWSA-N dextrose-2-13c Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[13C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-UKLRSMCWSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 150000002314 glycerols Chemical class 0.000 description 1
- 108010028188 glycyl-histidyl-serine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010013759 hepatoglobin Proteins 0.000 description 1
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005649 metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 1
- VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N phenylbutazonum Chemical compound O=C1C(CCCC)C(=O)N(C=2C=CC=CC=2)N1C1=CC=CC=C1 VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- OYEHPCDNVJXUIW-UHFFFAOYSA-N plutonium atom Chemical group [Pu] OYEHPCDNVJXUIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108010014614 prolyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 125000006308 propyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229940005605 valeric acid Drugs 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010037084 valine-pyruvate transaminase Proteins 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007704 wet chemistry method Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B08—CLEANING
- B08B—CLEANING IN GENERAL; PREVENTION OF FOULING IN GENERAL
- B08B9/00—Cleaning hollow articles by methods or apparatus specially adapted thereto
- B08B9/02—Cleaning pipes or tubes or systems of pipes or tubes
- B08B9/027—Cleaning the internal surfaces; Removal of blockages
- B08B9/04—Cleaning the internal surfaces; Removal of blockages using cleaning devices introduced into and moved along the pipes
- B08B9/053—Cleaning the internal surfaces; Removal of blockages using cleaning devices introduced into and moved along the pipes moved along the pipes by a fluid, e.g. by fluid pressure or by suction
- B08B9/055—Cleaning the internal surfaces; Removal of blockages using cleaning devices introduced into and moved along the pipes moved along the pipes by a fluid, e.g. by fluid pressure or by suction the cleaning devices conforming to, or being conformable to, substantially the same cross-section of the pipes, e.g. pigs or moles
- B08B9/0553—Cylindrically shaped pigs
-
- E—FIXED CONSTRUCTIONS
- E21—EARTH OR ROCK DRILLING; MINING
- E21B—EARTH OR ROCK DRILLING; OBTAINING OIL, GAS, WATER, SOLUBLE OR MELTABLE MATERIALS OR A SLURRY OF MINERALS FROM WELLS
- E21B37/00—Methods or apparatus for cleaning boreholes or wells
- E21B37/02—Scrapers specially adapted therefor
- E21B37/04—Scrapers specially adapted therefor operated by fluid pressure, e.g. free-piston scrapers
- E21B37/045—Free-piston scrapers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
- G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
- G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
- G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
- G01R33/46—NMR spectroscopy
- G01R33/4633—Sequences for multi-dimensional NMR
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mining & Mineral Resources (AREA)
- Fluid Mechanics (AREA)
