JP2000500565A - コンビナトリアルケミストリーにて用いるための２元的コード化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は固体相合成樹脂に共有結合により結合しているリガンドまたは化合物を¹³Ｃおよび／または¹⁵Ｎを含有するタグで標識する技法に関するものである。この高分解能アイソトープフィルター処理した¹Ｈ ＮＭＲ、およびマジック角回転プローブを用いるタグ化は、一般に、非破壊的で、樹脂結合サンプルは無傷のままであり、さらなる化学的変化に利用できることが判明した。この系での検出限界(＜８００ピコモル)はＮＭＲを「１ビーズ、１化合物」コンビナトリアルケミストリーライブラリーの内容を解読するのに使用するのに十分である。

Description

【発明の詳細な説明】 コンビナトリアルケミストリーにて用いるための２元的コード化方法発明の分野 複合的なコンビナトリアルライブラリーは、合成されたライブラリーの内容を 同定する技法を必要とする。非破壊的であり、一貫して信頼できる技法が本発明 の目的である。発明の背景 複合的なコンビナトリアルライブラリーの構築において、ライブラリーの内容 を解読するための効率のよい方法が必要とされている。ライブラリーを構築する のに必要な全ての反応条件およびライブラリーの個々の成分を開裂するための条 件に対して安定な分子タグを開発する必要がある。 複合的なコンビナトリアルライブラリーをコードするにおいて、実現可能な技 法（Ｏhlmeyerら、Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.，117:5588（1995））として２元的コー ド化方法が確立されている。このタグ化技法は、たとえ用途が広いとしても、タ グが同定され、リガンド歴が解読されうる前に、タグはビーズから取り除かれな ければならない。 同定前にタグをビーズから取り外すことが必要なため、使用されており、以前 に利用可能であった技法には多くの制約がある。従って、ビーズからそれらを取 り外す前に、目的のリガンドを同定する方法が必要である。発明の概要 本発明はコンビナトリアルライブラリーの内容を解読するのに効率的な方法で ある技法を提供する。この技法は固相合成樹脂の単一のビーズに結合したままの 化合物を選択的に同定するのに利用される。¹³Ｃおよび／または¹⁵Ｎタグはライ ブラリー構築時にそれに課せられる全ての反応条件に対して安定であり、ライブ ラリーの目的とするリガンド（すなわち、個々の成分）を開裂するための条件に 対しても安定である。従って、この技法は、目的とするリガンドの同定をその取 り外しの前 後で解読できる手段を提供する。標識化された基質の検出は（多元的（multidim ensional）アイソトープーフィルター処理した¹Ｈ ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）によるの が好ましい。図面の簡単な記載 図１は、Ｗang樹脂に結合した¹³Ｃ標識基質を示す。 図２（ａ）は、標準的な商業上入手可能なヘテロ核Ｎano−ＮＭＲプローブの デカップラー・コイル（decoulper coil）を用いて単一のビーズ上で得られる、 樹脂に結合した図１の化合物の５００ＭＨzの¹³Ｃ−フィルター処理した¹Ｈ Ｎ ＭＲスペクトルを示す。 図２（ｂ）は、図２（ａ）の対応するフィルター処理していない¹Ｈ ＮＭＲス ペクトルを示す。 図３は、前記と同一の単一のビーズサンプル上で得られた２元的¹Ｈ¹³Ｃ ＨＭ ＱＣスペクトルの概略プロット（contour plot）を示す。発明の詳細な記載 固相合成（ＳＰＳ）樹脂に共有結合した化合物の高解析能¹Ｈ−ＮＭＲスペク トルを生じさせうるＮＭＲ技法が開発されている。本発明はコンビナトリアルラ イブラリーの内容を解読するための、すなわち樹脂の単一（１００um）のビーズ に結合した物質を検出するための、この高解析能ＮＭＲ技法の新規用途を提供す る。この方法では、２コイル高解析能マジック角回転（ＭＡＳ）プローブ（Ｂar bara,Ｔ.Ｊ.Ｍagn.Ｒeson.，Ｓer.Ａ.，109:265-269（1994））のアイソトープ −フィルター処理した¹ Ｈ ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）（Ｂaxら、Ｓ.Ｊ.Ｍagn.Ｒeson.，67:565-569（1986） ）を用いて、¹³Ｃおよび／または¹⁵Ｎ標識化合物を選択的に検出する。この技法 は樹脂ビーズの標識されていない部分より生じる信号を抑制し、従って結合化合 物を明確に同定できるようになる。 