CH690695A5 - Verfahren zum Nachweis biologisch aktiver Substanzen in Substanzbibliotheken. - Google Patents

Description

  
 



  Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis zumindest einer in einer Substanzbibliothek vorliegenden Substanz (Ligand) unter Verwendung zumindest einer weiteren, an den Liganden bindenden Substanz (Rezeptor). 



  Solche Verfahren sind aus dem biochemischen Laboralltag bekannt. 



  Eine Substanz im Sinne der vorliegenden Erfindung kann ein Molekül, ein Aggregat oder Komplex aus mehreren gleichen oder verschiedenen Molekülen und/oder Atomen sein. 



  Ein Ligand, der an einen Rezeptor bindet, also eine Bindungsaffinität für diesen Rezeptor aufweist, wird als biologisch aktive Substanz bezeichnet. 



  Unter Substanzbibliotheken, die auch kombinatorische Bibliotheken genannt werden, versteht man synthetische oder natürliche Gemische, in denen mehrere verschiedene Substanzen enthalten sind. Die Menge und die Identität der einzelnen in der Bibliothek enthaltenen Substanzen sind meist nicht bekannt, oft kennt man aber das Herstellungsverfahren, durch das diese Gemische erhalten wurden. Solche Substanzbibliotheken k²nnen entweder aus einer Art von Verbindungen bestehen, bspw. aus Peptiden, oder organisch synthetisierten Verbindungen, sie k²nnen jedoch auch verschiedene Komponenten umfassen, wie bspw. Pflanzenextrakte. Auch komplexe Bestandteile wie ganze Viren, Bakterien oder Zellen k²nnen in einer Substanzbibliothek enthalten sein. 



  Substanzbibliotheken spielen vor allem in der Arzneimittelforschung eine wesentliche Rolle, wenn es darum geht, als Arzneimittel geeignete Substanzen in komplexen Gemischen nachzuweisen oder in solchen Gemischen neue biologisch aktive Substanzen zu finden. 



  Solche Untersuchungen werden auch als "Screening" von Substanzbibliotheken bezeichnet. Das Screening, also die Untersuchung, ob eine interessierende Substanz oder eine Substanz mit potenziell interessanten Eigenschaften in einer Substanzbibliothek vorliegt, erfolgt dann mit einem Rezeptor. Der Rezeptor stellt die Angel dar, mit der der Ligand aus der Substanzbibliothek gefischt werden kann. 



  Zum Screening von Substanzbibliotheken sind die verschiedensten Verfahren entwickelt worden, die sowohl in der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung als auch in der biochemischen und medizinischen Grundlagenforschung eingesetzt werden. Weit verbreitete Verfahren sind bspw. der ELISA-Test, der RIA-Test, die Affinitätschromatographie oder die verschiedenen bekannten Blotmethoden, der Western-, Northern- oder Southern-Blot. 



  All diesen Verfahren ist es gemeinsam, dass der Ligand in der Substanzbibliothek mithilfe des Rezeptors räumlich von den übrigen Substanzen der Bibliothek getrennt wird. Diese räumliche Trennung kann während oder nach der Bindung des Rezeptors an den Liganden erfolgen. Zu dieser räumlichen Trennung ist es notwendig, dass einer der Bindungspartner (also entweder der Rezeptor oder die Komponenten der Substanzbibliothek) an einen festen Träger immobilisiert wird. Solche Träger liegen meist in Form von Mikrotiterplatten, Chromatographieharzen, Kügelchen ("beads") oder Filterpapieren vor. 



  Um den Rezeptor-Liganden-Komplex nachweisen zu k²nnen, ist es häufig ausserdem noch notwendig, eines der beteiligten Moleküle zu markieren, sei es radioaktiv oder nicht radioaktiv. Alternativ kann auch ein spezifisches Nachweismittel wie bspw. ein Antik²rper dazu verwendet werden, den Rezeptor-Liganden-Komplex zu detektieren. 



  Bei der zum Screening von Substanzbibliotheken weit verbreiteten Affinitätschromatographie wird bspw. der Rezeptor an ein Chromatographieharz immobilisiert und mit diesem eine Chromatographiesäule hergestellt. Wenn über diese Säule eine Substanzbibliothek gegeben wird, in der ein Ligand für den an die Säule  gekoppelten Rezeptor enthalten ist, so bindet dieser spezifisch an den immobilisierten Rezeptor und kann so von den übrigen Substanzen der Bibliothek abgetrennt werden. Der Nachweis des Liganden erfolgt danach z.B. durch Elution des Liganden von der Säule und nachgeschaltete Nachweisreaktionen. 



  Diese Nachweisreaktionen k²nnen darin bestehen, den Liganden mit einem spezifischen Antik²rper nachzuweisen, oder, wenn er markiert war, diese Markierung nachzuweisen. 



  Häufig ist es nicht m²glich, die Substanzen einer Bibliothek zu markieren, und häufig hat man auch keine spezifischen Antik²rper zum Nachweis in der Hand, vor allem dann nicht, wenn ein neuer Ligand in der Substanzbibliothek identifiziert werden soll. 



  Dann müssen Verfahren zur chemischen Analyse durchgeführt werden, bspw. Sequenzierreaktionen, die derzeitig allerdings nur für Nukleinsäuren und Peptide m²glich sind. 



  Eine weitere M²glichkeit der Analyse des über den Rezeptor von der Substanzbibliothek abgetrennten Liganden ist die Massenspektrometrie. Sie wurde in jüngster Zeit in zunehmendem Masse dazu eingesetzt, Substanzbibliotheken zu analysieren. 



  Ein derartiges Verfahren ist aus der WO 96/22 530 bekannt. Hierbei wird ein Rezeptor zur einer Substanzbibliothek gegeben, wobei sich bei Anwesenheit eines Liganden für den Rezeptor in der Substanzbibliothek Liganden-Rezeptor-Komplexe ausbilden, die dann von den übrigen Verbindungen der Substanzbibliothek abgetrennt werden. Die Abtrennung erfolgt meist über chromatogra phische Methoden. Danach werden die isolierten Rezeptor-Liganden-Komplexe mittels Massenspektrometrie analysiert. 