- Geology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- High Energy & Nuclear Physics (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Geochemistry & Mineralogy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
1223710 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明領域 本發明是有關使用核磁共振偵測化合物及富含13c之標靶 分子間結合之方法。 相關發明案之交互參考 本案是申請案No. 09,241，194之部份續篇，其公告於 1999年2月1曰，其又為No. 08/744,701之連續篇，公告於 1996年1 0月3 1日，目前為美國專利案No. 5,…，…。其又 為No. 08/678,903之部份續篇，公告於1996年7月1 2曰， 目前已放棄，其又為No. 08/558,633之部份續篇，公告於 1995年11月14日，目前為美國專利案5,…，…。 發明背景 發明新藥的最有力工具之一是任意的篩選合成的及天然 產物庫，以發現可與特定標靶分子結合之化合物（如標的 配體之鑑定）。利用此方法，配體經由與標靶分子形成物 理上相關性之能力，或其改變標靶分子功能的能力可被鑑 知。 當尋求物理性結合時，標靶分子通常曝於一個以上疑似 配體之化合物下，再進行分析以決定在標乾分子及一個以 上這些化合物之間是否形成複合物。此分析如同精藝者已 知的，測試標#巴分子大體上的變化（如大小，電荷，移動 性上之改變）可顯示複合物之形成。 當測及功能上的改變時，可發展分析條件，其中用以偵 測與標靶分子有關之生物或化學事件（如酵素-催化之反 應，受體-調介之酵素活化作用等）。為鑑定此類改變，在 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1223710 五、發明説明（2 標靶分子曝於受試化合物 、現存的物理及功能分析已可成功地用於鑑^藥要角， ΠΓ合療性化合物。然而，在這些分析中有固有的 限制，可危及其正確性，可信度及效率。 是有關“偽陽性，，的產生。在一個典型的功能分析：要= 二广生:，結果是因其可啟動分析，但此化合物並無 丨"-秀生欲求的生理反應。在典型的物理分析中，仆 合偽陽性”係其本身可黏附至標乾，但卻是呈非特里 万式(如非特異的結合）。當篩選較高濃度之推想配體時:、 偽陽性是特別普遍且有問題的，因為許多化合物在這：濃 度下有非特異的作用。 二版 於相似方式中，既存的分析法常為“偽陰性，，問題所困， 化合物在分析中有陰性反應，但料下來以其他 某些万法則可知其確實是標乾之配體。偽陰性結 通常是分析中受試化合物濃度太高(造成毒性 ： 致，此和化合物對標乾之結合或解離常數有關。太低所 現存分析法的另—個問題是分析本身可提供的資料有 L雖然分析法可正確地鑑定出可黏附至或自標革巴分子中 物：但這些分析法通常對於標乾分子上之 •八，、、口口上，或觉試化合物及標靶分子間之結構活性 關：並ΐ法提供任何的資料。當筛選分析是用來鑑定出L 的^汗九（要角時’無法提供此類任何資科是特別成問題 目月!已建4 X·射線結晶學可用來鑑定有機溶劑在大 -5 G張尺度適财目目家鮮(c^iir2.1QX297公釐） 1223710 A7 B7 五 發明説明（ 3 分子上之結合位置。然而，此方法無法決定標把上不同位 置之相對結合親和力。其僅可應用至極穩定的標把蛋白 質’其在南濃度有機溶劑存在下不致變性。 此外，由於決定個別結晶結構需長時間，此途徑並不適 合快速測試大量化合物，因化合物是化學上多樣的，此途 徑限於定出僅少數有機溶劑之結合位置舆圖。 快速，有效率及可信賴的決定配體/標靶結合之方法， 及訂定標靶物質上結合位置輿圖之方法，揭示於美國專利 案 No. 5,698,401 及 5,804,390 屬 Fesik，et al.。這些專利中揭 示偵測配體化合物與標靶生物分子結合之方法，其中係自 ‘革巴生物分子中產生第一及第二核磁共振關聯光譜 (correlation spectrUm)，此分子係以NMR-可測及之 15N核種同位素的加豐。第一光譜是在無配體下由標靶物 質收集之數據所得，第二光譜則是在一種以上配體存在 下。二光譜的比較，可決定推想配體混合物中是何化合物 可結合至標靶生物分子，以及有關結合位置的特殊資料。 由於方法可謗生關於標靶分子上結合位置之資料，方法口 用來對配體與預選之標靶有最佳的設計。 ’可 因為Fesik，et al.之NMR方法（上文）依據為1Sn之標靶分 子之同位素加豐而定，需有含氮的標靶分子，因此^供= 應用不同型式同位素加豐之標靶分子之 & '、可 一 u万法，對於枯 蟄而言可貴之貢獻。 、 發明要！!;_ 本發明提出偵測一個以上推想配體及其 · 八視域疋且同位素 -6 - 1223710
加豐之標靶分子間之結合的方法。 本發明進一步提出在化合物混合物中篩選可與預選定且 同位素加豐之標靶分子結合之方法。 本發明也提出決定配體化合物與預選定且同位素加豐之 標革e生物分子結合之解離常數的方法。 另外&出決定13C -加豐之標革巴分子可因配體結合而受影 響之特異胺基酸之方法。
又提出的是由本發明篩選之方法中鑑知之化合物，此篩 選方法選自可與預選定且同位素加豐之標靶分子結合之化 合物混合物中。 附圖說明 裝 圖1說明均勻13C-標記之FKBP之關聯光譜。 圖2說明在加入2 -苯基咪唑（〇·12ηΐΜ)之前（薄的多重輪 廓）及之後（厚的單一輪廓），均句l3c _標記之FkbP 13C / 4 關聯光譜之甲基區域。
線 圖3 明FKBP在、纈胺酿基及白胺酸基殘基選擇性 13C/15N/2H-標記，於加入2-苯基咪吐（〇.25mM)之前（薄的 多重輪廓）及之後（厚的單一輪廓），l3c / 1η關聯光譜的甲 基區域。 圖4說明FKBP在丙胺醯基選擇性i3c _標記，於加入2 -苯 基咪唑（0.25mM)之前（薄的多重輪廓）及之後（厚的單一輪 廓），13C / iH關聯光譜之甲基區域。 圖5說明FKBP三度空間結構之“板狀模式，，描述。 1明詳細說明 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) 1223710
五、發明説明（
A7 B7
在本說明書中所用的術語有其一般可接受的意義。以下 特殊術語有所述之定義。 DTT ”表示二硫異赤絲藻醇。 FKBP ”指與F K -結合蛋白質。 ‘‘ HEPES ”表示N-2-喪基乙基六氫p比呼乙其石^ 酸0 “ IPTG ’’表示異丙基_ β - D -硫吡喃半乳糖菩。 “PMSF”指α-甲苯磺醯氟。 “ SCD ”指在基質落素之催化區域（§ 1 -256殘基）。 任何可生成高解析NMR光譜且可為l3c均勾地或選擇性 加豐的任何標靶生物分子均可用於本發明方法中。因此這 些方法可應用至任何欲求的13C -加豐之標乾生物分子，^ 括脂蛋白，脂蛋白片段，糖蛋白，糖蛋白片段，蛋白質G 蛋白質片段，多肽，DNA及RNA。13C的天然同位素=度 是1.11%。因此，在有機分子内任何特定碳原子是Bc: ^ 然率通常約0.01 1 1。 / 為了增加和1¾碳原子核種及任何相鄰氳原子間之自旋麵 合有關之NMR訊號證明數據之強丨，因料望增加欲研突 之標靶分子之天然13C含量。為完成此可均勻地或選擇性 地以13c加豐標把分子。如本說明書及所附中請專利範圍 中所用的，所謂“均勻加豐，，，“均勾地加豐”，“均勾加豐 的 句勻才“己及肖勻標記的，，表示以合成方式將數據 ::=咖，則整個標乾分子任意選擇之碳原子或 方，、辜知疋C。另一万面，所謂“特異的加豐，，，“特異加