現在、サンプルは化学的または光分解のどちらかにより樹脂から開裂され（Ｌ loyd-Ｗilliamsら、Ｔetrahedron，49(48):11065-11133（1993））、通常の構造 決定技法により分析される。しかしながら、ポリマーマトリックスに結合したま まのサンプルを分析できる分析技法を開発することに強い関心が寄せられている 。これはかかる技法の１つである。この技法が非破壊的であるという事実もまた 「ワンビーズ、ワンコンパウンド」のコンビナトリアルケミストリーの急速に拡 がった分野において特に有用である。（Ｌamら、Ｊ.Ｎature，354:82-84（1991 ）；Ｌeblら、Ｂiopolymers，37:177-198（1995））。これらの実験では、何百 万個かのビーズの可能性のある（何百万種の構造を意味する）多様なライブラリ ーを含有する反応混合物を試験できる。この混合物から、望ましい活性を有する １個のビーズのみを単離でき、この方法の成功は、限定的に、この単一のビーズ に通常結合する約０．１〜１ナノモルのサンプルの構造決定に依存している。( Ｍaddenら、Ｐrespect.Ｄrug Ｄiscovery Ｄes.，2:269.285（1994）)。 固相合成(ＳＰＳ)技法(Ｍerrifield,Ｒ.Ｂ.,Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.85:2149-2154 (1963))が発展分野のコンビナトリアルケミストリー（Ｇallopら、Ｊ.Ｍed.Ｃhe m.37:1233-1251（1994）；Ｇordonら、Ｊ.Ｍed.Ｃhem.37:1385-1401（1994）） と一緒になり、現在、薬物開発および一般の化学に大きな影響を与えている。残 念ながら、ＳＰＳサンプルのための分析技法は合成技法ほど高度に開発されてな い。 古典的なペプチドコンビナトリアルケミストリーでは、例えば、ペプチドをビ ーズから開裂し、エンドマン（Ｅdman）分解法またはマス・スペクトロノミー（ massspectronomy）のどちらかにより配列決定する。この方法は単純な繰り返し 単位で構築されていない非ペプチドサンプルではうまくいかず、そこで「コード 化法」が開発された（Ｂrennerら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ，89:5381-5 383（1992））。樹脂ライブラリーをコードするために、付加的「タグ」化合物 をを各ビーズに加え、その合成歴を明らかにし、開裂し、かつ同定（ＧＣまたは ＧＣ／ＭＳにより）可能な独特な「バーコード」（Ｃhabalaら、Ｐerspect.Ｄru g Ｄiscovery Ｄes.2:305-318（1994））を形成し、一次サンプルを間接的に同 定する。使用されたリポータータグの例としては、ヌクレオチド（開裂し、ＰＣ Ｒにより増幅し、配列決定される）（Ｂrennerら、前掲；Ｎeedelsら、Ｍ.Ａ.Ｐ roc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ，90:10700-10704（1993）を参照のこと）、ペプ チド（エドマン分解により配列決定される）（Ｋerrら、Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.115 :2529-2531（1993））、または炭化水素相同体およびポ リ塩素化芳香族化合物の一連の組み合わせ（ＧＣにより分析）（Ｏhlmyerら、Ｐ roc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,90:10922-10926（1993）；Ｂorchardtら、Ｊ.Ａm .Ｃhem.Ｓoc.117:373-374（1994）；およびＢaldwinら、Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.117 :5588-5589（1995））が挙げられる。全てのケースにおいて、リポータータグの 使用は合成法を複雑化し、副反応および副生成物を生じる危険性を増加させ、単 に構造に関する間接的な証拠をもたらすにすぎない。コード化構造の存在もまた 結合アッセイの結果に影響を及ぼすかもしれない。