  Ein weiteres auf massenspektrometrischen Methoden beruhendes Verfahren zur Identifizierung von in Substanzbibliotheken vorliegenden Verbindungen ist in der WO 95/25 737 beschrieben. Hierbei wird die Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry (TOF-SIMS) dazu verwendet, die Molekulargewichte von kleinen Verbindungen in der Substanzbibliothek wie Peptiden, Oligonucletiden oder Heterocyklen zu bestimmen. 



  Ein weiteres Beispiel für ein auf Massenspektrometrie beruhendes Verfahren ist in der Publikation "Matrix-assisted laser desorption ionization for a rapid determination of the sequences of biologically active peptides isolated from support-bound combinatorial peptide libraries" von Youngquist et al., 1994, Rapid Communications in Mass Spectrometry, Nr. 8, Seiten 77-81, beschrieben. 



  Hier wird eine spezielle massenspektrometrische Technik, die "Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization" (MALDI) dazu eingesetzt, aus einer synthetischen Peptidbibliothek solche Peptide zu isolieren, die m²glicherweise dazu geeignet sind, Infektionen mit dem HIV-Virus zu inhibieren. 



  In dem beschriebenen Verfahren wurde eine Peptidbibliothek durch automatische Synthese von Peptiden mit zufälligen Sequenzen an einem festen Träger, der in Form von inerten Plastikkügelchen vorliegt, hergestellt. Die auf den Kügelchen immobilisierten Peptide werden auf ihre biologische Aktivität mithilfe eines monoklonalen Antik²rpers getestet, der gegen ein bestimm tes Oberflächenprotein des HIV-Virus gerichtet ist. Diejenigen Kügelchen, an die der Antik²rper gebunden hatte, wurden in einem Enzym-gekoppelten Färbeverfahren nachgewiesen, wie es aus der ELISA- bzw. Immunblot-Technik bekannt ist. Gefärbte Kügelchen wurden isoliert und die daran gebundenen Peptide abgespalten. Diese Peptide wurden in der MALDI analysiert, in der eine direkte Sequenzanalyse und damit Identifizierung der Peptide m²glich ist. 



  Jeder Schritt dieses Verfahrens weist grundlegende Nachteile auf, die auch für die übrigen bekannten Verfahren zum Nachweis spezifischer Liganden in Substanzbibliotheken charakteristisch sind. All diese Verfahren beruhen nämlich darauf, den Rezeptor als Komplex mit dem Liganden räumlich von den übrigen Komponenten der Substanzbibliothek zu trennen. Diese räumliche Trennung setzt die Immobilisierung entweder des Liganden, wie in der oben zitierten Ver²ffentlichung beschrieben, oder des Rezeptors, wie bspw. in der Affinitätschromatographie, an einen festen Träger voraus. 



  Diese Immobilisierung stellt ein wesentliches Problem bei solchen Analyseverfahren dar, da biologisch aktive Rezeptoren häufig durch die Immobilisierung inaktiviert werden. Die Bindungsstellen für Liganden auf Rezeptoren liegen im Allgemeinen an der Oberfläche der Moleküle. Dadurch sind diese Bindungsstellen dann auch dazu geeignet, direkt an der Immobilisierungsreaktion teilzunehmen, bei der nicht kontrolliert werden kann, welche Stelle des Rezeptors dazu benutzt wird. So kommt es häufig vor, dass an dem Rezeptor gerade die Bindungsstelle für den Liganden direkt an den Träger gekoppelt und damit für den später zugegebenen Liganden nicht mehr zugänglich ist. 



  Ein weiteres Problem bei der Immobilisierung vor allem von Proteinrezeptoren stellt die Denaturierung dar, also eine Konformationsänderung des Rezeptors, durch die die Bindungsaktivität ebenfalls verloren geht. 



  Werden die Substanzen der Bibliothek immobilisiert, so ist nicht vorauszusehen, ob alle Substanzen gleich gut immobilisiert werden k²nnen, und welche Substanzen danach noch biologisch aktiv sind. Dies birgt die Gefahr, dass biologisch aktive Substanzen zwar in der untersuchten Bibliothek vorhanden sind, sie jedoch nicht immobilisiert und damit dem Verfahren zugänglich gemacht werden konnten. Dann fällt die Nachweisreaktion negativ aus, obwohl ein Ligand in der Substanzbibliothek enthalten war. 



  Ein weiterer gravierender Nachteil der bekannten Verfahren ist ihre komplizierte und langwierige Durchführung. Nach der Immobilisierung des Liganden oder Rezeptors sind viele Waschschritte notwendig, um nicht immobilisierte Moleküle zu entfernen, erst dann kann mit dem Rezeptor oder der Substanzbibliothek inkubiert werden. Nach der Inkubation sind wiederum Waschschritte notwendig, um ungebundenes Material zu entfernen, und danach schliessen sich noch komplizierte Analyseverfahren wie Immunfärbungen oder, nach Abspaltung des zu analysierenden Materials vom Träger, massenspektrometrische Analysen an. 



  Das Durchführen von Immunfärbungen setzt voraus, spezifische Antik²rper gegen den Liganden in der Hand zu haben. Dies ist dann unm²glich, wenn neue Liganden gesucht werden, und sehr schwierig, wenn Liganden untersucht werden sollen, die keine Proteine sind. 



  Eine Alternative zur Immunfärbung ist das radioaktive oder nicht radioaktive Markieren der Substanz in der Bibliothek. Dies ist lediglich bei der Untersuchung von Nukleinsäurebibliotheken kein Problem, für alle übrigen Verbindungen sind entweder keine Markierungstechniken bekannt, oder sie weisen weitere erhebliche Nachteile auf. Zum Beispiel stellt das radioaktive Markieren von Proteinen durch "Jodinierung" ein erhebliches Gesundheitsrisiko dar. 



  Ein weiterer Nachteil liegt darin begründet, dass in einer Substanzbibliothek mehrere Substanzen mit gleicher oder ähnlicher Affinität für den Rezeptor vorliegen k²nnen. Sie werden dann als Gemisch isoliert und k²nnen mit den bekannten Methoden nicht analysiert werden. 



  Ein weiterer Nachteil der bekannten Verfahren liegt darin, dass es nicht m²glich ist, die Konformation, also die 3D-Struktur, des gebundenen Liganden oder des Rezeptor-Liganden-Komplexes zu analysieren. 



  Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis einer in einer Substanzbibliothek vorhandenen Substanz bereitzustellen, das wesentlich einfacher und schneller durchzuführen ist als die bekannten Verfahren, und in dem eine Immobilisierung oder Markierung des Rezeptors oder des Liganden sowie eine räumliche Trennung des Rezeptor-Liganden-Komplexes von den übrigen Substanzen der Substanzbibliothek nicht mehr notwendig ist. 



  Erfindungsgemäss wird die Aufgabe bei einem Verfahren der eingangs genannten Art durch die folgenden Verfahrensschritte gel²st: 



  a) Zugabe eines solchen Rezeptors zu der Substanzbibliothek, der ein wesentlich h²heres Molekulargewicht als der nachzuweisende Ligand aufweist, und 



  b) Durchführen eines solchen spektroskopischen Messverfahrens mit der aus Schritt a) resultierenden Mischung, ohne Isolierung des Rezeptor-Liganden-Komplexes, mit dem diejenigen dipolaren Resonanzphänomene erfassbar sind, die bei einer Bindung des Rezeptors an den Liganden auftreten. 



  Die Erfinder haben erkannt, dass es m²glich ist, einen Liganden direkt in einer Substanzbibliothek nachzuweisen, indem mit an sich bekannten spektroskopischen Messverfahren diejenigen dipolaren Resonanzphänomene erfasst werden, die dann, und nur dann stattfinden, wenn ein Rezeptor mit einem wesentlich h²heren Molekulargewicht als der nachzuweisende Ligand an den Liganden bindet. 



  Dipolare Resonanzphänomene beruhen auf der Resonanzwechselwirkung zwischen den in eine Probe eingestrahlten elektromagnetischen Wellen mit Dipolen. Die dipolaren Wechselwirkungen sind abhängig von der Beweglichkeit desjenigen Moleküls, in dem die Dipole enthalten sind. Die Molekülbeweglichkeit ist wiederum davon abhängig, ob das Molekül frei in L²sung vorliegt oder ob es mit einem grossen Molekül assoziiert ist, also bspw. als Komplex vorliegt. Wenn ein kleiner Ligand an einen grossen Rezeptor bindet, so wird die Molekülbeweglichkeit durch den grossen Re zeptor bestimmt. Nur aktive Substanzen sind überhaupt fähig, eine Bindung mit dem Rezeptor einzugehen. Die Tatsache, dass überhaupt eine Bindung stattgefunden hat, wird dadurch nachweisbar, dass der Rezeptor mit dem wesentlich h²heren Molekulargewicht als der Ligand den Komplex aus Ligand und Rezeptor charakteristisch prägt. 



  Es hat sich nun überraschenderweise herausgestellt, dass dieses Phänomen dazu eingesetzt werden kann, die Bindung eines Rezeptors an einen Liganden auch dann nachzuweisen, wenn eine Vielzahl weiterer Substanzen direkt in der untersuchten L²sung enthalten ist. Bei Zugabe des Rezeptors zu der Substanzbibliothek treten dann, wenn der Rezeptor an den Liganden bindet, ganz spezifische Messsignale auf, die von den übrigen Messsignalen diskriminiert werden k²nnen. Findet keine Bindung statt, so treten diese spezifischen Messsignale nicht auf, d.h. in der Substanzbibliothek ist kein Ligand für den Rezeptor enthalten. 



  Bei diesem Verfahren ist es nunmehr nicht mehr n²tig, den Rezeptor oder den Liganden zu immobilisieren oder in irgendeiner Weise zu modifizieren oder markieren. Dadurch fallen nicht nur aufwändige Verfahrensschritte weg, sondern es besteht auch keine Gefahr der biologischen Inaktivierung durch diese Verfahrensschritte mehr. 



  Der spektroskopische Nachweis der Rezeptor-Liganden-Interaktion in der Substanzbibliothek erfolgt direkt nach Zugabe des Rezeptors frei in L²sung, sodass die natürliche (native) Konformation aller beteiligten Moleküle erhalten bleibt. Dadurch wird gewährleistet, dass die in vivo exponierten Bindungsstellen zugänglich und erhalten sind. Die Rezeptor-Liganden-Interaktion  kann somit unbeeinflusst von experimentellen Einflüssen stattfinden. 



  Die Bindungsreaktion kann sogar dann nachgewiesen werden, wenn zusätzliche Moleküle zu dieser Bindung ben²tigt werden, wenn diese ebenfalls in der Substanzbibliothek enthalten sind. Dies ist bspw. bei allosterischen Enzymreaktionen wichtig, in denen die Bindung des Enzyms an sein Substrat durch dritte Moleküle, so genannte allosterische Effektoren beeinflusst wird. 



  Ein erheblicher Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens liegt darin, dass eine Isolierung des Rezeptor-Liganden-Komplexes, also eine räumliche Trennung dieses Komplexes von den übrigen Substanzen der Bibliothek, nicht mehr notwendig ist. Dadurch, dass dieser zeitaufwändige, bei jedem individuellen Experiment neu zu optimierende Verfahrensschritt wegfällt, verkürzt und vereinfacht sich das Verfahren erheblich. Darüber hinaus werden die mit dem Trennverfahren verbundenen Verluste vermieden. 



  So kann mit einem Minimum an experimentellen Vorbereitungen und mit einer spektroskopischen Standardausrüstung schnell herausgefunden werden, ob ein interessierender Ligand in einer Substanzbibliothek enthalten ist. Dieses Verfahren ist also bestens dazu geeignet, ein "Screening" von Substanzbibliotheken vorzunehmen. 



  Sucht man in einer Substanzbibliothek eine an sich bekannte Substanz, die sich als solche spektroskopisch von den anderen Substanzen nicht unterscheiden lässt, so ist dies nunmehr nach der Bindung dieser nachgesuchten Substanz (Ligand) an den Rezeptor deswegen m²glich, da die spektroskopisch erfassbaren Ei genschaften nunmehr durch den Rezeptor charakteristisch beeinflusst werden. 



  Diese Eigenschaften liegen spektral anders als die der Substanzbibliothek als solcher und auch anders als die des ungebundenen Rezeptors. Somit k²nnen in diesem Fall routinemässig, nach Zugabe des Rezeptors, Substanzbibliotheken nach dem Vorhandensein der nachgesuchten Substanz abgefragt werden. 