裝 訂
-8 -
1223710 A7
表7JT 一個 豐”’ “特異地加豐的” ’“特異標記’，及“特異標記的，， 利用合成方法增加數值至大於〇.〇丨丨丨，在標乾八子 以上特異預選定位置之碳原子或然率是。 例如，由生長在含有均勻加豐之葡萄糖之營養培養 基中之經遺傳修飾的微生物所表現之生物八 " 〜刀卞，可被均勻 地C加豐之。換另一方面，由在含有丙胺酸之營養谇養 基中之遺傳修飾微生物所表現之蛋白質，其中丙胺酸^在 甲基側鏈上被13C_加豐，將可為含於表現蛋白質之丙胺醯 基殘基處之13c特異地加豐。 本發明方法，其中應用13C同位加豐作用，可應用至任何 的有機標靶分子，包括含有氮者。方法也可用來分析其中 特異的碳原子位置已被加豐之標靶分子分析（如丙胺醯 基，白胺醯基，異白胺醯基，及纈胺醯基之甲基）。甲基 與醯胺比較下有較有益之鬆弛特性，當應用至較大標的生 物分子時較有益（MW>30 kDa)。 多肽及蛋白質在活有機體中進行許多重要角色。以下提 出之實例是應用多肽來說明本方法。對於本發明方法而 吕’多肽及蛋白質片段含有較佳的標革巴物質類型。然而， 應了解，本發明方法可應用至其他可被13C -加豐之標乾物 質。 以下示出均勻且特異13C -加豐之示範多肽標靶分子製 劑。製備含有適量均勻或特異13c -加豐之多肽之標革巴分子 的方法包括，以含有編碼欲求多肽之聚核苷酸之表現載體 轉形於宿主細胞。蛋白質或多肽蛋白質片段之表現，係在 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
% 訂
五、發明説明 含有技藝中已知之可同仆的13p*、@、 . 心』U化的C源 < 培養基中培養經轉形 的細胞株。用於均句l3r炉, J J 己《較佳的可同化源是均勻％ _ 標記的葡萄糖或H葡萄糖’可購自Cambridge Isotope
Laboratories。於位置特異的標記中’標革巴多肽％ _標記之 可同化源包括商品化牿昱13Γ挪—、、从& G秤/、 C -铋圮 < 胺基酸。在特異加豐 之另外具體實例中，本3人與1 4_土 Jη 口万；S養培養基中之13C可同化源是 月^基酸13\標記之生合成前軀體。例如，α_酮基-丁酸酯 是兴白胺酸之生合成觔軀體，且α •酮基-異戊酸酯則是纈 胺酸及白胺酸之生合成前軀體。以下流程〗示出如何合成 白胺酸，異白胺酸，及纈胺酸特異Uc _加豐之生合成前軀 體。相當廉價的13c ·加豐之甲基碘（H 313C J)可充作同位素 黏附之來源，以產生C -末端標記之α _酮基丁酸及α _酮基· 異戊酸。 使用均勻地13c-加豐之營養物，如-加豐的葡萄糖是 將13c -加豐物列入標靶物質的合宜方法；然而，其十分昂 貴。然而，在勻勻地13C _標記之標靶中大量的碳位置，將 有一個共價鍵結的鄰居，其也被13C -標記，引入13C _ 13C _ 偶合，其可負面地衝擊標靶生物分子中13C _標記位置之訊 號一對一雜訊比例及鬆弛特性。特別的益處可由13C位置 特異地標1己標革巴多肽而達成。如上文中所陳述的，此其可 以在營養培養基中納入商品化之13C -標記之胺基酸而成。 然而，此點仍是十分花錢，但在需標記標靶多肽中某些胺 基驢基殘基之狀況下，此也是企求的。然而，13c -標記多 肽標靶分子的較佳方法包括，在含有13c -標記之胺基酸生 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1223710 A7 B7 五、發明説明（ 合成前軀體之營養培養基中培養經遺傳修飾之細胞株。特 3之’被標記之較佳胺基酸前軀體包括α - g同基丁酸及α _ 酉同基-兴戊酸。這些前軀體之生合成產物有白胺酸，異白 胺酸，及纈胺酸，其中特殊的側鏈甲基被13C _加豐。因為 在甲基中，各自有三個氫原子連接至13C -標記之碳原子 上’因此相當的N M R訊號特別強且獨特。 標記α -目同基-丁酸及α -酮基-異戊酸之合成次序涉及以 13C -加豐之甲基碘甲基化丙酮酸中之末端碳原子。一般而 言，α -酮基酸之烷化作用，如丙酮酸酯，先天上是困難 的，且因有許多副產物之形成可伴隨婦醇化物之分解。然 而 ’ Τ· Spencer，et al.，Tetrahedron—Letters，1975, 3889，及 D.R· Williams，etal.上文，1990，5881，已示出相當的肟之 ’元化作用可容易地完成’且D. Enders，et al.，Angew. Chem.
Int· Eng· Ed·，1992，618 及 D· Enders，et al·，Synlett，1992, 901已證明腙也可在無分解下容易地烷化。 於流程I，丙酮酸第三丁酯，1，經由與N，N-二甲基肼在 二乙醚中，於室溫下，反應而轉化成相當的N，N-二甲基 腙，2。生成的腙，2，在四氫呋喃溶液中冷卻至_78°C， 再以溴化鋰，繼以二異丙基醯胺鋰處理，可形成中間的 吖-烯丙基烯醇化物。晞醇化物以i3c _標記之甲基蛾烷 化’以產生膝3。3的第二回貌化作用可產生經標記的二甲 基化腙，4。3及4以HC1/THF或Et20，及HC1氣體 / C Η 2 C 12可產生相當的1¾ -末端標記之α -酮基酸，5及 6 ( 4 ( 13C ) - 丁酸及 4 - (13C ) - 3 - (13C )-甲基丁酸）。 -11 -
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公D
裝
線 1223710 A7 B7 五、發明説明（9 ) 流程I 經標記前軀物之化學合成 h3c\〇YCH3 ό ch3 N，N-二甲基肼 CH h3c，n、n ch3 環己烷，熱 O CH: 〇 1. (視所需）LiBr, LDA 2. H3nCI, THF, -78°C CH3
V H3nC，Y 〇
C〇〇H nCH,
H3nC，YC〇〇H 斗 1· INaqHCl/THF 或Et》0 2. HC1 氣體/CH2Cl2 Λ O ch3 nCH^ 0 CH3 1. (視所需）LiBr, LDA 2. Η3·α, THF, ·780ϋ CH, 或Ε【2〇 2.HC1 氣體/CH2CI2
ch3 〇Υ〇η3 ^ l"CH3 O CH, 3 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1223710 A7 B7 五、發明説明（10 ) 流程11，111及I V分別說明這些α -酮基酸如何生合或轉 化成13C -白胺酸，13C -異白胺酸及13C -纈胺酸。在所有的 流程中，同位加豐位置以星號示出。 流程11 經標記異白胺酸之生化合成
COOH 乙醯乳酸酯合成酶
丙酮酸 co2
H3C
ch3 COOH
0H 乙酮醉-酸 道原異構酶
NADH
NAD+ 1.二羥酸去氫酶 〇 2.還原酶
分支鏈 酸轉胺酶
H3C
COOH ΝΗ2
L-穀胺醯胺 2-酮殺胺醯胺 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1223710 A7 B7 五、發明説明（11 ) 流程111經標記白胺酸之生化合成 CH h3c
COOH 2-異丙基蘋果酸酯合成酶 乙随基-CoA H2〇
CoA CH,
3-異丙基蘋果 酸6§去氫酶 H.0 CH 3 h3c