最近、コード化リガンドを使 用せずに、ペプチド（Ｙoungquistら、Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.,117:3900-3906（199 5）；Ｅgnerら、Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.,60:2652-2653（1995）；Ｂrummelら、Ｓcience ,264:399-402（1994））およびペプトイド（Ｚambiasら、Ｔetrahedron Ｌett.3 5:4283-4286（1994））の単一ビーズサンプルを分析できる、新しいＭＳ技法が 開発されたが、かかる方法は全て一般に破壊的である。 ＳＰＳ樹脂から開裂したサンプルを分析するのにＮＭＲ分光学が一般に用いら れるが、たとえ樹脂が溶媒添加により膨潤されていても、樹脂結合サンプルのＮ ＭＲスペクトルは非常に幅広のラインからなる。比較的低解析能の¹Ｈおよび¹³ Ｃ ＮＭＲスペクトルが報告されているが（Ｇiralt,Ｅ.ら、Ｔetrahedron 40:41 41-4152（1984）；Ａlbericioら、Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.54:360-366（1989）；および Ｍazureら、Ｃ.Ｒ.Ａcad.Ｓci.Ｓer.２，303:553-556（1986））、大きなスペク トル分散が少なくとも部分的には広い線幅を補うので、¹³Ｃ ＮＭＲがより有用 であることが判明している。樹脂結合サンプル中に部位特異的¹³Ｃ標識を組み込 むと、¹³Ｃ ＮＭＲを用いて合成ＳＰＳ反応の進行をモニターするのが容易にな ることが示されている(Ｌookら、Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.59:7588-7590（1994））。 本発明は適当なＳＰＳ成分または化合物その物のいずれかを¹³Ｃ／¹⁵Ｎ標識を 用いてコードする技法に基づく。好ましくは、コンビナトリアル作業に必要な標 識量を低減させるためには、コーディング法は二元的である。しかしながら、個 々の独特に標識されたビーズを検出し、コンビナトリアルライブラリーを同定で きることが知られている。標識基質の検出はマジック角回転（ＭＡＳ）で（多元 的）アイソトープフィルター処理した¹Ｈ ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）によるのが好まし い。この組 み合わせは今ではＮano ＮＭＲプローブ技法として周知である。この技法は逆検 出によって¹³Ｃ／¹⁵Ｎ標識に結合したプロトンを選択的に観察する能力を利用し ている(Ｍuller,Ｌ.、Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.,101:4481(1979);Ｂaxら、Ｊ.Ｍag.Ｒe son.67:565（1986））。 アイソトープフィルター処理したＮＭＲによる¹³Ｃ−および／または¹⁵Ｎ−で 標識した炭素および／または窒素に結合したプロトンを間接的に検出することに より、標識していない炭素および／または窒素に結合したプロトン由来のシグナ ルをすべて抑制することにより、プロトン共鳴を選択的に検出することができる （Ｂaxら、Ｓ.Ｊ.Ｍagn.Ｒeson.67:565-569（1986）；Ｂaxら、Ｊ.Ｍagn.Ｒeson .55:301-315（1983））。この技法はタンパク質および核酸のような生物学的巨 大分子の構造決定に広範に適用される。（Ｇ.Ｍ.ＣloreおよびＡ.Ｍ.Ｇonenborn 、ＮＭＲ of Ｐroteins,ＣＲＣプレス、Ａnn Ａrbor、（1993））。本発明はこ の理論をコンビナトリアルケ ミストリーの適用における使用に新規に適用し、さらに単一のビーズにおける新 規な使用にも適用する。 コンビナトリアルケミストリーライブラリー中の単一のビーズに結合する物質 の量は、約０．１〜１ナノモルである。樹脂、不純物からの、および溶媒からの 大きなバックグラウンドシグナルが存在する中、このように少量の物質を検出す るのは大変な難題である。これらの問題を解決するために、コンビナトリアルラ イブラリー中に¹³Ｃおよび／または¹⁵Ｎ標識をタグとして結合させ、次いでアジ ック角回転（ＭＡＳ）条件下でアイソトープフィルター処理したＨ ＮＭＲ（Ｈ ＭＱＣ）のごとき適当なＮＭＲ技法を用いて（Ｂarbaraら、Ｊ.Ｍagn.Ｒeson.， Ｓer.Ａ，109:265-269（1994）；およびＧarroway,Ａ.、Ｊ.Ｍagn.Ｒeson.,49:1 68-171（1982））、¹³Ｃおよび／または¹⁵Ｎ標識した化合物を選択的に検出する 。この技法は樹脂ビーズの標識していない部分からのシグナルを抑制し、従って 、結合化合物の従来の明確な同定が可能になる。 以下のスキーム(スキームII−３工程ライブラリーにおける典型的なライブラ リーの構成化合物を示す)に示すように、タグをライブラリー合成の進行に伴っ て組み込むことができる。