  Es ist auch m²glich, Substanzbibliotheken danach abzufragen, ob überhaupt eine aktive Substanz enthalten ist, denn nur diese wird an den Rezeptor binden. Die durch diese Bindung erstmals auftretenden dipolaren Resonanzphänomene erscheinen im Spektrum und k²nnen, ggf. unter Heranziehung mehrerer Messmethoden, über die diese dipolaren Resonanzphänomene erfasst werden k²nnen, einer bestimmten Substanz (Ligand) zugeordnet werden. 



  Somit wird die erfindungsgemässe Aufgabe vollkommen gel²st. 



  In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemässen Verfahrens wird als spektroskopisches Messverfahren die NMR (Nuclear Magnetic Resonance)-Spektroskopie eingesetzt. 



  Hierbei ist vorteilhaft, dass diese bereits seit Jahren bekannte Technik sich inzwischen zu einer Routinetechnik entwickelt hat. So stehen vielerorts Standard-NMR-Spektrometer bereit, mit deren Hilfe das erfindungsgemässe Verfahren durchgeführt werden kann. Am häufigsten wird mithilfe der NMR die Protonenresonanz von <1>H bestimmt, das vor allem bei biologisch aktiven Molekülen in grosser Zahl enthalten ist und ein grosses magnetisches Moment aufweist. Durch die Bindung an den Rezeptor treten Resonanz phänomene auf, die charakteristisch sind. Dadurch ist es m²glich, praktisch alle biologisch interessanten Moleküle mit einer gut etablierten Technik dem erfindungsgemässen Verfahren zugänglich zu machen. 



  In einer besonders bevorzugten Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird als dipolares Resonanzphänomen der Transfer-Kern-Overhauser-Effekt (trNOE, transfer Nuclear Overhauser Effect) gemessen. 



  Diese Ausgestaltung beruht auf dem Kern-Overhauser-Effekt oder Nuklear-Overhauser-Effekt (NOE; er wurde als genereller Effekt erstmals beschrieben in "Paramagnetic Relaxation in Metals", 1953, Physical Review 89, Seiten 689-700). Durch den NOE werden die in einem NMR-Experiment gemessenen Signale verstärkt. Der Kern-Overhauser-Effekt beruht auf der dipolaren Wechselwirkung von Kernspins, z.B. von <1>H-Kernen, durch den Raum. Der Verstärkungseffekt, der durch den NOE zustande kommt, hängt vom Abstand der über Dipol-Dipol-Wechselwirkung verknüpften Kerne und von der Zeit ab. Die dipolaren Kopplungen zwischen Wasserstoffkernen hängen von der molekularen Beweglichkeit ab, diese Kopplungen sind bei niedermolekularen Substanzen v²llig anders als bei hochmolekularen Substanzen.

   Wenn nun ein Ligand an einen Rezeptor bindet, der ein wesentlich h²heres Molekulargewicht als der Ligand aufweist, so zeigt der Ligand einen so genannten Transfer-NOE, denn seine Molekülbeweglichkeit wird nun durch den h²hermolekularen Rezeptor bestimmt (trNOE, beschrieben in "Negative Nuclear Overhauser Effects as Probes of Macromolecular Structure", 1972, Journal of the American Chemical Society 94, Seiten 4015-4017). Anders ausgedrückt, transferiert der Rezeptor spezifische, spektroskopisch nachweisbare  Eigenschaften auf den Liganden, die einerseits die Tatsache der Bindung als solche anzeigen und andererseits anzeigen, mit welcher Substanz (Ligand) der Rezeptor gebunden hat. 



  Beim Messen des trNOE ist von Vorteil, dass damit mit hoher Empfindlichkeit und Selektivität zwischen den an den Rezeptor gebundenen und den nicht gebundenen Substanzen in der Substanzbibliothek unterschieden werden kann, und zwar auch dann, wenn die Substanzbibliothek ein komplexes Gemisch aus verschiedensten Komponenten umfasst. 



  In einer bevorzugten Ausführung wird als dipolares Resonanzphänomen der Transfer-Elektron-Kern-Overhauser-Effekt gemessen. 



  Hierbei wird der Austausch von dipolarer Polarisation zwischen Elektronen und Atomkernen mit magnetischem Moment gemessen. Dieser Effekt tritt bspw. auf, wenn radikalische Liganden oder Rezeptoren vorliegen und es zu einer Bindungsreaktion kommt. 



  Man beobachtet hierbei eine starke  nderung der Signalintensität, die dann Aufschluss über Natur des gebundenen Zustands erlaubt. 



  Hierbei ist von Vorteil, dass starke  nderungen in der Signalintensität beobachtet werden k²nnen, die dann Aufschluss über die Natur des gebundenen Zustands geben. 



  Im Folgenden werden der Transfer-Kern-Overhauser-Effekt und der Transfer-Elektron-Kern-Overhauser-Effekt unter der Abkürzung trNOE zusammengefasst. 



  In einer besonders bevorzugten Ausführung wird der trNOE in einem zweidimensionalen NOE-Spektroskopie-Experiment (2D-NOESY oder 2D-ROESY) gemessen. 



  Das 2D-NOESY bzw. 2D-ROESY ist ein Experiment, in dem ein zweidimensionales NMR-Spektrum aufgezeichnet wird, also ein Spektrum, das zwei Frequenzachsen hat. Die Intensitäten der dabei entstehenden Signale, der so genannten "Crosspeaks", entsprechen der dritten Dimension. 



  Ein zweidimensionales NMR-Experiment besteht aus mehreren Phasen, der ersten so genannten Präparationsphase, einer zweiten so genannten Evolutions- und Mischphase und der eigentlichen Detektionsphase, in der ein Inferogramm (FID) aufgezeichnet wird. Die Zeit der Evolutionsphase, t1 genannt, ist eine variable Wartezeit, die im Bereich von Millisekunden bis Sekunden liegt, und innerhalb derer sich chemische Verschiebungen und Spin-Spin-Kopplungen entwickeln. Die Mischphase folgt dabei auf die Evolutionsphase oder unterbricht sie auch. Während der Mischphase entwickeln sich die dipolaren Resonanzphänomene, wobei die Mischzeit jedoch konstant ist, während die Evolutionszeit t1 innerhalb eines Experiments verändert wird. Nach der Evolutions- und Mischphase erfolgt die Detektionsphase mit einer Zeit t2, die ebenfalls konstant ist.