COOH 3·異丙基蘋果酸 δ旨去乱 HO COOH 13 Η,Ο
CHU
NAD'
NADH
H,C
ChK
3-異丙基蘋果酸 酯去氫酶 0^ 14
L-穀胺酿胺 2-酮基:殺胺磕胺 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1223710 A7 B7 五、發明説明（12 )
流程I V 纈胺酸之生化合成
〇 6
COOH 纈胺酸-丙酮酸 轉胺酶
L·纈胺酸
COOH 製備其中含有編碼特異多肽之聚核甞酸序列之表現載 體，及以這些載體轉形宿主細胞之方法是技藝中熟知的。 (如見，R. W. Old，et al·，“Techniques of Gene Manipulation，”
Blackwell Science，London，1994，此領域中類似的論述）。 另外，培養轉形細胞以表現編碼多肽之方法，及分離，純 化及再折疊多肽的方法是技藝中熟知的。下示之實例說 明，自經修飾之E. coli中產製人類基質溶素及FK結合蛋 白質（FKBP) 8 1-256胺基酸催化區之13C-加豐的樣品，以及 這些同位加豐之多肽在本方法中之用途。 當本方法用來篩選一種以上可與標靶分子結的化合物 時，例如化合物混合物或體，且其中在由單獨的標把分子 產生之第一光譜及標靶分子加上化合物中產生的光譜間生 成差異時，要進行額外的步驟以鑑定混合物中可確實與標 靶分子結合之特殊化合物。這些額外的步驟包括將13C -加 豐之標靶分子個別地曝於混合物各化合物下；產生經標記 標靶分子的二度空間UC/1!! NMR關聯光譜，其係個別曝於 各化合物下的；將各光譜與由單獨標靶分子產生之第一光 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1223710 A7 B7 五、發明説明（13 ) 譜比較，以決定所比較光譜中任一者之差異。在光譜上的 差異有助於鑑定出為配體之化合物。 在二度空間關聯光譜中，特定13C / iH訊號之化學位移值 相當於標靶分子中原子集團之已知特異所在（例如，標靶 分子特定胺基酸殘基之碳原子，或在多肽例子中，特異標 記在丙胺酿基，白胺醯基，異白胺酿基及纈胺酿基殘基之 甲基上）。因此本發明的篩選方法，不僅可用於鑑定與特 定標靶分子結合之化合物，也可決定可因化合物與標靶分 子結合而受影響之特殊胺基酸。化學位移值可反映出標靶 分子構型的變化，或可反映出標乾化合物在相當於特殊訊 號之位置處之結合。 此外，若欲求時可以本方法決定特定配體及其標靶分子 之解離常數，KD，即產生13C -標記之標靶分子之第一個二 度空間13<：/咕NMR關聯光譜；將經標記之標靶分子曝於各 種濃度的配體下；產生所應用配體在各濃度下之二度空間 13<3/屮NMR關聯光譜；所產生之光譜與標靶分子的第一光 譜比較；由其中之差異利用方程式1，估算出標靶分子及 配體間之解離常數： ([P〇]-x)([L〇]-x) KD=-
X 其中[PQ]是標靶分子之總莫耳濃度，[L〇]是配體的總莫耳 濃度，且X是結合種類之莫耳濃度。X數值依方程式2，且 N M R化學位移數據中決定： -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐)
裝
1223710 A7 B7 五、發明説明（14 ) β觀察值-5自由態 X 二- Δ 其中5觀察值是所觀察得之化學位移數值’ 5自由態是自由態 種類之化學位移值，且Δ是飽和時有限化學位移值（5飽和） 及未結合至配體之標靶分子化學位移值（5自由態）間之差 異。 再決定解離常數，係利用標準的曲線配合統計方法，變化 其數值直到以所觀察之數值得到最佳之配合為止。在（？飽和 之數值是未直接已知之狀況中，KD及飽和可予以變化， 且生成之數據接受相同的曲線配合統計方法。 本篩選方法一個有益處在於，可在第二分子已結合至配 體存在下，決定標靶分子的一個配體的解離常數。此點在 應用“濕式化學”分析方法決定配體與標靶分子受質結合之 其他方法中通常是不可能的。 配體解離常數之決定，可在第二結合配體存在下進行。 因此，13c -標記之標靶分子標靶曝於受試化合物之前，先 結合至第二配體。篩選方法另外可對第二或接續配體與標 靶分子之結合提供資料。此第二配體可與已結合至標靶分 子之第一配體化學鏈結，因此提供新的組成分子以用於影 響標靶分子。 本發明的篩選方法始自同位加豐標靶分子二度空間 13C / iH關聯光譜之產生或獲得。如上文所陳述的，標靶分 子可以13C均勻地加豐，或可由13C -甲基納入丙胺醯基，白 胺醯基，纈胺醯基及異白胺醯基中而特異地加豐。產生二 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
裝
^23710 A7 ^_____B7 五、發明説明（15 ) 度空間13c/iH關聯光譜之方法，是技藝中熟知的。所記錄 的NMR光譜通常是二度空間Uc/iH異核單量子關聯 (HSQC)光譜’然而也可使用精藝者已知之其他技術。因 為相當於蛋白質之UC/ΐΗ訊號通常可充份解析，因此個別 的13C /咕對化學位移變化可容易地追蹤。Uc _標記之標革巴 多肤（FKBP)具代表性的二度空間i3C/咕關聯光譜示於圖 1。特異13C-加豐之FKBP之代表性二度空間化/咕關聯光 譜示於圖3。 13C -標記之標靶分子曝於一種以上受試化合物之後，可 產生第二個二度空間i3C/ iH NMR關聯光譜。此光譜之產 生如上述之相同方式。再比較第一及第二光譜，以決定二 者間有否任何的差異。二度空間i3c/ lH NMR關聯光譜間 之差兴’可_示出存在有和標乾分子上i3C _標記位置相當 之配體。這些差異可利用精藝者熟知之標準步驟來決定。 圖2 π出加入2 -苯基咪唑（〇·ι2mM)之前（薄的多重輪廓）及 之後（厚的單一輪廓），均勻13C -標記之FKBP之甲基區域。 在二度空間關聯光譜中之特殊訊號，相當於標革巴 分子中特異的碳及質子原子（如蛋白質胺基酸中特殊的甲 基）。經由實例，可由圖3中看出，在f K B P二度空間 13C /1 Η關勝光譜（曝於受試化合物）中，可察到之化學位移 係發生在第9 7位置（白胺酸）及5 5位置（纈胺酸）上之殘基 處。負責與個別化合物結合之蛋白質區域，可由一旦加入 化合物係而變化之特殊碳及質子原子對中鑑知。 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1223710 A7 B7 五、發明説明（彳6 ) 實例 製備1 製備人類基質溶素均勻13C -加豐之催化區域（SCD ) 基質溶素81-256片段（SEQ ID NO:l)(SCD)之製備，係將 可指導合成蛋白質片段產製之質體引入E coli株中，並在 適當的培養基中培養經遺傳修飾之細菌菌株。蛋白質片段 自培養基中分離，純化，再依據本發明方法用於其與受試 化合物親和力方面之二度空間NMR分析。下述其製備過 程步驟。 人類皮膚纖維細胞（ATCC NO· CRL 1507)利用Clark et al.，Archiv. Biochem. and Biophys· 241:36 (1985 )所述之步 驟生長及謗導。總RNA利用RNAgents® Total RNA分離系 統套組（Promega Corp.)自1克細胞中分離，依廒商操作指 示進行。1微克RNA在80°C下加熱5分鐘便變性，再利用 GenAmp® RNA PCR 套組（Applied Biosystem/Perkin-Elmer) 依循操作指示接受逆轉錄酶PCR。 進行隱匿 PCR ， 係利用第一引子 （a) GAAATGAAGAGTCTTCAA (SEQ ID NO :2) 及（b) GCGTCCCAGGTTCTGGAG (SEQ ID NO. 3)及 35 個（94 °C，2分鐘；4 5 °C，2分鐘；及7 2 °C，3分鐘）循環。之後 是 内 部 引 子 之 再 擴 大 （c) TACCATGGCCTATCCATTGGATGGAGC (SEQ ID NO: 4)及 (d) ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG (SEQ ID NO: 5 )利用上述3 0個相同條件之循環，以產生可指導合成 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