タグは二元的コードとして使用できる。本発明の別の 態様ではまたタグ化標識をリガンド自身に組み込むことができる。実施例で示す ように、タグＡ、ＢおよびＣは、提案されているアイソトープフィルター処理の 技法を用いて容易にモニターできる、独特な¹Ｈおよび¹³Ｃ化学シフトを有する （Ｓpectroscopic methods in Ｏrganic Ｃhemistry、Ｗiilams ＆ Ｆleming、 ＭcＧraw Ｈill（1966））。記載するように、この技法は標識（¹³Ｃ／¹⁵Ｎ）が リガンド自身に組み込まれた場合にも用いることができる。 この実験は、逆検出およびマジック角回転能を有し、プロトン振動数３００− ７５０ＭＨｚで作動する２チャンネルＮＭＲ分光器で実施できる。マジック角回 転能を有する２元的プローブ（１Ｈで¹³Ｃ、¹⁵Ｎデカップリングを観察する）が この目的のために必要である。 本発明の別の態様は、多くの異なる¹³Ｃ／¹⁵Ｎ標識を−のサンプルに利用する （すなわち、従来の二元法でビーズをコードする）か、または¹³Ｃ／¹⁵Ｎ標識の 部位を利用し、さらなる情報をコードする能力にある。任意の付加的、かつ分裂 する可能性のある化学構造を樹脂に加えなくても、任意の複雑な相互に適合でき る平行合成法を設計しなくてもコード化が起こり、検出が非破壊的になされるた め、この方法はサンプルを無傷のまま、樹脂に結合したままでなされる。この新 規の技法のさらなる特徴では、所望により、サンプルをさらなる化学的変化また は分析に供することができる。 この技法により、均等に標識した分子の合成、および続いて多次元アイソトー プフィルター装着ＮＭＲ実験による分析が可能になる。本明細書においては、こ の実験で約８００ピコモルの物質が示されているが、この技法により１００ピコ モルほどの少量のサンプルの検出が可能になる。加えて、ＮanoＮＭＲプローブ の¹Ｈ デカップラー・コイルをこれらの実験に使用したが、他のより効率的な反 転−幾何学的デザインのプローブを用いることで、単一のビーズに結合した低量 の物質を検出するのに必要な感度が得られることがわかる。実施例 このように少量の物質の¹Ｈ ＮＭＲスペクトルは、典型的には、溶媒バックグ ラウンド、不純物、サンプルセルの外側の指紋、およびビーズ自体のポリスチレ ン骨格による小さなピークから生じた大きなシグナルにより、複雑化される。こ れらの問題を克服するために、[３,５−ジメトキシ−¹³Ｃ]安息香酸（化合物１ 、図１）を合成し、それを１００μｍ径のＷang樹脂ビーズに結合させ、アイソ トープフィルター処理したＮＭＲを用いて[３,５−ジメトキシ−¹³Ｃ]基のプロ トン共鳴を選択的に観察した。１Ｄ（１元的）化合物１の¹³Ｃ−フィルター処理 した¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２(ａ)に示す。[３,５−ジメトキシ−¹³Ｃ]基の プロトン(３.７ppm)および溶媒の¹³Ｃサテライトが明確に観察できる。対応する フィルター処理していないスペクトルを図２（ｂ）に示し、大きなバックグラウ ンドシグナルが存在するためにプロトン共鳴への割り当てが困難であることがス ペクトルから明らかである。これらのシグナル、およびポリスチレン樹脂自体か らの非−¹³Ｃ-標識のピークは¹³ Ｃ−フィルター処理したスペクトルにおいて完全に抑制されている。化合物の 完全な構造特性はスルーボンドおよびスルースペースのプロトン−プロトンまた はプロトン−炭素連結相互作用に依存し、これらは、通常２Ｄ（２元的）ＮＭＲ データより得られるため、データを図３にて¹Ｈ−¹³Ｃ ＨＭＱＣの２Ｄバージョ ンで示す。再度、[３，５−ジメトキシ−¹³Ｃ]基のプロトンおよび溶媒の¹³Ｃサ テライトから生じる相互関係は明確に可視化できる。これらのデータは、感受性 および選択性が、１Ｄ ＮＭＲを用いて単一の樹脂ビーズに結合したままの独特 の¹³Ｃ標識基質を観察するのに十分であり、混合物を分析する必要がある／あっ た場合、２Ｄ ＮＭＲは実施可能であったことを証明している。 より詳細には、図２ａは、標準的な商業上入手可能なヘテロ核Ｎano・ＮＭＲ^{T M} プローブのデカップラー・コイルを用いて、単一のビーズ上で得られた、Ｗang 樹脂に結合した化合物１の５００−ＭＨｚでの¹³Ｃフィルター処理した¹Ｈ ＮＭ Ｒスペクトルを示す。単一のビーズを標準（４０μl）Ｎanoプローブ・セル中ジ クロロメタン−_d2 ３０μｌに懸濁させ、約２ＫＨｚで、マジック角（５４．７ °）で回転させた。このプロトンスペクトルは、¹³Ｃデカップリングでなく、５ ．