   Die in einem zweidimensionalen NMR-Experiment aufgezeichneten Daten werden oft im so genannten Konturdiagramm dargestellt. Ein solches Konturdiagramm zeigt einen Schnitt entlang einer H²henlinie durch das entstehende "Signalgebirge", also durch die Crosspeaks des Spektrums. 



  Das Messen des trNOE in 2D-NOESY-Experimenten hat den Vorteil, eine grosse spektrale Aufl²sung zu gewährleisten, also eine gro sse Trennung oder Spreizung der Signale zu erreichen. Damit ist es m²glich, vor allem in komplex aufgebauten Substanzbibliotheken trNOEs spezifisch und bei niedrigen Konzentrationen der nachzuweisenden Liganden zu detektieren. 



  Diese zweidimensionalen Experimente k²nnen auch als Bestandteil mehrdimensionaler Experimente durchgeführt werden. 



  Es versteht sich, dass beliebig viele Evolutionszeiten konstant gehalten werden k²nnen und sich so die Dimensionalität reduzieren lässt. 



  In einer bevorzugten Ausgestaltung wird der trNOE als Bestandteil eines mehrdimensionalen homo- oder heteronuklearen Experiments gemessen. 



  Ein solches Experiment kann bspw. ein 3D-HMQC-NOESY, ein 3D-NOESY-NOESY, oder ein 4D-TOCSY-NOESY-HSQC sein (HMQC = Heteronuclear Multiple Quantum Coherence, TOCSY = Totally Correlated Spectroscopy, HSQC = Heteronuclear Single Quantum Coherence). 



  Bei derartigen mehrdimensionalen Experimenten ist vorteilhaft, dass die spektrale Aufl²sung weiter gesteigert wird. 



  Es versteht sich, dass alle genannten NMR-Experimente auch in einem rotierenden Koordinatensystem durchgeführt werden k²nnen. Dabei wird der trNOE dann als trROE bezeichnet. 



  Ferner k²nnen Techniken herangezogen werden, um die Dimensionalität des Experiments zu erniedrigen oder um gezielte Effekte zu erzielen, wozu eine oder mehrere Evolutionszeiten konstant  gehalten werden oder ein oder mehrere Hochfrequenzpulse selektiv oder bereichsselektiv eingestrahlt werden. 



  Hierbei ist vorteilhaft, dass die Aufl²sung verbessert wird, z.B. dadurch, dass mehr Datenpunkte erhalten werden, dass die Messzeit und damit die Dauer der Durchführung des einzelnen Experiments sich verkürzt und der Hintergrund erniedrigt wird. Wird der trNOE in einem eindimensionalen Experiment gemessen, so ist von Vorteil, dass die Auswertung der Spektren besonders einfach ist. 



  In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wird das 2D-NOESY-Spektrum der Substanzbibliothek in Gegenwart des Rezeptors mit einer kurzen Mischzeit, die insbesondere kleiner als etwa 500 ms ist, durchgeführt. 



  Hierbei ist von Vorteil, dass sich ein besonders gutes Signal:Hintergrund-Verhältnis ergibt, dass das "Rauschen" also m²glichst klein gehalten wird. Durch diese Massnahme treten die für den gebundenen Liganden charakteristischen Crosspeaks noch deutlicher hervor, wodurch der Nachweis zusätzlich erleichtert wird. 



  In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemässen Verfahrens wird als spektroskopisches Messverfahren die Fluoreszenz-Spektroskopie eingesetzt. 



  Dies ist zweckmässig, wenn die zu untersuchenden Substanzen Fluoreszenz zeigen, d.h. innerhalb von extrem kurzen Zeiträumen nach einer Anregung durch Einwirkung von Licht oder sonstiger Strahlung die absorbierte Energie in Form von Strahlung wieder  abgeben. Bei der Fluoreszenz-Spektroskopie ist von Vorteil, dass sie sehr empfindlich ist, vor allem dann, wenn eine Laserinduzierte Fluoreszenz nachgewiesen wird. Auch hier beeinflusst der gebundene Rezeptor das Fluoreszenzspektrum charakteristisch. 



  In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemässen Verfahrens wird als spektroskopisches Messverfahren die ESR (Elektronenspinresonanz)-Spektroskopie eingesetzt. 



  Die ESR-Spektroskopie wird auch EPR-Spektroskopie genannt (Elektronenparamagnetische Resonanz). Sie beruht darauf, dass bei Einstrahlung einer elektromagnetischen Welle einer bestimmten Frequenz magnetische Resonanzabsorption eintritt, deren Gr²sse gemessen wird. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass es eines der am weitesten verbreiteten spektroskopischen Methoden ist. 



  In bevorzugten Ausführungen des Verfahrens ist der Ligand eine niedermolekulare Substanz, deren Molekulargewicht insbesondere kleiner als etwa 2000 Da ist, und der Rezeptor ist eine hochmolekulare Substanz, deren Molekulargewicht insbesondere gr²sser als etwa 15 000 Da ist. 



  Bei diesen Massnahmen ist besonders vorteilhaft, dass sich ausgeprägte trNOEs nachweisen lassen, da bei einem grossen Verhältnis des Molekulargewichts des Rezeptors zum Molekulargewicht des Liganden der NOE des Liganden vollkommen von dem NOE des Rezeptors bestimmt wird. Es ergeben sich dann besonders charakteristische Spektren, aus denen das Vorliegen einer Bindung leicht abgelesen werden kann. 



  Hierbei ist weiterhin von Vorteil, dass pharmazeutisch bedeutsame Substanzen, insbesondere so genannte Leitsubstanzen, meist ein niedriges Molekulargewicht (MW < 1000 bis 2000) aufweisen, bspw. Hormone, Antibiotika, Enzyminhibitoren etc. Ihre Rezeptoren, in den meisten Fällen Proteine, haben dagegen hohe Molekulargewichte, die meist wesentlich gr²sser als 15 000 Da sind. 