裝 玎
1223710 A7 _____ B7 五、發明説明（17 ) 人類基質溶素胺基酸1-256殘基之DNA序列。 pCR片段再依廠商指示，選殖至PCR選殖載體pT7BIue® (Novagen，Inc·)。生成之質體以Ncol及BamHI切割，基質 A素再繼以選殖至表現載體pET3d中（Novagen，Inc.)。 指導合成胺基酸殘基81 -256，加上啟始的甲硫胺酸胺基 酿基殘基之成熟的基質溶素表現構體，以PCR擴大作用產 自1-256表現構體。所生成之PCR片段先選殖至PT7BIue® 載體（Novagen，Inc.)再繼代選殖至pET3d載體（Novagen， Inc·)，利用廠商指示如上述方式進行，可產生質體 pETST-83-256。此最終質體和Qi-Zhuang所述的相同， Biochemistry，31:1 1231 (1992)，例外之處在於本負體指導 合成之肽序列始自人類基質溶素序列的較早二個胺基酸， 在8 1位置處。質體pETST_83-256轉形至E coli株BL21 (DE3)/pLysS (Novagen，Inc·)，依廒商指示可產生表現株， BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-l。 製備預培養用培養基，係將1.698克的NaH2P04 · 7H20， 0.45 克 KH2P〇4，0.075 克 Naa，0.150 克 NH4C卜 0.3 克 U-13C-葡萄糖，3 00微升1M MgS04水溶液及1 5毫升CaCl2水溶液 溶於1 5 0亳升去離子水中。生成的預培養培養表基溶液滅 菌，再轉移至無菌的500毫升有擋板燒瓶中。在以細菌株 接種至預培養培養基之前，於燒瓶内加入含有3 4毫克/毫 升氯徵素於100 %乙醇及1.5毫升含有20毫克/毫升氨芊青 徵素溶液之1 5 0毫升溶液。燒瓶内容物再以1毫升遺傳修 飾之E coli BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-l 之甘油貯液接 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1223710 A7 _ B7 五、發明説明（~ίΓ)~ " 種。燒瓶内容物在3 7 °c下震盪225 rpm，直到可觀察到 0.65之光密度為止。 製備醱酵營養基，係將113.28克，Na2HP04*7H20，30 克ΚΗ2Ρ04，5克NaCl及1 〇毫升1 % DF-60抗起泡劑溶於 9604毫升去離子水中。此溶液置於New Brunswick
Scientific Micros Fermenter 中，再於 121 °C 下滅菌 40 分 鐘。在接種至醱酵培養基之前，以下預先滅菌的組份立即 加至醱酵容器内容物中：100毫升1〇% NH4C1水溶液，1 5 克均句i3C —加豐之葡萄糖，2 〇毫升m MgS04水溶液，1毫 升1M CaCl2水溶液，5毫升硫胺素鹽酸鹽水溶液（丨〇毫克/ 愛升），10毫升含有34毫克/毫升氯徵素於1〇〇 %乙醇之溶 液’及1 · 9克氨苄青徵素溶於氯徵素溶液中。生成溶液之 pH值加4N H2S04水溶液使調成pH 7.00。 由震盪燒瓶上述擴大規模步騾而來的E coli株EL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-l，加至醱酵槽内容物中，令細胞 生長土達到〇 · 4 8光舍度為止。在此過程中，暖酵槽内容物 依所需加入4N H2SOpt4N KOH自動維持在pH 7〇。醱酵 槽内容物之溶氧量，經由階式環維持在55%空氣飽和度以 上，其可在溶氧量減至5 5%以下時增加攪動速率。空氣以 每分鐘7個標準升（SLPM)加至醱酵槽内容物中，且培養物 溫度在整個過程中均維持在3 7 °C。 細胞以，17,000g離心10分鐘而回收’生成之細胞團 塊收集後貯於-85t下。濕細胞產率為3 5克/升。以硫酸 十二酯鈉聚丙埽醯胺凝膠電泳（SDS_PAGE)分析溶胞產物 -21 -
1223710 A7 B7 五、發明説明（19 ) 可溶的及不溶部份，顯示在可溶相中可見到5 0 %的基質溶 素。 如上製備之基質溶素片段，應用Ye，et al.，Biochemistry， 31:1 1231 (1992)技術之變化法純化。且收的細胞懸浮在20 mM Tris-HCl緩衝溶液（pH 8.0)，疊氮化鈉溶液，其中含 有 1 mM MgCl2，0.5 mM ZnCl2，2 5 單位 / 毫升 Benzonase® 酵素（Benzon Pharma)，及由4-(2 -胺乙基）苯續B盛氟 (“AEBSF”），亮肽素抑肽素®及肽制素®(濃度均為1毫 克/毫升）組成的抑制劑混合物。AEBSF，Leupeptin®(亮肽 素），Aprotinin ®(抑肽素）及Pepstatin®(肽制素）均可購自 American International Chemical。生成的混合物緩緩攪動 1 小時，再冷卻至4 °C。細胞再利用5 0 %功率循環超音波地 瓦解。生成的溶胞產物以14,000 rpm離心3 0分鐘，不溶的 流份團塊冷凍於-80°C下以進一步處理。 在上清液中加入硫酸銨固體，使達到2 0 %飽和點，生成 的溶液填加至700毫升苯基Sepharose快流管柱内（”(^-Sepharose FF) (Pharmacia Biotech)。填料前，Sepharose 管 柱以 50 mM Tris-HCl 缓衝溶液（pH 7.6，4 °C )，5 mM CaCl2，及1M (NH4)2S04平衡。填加的管柱以（NH4)2S04濃度 漸減之水溶液（由1 Μ至0 Μ )及CaCl2濃度漸增的水溶液（由 5 mM至20 mM)於Tris-HCl緩衝溶液，pH 7.6之直線梯度 溶離。收集溶離液中活性流份，在Amicon攪拌小池中濃縮 (Amicon，Inc.)。濃縮樣品在Q-Sepharose FF管柱所用之起 始緩衝溶液中，即50 mM Tris-HCl (pH 8.2，4°C )加有10 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1223710 A7 B7 五、發明説明（20 ) mM CaCl2，透析一夜。 經透析的樣品再填加至Q-Sepharose FF管柱，並以含有 起始緩衝溶液及200 nM NaCl之線性梯度溶離。