３２ｐｐｍで残留プロトン化ジクロロメタン共鳴のプレ飽和（presaturation ）（１１Ｈｚフィールド強度で１秒間）で作動させるＨＭＱＣ配列¹の１元的バ ージョンを用いて得られた。全実験時間は１７０分（５０００トランジエント、 １．０２秒獲得時間、１．０秒プレ飽和遅延）であった。図２ｂは１パルス実験 を用いて得られた¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。全実験時間は２５０分（５００ ０トランジエント、２．０５秒獲得時間、１．０秒プレ飽和遅延）であった。両 スペクトルを４ＨＺの指数的加重（exponential weighting）（ジクロロメタン^{1 3} Ｃサテライトは２Ｈｚの線幅であるが、あまり可動性のない[３，５−ジメトキ シ−¹³Ｃ]共鳴は２０Ｈｚの線幅である）で処理した。 前記するように、図３は同一の単一のビーズサンプル上に得られた２Ｄ ¹Ｈ−¹³ Ｃ ＨＭＱＣスペクトルの概略プロットを示す。¹³ＣＨ₃Ｏ−プロトンのｆ₂周 波数でのｆ₁横断面をも示し、これは¹²Ｃに結合するプロトンの感受性が高く良 好に抑制することの両方を示している。１７．５時間の実験では１２８msec獲得 時間、 １．１３秒プレ飽和遅延、４９ハイパーコンプレックスｔ₁−データポイント並 びに５ｋＨｚおよび８ｋＨｚスペクトルの線幅の各々のための５１２スキャン、 並びにｔ₁およびｔ₂の各々におけるコサインおよび１０Ｈｚ指数的加重の間、広 幅バンド（３．５ｋＨｚ）¹³Ｃ ＧＡＲＰ−１デカップリング³¹を用いた。 ３個の異なる単一ビーズサンプルを試験し、この技法の再現性を証明した。前 記するように、この研究を用いて、１Ｄ ¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルは¹³Ｃ標識単一 ビーズサンプル上に得ることができることをも示された。Ｎanoプローブサンプ ルセルはレシーバー・コイルの活性領域内でサンプル（最高４０μｌ）の１００ ％を制限し、単一のビーズでもいつも検出できることを確認する。 化合物１はＣalbiochemより入手した１００−２００メッシュのＭerrifield樹 脂に結合し、Ｗang,Ｓ.Ｓ.、Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.，95:1328-1333（1973）に記載 される方法に準じて機能化した。ＮＭＲ用に選別したビーズは光顕微鏡により測 定し、直径１００μｍになるようにした。 本明細書において引用した特許、特許出願および公開の明細書は全て出典明示 により本明細書の一部とした。 前記の記載は全て、本発明の好ましい具体例を包含する本発明を開示する。本 明細書に具体的に開示した具体例の修飾および改良は以下の請求の範囲内である 。さらに詳細に記載せずとも、当業者は前記の記載を使用し最大限に本発明を利 用できると考える。従って、本明細書の実施例は単に説明のためのみであると解 釈すべきであり、本発明の範囲をいかなる様にも限定するものではない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コンビナトリアルライブラリーの内容を解読する方法であって、 （ａ）コンビナトリアルライブラリーに含まれる化合物を、コード化した¹³ Ｃおよび／または¹⁵Ｎ標識でタグ化し； （ｂ）その標識をＮＭＲで検出すること； からなる方法。 ２．コード化が２元的コーディングである請求項１に記載の方法。 ３．ＮＭＲ技法がアイソトープフィルター処理した¹Ｈ ＮＭＲである請求項１ または２に記載の方法。 ４．ＮＭＲ技法をマジック角回転を用いて行う請求項３に記載の方法。 ５．ＮＭＲ技法が反転−幾何学的デザインのプローブを使用する請求項１に記 載の方法。 ６．化合物がポリマーマトリックスに結合している請求項１ないし３の何れか に記載の方法。 ７．化合物および／または樹脂がサンプル中で異なる¹³Ｃ標識で標識されてい る請求項１または２に記載の方法。 ８．化合物および／または樹脂がサンプル中で異なる¹⁵Ｎ標識で標識されてい る請求項１または２に記載の方法。 ９．化合物および／または樹脂がサンプル中で異なる¹³Ｃ／¹⁵Ｎ標識で標識さ れている請求項１または２に記載の方法。 １０．コード化が¹³Ｃの¹⁵Ｎ標識に対する比率によるものである請求項１、２ 、７、８、または９の何れかに記載の方法。 １１．化合物がコンビナトリアルケミストリーライブラリー中の単一のビーズ に結合している請求項１に記載の方法。 １２．ビーズが固体であるかまたは膨潤している請求項１１に記載の方法。 １３．ビーズが溶液中にある請求項１１に記載の方法。