  Der Rezeptor kann auch aus mehreren hochmolekularen Substanzen bestehen, kann in ein h²hermolekulares Aggregat eingelagert sein oder kann in ganzen Zellen oder in Zellfragmente eingebettet sein. 



  Es ist ausserdem m²glich, Kontrollexperimente zu den einzelnen Spektroskopie-Versuchen durchzuführen. Dabei k²nnen bspw. Inhibitoren der Rezeptor-Liganden-Bindung eingesetzt werden. Der entsprechende trNOE darf dann unter Zugabe des Inhibitors nicht mehr nachweisbar sein. 



  Auf diese Weise ist es auch m²glich, die Spezifitäten der Rezeptor-Liganden-Bindung auszutesten. Dies ist vor allem dann vorteilhaft, wenn in der Substanzbibliothek mehrere Liganden mit Bindungsaffinitäten für den Rezeptor enthalten sind. 



  In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemässen Verfahrens umfasst die Substanzbibliothek natürliche Substanzen, die insbesondere ausgewählt sind aus den Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, Lipiden, ganzen Zellen, Organellen, Zellextrakten, ganzen Bakterien, Bakterienextrakten, ganzen Viren, Virenextrakten oder K²rperflüssigkeiten oder Mischungen davon. 



  Hierbei ist von Vorteil, dass komplexe Substanzbibliotheken wie Naturstoffgemische oder Gewebsextrakte als solche direkt in das erfindungsgemässe Verfahren eingesetzt werden k²nnen, ohne dass eine vorherige Trennung ihrer Komponenten oder Isolierung einzelner Komponenten notwendig ist. Dadurch wird das Verfahren einfacher und schneller in der Durchführung. 

 

  In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung umfasst die Substanzbibliothek chemisch synthetisierte Substanzen. Diese k²nnen Peptide, Oligonukleotide oder sonstige organisch synthetisierte Moleküle sein, es muss wiederum kein einheitliches Gemisch vorliegen. 



  In der Arzneimittelforschung werden häufig bereits bekannte Wirkstoffe chemisch modifiziert, wobei danach kontrolliert werden muss, ob die modifizierte Form noch biologisch aktiv ist. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren ist es nun m²glich, ganze Gemische verschiedener modifizierter Formen in einem Experiment auf ihre biologische Wirksamkeit zu testen. Es muss weder eine vorgeschaltete Trennung z.B. verschieden grosser Syntheseprodukte vorliegen, noch müssen die Wirkstoffe chemisch homogen sein. Hierbei ist ausserdem auch an Peptidbibliotheken zu denken, die zur Inhibition k²rpereigener Rezeptoren oder zur Inhibition von Viren oder anderen Krankheitserregern eingesetzt werden k²nnen. Hier spielt jeweils die Interaktion zwischen einem niedermolekularen Liganden und einem hochmolekularen Rezeptor eine Rolle, die im erfindungsgemässen Verfahren schnell getestet werden kann. 



  Es versteht sich, dass in das erfindungsgemässe Verfahren auch Gemische natürlicher und synthetischer Substanzen als Substanzbibliotheken eingesetzt werden k²nnen. 



  In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens werden noch nicht bekannte Liganden mithilfe weiterer ein- oder mehrdimensionaler NMR-Experimente identifiziert. 



  Dadurch ist die M²glichkeit gegeben, in Substanzbibliotheken nach neuen Liganden für bereits bekannte Rezeptoren zu suchen. In einem solchen Verfahren wird ein 2D-NOESY- oder im Regelfall 2D-ROESY-Experiment durchgeführt, und anhand der damit gewonnenen Daten (Spektren, Crosspeaks) werden weitere zwei- oder mehrdimensionale NMR-Experimente durchgeführt, wie bspw. so genannte COSY-, TOCSY- oder HMQC-Experimente. Diese dem Fachmann bekannten NMR-Verfahren k²nnen ausserdem als 3D-NMR-Experimente realisiert werden oder vorzugsweise als 1D- oder 2D-Varianten der 3D-Experimente. 



  Die gleichen Massnahmen machen es darüber hinaus m²glich, nicht nur neue Liganden zu identifizieren, sondern auch die Strukturen bereits bekannter oder noch nicht bekannter Liganden im an den Rezeptor gebundenen Zustand aufzuklären. 



  Ein solcher Ansatz zur Strukturaufklärung hat den Vorteil, dass die biologisch aktive Konformation eines Liganden, nämlich die an den Rezeptor gebundene Struktur, aufgeklärt werden kann, ohne den Liganden vorher zu kristallisieren oder auf sonstige Weise chemisch zu behandeln oder zu beeinträchtigen. Zudem ist dieses Verfahren wesentlich sensitiver und kommt mit geringeren  Substanzmengen aus als die Standardverfahren zur Strukturbestimmung. 



  In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens werden neuronale Netze eingesetzt. 



  Unter neuronalen Netzen versteht man Programme, deren Struktur und Funktion sich an den Nervennetzen lebender Organismen orientiert. Solche Programme weisen eine erheblich h²here Leistungsfähigkeit auf, besonders bei komplexen Problemstellungen wie Mustererkennung und Lernfähigkeit. 



  Insbesondere sind hier die Eigenschaften von neuronalen Netzwerken von Vorteil, mit denen Informationen selbst aus Spektren erhalten werden k²nnen, die über einen extrem starken Hintergrund verfügen. Dieser Hintergrund kann die Signale in etwa um bis das Zehnfache übersteigen. Ebenso verfügt eine Spektrenerkennung mit neuronalen Netzwerken über die Fähigkeit, aus den Spektren von Gemischen die einzelnen Komponenten zu erkennen. Diese Eigenschaft ist von besonderem Vorteil, wenn bei der Bindung von Liganden an Rezeptoren viele Moleküle ungefähr gleich stark gebunden werden. 



  Hierbei ist weiter von Vorteil, dass die Empfindlichkeit des Verfahrens sowohl während der Messung als auch während der Auswertung der Messergebnisse erheblich gesteigert werden kann. Gerade bei der Auswertung komplexer zweidimensionaler Spektren ist es vorteilhaft, leistungsfähige Rechnerprogramme zur Verfügung zu haben, um die wesentlichen Crosspeaks eines Experimentes herauszufiltern. 



  Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. 



  Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines ausgewählten Ausführungsbeispiels unter Verwendung der Zeichnung näher erläutert und beschrieben. Es zeigen: 
 
   Fig. 1 die chemische Formel eines niedermolekularen Disaccharids (Ligand), nämlich  alpha -L-Fuc-(1->6)- beta -D-GlcNAc-OMe, das von dem Lectin Aleuria aurantia Agglutinin (Rezeptor AAA) gebunden wird; 
   Fig. 2a ein 2D-NOESY-Spektrum eines Gemisches aus sechs verschiedenen Sacchariden, in dem das Disaccharid von Fig. 1 enthalten ist (Substanzbibliothek A); 
   Fig. 2b ein 2D-NOESY-Spektrum eines Gemisches aus 15 verschiedenen Sacchariden, in dem das Disaccharid von Fig. 1 enthalten ist (Substanzbibliothek B); 
   Fig. 3a ein 2D-trNOESY-Spektrum des Gemisches von Fig. 2a nach Zugabe des Rezeptors AAA; 
   Fig. 3b ein 2D-trNOESY-Spektrum des Gemisches von Fig. 2b nach Zugabe des Rezeptors AAA;

   und 
   Fig. 4 ein 2D-trN0ESY-Spektrum des Disaccharids von Fig. 1 in Gegenwart des Rezeptors AAA. 
 


 Screening zweier Disaccharid-Substanzbibliotheken mithilfe eines Lectins (Rezeptor) durch trNOE 
 



  Es wird ein spezielles Disaccharid 1 (Ligand), das in zwei Substanzbibliotheken verschiedener Komplexitäten vorliegt, mithilfe eines Proteinrezeptors, nämlich eines Lectins, mit dem erfindungsgemässen Verfahren nachgewiesen. 



  Das Disaccharid 1,  alpha -L-Fuc(1->6)- beta -D-GlcNAc-OMe, ist aus einem Fucoserest und einem substituierten Glucosaminrest zusammengesetzt. 



  Das in Fig. 1 gezeigte Dissaccharid 1 ist in zwei unterschiedliche Substanzbibliotheken A und B, die aus 6 bzw. 15 verschiedenen Kohlenhydratderivaten bestanden, enthalten. Die Zusammensetzung der Disaccharidbibliotheken ist in Tabelle 1 gezeigt. 


 Tabelle 1 
 


 Zusammensetzung der Substanzbibliotheken 
 
EMI25.1
 
 



  Es ist bekannt, dass das Lectin Aleuria aurantia Agglutinin (AAA) an das Disaccharid 1 bindet. Von den anderen in den Substanzbibliotheken enthaltenen Kohlenhydratstrukturen war nicht bekannt, ob sie Bindungsaktivität für das Lectin besitzen. 



  Folgende Versuchsbedingungen wurden gewählt: 



  Die NMR-Spektren der Substanzbibliotheken A und B wurden auf einem Bruker DRX 500 Spektrometer mit einer Spektrometerfrequenz von 500,13 MHz und bei einer Temperatur von 310 K gemessen. Zur Vorbereitung der Messproben wurden die Bibliotheken A und B in jeweils 80  mu l D2O aufgel²st. Je 40  mu l der beiden L²sungen mit den Bibliotheken A und B wurden dann in 500  mu l D2O verdünnt. Diese Proben wurden für NMR-Experimente verwendet, bei denen kein Rezeptor (Lectin, AAA) eingesetzt wurde. 



  Die übrigen 40  mu l wurden mit je 500  mu l einer 0,5 mM-L²sung des Lectins (Rezeptor AAA) in D2O versetzt. Diese Proben wurden für die Messung von trNOEs eingesetzt. 



  Die Konzentration der Oligosaccharidliganden war in allen Proben ca. 10 mM für jede Komponente, was zu einem molaren Liganden-Rezeptor-Verhältnis von ca. 20 : 1 führte. 



  Phasensensitive 2D-NOESY-Spektren wurden mit der folgenden Standardpulssequenz aufgenommen, nämlich: 



  /2 - t1 - /2 - Mischzeit - /2 - t2. 



  t1 entspricht dabei der Evolutionszeit, t2 der Detektionszeit, wie bereits zuvor erläutert. Das HDO-Signal (d.h. das Hintergrund-Restsignal von Wasser) wurde mit geringer Leistung vorgesättigt. Die NOESY-Spektren für die Bibliotheken A und B in Abwesenheit des Lectins wurden mit 512 Inkrementen in t1 und mit 2K (Bibliothek A) bzw. (Bibliothek B) Datenpunkten in t2 aufgenommen. Es wurden jeweils 32 Scans aufgenommen. Nach Zero-Filling und Fourier-Transformation wurden 4K x 2K Datenmatrizen erhalten. Die Relaxationsdelays waren 4,4 s (Bibliothek A) bzw. 3,6 s (Bibliothek B). Die Mischzeiten betrugen in beiden Fällen 900 ms. Die spektralen Weiten waren 2.740 Hz (Bibliothek A) und 4.496 Hz (Bibliothek B). 



  Für die trN0ESY-Spektren der beiden Bibliotheken in Gegenwart des Lectins wurden 640 Inkremente in t1 und 4K Datenpunkte mit jeweils 32 Transienten in t2 aufgenommen. Zero-Filling und Fourier-Transformation ergab 4K x 2K Spektren. Nach dem ersten /2-Puls wurde ein Spinlockfeld von ca. 3,5 kHz angeschaltet, um den st²renden Signalhintergrund von Proteinsignalen zu unterdrücken. Die Mischzeit betrug 400 ms und die spektralen Weiten waren 2.379 Hz für beide Spektren. 



  Fig. 2 zeigt die erhaltenen 2D-NOESY-Spektren der Bibliotheken A (Fig. 2a) und B (Fig. 2b) in Abwesenheit des Lectins, also des Rezeptors. Diese <1>H-NMR-Spektren weisen starke !berlappungen aller Signale auf. Das NOE-Muster des gesuchten Disaccharids kann nicht erkannt werden. 