基質溶素 片段之經純化的可溶部份予以濃縮，再貯於4 °C下。團塊 溶於8 Μ胍-HC1中。溶液以20,000 rpm離心2 0分鐘，上清 液再逐滴加至折疊緩衝溶液中，其中含有50 mM Tris-HCl (pH 7.6)，10 mM CaCl2，0·5 mM ZnCl2及 AEBSF，亮肽素 ®，抑肽素®及肽制素之抑制劑掺合物（濃度均為1微克/毫 升）。折疊緩衝溶液之體積是上清液的1 0倍。上清液及折 疊緩衝溶液之混合物以20,000 rpm離心3 0分鐘。來自此離 心之上清液貯於4°C，團塊接受溶於胍-HC1，折疊於緩衝 溶液，及離心的上述步·驟二次。混合三次離心中各最終的 上清液，再加入硫酸铵固體至2 0 %飽和度。因此衍生自不 溶部份的溶液，再接受如何溶流份般之苯基Sepharose及Q_ Sepharose之純化。經純化的可溶及不溶流份混合，產生約 1 . 8毫克經純化的基質溶素81-256片段（SCD)，以每克原 有溶胞產物計，並以13C均勻加豐。 製備2 製備人類基質溶素特異13C -加豐之催化部份（S C D ) SCD之表現係在含有13C -加豐之α -酮基丁酸及α -酮基-異戊酸之培養基中，培養BL21(DE3)/pLysS/pETST-255-l 經修飾的E coli株。用於製備E coli經遺傳工程株，及表 現，分離及純化蛋白質片段之方法述於上文，除了使用U-12C-葡萄糖，取代U-13C-葡萄糖外。 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1223710 A7 B7 五、發明説明（21 ) 製備3 製備均勻特異13C -加豐之FKBP A . 製備特異13C -加豐的Val/Leu FKBP 將以指導合成人類FKBP之質體所轉形之細胞/如Egan，et al·，Biochemistry 32: 1920-1927 (1993 )所述）培養在 100% D20培養基中，其中含有15NH4C1 ( Cambridge同位素）為唯 一的氮源（1 · 0克/升）及全氘化的葡萄糖（1 · 5克/升）為碳源 (Cambridge同位素）。細胞培養在3 7 °C中，並震盪燒瓶内 容物直到得到1 . 0之光密度為止。於謗導於1小時，在培養 基中加入 80 毫克的 L -纈胺酸-U-13C5-15N-2,3-d2 (Cambridge 同位素）。培養物以1 mM IPTG謗導1 2小時。 細胞以17,000 xg離心1 0分鐘（4 °C )下而回收，生成之細 胞團塊再懸浮於含有5 mM DTT及1 mM PMSF之50 mM磷 酸鹽緩衝溶液中（pH 7.4)，並利用French壓力器機制地解 離之。生成之溶胞產物以25,000 rpm離心3 0分鐘。將固體 硫酸铵加至上清液中，使達4 0 %飽和點，再以1 8,000 rpm 離心5分鐘。上清液以10 mM HEPES (pH 8.0)在4°C下離心 1 2小時。生成的溶液再填加至1 0毫升Q-Sepharose快流式 管柱（Sigma )，其中已用透析緩衝溶液預先平衡。收集流 份，滙集，並以Amicon流動小池濃縮。溶液再以含有10 mM DTT及0.01 %疊氮化鈉之20 mM磷酸鹽緩衝溶液（pH 6.5)透析。 B . 特異13C -加豐之Val/Leu/Ile FKBP之製備 將指導合成人類FKBP之質體所轉形之細胞（如Egan et al. -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
裝 訂
1223710 A7 _ B7 五、發明説明（22 ) 所述，Biochemistry，32:1920-1927 (1993)，培養基在含有 NH4C1為唯一氮源（1 · 〇克/升）及葡萄糖（丨.5克/升）為碳源 之培養基中。細胞生長在3 7 °C下，燒瓶内容物再震盪直到 得到1 · 0之光金度為止。誘導前1小時，在培養基中加入 100毫克的α -酮基-丁酸及α·酮基-異戊酸。培養物以1 mM IPTG謗導1 2小時。欲表現蛋白質之表現，分離及純 化如上述。 C,_均勻13C -加豐之FKBP之製備 將指導合成人類FKBP之質體所轉形的細胞（如Egan et al · 所述，Biochemistry，32:1920-1927 (1993)，培養基在含有 15NH4C1 ( Cambridge同位素）為唯一氮源（1 · 〇克/升）及均句 13C -加豐之葡萄糖（1.5克/升）為碳源（Cambridge同位素）之 培養基中。欲表現蛋白質之表現，分離及純化如上述。 實例1 利用均勻13C -加豐之FKBP之13C / 4 NMR關聯 光譜來篩選配體 依上述步驟製備均勻l3C -加豐之FKBP。用於篩選分析之 蛋白質溶液含有均句13C -加豐之FKBP (0.2 mM及疊氮化鈉 (0.05%：UfH2O/D2O (9/1)磷酸鹽緩衝之溶液（20 mM，pH 6.5)。 在裝置有三重共振探針及Bruker樣品交換儀之Bruker DRX 500 NMR分光計上，以30 °C產生二度空間13c/ih NMR 光譜。13C/1H hSQC 光譜利用 3771 Hz (13C，y 及 8333 Hz pH，t2)之掃描寬度，以64 x 1024集合點獲得。收 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1223710 A7
裝
訂
1223710 A7 __ _ B7 五、發明説^~) "" 光譜。光譜（128複合點，4掃描/fid)在0.1 mM FKBP樣品 於20 mM磷酸鹽（PH 6.5)，0.01 %疊氮化鈉，及1 0%氧化 氣（D20)中獲得。 圖1示出均勻13C -標記之FKBP之13C/iH關聯光譜。光譜 (128複合點，4掃描/fid)在FKBP O.lmM樣品於20 mM磷酸 鹽（pH 6.5)，0.01%疊氮化鈉及1〇〇/。氧化氘）(〇2〇)中獲得。 圖2示出均勻13C-標記之ρκΒΡ (0.2 mM)在加入2-苯基咪唑 (0·25 mM)之前（薄多重輪廓）及之後（厚單一輪廓）13c/ih 關聯光譜（64複合點，8掃描/ fid)之甲基區域。可示出在 胺基醯基殘基Leu 97，VaL55，lie56及lie90上有化學位移的變 圖3示出在纈胺醯基及白胺醯基殘基選擇性i3c/i5N/2H標 各己FKBP ’在加入2 -苯基咪吨（〇·25 mM )之前（薄的多重輪 廓）及之後（厚的單一輪廓）之/咕關聯光譜（4 8複合點， 8掃描/ fi d)。所有的其他條件和圖1中所說明的，用來產 生光譜的相同。示出一旦結合後，可示出顯著變化之選擇 性殘基。同樣的，在化學位移數值上的變化顯示，結合係 發生在Leu97及VaL55殘基處或近處。 圖4示出選擇性〗3c標記在丙胺醯基殘基之ρκΒΡ，在加 入2-苯基咪唑（〇·25 mM)之前（薄的多重輪廓）及之後（厚的 單一輪廓）之13C/ iH關聯光譜。加入配體之前（薄的多重輪 廓）及之後（厚的單一輪廓）化學位移值之絕徑位置顯示， 丙胺酿基無一者涉及於結合之中。 圖5示出FKBP三度空間之“板狀模示，，描述。標出選定殘 基之編號以助具象化。蛋白質中涉及於結合位置之胺基醯 基殘基以粗體字示出。 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公嫠) 1223710 A7
序列表 <ll〇> Fesik, Stephen W.
