DE10233999B4

DE10233999B4 - Verfahren der Festkörper-NMR mit inverser Detektion

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Publication number: DE10233999B4
Application number: DE10233999A
Authority: DE
Inventors: Kay Dipl.-Chem. Dr. Saalwächter; Ingo Dipl.-Chem. Dr. Schnell; Manfred Hehn
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2002-07-25
Filing date: 2002-07-25
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2022-07-26
Also published as: GB2395014A; DE10233999A1; US20040017194A1; GB2395014B; GB0317353D0; US6838878B2

Abstract

Verfahren der Festkörper-Kernspinresonanz (NMR) zur Untersuchung einer Materialprobe, welche sowohl Protonen H als auch Spin-1/2-Heterokerne X enthält, wobei die Materialprobe am magischen Winkel rotiert wird (MAS = magic angle spinning), mit folgenden Schritten:
a) Erhöhung der Gleichgewichtspolarisation von X;
b) Zerstörung (2) der Protonenmagnetisierung;
c) Transfer der Polarisation von X nach H;
d) Aufnahme der Protonensignale (8) unter der Bedingung einer Linienverschmälerung;
wobei die Schrittfolge a) bis d) mehrmals durchlaufen wird,
dadurch gekennzeichnet,
dass in Schritt c) der Transfer der Polarisation von X nach H mit einer Hochfrequenz(=HF)-Impulssequenz erfolgt, die den Transfer unter Ausnutzung der Dipolkopplungskonstanten D_XH zwischen den Kernen X und den räumlich am nächsten benachbarten Protonen H bewirkt, wobei der Transfer nur schwach von Kopplungen von Kernen X zu räumlich weiter entfernteren Protonen sowie von Kopplungen der Protonen untereinander abhängt,
und dass durch Variation eines mit dem Transferprozess physikalisch eindeutig...

Description

Die Endung betrifft ein Verfahren der Festkörper-Kernspinresonanz (NMR) zur Untersuchung einer Materialprobe, welche sowohl Protonen N als auch Spin-1/2-Heterokerne X enthält, wobei die Materialprobe am magischen Winkel rotiert wird (MAS = magic angle spinning), mit folgenden Schritten:

a) Erhöhung der Gleichgewichtspolarisation von X; b) Zerstörung (2) der Protonenmagnetisierung;
c) Transfer der Polarisation von X nach H;
d) Aufnahme der Protonensignale (8) unter der Bedingung einer Linienverschmälerung;

Ein solches Verfahren ist durch Y. Ishii, J. P. Yesinowski und R. Tycko, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 2921-2922 bekannt geworden.

Die Kernspinresonanz (NMR = nuclear magnetic resonance)-Spektroskopie ist in den letzten Jahrzehnten eine der leistungsfähigsten Methoden der analytischen Chemie geworden. Elemente mit nicht verschwindendem Kernspin können in einem äußeren Magnetfeld zur Präzession ihrer magnetischen Momente angeregt werden. Mittels Einstrahlung und Absorption von elektromagnetischen Wellen kann die zugehörige Präzessionsfrequenz (Resonanzfrequenz) bestimmt werden. Diese ist von der Umgebung des analysierten Kernes abhängig, so dass aus dieser NMR-Messung Informationen über die Bindungspartner der untersuchten Atomkerne und die Bindungsabstände zu benachbarten Kernen gewonnen werden können.

Zahlreiche besondere Verfahren tragen zu einer Steigerung des Genauigkeit von NMR-Messungen bei, zum Beispiel das Rotieren von Festkörperproben am magischen Winkel.

Für die exakte Bestimmung von Bindungsabständen zwischen Wasserstoff und einem in einer Materialprobe reichlich vorhandenem Heterokern mit Kernspin ½ stellten X. Zhao, J. L. Sudmeier, W. W. Bachovchin und M. N. Levitt, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 11097-11098 ein Bestimmungsverfahren vor. Dieses beruht auf heteronuklearer dipolarer Wiedereinkopplung unter Verwendung einer R18⁵ ₂-Sequenz. Diese Methode wurde bei ¹⁵N-¹H-Gruppen bei künstlich angereichertem, d.h. erhöhtem ¹ ⁵N-Gehalt eingesetzt. Sie ist aber ungeeignet bei gering konzentrierten Heterokernen, etwa ¹⁵N in natürlicher Konzentration in einer Materialprobe.

Die Arbeit von Ishii et al. 2001, a.a.O., stellt Untersuchungen an ¹³C in PMMA-Kunststoffen vor. Das dort angewendete Verfahren beruht auf der indirekten Detektion der ¹³C-Magnetisierung über das Wasserstoffspektrum. Nach einem Polarisationstransfer von H nach ¹ ³C, einer Zerstörung der H-Magnetisierung mittels zweier Hochfrequenz (HF)-Pulse unter einer Rotationsresonanz-Wiedereinkopplungsbedingung und einem qualitativen Transfer der Polarisation von ¹ ³C zurück nach H wurden reine Korrelationsspektren der chemischen Verschiebungen erhalten. Eine präzise Bestimmung von Bindungsabständen ist mit der Methode nach Ishii et al. 2001 nicht möglich.

In der US 6,027,941 werden verschiedene Methoden der Analyse von Daten aus Festkörper-NMR-Experimenten vorgestellt, insbesondere REDOR, TEDOR, DRAMA and DRAWS. Dabei werden heteronukleare und homonukleare Bindungsabstände in biologischen Materialien bestimmt, etwa ¹ ⁵N-¹³C. Die dazu angewandten Pulssequenzen beginnen mit einem 90°-Puls im H-Kanal gefolgt von einem kontinuierlichen HF(Hochfrequenz)-Signal zur Übertragung von Polarisation von H auf ¹ ⁵N. Anschließend wird Entkopplungsstrahlung in den H-Kanal eingestrahlt. Im ¹⁵N-Kanal werden refokussierende HF-Impulse angewandt, und anschließend werden sowohl im ¹ ⁵N- als im ¹ ³C-Kanal HF-Impulse angewandt. Dabei wird eine Rotations-Periode beachtet. Anschließend erfolgt eine FID-Aufzeichnung.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es demgegenüber, ein Verfahren zur präzisen Bestimmung von Bindungsabständen zwischen Protonen und einem Heterokern mit Kernspin ½ bereitzustellen, das auch bei geringer Konzentration der Heterokerne im Verhältnis zu den Protonen gute Ergebnisse liefert und nur wenige Stunden Messzeit in Anspruch nimmt.

Diese Aufgabe wird mit einem NMR-Verfahren der eingangs vorgestellten Art dadurch gelöst, dass in Schritt c) der Transfer der Polarisation von X nach N mit einer Hochfrequenz(=HF)-Impulssequenz erfolgt, die den Transfer unter Ausnutzung der Dipolkopplungskonstanten D_XH zwischen den Kernen X und den räumlich am nächsten benachbarten Protonen N bewirkt, wobei der Transfer nur schwach von Kopplungen von Kernen X zu räumlich weiter entfernteren Protonen sowie von Kopplungen der Protonen untereinander abhängt, und dass durch Variation eines mit dem Transferprozess physikalisch eindeutig assoziierten experimentellen Parameters und einer dadurch bewirkten Variation der Intensität der in Schritt d) jeweils aufgenommenen Protonensignale die Dipolkoppiungskonstante D_XH bestimmt wird.

Als inverses Detektionsverfahren hat das erfindungsgemäße Verfahren Zugang zu Elementen mit nur geringem Beitrag zur Kernmagnetisierung der gesamten Materialprobe, etwa aufgrund geringer Konzentration oder geringem magnetogyrischen Verhältnis. Durch das erfindungsgemäße Verfahren erfolgt der Transfer der Polarisation von X nach H in einer quantifizierbaren, definierten Weise. Das ermöglicht eine absolute Bestimmung der Bindungsabstände von X und N. Die Auswertung der NMR-Messung kann grundsätzlich auf zwei Wegen erfolgen:

1) Durch geeignete Wahl des experimentellen Parameters spaltet das NMR-Signal in der indirekten Dimension eines 2- oder 3-dimensionalen Spektrums in ein Seitenbandenmuster auf, aus dessen Intensitätsverteilung der Bindungsabstand von X und H berechnet werden kann.
2) Bei einer anderen Wahl des experimentellen Parameters variiert die Intensität eines Resonanzmaximums mit der Inkrementierung, wobei aus dem Intensitätsverlauf der Bindungsabstand berechnet werden kann.

Dazu werden die Messdaten an eine theoretisch abgeleitete Formel angepasst. Im Falle sehr komplexer Formeln kann die Auswertung auch durch Vergleich der Messdaten mit einer einmalig berechneten Muster-Kurve erfolgen, bei der auch die Kalibrierung im Falle von Abweichungen von der idealisierten Theorie, z.B. aufgrund von experimentellen Imperfektionen, berücksichtigt wird.

Bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Verfahrensvariante, bei der das Verhältnis von H-Kernen zu X-Kernen größer oder gleich 10:1 ist, insbesondere größer oder gleich 100:1 ist. Damit ist es möglich, auch nach einer erheblichen Verdünnung oder Abreicherung von X in der Materialprobe NMR-Spektren zu erhalten. Die geringen Anforderungen an die Konzentration des Heterokerns im erfindungsgemäßen Verfahren kommen dann besonders gut zur Geltung.

Eine andere Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, dass die X-Kerne in natürlicher Häufigkeit in der Probe vorliegen. In diesem Fall kann eine Probenpräparation wie etwa Isotopenmarkierung eingespart werden. Insbesondere ist eine sinnvolle Messung an einer niedermolekularen Probe mit natürlichem ¹⁵N-Gehalt (ca. 0,3% an allem N) erfindungsgemäß ohne weiteres möglich.

Besonders vorteilhaft ist eine erfindungsgemäße Verfahrensvariante, bei der die X-Kerne ein magnetogyrisches Verhältnis γ(X) ≤ γ(¹ ³C) aufweisen. Aufgrund des Prinzips der indirekten Detektion der Polarisation der X-Kerne kann ein intrinsisch schwaches NMR-Signal aufgrund niedrigen magnetogyrischen Verhältnisses von X umgangen werden.

Bevorzugt ist auch eine erfindungsgemäße Verfahrensvariante, gemäß der die X-Kerne ¹⁵N umfassen. N ist ein wichtiger Baustein der Biochemie, und die Eigenschaften von N-N-Bindungen, insbesondere bei Peptidbindungen, sind von großem Interesse für die Aufklärung von Stoffwechselvorgängen. ¹ ⁵N ist ein mit einem Anteil von lediglich 0,3% natürlich vorkommendes Isotop mit Kernspin 1/2.

In einer anderen Verfahrensvariante umfassen die X-Kerne insbesondere ¹³C. Kohlenstoff ist in allen organischen und biochemischen Verbindungen enthalten, wobei ¹³C wiederum ein natürliches Kohlenstoffisotop mit Kernspin ½ darstellt und in einer Konzentration von etwa 1% enthalten ist. Damit ermöglicht diese Variante Strukturaufklärung in der organischen Chemie.

Schließlich können erfindungsgemäß die X-Kerne auch ²⁹Si umfassen. Si ist ein Grundbaustein für zahlreiche Kunststoffe wie Silikon und ist auch in der hochtemperaturfesten Keramik von Bedeutung. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch auf diesen Gebieten zur Struktur- und Eigenschaftsbestimmung eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass in Schritt a) ein Polarisationstransfer von N nach X erfolgt. Dies stellt das Standardvorgehen zur Erhöhung der Polarisation von X über die natürliche Gleichgewichtspolarisation von X hinaus dar.

Eine besonders einfache Verfahrensvariante sieht vor, dass in Schritt a) eine Kreuzpolarisation angewendet wird. Kreuzpolarisation ist eine verbreitete Standardmethode in der NMR zur Übertragung von Polarisation, insbesondere von H nach X.

Vorteilhaft ist auch eine erfindungsgemäße Verfahrensvariante, bei der in Schritt b) ein Feldgradientenimpuls angewendet wird. Dadurch kann die Länge des Phasenzyklus des Experiments reduziert werden, d.h. die Anzahl der Durchläufe der Schrittfolge a) bis d) und damit die Gesamtdauer des Experiments kann verringert werden.

Alternativ dazu können in einer Verfahrensvariante in Schritt b) zwei Hochfrequenz-Pulse unter der Bedingung der Rotationsresonanz-Wiedereinkopplung (rotary resonance recoupling condition) angewendet werden. Diese Variante kann ohne eine teuere Laborausrüstung zur Erzeugung eines Gradientenfeldes realisiert werden.

Bevorzugt wird weiterhin eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der zwischen den Schritten b) und c) eine Codierung der chemischen Verschiebung der X-Kerne unter Protonenentkopplung während einer Zeit t₁ erfolgt. Dies ist eine bekannte Vorgehensweise im Stand der Technik.

Ganz besonders bevorzugt ist eine Verfahrensvariante, die dadurch gekennzeichnet ist, dass in Schritt c) eine TEDOR/REPT-Sequenz angewendet wird, wobei als mit dem Transferprozess physikalisch eindeutig assoziierter experimenteller Parameter das Zeitintervall t₁' zwischen dem 90°-Impuls auf X und dem 90°-Impuls auf H zur Codierung der Dipolkopplungskonstanten D_XH verwendet wird. Dies stellt ein besonders robustes Verfahren dar, welches mit vergleichsweise grober Justierung der Messparameter auskommt. Insbesondere können auch die Messergebnisse, aus denen nach Fouriertransformation ein Seitenbandenmuster erhalten wird, relativ einfach interpretiert werden. Die TEDOR/REPT-Sequenz ist in 1, Bezugszeichen 4 bis 6 dargestellt.

Eine Ausgestaltung der beiden vorgenannten Verfahrensvariante sieht vor, dass die Schrittfolge a) bis d) mehrfach hintereinander ausgeführt wird, wobei t₁ und t₁' simultan inkrementiert werden, insbesondere mit unterschiedlichen Zeitinkrementen. Durch diese Ausgestaltung wird ein dreidimensionaler Messergebnisraum vermieden. Die Seitenbandenmuster werden in die X-Dimension eingefaltet.

Eine Alternative zu der vorherigen Verfahrensvariante ist dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) eine TEDOR/REPT-Sequenz angewendet wird, wobei das Zeitintervall t₁' zwischen dem 90°-Impuls auf X und dem 90°-Impuls auf H fest gewählt wird, und wobei die Anzahl der rotorsynchronisierten 180°-Impulse als mit dem Transferprozess physikalisch eindeutig assoziierter experimenteller Parameter variiert wird, und dass die Intensitäten aus den gewonnenen Spektren für verschiedene Anzahlen von rotorsynchronisierten 180°-Impulsen zur Bestimmung der Dipolkopplungskonstanten Dx_H verwendet werden. Bei dieser Variante erfolgt lediglich eine Analyse von Intensitätsvariationen der NMR-Signale. Es ist keine Analyse von Seitenbandenmustern notwendig. Die Auswertung ist damit vergleichsweise einfach.

Eine weitere Alternative zur obigen Verfahrensvariante sieht vor, dass in Schritt c) eine TEDOR/REPT-Sequenz angewendet wird, wobei das Zeitintervall t₁' zwischen dem 90°-Impuls auf X und dem 90°-Impuls auf H fest gewählt wird, und wobei ein zeitlicher Abstand zwischen den rotorsynchronisierten 180°-Impulsen auf X relativ zu den rotorsynchronisierten 180°-Impulsen auf H als mit dem Transferprozess physikalisch eindeutig assoziierter experimenteller Parameter variiert wird, und dass aus den gewonnenen Spektren für verschiedene zeitliche Abstände die Dipolkopplungskonstanten D_XH bestimmt werden. Diese Variante ist ebenfalls sehr robust und störungsunempfindlich und liefert einfach zu interpretierende Ergebnisse.

Eine Ausgestaltung dieser Verfahrensvariante ist dadurch gekennzeichnet, dass die Schrittfolge a) bis d) mehrfach hintereinander ausgeführt wird, wobei t₁ und der zeitliche Abstand zwischen den rotorsynchronisierten 180°-Impulsen auf X relativ zu den rotorsynchronisierten 180°-Impulsen auf H simultan inkrementiert werden, insbesondere mit unterschiedlichen Zeitinkrementen. Durch diese Ausgestaltung wird wiederum ein dreidimensionaler Ergebnisraum vermieden. Auch hier werden Seitenbandenmuster erhalten, die in die X-Dimension eingefaltet sind.

Eine letzte Alternative zu obiger Verfahrensvariante sieht vor, dass in Schritt c) der Transfer durch eine Lee-Goldburg Kreuzpolarisation erfolgt, deren Zeitdauer als mit dem Transferprozess physikalisch eindeutig assoziierter experimenteller Parameter variiert wird. Bei etwas höherem experimentellem Aufwand als bei den zuvor genannten Alternativen können Spektren mit hoher Genauigkeit erhalten werden.

In einer vorteilhaften Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt d) allein ein schnelles Rotieren am magischem Winkel mit einer Rotationsfrequenz größer oder gleich 25 kHz (fast MAS) angewendet. Fast MAS stellt ein sehr einfaches Standardverfahren zur Erhöhung der Messgenauigkeit dar, wobei keine HF-Impulse eingestrahlt werden müssen. Es werden nur geringe Materialprobenmengen verwendet.

Alternativ ist bei einer Verfahrensvariante vorgesehen, in Schritt d) ein langsameres Rotieren am magischem Winkel unterstützt von Hochfrequenz-Impulsen anzuwenden. Diese Variante erlaubt die Verwendung von größeren Probenmengen und damit eine Steigerung der Signalintensität.

Eine weitere erfindungsgemäße Verfahrensvariante sieht vor, dass in Schritt d) ein Rotieren am magischem Winkel unterstützt von gepulstem Spin-Lock (pulsed spin locking) angewendet wird. Damit können sehr schmale Linien im Protonenspektrum erreicht werden, wodurch die Messung schneller wird und eine höhere Intensität liefert.

Ganz besonders bevorzugt ist eine Verfahrensvariante, bei der mittels des Verfahrens eine Bestimmung von X-H Bindungsabständen, insbesondere von Wasserstoffbrücken, erfolgt. Die Ermittlung von Bindungsabständen über NMR ist sehr viel billiger als alle Alternativmethoden des Standes der Technik wie etwa Neutronenstreuung.

Ebenso bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Verfahrensvariante, bei der mittels des Verfahrens eine Bestimmung einer Struktur einer Peptidkette erfolgt. Aus der Struktur der Peptidkette kann auf die Funktionsweise der Peptidkette (beispielsweise der katalytischen Wirkung eines Enzyms) geschlossen werden, und somit der Ablauf von biochemischen Vorgängen erforscht werden.

Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und der Zeichnung. Ebenso können die vorstehend genannten und die noch weiter ausgeführten Merkmale erfindungsgemäß jeweils einzeln für sich oder zu mehreren in beliebigen Kombinationen Verwendung finden. Die gezeigten und beschriebenen Ausführungsformen sind nicht als abschließende Aufzählung zu verstehen, sondern haben vielmehr beispielhaften Charakter für die Schilderung der Erfindung.

Die Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird anhand von Ausführungsbeispielen naher erläutert. Es zeigen:
1: eine erfindungsgemäße Pulssequenz für ¹H-detektierte ¹ ⁵N-¹H Korrelations-NMR-Spektroskopie unter schnellem MAS im Festkörper;
2a: ein ¹⁵N-Korrelationsspektrum von L-Histidin·HCl·H₂O, aufgenommen mit einem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß 1 mit dephasierenden HF-Impulsen bei 30kHz MAS;
2b: ein Spektrum der gleichen Materialprobe wie in 2a, aufgenommen mit einem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß 1 mit gepulsten Feldgradienten;
2c: drei Schnitte durch das Spektrum von 2b entlang der ¹⁵N-Dimension;
2d: reine rotorkodierte Seitenbandenmuster, aufgenommen mit einem erfindungsgemäßen Verfahren bei inkrementiertem t₁' und konstantem t₁ = 0 mit dephasierenden HF- Impulsen.
Die Erfindung wurde experimentell erprobt zur Bestimmung von ¹ ⁵N-¹H Bindungslängen in natürlicher Häufigkeit mittels inverser Detektion in Festkörper-NMR-Spektroskopie unter schnellem MAS.
Es wird ein ¹⁵N-¹H Korrelations-NMR-Experiment für Festkörper vorgestellt, das die Signalempfindlichkeit durch inverse ¹H-Detektion unter schnellem MAS wesentlich steigert und die präzise Bestimmung von NH Bindungslängen über heteronukleare ¹H-¹⁵N Dipol-Dipol-Kopplungen an Proben mit ¹⁵N in natürlicher Häufigkeit ermöglicht. Gepulste Feldgradienten oder, alternativ, Hochfrequenzpulse gewährleisten eine ausreichende Unterdrückung unerwünschten ¹H-Signals. Durch diese Methode wird ¹⁵N-¹H-Korrelations-NMR-Spektroskopie in natürlicher Isotopenhäufigkeit routinemäßig anwendbar für Festkörperproben mit Experimentdauern von wenigen Stunden. Die dipolaren Kopplungskonstanten werden aus Rotationsseitenbandenmustern bestimmt, die durch kürzlich entwickelte Widereinkopplungstechniken in den Spektren entstehen. Die Informationen über ¹ ⁵N/¹H chemische Verschiebungen und quantitative ¹⁵N-¹H Kopplungen können in einem "split-t₁" Ansatz unmittelbar miteinander kombiniert werden.
Sensitivitätssteigerung durch ¹H inverse Detektion⁽¹⁾ wird heutzutage beinahe universell in heteronuklearen multidimensionalen NMR Experimenten zur Strukturbestimmung von Molekülen in Lösung eingesetzt. Für Festkörper wurde erst kürzlich gezeigt, dass die Steigerung der ¹H-Auflösung unter schnellem Magic-Angle Spinning (MAS) ausreicht, um das Haupthindernis für inverse Detektion in Festkörpern zu überwinden, nämlich die Breite der ¹H-Linien⁽²⁾. Wesentliche Sensitivitätssteigerungen wurden berichtet für eine Reihe von ¹⁵N- und ¹³C-Systemen.^(2)-(4) Spezifische Pulssequenzen und Detektionsvarianten, die hohe ¹H Auflösung gewähren, ermöglichen ebenfalls große Sensitivitätssteigerungen in invers detektierten statischen ²H- und ¹⁵N-Pulverspektren.^(5),(6) Inverse Detektionstechniken sind mit besonderen Herausforderungen verbunden, sobald es gilt, geringe Isotopenkonzentrationen zu beobachten, denn die unvollständige Unterdrückung der großen Überschussmagnetisierung ungekoppelter ¹H-Kerne kann zu schweren Signalartefakten führen. In der NMR an Lösungen sind gepulste Feldgradienten (PFGs) als Technik zur Zerstörung unerwünschter Kohärenzen bekannt.⁽⁷⁾ Für Festkörper wurde gezeigt, dass Radiofrequenz(RF)-Pulse, die starke Dipol-Dipol-Kopplungen ausnutzen, dieselbe Aufgabe erfüllen können, ohne dass spezielle Spektrometerausrüstung vonnöten ist.⁽ ⁴⁾
In dieser Erfindung präsentieren wirzweidimensionale ¹ ⁵N-¹H Korrelations-NMR-Experimente, die mit inverser ¹H-Detektion unter schnellem MAS an Proben mit ¹⁵N in natürlicher Häufigkeit durchgeführt werden. PFGs oder, alternativ, HF-Pulse sorgen für die Unterdrückung von unerwünschtem ¹H-Signal, und die experimentelle Aufnahme von 2D-Spektren ist innerhalb weniger Stunden möglich. Wir zeigen erstmals, dass heteronukleare ¹H-¹⁵N Dipol-Dipol-Kopplungen, und damit Bindungslängen, verlässlich für ¹⁵N in natürlicher Häufigkeit aus Rotationsseitenbandenmustern bestimmt werden können, die durch eine kürzlich entwickelte dipolare Wiedereinkopplungstechnik entstehen.⁽⁸⁾ Auf die große Bedeutung von Hochpräzisionsbestimmungen von N-H Bindungslängen durch Festkörper-NMR im Hinblick auf die Charakterisierung von Wasserstoffbrückenbindungen wurde erst neulich hingewiesen.⁽⁹⁾ In unseren ¹⁵N-¹H Spektren kann die Information über (i) chemische Verschiebung und (ii) Dipol-Dipol-Kopplungen/Bindungslängen entweder unabhängig voneinander oder in kombinierter Form (durch einen "split-t₁"-Ansatz) gewonnen werden.
Die erfindungsgemäße Methode basiert auf der Verbindung zweier Festkörper-NMR Techniken, die zuerst einen inkohärenten, dann einen kohärenten Polarisationstransfer zwischen ¹H und ¹ ⁵N bewerkstelligen (siehe 1).
Anfängliche ¹H-Polarisation wird inkohärent auf ¹⁵N durch konventionelle Kreuzpolarisation (CP) transferiert. Danach bereitet man die abschließende (inverse) Detektion des schwachen ¹ ⁵N-Signals auf ¹H vor, indem starke ¹H-Restpolarisation effizient durch einen Feldgradientenpuls (mit 100 μs Länge) oder durch zwei RF-Pulse (mit je 400 μs Länge und unter Rotationsresonanzbedingungen)⁽ ⁴⁾entfernt wird, während die ¹⁵N-Polarisation in einem longitudinalen Zustand gespeichert bleibt. Beide Dephasierungstechniken waren in ihrer Leistung in der Praxis vergleichbar. Dank dieser Vorselektion kann der gewünschte Kohärenzpfad (d.h. ¹H → ¹⁵N → ¹H) durch einen vierstufigen Phasenzyklus selektiert werden, der zur vollständigen Reinigung des Signals auf insgesamt 16 oder 32 Stufen auszubauen ist. Während HF-Pulse zur Dephasierung unmittelbar mit Standard-NMR-Ausrüstung ausführbar sind, erfordern PFGs den Einbau von Gradientenspulen an Kopf und Boden des MAS-Stators. Schließlich wird das ¹ ⁵N-Signal über einen kohärenten TEDOR-Wiedereinkopplungsschritt^(8),(9) zur Detektion zurück auf ¹H transferiert, wodurch die ¹⁵N-¹H-Kopplung messbar wird.
In dieses CP-TEDOR-Transferschema können zwei unabhängige spektrale Dimensionen eingebaut werden: eine dipolar entkoppelte (DD) ¹⁵N-Dimension (t₁) zwischen den beiden Transferblöcken, und eine t₁'-Dimension in der Mitte der TEDOR-Sequenz. Während die erstere chemische Verschiebungsinformation über ¹⁵N zugänglich macht, führt die letztere zu einer Modulation eines dipolar geordneten Zustands durch die Wiedereinkopplung. Dieses Verfahren der "Rotorkodierung" wurde bereits in anderen homo-⁽¹¹⁾ und heteronuklearen⁽⁸⁾ Korrelationsexperimenten eingeführt. Die Kopplungsinformation kann aus der t₁'-Modulation des detektierten Signals gewonnen werden, die mittels Fouriertransformation in ein Seitenbandenmuster konvertiert wird. Diese Muster hängen empfindlich vom Produkt aus Wiedereinkopplungszeit und Kopplungsstärke ab.⁽⁸⁾
2a zeigt ein ¹ ⁵N-¹H Korrelations-NMR-Spektrum von L-Histidin·HCl·H₂O, das in einem 2.5mm Rotorsystem bei 30 kHz MAS aufgenommen wurde. Der Einsatz kleiner Rotoren, der die Technik für Proben mit natürlicher Isotopenhäufigkeit aufgrund der geringen Probenmenge auf kleinere Moleküle beschränkt, ist leider unausweichlich, da schnelles MAS essentiell für einen effizienten und quantifizierbaren TEDOR-Transfer ist.⁽⁸⁾ Alternativ ist die Verwendung einer Lee-Goldburg Kreuzpolarisation anstelle des TEDOR/REPT-Transfers in Verbindung mit Multipuls-unterstützter ¹H-Akquisition in t₂ denkbar (siehe Schritt 8), wodurch die Bindungslängenbestimmung auch mit Hilfe von Systemen mit größeren, langsamer rotierenden Rotoren ermöglicht wird.
Nichtsdestoweniger waren nur 8192 Durchläufe der Pulssequenz aus 1 nötig, um das volle 2D-Spektrum in 2a aufzunehmen. Um ein reines Korrelationsspektrum der chemischen Verschiebungen zu erhalten, wurde t, in Schritten voller Rotorperioden (τ_R) inkrementiert, wobei Rotorkodierung vermieden wird (t₁'= 0). In dieser Weise können ¹⁵N-¹H Korrelationsspektren in natürlicher Häufigkeit innerhalb 4-10 Stunden aufgenommen werden, was die Technik auch für Festkörper routinemäßig einsetzbar macht. Aus dem Vergleich von invers detektiertem CP-TEDOR und dem analogen ¹⁵N-detektierten konventionellen 2D TEDOR Experiment resultiert ein Empfindlichkeitsgewinn⁽ ²⁾ von etwa Faktor 6 bis 8.
Im Spektrum aus 2a treten alle drei erwarteten NH Korrelationssignale auf, wenn die ¹ ⁵N-¹H Kopplungen für eine Dauer von 2×6τ_R im TEDOR-Schritt wiedereingekoppelt werden. Für kürzere Wiedereinkopplungszeiten (< 2×4τ_R) verschwindet das Signal der schnell rotierenden NH₃ ⁺ Gruppen aufgrund der schwächeren Kopplung. Eine präzise Messung der Kopplungen ist durch die Rotationsseitenbandenmuster möglich, die in die Spektren dadurch eingebracht werden, dass t₁' in Schritten von τ_R/N simultan mit t₁ inkrementiert wird ("split-t₁'' Ansatz). Die ganze Zahl N bestimmt die Aufspaltungsweite Δν der (ungeradzahligen) Seitenbandenordnungen in den Spektren gemäß Δν = 2ν_R/N, worin ν_R die MAS-Frequenz ist; das Spektrum aus 2b wurde mit N = 30 aufgenommen. Im TEDOR-Schritt wurde dipolare Wiedereinkopplung angewendet über eine Dauer von 2×6τ_R. Aus den resultierenden Seitenbandenmustern (2c) können ¹ ⁵N-¹H Kopplungen im Bereich D_NH/2π > 2 kHz bestimmt werden, was N-H Abständen von bis zu 180 pm entspricht. Da das Signal im "split-t₁"-Experiment über ein Muster verteilt ist, benötigt man 5 bis 10 mal mehr Signalakkumulationen als im reinen Verschiebungs-Korrelationsexperiment.
Sofern die ¹ ⁵N-Verschiebungsinformation nicht benötigt wird, kann die t₁-Dimension weggelassen und ein rein rotorkodiertes Signal in der t₁'-Dimension aufgenommen werden. 2d zeigt die Seitenbandenmuster, die für das δ₁-NH und das ε₂ NH bei ~18 ppm bzw. ~13 ppm im ¹H-Spektrum beobachtet werden. 20480 Experimentdurchläufe (2,5mal mehr als für das Spektrum in 2a) wurden insgesamt für die Aufnahme verwendet. Die aus diesen Mustern bestimmten N-H Abstände stehen sehr gut mit Resultaten früherer Untersuchungen in Einklang,⁽⁹ ⁾'⁽¹²⁾ wie man Tab. 1 entnehmen kann. Abgesehen von der üblichen Überschätzung der Abstände in der NMR,⁽⁹⁾ ist eine weitere systematische Abweichung zu erwarten aufgrund des Einflusses von Kopplungen des ¹⁵N zu weiteren Protonen. Nichtsdestotrotz können Abstände verlässlich bestimmt werden, selbst wenn die störende Kopplung schon ~30% der Hauptkopplung beträgt.⁽ ⁸⁾ Man beachte, dass in einem System, in dem viele Protonen mit einem einzelnen ¹ ⁵N-Kern koppeln, die Technik nur Zugang zur dominierenden (stärksten) Kopplung bietet. Zwei oder mehr Kopplungen ähnlicher Stärke führen zu destruktiven Interferenzen während der Wiedereinkopplung und somit zu Signalverlusten.^(8),(3) Tab. 1. N-H Dipole-Dipol-Kopplungen (D_NH) und Abstände (r_NH), die mittels NMR Seitenbandenmuster (2c und 2d) gemessen wurden. Daten früherer Messungen mittels Festkörper-NMR und Neutronenstreuung an L-Histidin·HCl·H₂O sind zum Vergleich aufgeführt.^(9),(12)
Zusammenfassend gesprochen, können wir uns eine weite Anwendungsbreite dieser und verwandter⁽⁴⁾ ^, ⁽⁶⁾ inverser ¹H-Detektionstechniken vorstellen, weil sie Informationen über dipolare Kopplungen (d.h. Bindungslängen) zusammen mit der Auflösung chemischer Verschiebungen in Proben mit ¹⁵N in natürlicher Häufigkeit zugänglich machen. Insbesondere ist diese Technik bedeutsam für Untersuchungen von N-H..N und N-H...O Wasserstoffbrücken. Im Hinblick auf Biomoleküle wird die Sensitivitätssteigerung für ¹ ⁵N in Kombination mit der ¹⁵N-¹H Kopplungsinformation wesentlich helfen, NMR-Experimente zur Strukturbestimmung von Peptidhauptketten im Festkörper zu verbessern. Weitere technische Entwicklungen, insbesondere die Optimierung des ¹H HF-Schwingkreises zu Detektionszwecken, lassen einen weiteren Gewinn an Signalempfindlichkeit erwarten, der die praktische Bedeutung von ¹H-detektierten Festkörper-NMR-Experimenten weiter steigern wird.
1 zeigt eine erfindungsgemäße Pulssequenz für ¹H-detektierte ¹⁵N-¹H Korrelations-NMR-Spektroskopie unter schnellem MAS im Festkörper. Nach rechts ist die Zeit aufgetragen; Pulssequenzen auf H, X sowie Gradientenpulse bzgl. der z-Richtung G_z sind auf drei Linien markiert. Schwarze und weiße (unausgefüllte) Balken stehen für 90° bzw. 180° Pulse. Die alternativen Möglichkeiten zur Unterdrückung überschüssiger ¹H-Magnetisierung sind horizontal schraffiert (PFGs) und vertikal schraffiert (dephasierende RF-Pulse) eingezeichnet.
Im Zeitintervall 1 wird die Kreuzpolarisation mit entsprechenden Sequenzen 1a auf H und X vorgenommen. Anschließend erfolgt die Dephasierung im Zeitintervall 2. Während des Zeitintervalls t₁, markiert mit Bezugsziffer 3, findet die dipo-lare Entkopplung 3a und die Kodierung der ¹ ⁵N chemischen Verschiebung statt. Es schließen sich die Zeitintervalle 4, 5 und 6 an, die gemeinsam die TEDOR/REPT-Sequenz bilden. Im Zeitintervall 4, findet eine erste Wiedereinkopplung statt. Die in eckigen Klammern gesetzten Pulse können dabei in Abständen von einer halben Rotorperiode mehrfach wiederholt werden. Im Zeitintervall t₁', markiert mit Bezugsziffer 5, findet die Rotorcodierung 5a statt. Es folgt im Zeitintervall 6 eine zweite Wiedereinkopplung; auch hier können die in eckige Klammern gesetzten Pulse wiederholt werden. Zeitintervall 7 markiert einen Dephasierungsschritt, und in Zeitintervall 8 findet die Aufnahme der Protonensignale statt.
2a zeigt ein ¹⁵N-¹H Korrelationsspektrum von L-Histidin·HCl·H₂O, aufgenommen unter 30 kHz MAS in einem 16.4 T Magneten (700 MHz ¹H Larmor- Frequenz) mittels einer Wiedereinkopplungszeit von 2×6τ_R und durch Signalakkumulation von 8192 Experimentdurchläufen der Pulssequenz aus 1 (mit RF Dephasierungspulsen und t₁'= 0). Nach rechts und oben sind die chemischen Verschiebungen von ¹H und ¹⁵N aufgetragen. 2b zeigt das gleiche Spektrum wie in 2a, aber mit PFG-Dephasierung und dipolaren Rotationsseitenbandenmustern in der ¹⁵N-Dimension, aufgenommen durch simultane Inkrementierung von t₁ und t₁' in Schritten von τ_R bzw. τ_R/30. 2c zeigt Schnitte durch 2b entlang der ¹ ⁵N-Dimension bei den entsprechenden ¹H-Positionen. 2d zeigt reine rotorkodierte Seitenbandenmuster, aufgenommen durch Inkrementierung von t₁', während t, = 0 gesetzt war (mit RF-Dephasierungspulsen). Berechnete Muster sind in den 2c und 2d jeweils mit feinen, gepunkteten Linien oberhalb der experimentell bestimmten Muster dargestellt. Die N-H Dipol-Dipolkopplungen und N-H Abstände, die aus den Mustern ermittelt wurden, sind in Tab. 1 aufgeführt.
Literaturverzeichnis

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Claims

Verfahren der Festkörper-Kernspinresonanz (NMR) zur Untersuchung einer Materialprobe, welche sowohl Protonen H als auch Spin-1/2-Heterokerne X enthält, wobei die Materialprobe am magischen Winkel rotiert wird (MAS = magic angle spinning), mit folgenden Schritten: a) Erhöhung der Gleichgewichtspolarisation von X; b) Zerstörung (2) der Protonenmagnetisierung; c) Transfer der Polarisation von X nach H; d) Aufnahme der Protonensignale (8) unter der Bedingung einer Linienverschmälerung; wobei die Schrittfolge a) bis d) mehrmals durchlaufen wird, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) der Transfer der Polarisation von X nach H mit einer Hochfrequenz(=HF)-Impulssequenz erfolgt, die den Transfer unter Ausnutzung der Dipolkopplungskonstanten D_XH zwischen den Kernen X und den räumlich am nächsten benachbarten Protonen H bewirkt, wobei der Transfer nur schwach von Kopplungen von Kernen X zu räumlich weiter entfernteren Protonen sowie von Kopplungen der Protonen untereinander abhängt, und dass durch Variation eines mit dem Transferprozess physikalisch eindeutig assoziierten experimentellen Parameters und einer dadurch bewirkten Variation der Intensität der in Schritt d) jeweils aufgenommenen Protonensignale die Dipolkopplungskonstante D_XH bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von H-Kernen zu X-Kernen größer oder gleich 10:1 ist, insbesondere größer gleich 100:1 ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die X-Kerne in natürlicher Häufigkeit in der Probe vorliegen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die X-Kerne ein magnetogyrisches Verhältnis γ(X) ≤ γ(¹³C) aufweisen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die X-Kerne ¹⁵N umfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die X-Kerne ¹³C umfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die X-Kerne ²⁹Si umfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) ein Polarisationstransfer von H nach X erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) eine Kreuzpolarisation (1) angewendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) ein Feldgradientenimpuls angewendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) zwei Hochfrequenz-Pulse unter der Bedingung der Rotationsresonanz-Wiedereinkopplung (rotary resonance recoupling condition) angewendet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den Schritten b) und c) eine Codierung der chemischen Verschiebung der X-Kerne unter Protonenentkopplung (3a) während einer Zeit t₁ (3) erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) eine TEDOR/REPT-Sequenz (4, 5, 6) angewendet wird, wobei als mit dem Transferprozess physikalisch eindeutig assoziierter experimenteller Parameter das Zeitintervall t₁' (5) zwischen dem 90°-Impuls auf X und dem 90°-Impuls auf H zur Codierung der Dipolkopplungskonstanten D_XH verwendet wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Schrittfolge a) bis d) mehrfach hintereinander ausgeführt wird, wobei t₁ (3) und t₁' (5) simultan inkrementiert werden, insbesondere mit unterschiedlichen Zeitinkrementen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) eine TEDOR/REPT-Sequenz (4, 5, 6) angewendet wird, wobei das Zeitintervall t₁' (5) zwischen dem 90°-Impuls auf X und dem 90°-Impuls auf H fest gewählt wird, und wobei die Anzahl der rotorsynchronisierten 180°-Impulse als mit dem Transferprozess physikalisch eindeutig assoziierter experimenteller Parameter variiert wird, und dass die Intensitäten aus den gewonnenen Spektren für verschiedene Anzahlen von rotorsynchronisierten 180°-Impulsen zur Bestimmung der Dipolkopplungskonstanten D_XH verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) eine TEDOR/REPT-Sequenz (4, 5, 6) angewendet wird, wobei das Zeitintervall t₁' (5) zwischen dem 90°-Impuls auf X und dem 90°-Impuls auf H fest gewählt wird, und wobei ein zeitlicher Abstand zwischen den rotorsynchronisierten 180°-Impulsen auf X relativ zu den rotorsynchronisierten 180°-Impulsen auf H als mit dem Transferprozess physikalisch eindeutig assoziierter experimenteller Parameter variiert wird, und dass aus den gewonnenen Spektren für verschiedene zeitliche Abstände die Dipolkopplungskonstanten D_XH bestimmt werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 12 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Schrittfolge a) bis d) mehrfach hintereinander ausgeführt wird, wobei t₁ (3) und der zeitliche Abstand zwischen den rotorsynchronisierten 180°-Impulsen auf X relativ zu den rotorsynchronisierten 180°-Impulsen auf H simultan inkrementiert werden, insbesondere mit unterschiedlichen Zeitinkrementen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) der Transfer durch eine Lee-Goldburg Kreuzpolarisation erfolgt, deren Zeitdauer als mit dem Transferprozess physikalisch eindeutig assoziierter experimenteller Parameter variiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) allein ein schnelles Rotieren am magischem Winkel mit einer Rotationsfrequenz größer oder gleich 25 kHz (fast MAS) angewendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) ein Rotieren am magischem Winkel unterstützt von Hochfrequenz-Impulsen angewendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) ein Rotieren am magischem Winkel unterstützt von gepulstem Spin-Lock (pulsed spin locking) angewendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mittels des Verfahrens eine Bestimmung von X-H Bindungsabständen, insbesondere von Wasserstoffbrücken, erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mittels des Verfahrens eine Bestimmung einer Struktur einer Peptidkette erfolgt.