  Fig. 3 zeigt die 2D-trNOESY-Spektren der Substanzbibliotheken A (Fig. 3a) und B (Fig. 3b) in Gegenwart des Lectins. Das NOE-Muster des gesuchten Disaccharids ist jetzt deutlich sichtbar  (vgl. auch Fig. 4), denn die für das Disaccharid charakteristischen Crosspeaks liegen weitab von dem in der Diagonalen liegenden Hintergrund. Das entstehende Signalmuster kann dazu benutzt werden, den Liganden, in diesem Fall das in Fig. 1 gezeigte Disaccharid, weiter zu charakterisieren. 



  In Fig. 4 ist ein 2D-trNOESY-Spektrum des Rezeptor-Liganden-Komplexes aus Disaccharid 1 (Ligand) und Lectin AAA (Rezeptor) gezeigt. In Fig. 4 sind zwei typische Crosspeaks bezeichnet, die deutlich den trNOE zeigen. Der mit <1>H-Fuc bezeichnete Crosspeak kann dem Proton am C1-Atom des Fucoserests zugeordnet werden. 



  Die mit <1>H-GlcNAc bezeichneten Crosspeaks k²nnen dem Proton am C1-Atom des Glucosaminrests zugeordnet werden. 



  Vergleicht man Fig. 4 mit Fig. 3, so kann der Ligand, also das Disaccharid 1, in beiden Substanzbibliotheken A und B unmittelbar identifiziert werden. Die nicht an den Rezeptor bindenden Verbindungen haben dagegen schwach positive NOE-Signale, die im vorliegenden Spektrum nicht sichtbar sind. 



  In diesem Fall ist die Identifizierung des Liganden (Disaccharid 1) in den Substanzbibliotheken A und B durch Vergleich der in Fig. 3 und 4 gezeigten Spektren besonders leicht. Es wird deutlich, dass das in Fig. 1 gezeigte Disaccharid an das Lectin AAA bindet und dass weder die Bibliothek A noch B andere Verbindungen enthalten, die an das Lectin binden, denn sonst würden weitere trNOE-Peaks auftauchen. 



  Daraus ergibt sich, dass ein Ligand eindeutig in Substanzgemischen mithilfe eines extern zugegebenen Rezeptors mit dem erfindungsgemässen Verfahren unmittelbar nachgewiesen werden kann. 



  Sind die Liganden und deren <1>H NMR-Spektren nicht bekannt, so müssen weitere NMR-Experimente folgen, mit deren Hilfe die Substanzen identifiziert und deren Struktur aufgeklärt werden kann. Die am Ende des trNOE-Experiments erzeugte Magnetisierung, die nur für die gebundenen Verbindungen vorhanden ist, kann dazu benutzt werden, klassische 2D-NMR-Experimente (TOCSY, COSY, HMQC) anzuschliessen. Diese Experimente k²nnen entweder als 3D-NMR-Experimente durchgeführt werden oder vorzugsweise als 1D- oder 2D-Varianten der 3D-Experimente. 

Claims (21)

1. Verfahren zum Nachweis zumindest einer in einer Substanzbibliothek vorhandenen Substanz (Ligand) unter Verwendung zumindest einer weiteren, an den Liganden bindenden Substanz (Rezeptor), gekennzeichnet durch a) Zugabe eines solchen Rezeptors zu der Substanzbibliothek, der ein wesentlich h²heres Molekulargewicht als der nachzuweisende Ligand aufweist, und b) Durchführen eines solchen spektroskopischen Messverfahrens mit der aus Schritt a) resultierenden Mischung, ohne Isolierung des Rezeptor-Liganden-Komplexes, mit dem diejenigen dipolaren Resonanzphänomene erfassbar sind, die bei einer Bindung des Rezeptors an den Liganden auftreten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als spektroskopisches Messverfahren die NMR (Nuclear Magnetic Resonance)-Spektroskopie eingesetzt wird.

3.

Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als dipolares Resonanzphänomen der Transfer-Kern-Overhauser-Effekt (transfer Nuclear Overhauser Effect, trNOE) gemessen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als dipolares Resonanzphänomen der Transfer-Elektron-Kern-Overhauser-Effekt gemessen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass der trNOE in einem zweidimensionalen NOE-Spektroskopie-Experiment (2D-NOESY oder 2D-ROESY) gemessen wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der trNOE als Bestandteil eines mehrdimensionalen homo- oder heteronuklearen Experiments gemessen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Evolutionszeiten bei der Messung konstant gehalten werden, um die Dimensionalität des Experiments zu erniedrigen.

8.

Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der trNOE in einem eindimensionalen Experiment gemessen wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Hochfrequenzpulse selektiv oder bereichsselektiv durchgeführt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das 2D-NOESY-Spektrum der Substanzbibliothek in Gegenwart des Rezeptors mit einer kurzen Mischzeit, die insbesondere kleiner als etwa 500 ms ist, durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als spektroskopisches Messverfahren die Fluoreszenz-Spektroskopie eingesetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als spektroskopisches Messverfahren die Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (ESR) eingesetzt wird.

13.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand eine niedermolekulare Substanz ist, deren Molekulargewicht kleiner als etwa 2000 DA ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor eine hochmolekulare Substanz ist, deren Molekulargewicht gr²sser als etwa 15 000 DA ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor aus mehreren hochmolekularen Substanzen besteht, deren Molekulargewicht jeweils gr²sser als etwa 15 000 DA ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor eine Substanz ist, die in ein h²hermolekulares Aggregat eingelagert ist, wobei das gesamte Molekulargewicht gr²sser als ca. 15 000 DA ist.

17.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor in ganzen Zellen oder in Zellfragmenten eingebettet ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzbibliothek natürliche Substanzen umfasst, die insbesondere ausgewählt sind aus den Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, Lipiden, ganzen Zellen, Organellen, Zellextrakten, ganzen Bakterien, Bakterienextrakten, ganzen Viren, Virenextrakten, K²rperflüssigkeiten oder Mischungen davon.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzbibliothek synthetische Substanzen umfasst.

20.

Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass bei nicht bekannten Liganden weitere ein- oder mehrdimensionale NMR-Experimente zur Identifizierung des Liganden und/oder des Liganden-Rezeptor-Komplexes vor- oder nachgeschaltet werden.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass zur Auswertung komplexer Spektrendaten neuronale Netze eingesetzt werden.