Hajduk# Philip J. <l2〇> 13C核磁共振測標靶分子結合之用途 <130> 5816.US.P3 <160> 5 <1·70> FastSEQ for Windows Version 3 ·0
<210> 1 <211> 174 <212> PRT <213>人工序列 一 <220> <223>人類基質溶素之Sl-256催化區域 <400> 1 \
Phe Arg Thr Phe Pro Gly lie Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu Thr 1 5 10 15
Tyr Arg He Val Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Lys Asp Ala Val Asp 20 -25 30
Ser Ala Val Glu Lys Ala Leu Lys Val Trp Glu Glu Val Thr Pro Leu 35 40 45
Thr Phe Ser Arg Leu Tyr Glu Gly Glu Ala Asp 工le Met lie Ser Phe 50 55 60
Ala Val Arg Glu Kis Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Gly Asn 65 7〇 75 80
Val Leu Ala His Ala Tyr Ala Pro Gly Pro Gly lie Asn Gly Asp Ala 85 90 95 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) U237l〇
A7 B7 26 ) 五、發明説明（
His Phe Asp Asp Asp Glu Gin Trp Thr Lys Asp Thr Thr Gly Thr Asn 100 105 110
Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu lie Gly His Ser Leu Gly Leu Phe 115 120 125
His Ser Ala Asn Thr Glu Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr His Ser Leu 130 135 140
Thr Asp Leu Thr Arg Phe Arg Leu Ser Gin Asp Asp lie Asn Gly 工le 145 150 155 160
Gin Ser Leu Tyr Gly Pro Pro Pro Asp Ser Pro Glu Thr Pro 165 170
<210> 2 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 ____ <220> <223>.引子序列 <400> 2 gaaatgaaga gtcttcaa \ g
<210> 3 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 — <220> <223> 引子序列 ： ， <400> 3 _ gcgtcccagg tcctggag 18 <210> 4 <211> 27 <212> DMA <213> 人工序列 -29- ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1223710 A7 B7 五、發明説明（27 ) <220> <223> 引子序列 <400 > 4 taccacggcc tatccattgg acggagc 27 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子序列 <400> 5 ataggatcct taggtctcag gggagtcagg 30 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)
Claims (1)
1223710 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 7. —種決定配體解離常數之方法，此配體係可結合至預選 擇且13C -加豐之標靶分子，此方法包括： a) 產生該標靶分子第一個二度空間13C / 4 NMR關 聯光譜； b ) 該標靶分子曝於各種濃度的配體下； c ) 在b )步騾配體各濃度下，產生二度空間13C /咕 NMR關聯光譜； d) 將（c)步驟之各光譜與（a)步騾之第一光譜比較； 及 e) 計算出解離常數。 8. 根據申請專利範圍第7項之方法，其中該標靶分子選自 下列包括：脂蛋白，脂蛋白片段，糖蛋白，糖蛋白片 段，蛋白質，蛋白質片段，多肽，DNA及RNA。 9. 根據申請專利範圍第8項之方法，其中該標靶分子選自 蛋白質，蛋白質片段，及多肽。 10. 根據申請專利範圍第8項之方法，其中該標靶分子係被 均勻地13C -加豐。 11. 根據申請專利範圍第8項之方法，其中該標靶分子係被 均勻13C -加豐的。 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/288,924 US20010004528A1 (en) | 1995-11-14 | 1999-04-09 | Use of 13c nuclear magnetic resonance to detect binding to target molecules |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TWI223710B true TWI223710B (en) | 2004-11-11 |
Family
ID=23109248
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW089105696A TWI223710B (en) | 1999-04-09 | 2000-03-28 | The use of 13C nuclear magnetic resonance to detect binding to target molecules |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20010004528A1 (zh) |
| EP (1) | EP1169648B1 (zh) |
| JP (1) | JP4723094B2 (zh) |
| AR (1) | AR024540A1 (zh) |
| AT (1) | ATE327510T1 (zh) |
| AU (1) | AU776165B2 (zh) |
| CA (1) | CA2365385C (zh) |
| CO (1) | CO5241342A1 (zh) |
| CY (1) | CY1107474T1 (zh) |
| DE (1) | DE60028196T2 (zh) |
| DK (1) | DK1169648T3 (zh) |
| ES (1) | ES2264930T3 (zh) |
| HK (1) | HK1044817B (zh) |
| IL (1) | IL145135A (zh) |
| MX (1) | MXPA01010180A (zh) |
| PT (1) | PT1169648E (zh) |
| TW (1) | TWI223710B (zh) |
| WO (1) | WO2000062074A1 (zh) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10139465A1 (de) * | 2001-08-10 | 2003-02-20 | Bayer Cropscience Ag | Selektive Herbizide auf Basis von substituierten, cayclischen Ketoenolen und Safenern |
| DE10160177A1 (de) * | 2001-12-07 | 2003-06-26 | Novaspin Biotech Gmbh | Verfahren zur Auffindung von Liganden die an ein drug target binden mittels 1H,1H-Kernresonanzspektroskopie |
| US20030148391A1 (en) * | 2002-01-24 | 2003-08-07 | Salafsky Joshua S. | Method using a nonlinear optical technique for detection of interactions involving a conformational change |
| DE10221158A1 (de) * | 2002-05-13 | 2004-02-19 | Novaspin Biotech Gmbh | Verfahren zur Auffindung von Liganden, die an ein drug target binden, mittels heteronuklearer Kernresonanzspektroskopie |
| KR100901309B1 (ko) * | 2002-06-15 | 2009-06-09 | 크리스탈지노믹스(주) | 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법 |
| US20040132102A1 (en) * | 2002-10-29 | 2004-07-08 | Maurizio Pellecchia | Use of selective labeling to detect and characterize molecular interactions by nuclear magnetic resonance spectroscopy |
| NO20025738D0 (no) | 2002-11-29 | 2002-11-29 | Amersham Health As | Metode |
| WO2006082963A1 (ja) * | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | 標的分子とリガンドあるいはリガンド候補化合物との結合検出方法 |
| US9182406B2 (en) | 2008-08-04 | 2015-11-10 | Biodesy, Inc. | Nonlinear optical detection of molecules comprising an unnatural amino acid possessing a hyperpolarizability |
| GB2503604B (en) | 2011-03-21 | 2020-04-22 | Biodesy Llc | Classification of kinase inhibitors using second harmonic optical techniques |
| WO2016106286A1 (en) | 2014-12-23 | 2016-06-30 | Biodesy, Inc. | Attachment of proteins to interfaces for use in nonlinear optical detection |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0856067A4 (en) * | 1995-10-19 | 2005-09-21 | Smithkline Beecham Corp | BINARY CODING METHOD FOR USE IN COMBINATION CHEMISTRY |
| AU711092B2 (en) * | 1995-11-14 | 1999-10-07 | Abbvie Inc. | Use of nuclear magnetic resonance to design ligands to target biomolecules |
| US5698401A (en) * | 1995-11-14 | 1997-12-16 | Abbott Laboratories | Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules |
-
1999
- 1999-04-09 US US09/288,924 patent/US20010004528A1/en not_active Abandoned
-
2000
- 2000-03-21 DK DK00918228T patent/DK1169648T3/da active
- 2000-03-21 WO PCT/US2000/007524 patent/WO2000062074A1/en active IP Right Grant
- 2000-03-21 JP JP2000611085A patent/JP4723094B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-21 DE DE60028196T patent/DE60028196T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-21 CA CA002365385A patent/CA2365385C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-21 AU AU39077/00A patent/AU776165B2/en not_active Ceased
- 2000-03-21 EP EP00918228A patent/EP1169648B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-21 IL IL145135A patent/IL145135A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-03-21 ES ES00918228T patent/ES2264930T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-21 PT PT00918228T patent/PT1169648E/pt unknown
- 2000-03-21 MX MXPA01010180A patent/MXPA01010180A/es active IP Right Grant
- 2000-03-21 AT AT00918228T patent/ATE327510T1/de active
- 2000-03-28 TW TW089105696A patent/TWI223710B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-04-06 CO CO00025248A patent/CO5241342A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-04-07 AR ARP000101598A patent/AR024540A1/es unknown
-
2001
- 2001-10-03 US US09/970,156 patent/US20020037529A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-06-25 HK HK02104719.0A patent/HK1044817B/zh not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-08-08 CY CY20061101110T patent/CY1107474T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004510952A (ja) | 2004-04-08 |
| AR024540A1 (es) | 2002-10-16 |
| WO2000062074A8 (en) | 2003-10-23 |
| AU3907700A (en) | 2000-11-14 |
| JP4723094B2 (ja) | 2011-07-13 |
| US20020037529A1 (en) | 2002-03-28 |
| EP1169648B1 (en) | 2006-05-24 |
| CY1107474T1 (el) | 2012-12-19 |
| HK1044817A1 (en) | 2002-11-01 |
| DK1169648T3 (da) | 2006-09-11 |
| DE60028196T2 (de) | 2007-03-29 |
| MXPA01010180A (es) | 2002-10-23 |
| DE60028196D1 (de) | 2006-06-29 |
| HK1044817B (zh) | 2006-12-22 |
| US20010004528A1 (en) | 2001-06-21 |
| EP1169648A1 (en) | 2002-01-09 |
| CA2365385C (en) | 2009-11-03 |
| IL145135A (en) | 2007-06-17 |
| ATE327510T1 (de) | 2006-06-15 |
| WO2000062074A1 (en) | 2000-10-19 |
| AU776165B2 (en) | 2004-08-26 |
| CO5241342A1 (es) | 2003-01-31 |
| PT1169648E (pt) | 2006-09-29 |
| ES2264930T3 (es) | 2007-02-01 |
| CA2365385A1 (en) | 2000-10-19 |
| IL145135A0 (en) | 2002-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110582566B (zh) | 肽连接酶及其用途 | |
| US6340578B1 (en) | 13C, 15N, 2H labeled proteins for NMR structure determinations and their preparation | |
| TWI223710B (en) | The use of 13C nuclear magnetic resonance to detect binding to target molecules | |
| Sakai et al. | Evolution of enzymatic activities in the enolase superfamily: N-succinylamino acid racemase and a new pathway for the irreversible conversion of D-to L-amino acids | |
| Brandt et al. | Microwave heating for solid-phase peptide synthesis: general evaluation and application to 15-mer phosphopeptides | |
| Wanigasekara et al. | Arginine-Selective chemical labeling approach for identification and enrichment of reactive arginine residues in proteins | |
| US20060293229A1 (en) | Site-specific isotopically-labeled proteins, amino acids, and biochemical precursors therefor | |
| Phan-Chan-Du et al. | Structure of Antibody-Bound Peptides and Retro− Inverso Analogues. A Transferred Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy and Molecular Dynamics Approach | |
| CA2368652C (en) | Site-specific isotopically-labeled proteins, amino acids, and biochemical precursors therefor | |
| Xu et al. | Separate site catalysis by pyruvate phosphate dikinase as revealed by deletion mutants | |
| KR102669378B1 (ko) | 펩티드 리가아제 및 그의 용도 | |
| TWI247804B (en) | Sphingolipid ceramide deacylase gene | |
| FORM et al. | ENZYME REGULATION AND MECHANISM IV (2634-2639) | |
| Ferguson | Design, preparation, and characterization of metallo-adducts of the histidine-containing phosphocarrier protein from Bacillus subtilis | |
| Agrawal et al. | Chemoselective Protein Modifications: Methods and Applications for the Functionalization of Viral Capsids | |
| JPH05227975A (ja) | 遺伝子とその利用法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |