DE102006032855A1

DE102006032855A1 - Verfahren zur Untersuchung von Molekülen mittels NMR-Spektroskopie

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Publication number: DE102006032855A1
Application number: DE102006032855A
Authority: DE
Inventors: Stephan Prof.Dr. Appelt; Holger Dr. Kühn; Ulrich Sieling; Friedrich-Wolfgang Dr. Häsing
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2006-06-24
Filing date: 2006-07-14
Publication date: 2007-12-27
Also published as: EP2033007A1; WO2007147685A1; CN101479619B; CN101479619A; JP2009541761A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung von Molekülen mittels NMR-Spektroskopie. Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Probe hochauflösend und umfassend charakterisieren zu können. Die Aufgabe wird durch ein Verfahren nebst zugehöriger Vorrichtung zur Untersuchung einer Probe mittels Kernspinresonanzspektroskopie gelöst, indem hetero- und homonukleare J-Kopplungen in einem kleinen Magnetfeld gemessen und die gemessenen hetero- und homonuklearen J-Kopplungen für die Charakterisierung der Probe verwendet werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung von Molekülen mittels NMR-Spektroskopie.
Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) sowie die Magnetresonanztomographie (MRT) sind sehr erfolgreiche zerstörungsfreie Untersuchungsmethoden sowohl für die Strukturaufklärung von Molekülen als auch für die Bildgebung von Materie bzw. von lebenden Systemen. Die großen Erfolge der NMR und MRT in den letzten 20 Jahren spiegeln sich in drei verliehenen Nobelpreisen wieder (Richard Ernst 1991, Kurt Wüthrich 2002, Paul Lauterbur und Peter Mansfield, 2003). Insbesondere hat die Strukturaufklärung von Makro- und von Biomolekülen durch die hochaufgelöste ein- bzw. mehrdimensionale NMR Spektroskopie große Fortschritte erzielt. Grundsätzlich können in der NMR fünf Wechselwirkungen beobachtet werden. Diese bestehen aus:

1. der Kern Zeeman Wechselwirkung,
2. der elektrischen Kernquadrupolwechselwirkung,
3. der Dipol-Dipol Wechselwirkung,
4. der chemischen Verschiebung und
5. der J-Kopplung.

Die letzten drei Wechselwirkungen spielen bei der Strukturaufklärung von Molekülen eine wichtige Rolle. Zum Beispiel wird der Polarisationstransfer zwischen verschiedenen Kernen über den Mechanismus der dipolaren Kreuzrelaxation (Nuklearer Overhauser Effekt Spektroskopie, NOESY) für die Strukturaufklärung von großen Molekülen ausgenutzt. Das 2D COSY Verfahren verwendet die chemische Verschiebung sowie die J-Kopplung, um das Netzwerk von J-gekoppelten Kernspins und damit die Molekülstruktur auszumessen, wie der Druckschrift „Ernst, R. R., Bodenhausen, G. & Wokaun, A. Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions (Clarendon Press, Oxford, UK, 1987)" zu entnehmen ist.
Die Ursache für die chemische Verschiebung rührt daher, dass ein Magnetfeld B₀ über die Elektronen eines Moleküls Kreisströme produziert und damit an jedem Ort des betrachteten Kernspin ein magnetisches Zusatzfeld der Größe ΔB = σ·B₀ erzeugt. Dieses magnetische Zusatzfeld ist proportional zum Magnetfeld B₀ und verschiebt die Larmorfrequenz ω0 = γ·B0 des betrachteten Kernspins um den Betrag γ·σ·B₀. Für verschiedene Protonenspezies in einem Molekül (z.B. CH₂, CH₃, OH) liegen die chemischen Verschiebungen im Bereich von 0-10 ppm, d.h. die Larmorfrequenz der betrachteten Protonenspezies wird nur um den Faktor 10^–6 bis 10^–5 mal der Larmorfrequenz verschoben.
Die chemische Verschiebung verschwindet, wenn B₀ gegen Null geht. In kleinen magnetische Feldern B₀, so zum Beispiel im Erdmagnetfeld (5·10^–5 T) beträgt daher die Frequenzdifferenz zwischen zwei verschiedenen Protonenspezies wenige mHz. Diese kleine Differenz ist grundsätzlich nicht beobachtbar, da die Linienbreiten der ¹H-NMR Spektrallinien größer als 0,03 Hz sind. Daher lassen sich chemische Verschiebungsdifferenzen umso besser messen, je größer und homogener das Magnetfeld B₀ ist. Dieser Sachverhalt und das mit wachsendem Feld immer größer werdende Signal zu Rausch (S/R) Verhältnis ist der Grund für den Trend zu immer größeren und teureren supraleitenden Magneten.
Von der Regel, dass in kleinen Magnetfeldern keine chemische Verschiebungen gemessen werden können, ist eine Ausnahme bekannt geworden, nämlich die hochaufgelöste NMR Spektroskopie von hyperpolarisierten Xe-Atomen im Erdmagnetfeld „Appelt, S., Häsing, F. W., Kühn, H., Perlo, J. & Blümich, B. Mobile High Resolution Xenon Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy in the Earth's Magnetic Field. Phys. Rev. Lett. 94, 197602 (2005)". Der Grund für diese Ausnahme ist, dass die chemischen Verschiebungsdifferenzen für Xe Atome ca. zwei Größenordnungen grö ßer sind als die der Protonen und dass gleichzeitig die Linienbreiten der Xe NMR Linien extrem schmal (einige mHz) sind.
Trotz der für die meisten Kerne nicht messbaren chemischen Verschiebung für kleine äußere magnetische Felder, insbesondere < 10^–4 T gab es in den letzten 50 Jahren eine ständige Verbesserung der Kernspinresonanzmessungen in kleinen Magnetfeldern, nachfolgend Niederfeld NMR genannt. Angefangen von dem ersten ¹H NMR Spektrum im Erdmagnetfeld von Packard und Varian (siehe Kaplan, J. Minutes of the Stanford Meeting December 28, 29, and 30, 1953, Phys. Rev. 93, 939-954 (1954); siehe Seite 941: Packard, M. & Varian, R. Free Nuclear Induction in the Earth's Magnetic Field) ging die Entwicklung weiter mit der Messung der ersten heteronuklearen ¹H-³¹P und ¹H-¹⁴N J-Kopplungen [siehe Benoit, H., Hennequin, J. & Ottavi, H. Les applications spectroscopiques de la méthode de prépolarisation en R.M.N. (champs faibles). Chimie Analytique 44, 471-477 (1962); Béné, G. J. Nuclear Magnetism Of Liquid Systems In The Earth Field Range. Phys. Rep.
58, 213-267 (1980)], der Messung der Selbstdiffusion von Wasser [siehe Stepišnik, J., Kos, M., Planinšič, G. & Eržen, V. Strong Nonuniform Magnetic Field for Self-Diffusion Measurement by NMR in the Earth's Magnetic Field. J. Magn. Reson. Series A 107, 167-172 (1994)] in den Poren von Antarktiseis [siehe Callaghan, P. T., Eccles, C. D. & Seymour, J. D. An earth's field nuclear magnetic resonance apparatus suitable for pulsed gradient spin echo measurements of self-diffusion under Antarctic conditions. Rev. Sci. Instrum. 68, 4263-4270 (1997)], der Detektion von Grundwasserreservoiren [siehe: Planinšič, G., Stepišnik, J. & Kos, M. Relaxation-Time Measurement and Imaging in the Earth's Magnetic Field. J. Magn. Reson. Series A 110, 170-174 (1994)], der Magnetresonanztomographie im Erdfeld [siehe: Shushakov, A. Groundwater NMR in conductive water. Geophysics 61, 998-1 006 (1996)] und schließlich der SQUID detektierten NMR im micro- bis nano Teslabereich [McDermott, R. et al. Liquid-State NMR and Scalar Couplings in Microtesla Magnetic Fields. Science 295, 2247-2249 (2002); Trabesinger, A. H. et al. SQUID-Detected Liquid State NMR in Microtesla Fields. J. Phys. Chem. A 108, 957-963 (2004); Burg hoff, M., Hartwig, S., Trahms, L. & Bernarding, J. Nuclear magnetic resonance in the nanoTesla range. Appl. Phys. Lett. 87, 054103 (2005); Greenberg, Y. S. Application of superconducting quantum interference devices to nuclear magnetic resonance. Rev. Mod. Phys. 70, 175-222 (1998); Clarke, J. in SQUID sensors: Fundamentals, Fabrication and Applications. Weinstock, H., Ed. (Kluwer Academic, Dordrecht, Nederlands, 1996), 1-62.].
Trotz der für die meisten Kerne unmessbar kleinen chemischen Verschiebungen für kleine äußere magnetische Felder von zum Beispiel kleiner als 10^–4 T kann man dennoch Information über die Struktur von Molekülen gewinnen, indem man den Mechanismus der J-Kopplung ausnutzt. Die J -Kopplung (auch indirekte Spin-Spin Kopplung genannt) zwischen zwei Kernspins [siehe: Proctor, W. G. &. Yu, F. C. On the Nuclear Magnetic Moments of Several Stable Isotopes. Phys. Rev. 81, 20-30 (1951)] kommt zustande durch die indirekte Kommunikation zwischen einem Kernspin I_A und einem zweiten Kernspin I_B, die über die Elektronen innerhalb der chemischen Bindung zwischen I_A, und I_B vermittelt wird. Die mathematische Form der Wechselwirkungsenergie der J -Kopplung H = 2π·J·IA·IB impliziert, dass die J-Kopplungsenergie (typischerweise 0,1-200 Hz für Protonen) von ihrer relativen Orientierung der beiden Kernspins (parallel oder antiparallel zum B₀-Feld) abhängt und ganz wesentlich, dass die J-Kopplung unabhängig vom äußeren Magnetfeld B₀ ist.
Die J-Kopplung zwischen I_A und I_B kann auch über mehrere chemische Bindungen erfolgen. Eine Faustregel besagt, dass je größer der Bindungsabstand ist (je mehr Bindungen sich zwischen I_A und I_B befinden), umso schwächer ist die J-Kopplungskonstante bzw. die J-Kopplungsenergie. Die Unabhängigkeit der J-Kopplung vom Feld B₀ bedeutet, dass man auch bei beliebig kleinen Magnetfeldern die J-Kopplungskonstante mit großer Genauigkeit messen kann. Quantenmechanischen Rechnungen haben ergeben, dass eine Aufspaltung im NMR Spektrum aufgrund der J-Kopplung nur dann beobachtbar ist, wenn die Differenz der Larmorfrequenzen der Kernspins I_A und I_B größer ist als die zu beobachtende J-Kopplung. Eine Differenz der Larmorfrequenzen von I_A und I_B besteht entweder aufgrund ihrer unterschiedlichen chemischen Verschiebungen oder aufgrund der unterschiedlichen gyromagnetischen Verhältnisse γ_A und γ_B.
Wenn es sich bei den Kernen um unterschiedliche Spezies mit unterschiedlichen gyromagnetischen Verhältnissen γ_A und γ_B handelt (z.B. ¹H und ¹⁹F), dann nennt man die J-Kopplung heteronuklear. Wenn es sich bei I_A und I_B um denselben Typ handelt (z.B. zwei Protonen), dann nennt man die Kopplung homonuklear. Die heteronukleare J-Kopplung ist demnach bis zu sehr kleinen Magnetfeldern (bis ~ 10^–7 T) messbar, da der Frequenzunterschied der Larmorfrequenzen von I_A und I_B selbst bei 10^–7 T größer ist als die J-Kopplung.
Ein anderer Fall liegt bei der homonuklearen J-Kopplung vor. Beispielsweise beträgt im Erdmagnetfeld die typische ¹H-Linienbreite von Ethanol ca. 100 mHz, während der Unterschied zwischen der chemischen Verschiebung der Protonen der CH₂ bzw. der CH₃-Gruppe bei wenigen mHz liegt. Daher sind im Erdmagnetfeld alle Protonen des Ethanols magnetisch äquivalent. Die homonukleare J -Kopplung lässt sich nicht messen. Dieser Sachverhalt ist für das Ethanolmolekül in 1 dargestellt. Bei hohem Magnetfeld – nachfolgend auch Hochfeld genannt – von zum Beispiel 1,5 T sind die chemischen Verschiebungen viel größer als die ¹H-Linienbreiten. Daher zeigt das ¹H-Spektrum zum einen die drei chemischen Verschiebungen der OH, CH₂ und der CH₃-Gruppe und zum anderen die homonuklearen J-Kopplungen der CH₂-Gruppe (Kopplung mit den Protonen der CH₃-Gruppe: -> Quartett) und der CH₃-Gruppe (Kopplung mit den Protonen der CH₂-Gruppe: -> Triplett). Das Proton der OH-Gruppe zeigt keine homonukleare J-Kopplung mit den anderen zwei Gruppen, da das Proton wegen der Wasserstoffbrückenbindung frei beweglich ist. Im Hochfeld erlaubt die Kombination aus der gemessenen chemischen Verschiebung mit den homonuklearen J-Kopplungen eine Zuordnung mit der Struktur des Ethanolmoleküls. Dieser Sachverhalt bildet daher das Fundament für die hochaufgelöste NMR im Hochfeld.
Bei kleiner werdenden B₀-Feld rücken die OH, CH₂ und die CH₃ Linien immer näher zusammen, bis sie bei sehr niedrigem Feld beginnen miteinander zu verschmelzen. In 1 ist dieser Kollaps exemplarisch für drei Magnetfelder demonstriert (1,5 T, 0,35 T und im Erdmagnetfeld 5·10^–5 T), wobei beim Erdmagnetfeld das ganze Ethanolspektrum aus einer Linie ohne irgendwelche strukturelle Information besteht.
In den letzten Jahren gelang es für äußere magnetische Felder kleiner als 10^–4 T, die heteronuklearen J-Kopplungen immer genauer zu messen. Vor einigen Jahren demonstrierte Mc Dermott et al. [siehe: McDermott, R. et al. Liquid-State NMR and Scalar Couplings in Microtesla Magnetic Fields. Science 295, 2247-2249 (2002)] die Messung der heteronuklearen ¹H-³¹P J-Kopplungskonstante mit SQUID's im nT-Bereich.
Die ¹H-Linienbreite beträgt ca. 1 Hz, welche in diesen Experimenten durch die Inhomogenität des B₀-Feldes dominiert ist. Erst kürzlich wurde von S. Appelt, H. Kühn, W. Häsing und B. Blümich in Nature Physics 2, 105-109 (2006) die Relevanz der ultrahochauflösenden ¹H, ¹⁹F und ⁷Li NMR Spektroskopie im Erdmagnetfeld demonstriert, wobei ¹H-Linienbreiten bis zu 0,03 Hz gezeigt wurden. Die heteronuklearen ¹H-¹⁹F und ¹H-²⁹Si J-Kopplungskonstanten von verschiedensten Molekülen konnten mit einer Genauigkeit von wenigen mHz bestimmt werden. Diese Genauigkeit kann man nicht weiter verbessern, da sich die gemessenen Linienbreiten schon bei der natürlichen Linienbreite (gegeben durch das Inverse der transversalen Relaxationszeit T₂) befinden. Entscheidend ist aber, dass die Genauigkeit der gemessenen J-Kopplungskonstanten ein bis zwei Größenordnungen besser ist verglichen mit der Genauigkeit, welche mit supraleitenden Hochfeldmagneten erreichbar ist. Diese extrem hohe Auflösung erlaubt eine genaue Klassifizierung bzw. eine Unterscheidung der chemischen Strukturen sowohl von kleinen als auch von Makromolekülen. Das hat in Zukunft weitreichende Konsequenzen, z.B. wenn man an die technische Realisierung von mobilen Niederfeld NMR Geräten denkt, um damit chemische Analysen mit hoher Genauigkeit durchzuführen.
Als Beispiel für die hohe Frequenzauflösung im Erdfeld zeigt 2 einen Vergleich zwischen der heteronuklearen ¹H-²⁹Si J-Kopplung von Tetramethylsilan (TMS), die in einem sehr homogenen (~ 3 ppb) 9,4 T Hochfeldmagneten gemessen wurde sowie der gleichen J-Kopplungskonstante, aber im Erdmagnetfeld gemessen. Die ¹H-²⁹Si J-Kopplung im Erdfeld ist mit 6,61 7 + 1 mHz um etwa zwei Größenordnungen besser als die mit dem Hochfeldmagneten gemessenen J-Kopplung (J = 6,6 ± 0,1 Hz). (Quelle: Nature Physics 2, 105-109 (2006)).
3 zeigt ein weiteres Beispiel für die Erdfeld NMR mit dem Molekül Nonafluorohexen mit acht heteronuklearen ¹H-¹⁹F J-Kopplungen, die alle im Spektrum identifiziert werden können. Dies ist ein Beispiel, welches demonstriert, dass man mit einer einzigen Messung das J-Kopplungsnetzwerk über viele Bindungen hinweg messen kann und damit die Molekülstruktur erfassen kann. Das in 3 gezeigte ¹⁹F Spektrum von Nonafluorohexen (NFH) ist charakterisiert durch acht heteronukleare ¹H-¹⁹F J-Kopplungen. Das ¹⁹F Spektrum besteht aus einer Überlagerung von 4 Tripletts und 4 Doublets. Die obere Kurve ist eine Simulation dieser Überlagerung und zeigt, dass die Molekülstruktur von NFH mit einer einzelnen Messung sichtbar wird. Die Zahl links oben neben der J-Kopplungskonstanten deutet auf die Zahl der chemischen Bindungen zwischen dem betrachteten ¹H und ¹⁹F Kern hin. (Quelle: Nature Physics 2, 105-109 (2006)).
Nach dem bisherigen Stand der Technik ist die Charakterisierung von Molekülen mittels ultrahochauflösender Niederfeld NMR jedoch nur mit der Hilfe von heteronuklearen J-Kopplungen möglich. Zwar gelingt eine hohe Frequenzauflösung. Die allein aus den heteronuklearen J-Kopplungen erhaltenen Informationen beinhalten jedoch keine Informationen über in einer Probe auftretende Molekülgruppen.
Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Probe hochauflösend und umfassend charakterisieren zu können.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe mittels Kernspinresonanzspektroskopie gelöst, indem homonukleare J-Kopplungen in einem kleinen Magnetfeld gemessen und die gemessenen homonuklearen J-Kopplungen für die Charakterisierung der Probe verwendet werden.
Der Fachmann war der Meinung, in kleinen magnetischen Feldern könnten nur heteronukleare J-Kopplungen einer Probe gemessen werden (siehe zum Beispiel Applied Physics Letters 87, 054103 (2005), Nuclear magnetic resonance in the nanoTesla range, erstes Blatt linke Spalte, Absatz 2). Die Fachwelt hat jedoch nicht bedacht, dass praktisch alle organischen Moleküle bzw. Biomoleküle hauptsächlich aus Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoffatomen bestehen und Kerne wie z.B. wie ¹⁹F bzw. selten vorkommen. Kohlenstoff besteht zu 99% aus ¹²C (mit Kernspin I = 0) und zu 1% aus ¹³C (mit Kernspin I = 1/2). Es koppeln 1 aller ¹H-Kerne des organischen Moleküls heteronuklear mit einem ¹³C-Kern, Deshalb besteht das ¹H-Spektrum im Niederfeld hauptsächlich aus einer einzigen ¹H-Linie ohne Struktur (wie es schon in 1 im Erdfeld angedeutet ist) sowie sehr kleinen Sattelitenlinien (ca. 200 mal kleiner als die Hauptlinie), die von den heteronuklearen ¹H-¹³C J-Kopplungen stammen. Das anspruchsgemäße Strukturbestimmung ist nun entgegen der Meinung der Fachwelt wenigstens für diejenigen ¹H-Kerne möglich, welche mit ¹³C Kernen (1% Häufigkeit) oder anderen seltenen Kernen (z.B. ¹⁵N) heteronuklear gekoppelt sind. Dies führt dann zu einem messbaren, hochaufgelösten homonuklear J-gekoppelten H-Spektrum, das auch gleichzeitig Information über die heteronuklearen Kopplungen enthält.
Entgegen dem in der Fachwelt herrschenden Vorurteils können also in Proben auftretende homonukleare J-Kopplungen grundsätzlich sehr wohl in kleinen Magnetfeldern gemessen werden.
Um das Spektrum homonuklearerer J-Kopplungen in der Praxis erfassen zu können, wird in einer Ausführungsform eine Vormagnetisierung der zu untersuchenden Probe so zum Beispiel in einem starken Magnetfeld von vorzugsweise wenigstens 1 Tesla durchgeführt. Zu diesem Zweck werden in einer Ausführungsform besonders starke Magnete, vorzugsweise Permanentmagnete von ein bis zwei Tesla eingesetzt. Sollen Messungen in kleinen magnetischen Feldern durchgeführt werden, so hatte die Fachwelt für Vormagnetisierungen regelmäßig vergleichsweise schwache (Elektro)Magnete eingesetzt, mit denen magnetische Felder in der Größenordnung von 0,1 bis 0,3 Tesla erzeugt wurden. Derart schwache, für eine Vormagnetisierung eingesetzte Felder haben in der Praxis für die Durchführung des beanspruchten Verfahrens regelmäßig unbefriedigende Messergebnisse zur Konsequenz. Im vorliegenden Fall wird hier also der fachübliche Weg verlassen und es werden sehr viel stärkere Magnete für die Durchführung einer Vormagnetisierung eingesetzt.
Um zu einer guten Frequenzauflösung zu gelangen, ist es von besonderer Bedeutung, auf eine besonders gute Homogenität des schwachen magnetischen Feldes zu achten, welches während der Messung auf die Probe wirkt. Um diesem Ziel nahe zu kommen, wird das Probenvolumen in einer Ausführungsform klein gewählt. Insbesondere ein Probenvolumen von kleiner als 2 cm³ ist klein im Sinne der Erfindung. Bei Messungen in schwachen Magnetfeldern hat der Fachmann regelmäßig eine Probe mit einem Volumen von 500 cm³ und mehr gewählt. Auch in dieser Hinsicht liegt eine Abweichung von fachüblichen Maßnahmen vor.
In einer Ausführungsform werden Proben geeignet angereichert, so zum Beispiel mit ¹³C Kernen, um die Durchführbarkeit des Verfahrens verbessert zu gewährleisten. Die gemessenen Ergebnisse werden anschließend für eine chemische Charakterisierung verwendet. Es gelingt so, erheblich genauer messen und damit eine Probe und zwar vor allem eine organische Probe erheblich genauer sowie im Erdmagnetfeld charakterisieren zu können. Regelmäßig kann aber das erfindungsgemäße Verfahren auch ohne eine solche Anreicherung durchgeführt werden.
Eine Charakterisierung im Erdmagnetfeld vereinfacht eine Charakterisierung, da ein Erdmagnetfeld grundsätzlich zur Verfügung steht, ohne einen technischen Aufwand betreiben zu müssen.
Beispielsweise besteht eine Probe aus Molekülen mit dem Gerüst X^M-A-B-X^K, wie die 4 verdeutlicht. A und B sind beliebige Molekülgruppen, an denen die magnetisch äquivalenten Spins X gebunden sind. An der Molekülgruppe A sind m = 1, 2, ... M Spins der Sorte X gebunden, nachfolgend X^M genannt. An der Molekülgruppe B sind k = 1, 2, ... K Spins der Sorte X gebunden, nachfolgend X^K genannt. X steht z.B. für das Proton oder für einen anderen zu messenden Kern. Ein solches Molekül umfasst zum Beispiel ¹³C – Atome mit einer natürlichen Häufigkeit von 1%, so zum Beispiel im Molekülteil A.
Beispielweise sei M = 3 und K = 2. Die beiden ¹H-¹³C heteronuklearen Kopplungskonstanten von X^M mit ¹³C und X^K mit ¹³C werden dann mit J_H-A und J_H-B-A bezeichnet und die ¹H homonukleare Kopplungskonstante zwischen X^M und X^K mit J_H-H. Da der Bindungsabstand zwischen X^M und A kleiner ist als zwischen X^K und A, gilt grundsätzlich J_H-A > J_H-B-A > J_H-H. Es wird dann regelmäßig ein H-NMR Spektrum im Niederfeld gemessen, welches typischerweise zunächst eine große Zentrallinie umfasst, die von allen magnetisch äquivalenten und ungekoppelten Spins X^M und X^K herrührt. Darüber hinaus umfasst das Spektrum zwei symmetrische Multiplettstrukturen, deren Intensitäten ca. 1000 mal geringer sind verglichen mit der Intensität der Zentrallinie. Die beiden Multiplettstrukturen bestehen typischerweise aus zwei Quartetts und aus zwei Triplets, deren Aufspaltungsmuster von der homonuklearen J-Kopplung zwischen X³ und X² herrühren. Die vier Linien der Quartettstruktur mit Intensitätsverhältnissen von typischerweise 1:3:3:1 und dem Abstand J_H-H im Frequenzraum gehören zu dem NMR-Signal der beiden Protonen der X²-Gruppe, die homonuklear an die 8 möglichen Einstellmöglichkeiten der drei Protonen der X³-Gruppe koppeln. Umgekehrt gehören die drei Linien der Tripletstruktur mit typischen Intensitätsverhältnissen 1:2:1 und dem gleichen Abstand J_H-H zu dem NMR-Signal der drei Protonen der X³-Gruppe, welche homonuklear an die 4 möglichen Einstellmöglichkeiten der zwei Protonen der X²-Gruppe koppeln. Dass die Quartett (bzw. Tripletstruktur) typischerweise symmetrisch um die Zentrallinie in zwei identische Untergruppen aufspalten, liegt an der heteronuklearen ¹H-¹³C J-Kopplung J_H-B-A (bzw. J_H-A). Der ¹³C Kernspin kann dabei entweder parallel oder antiparallel zum Feld B₀ stehen und verschiebt die Quartettstruktur (Tripletstruktur) von der Zentrallinie um den Betrag ± J_H-B-A/2(± J_H-A/2). Dieses messbare Spektrum wird in 3 gezeigt.
Eine homonukleare J-Kopplung zwischen den X^M und den X^K-Spins im Niederfeld ist jedenfalls dann messbar, wenn die folgende Gleichung erfüllt ist:
Hierbei ist J_XmXk definiert ist als die homonukleare J-Kopplungskonstante zwischen dem Kern X^m (m = [1,..M]) und dem Kern X^k (k = [1,..K]). In einer natürlichen Probe liegt in der Regel mindestens ein Heterokern ungleich X in ausreichender Konzentration im Molekülteil A vor und die beiden heteronuklearen J-Kopplungskonstanten J_X-A und J_X-B-A sind in ihrem Betrag unterschiedlich. Ist die Gleichung erfüllt dann wird die magnetische Äquivalenz zwischen den X^m und den X^k-Kern aufgehoben, da die Kopplungen J_X-A ≠ J_X-B-A ungleiche Aufspaltungen der NMR Spektrallinien der X-Kerne verursachen und somit die ursprünglich gleichen Übergangsfrequenzen von X^m und X^k unterschiedlich verschieben. Der Kern X^m kann dann unabhängig von der Spinorientierung des Kerns X^K einen magnetischen Übergang machen, wenn seine Übergangsfrequenz (gegeben durch ω_H + J_xm/2) weit genug von der Übergangsfrequenz des Kerns X^k (gegeben durch ω_H + J_Xk/2) entfernt ist. Diese Frequenzdifferenz zwischen den Kernen X^m und X^k muss größer sein als die homonukleare J-Kopplung zwischen X^m und X^k, da sonst beim magnetischen Übergang eines Kernes X^m der andere Kern X^k „mitgerissen" wird und daher grundsätzlich die homonukleare J-Kopplung nicht mehr gemessen werden kann. In der Praxis erfüllen reale Proben grundsätzlich diese erforderlichen Randbedingungenq, so dass die verschiedensten Proben erfolgreich durch das erfindungsgemäße Verfahren charakterisiert werden können.
In einer Ausführungsform werden organische Moleküle als Probe verwendet, da organische Proben in den meisten Fällen die Voraussetzungen erfüllen, um das Verfahren durchführen zu können. Das Verfahren wird daher vor allem dann eingesetzt, wenn eine aus organischen Molekülen bestehende Probe aufgefunden bzw. charakterisiert werden soll.
Um die Funktionsfähigkeit des Verfahrens weiter verbessert zu gewährleisten, wird die Probe so gewählt, dass mindestens zwei unterschiedliche heteronukleare J-Kopplungen, die die Gleichung
erfüllen, in einem Molekül vorhanden sind. Dies ist regelmäßig bei organischen Proben der Fall. Das Verfahren wird also insbesondere dann angewendet, wenn eine solche Probe aufgefunden werden soll. Andernfalls wird die Probe vor der Durchführung des Verfahrens in einer Ausführungsform der Erfindung geeignet angereichert.
Ein kleines äußeres Magnetfeld B₀ im Sinne der Erfindung liegt insbesondere dann vor, wenn dieses kleiner als 10^–4 T ist. Vorzugsweise wird das Erdmagnetfeld als kleines äußeres magnetisches Feld genutzt, da dieses grundsätzlich besonders homogen ist. Für den Erhalt guter Messergebnis se ist ein besonders homogenes äußeres magnetisches Feld von Vorteil.
Um weiter verbessert charakterisieren zu können, werden zusätzlich heteronukleare J-Kopplungen der Probe gemessen und für die Charakterisierung eingesetzt. Eine Probe kann so insgesamt im Vergleich zum Stand der Technik deutlich verbessert und vollständig charakterisiert werden.
Um weiter verbessert messen zu können, wird die Probe in einer Ausführungsform durch Hyperpolarisation der Kernspins der Probe vormagnetisiert. So wird das Signal-Rauschverhältnis verbessert.
Trotz der Abwesenheit von chemischer Verschiebungsinformation ist durch das Verfahren eine detaillierte molekulare Strukturbestimmung möglich. Der Fachmann war der Meinung, er müsse für eine detaillierte molekulare Strukturbestimmung die chemische Verschiebungsinformation sowie die heteronuklearen J-Kopplungen kennen. Diese Kenntnis ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht erforderlich, da homonukleare J-Kopplungen beobachtet werden und diese zusammen mit heteronuklearen J-Kopplungen eine detaillierte molekulare Strukturbestimmung sogar in verbesserter Weise ermöglichen.
Zum einen können die Spektren interpretiert werden. Zum anderen kann eine Probe analysiert werden, indem das Spektrum mit bekannten Spektren verglichen wird. Wird ein bereits bekanntes Spektrum bei der Probe aufgefunden, so folgt hieraus, dass die Probe den Stoff des bekannten Spektrums aufweist.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen weiter erläutert.
5 zeigt die Struktur des homonuklear gekoppelten Spektrums im Niederfeld für das Molekül X^M-A-B-X^K und zwar für ein Molekül der Struktur H³-C-B-H² für den Fall des schwachen Kopplungslimits (|ω_H – ω_C| >> |J_H-C|). Der ¹³C-Kern befindet sich mit 1% Häufigkeit in der Gruppe A. Diese Struktur des Spektrums sieht im Niederfeld ganz anders aus als im Hochfeld. 5 zeigt den Fall, dass es sich bei X um Protonen (¹H) handelt, weiterhin M = 3, K = 2, und dass sich für 1% aller Moleküle X^M-A-B-X^K innerhalb der Gruppe A ein ¹³C-Kern mit I = 1/2 befindet (natürliche Häufigkeit von ¹³C = 1%). Die beiden ¹H-¹³C heteronuklearen Kopplungskonstanten von X^M mit ¹³C und X^K mit ¹³C bezeichnen wir mit J_H-A und J_H-B-A, und die ¹H homonukleare Kopplungskonstante zwischen X^M und X^K mit J_H-H. ω_H (ω_C) bedeutet die Larmorfrequenz für die ¹H (¹³C) Kerne. Da der Bindungsabstand zwischen X^M und A kleiner ist als zwischen X^K und A können, ist |J_H-C – J_H-B-C| > |J_HH|.
Das in 5 gezeigte ¹H-NMR Spektrum im Niederfeld für den Fall des schwachen Kopplungslimit (ω_H – ω_C >> J_H-A) besteht zum einen aus einer großen Zentrallinie, die von allen magnetisch äquivalenten und ungekoppelten Spins X^M und X^K herrührt, und zum anderen aus zwei symmetrischen Multiplettstrukturen, dessen Intensitäten ca. 1000 mal geringer sind verglichen mit der Intensität der Zentrallinie. Die beiden Multiplettstrukturen bestehen aus zwei Quartetts und aus zwei Tripletts, deren Aufspaltungsmuster von der homonuklearen J-Kopplung zwischen X³ und X² herrühren. Die vier Linien der Quartettstruktur mit den Intensitätsverhältnissen 1:3:3:1 und dem Abstand J_H-H im Frequenzraum gehören zu dem NMR-Signal der beiden Protonen der X²-Gruppe, die homonuklear an die 8 möglichen Einstellmöglichkeiten der drei Protonen der X³-Gruppe koppeln. Umgekehrt gehören die drei Linien der Triplettstruktur mit den Intensitätsverhältnissen 1:2:1 und dem gleichen Abstand J_H-H zu dem NMR-Signal der drei Protonen der X³-Gruppe, welche homonuklear an die vier möglichen Einstellmöglichkeiten der zwei Protonen der X²-Gruppe koppeln. Das die ✝ (bzw. Triplettstruktur) symmetrisch um die Zentrallinie in zwei identische Untergruppen aufspalten liegt an der heteronuklearen ¹H-¹³C J-Kopplung J_H-B-A (bzw. J_H-A). Der ¹³C Kernspin kann dabei entweder parallel oder antiparallel zum Feld B₀ stehen und verschiebt die Quartettstruktur (Triplettstruktur) von der Zentrallinie um den Betrag ± J_H-B-A/2 (± J_H-A/2).
6 zeigt schematisch für den komplizierteren Fall des n-Butanols im Falle des schwachen Kopplungslimit alle im Niederfeld beobachtbaren homonuklearen ¹H-¹H J-Kopplungen.
Das n-Butanol Molekül besteht aus 4 Kohlenstoffatomen in linearer Anordnung mit vier möglichen Positionen (1-4 in 6) für den ¹³C-Kernspin Befindet sich der ¹³C-Kernspin an Position 1 des Butanols, so koppeln die Protonen der CH₂-Grappen an Position 2 und 3 bzw. der CH₃-Gruppe an Position 4 homonuklear an die beiden Protonen der CH₂-Gruppe an Position 1. Daraus resultieren drei symmetrisch um die Hauptlinie angeordnete Tripletpaare mit den Frequenzabständen ²J_H-C, ³J_H-C und ⁴J_H-C. Die Zahl links oben neben der J-Kopplungskonstanten deutet wiederum die Zahl der chemischen Bindungen zwischen den betrachteten Kernen an. Die einzelnen Triplets spiegeln wiederum die homonuklearen ¹H-¹H J-Kopplungen der CH₂ bzw. der CH₃-Gruppen (Position 2-4) mit den Protonen der CH₂-Gruppe an Position 1 wieder. Wegen der unterschiedlichen Bindungsabstände existieren drei unterschiedliche homonukleare Kopplungskonstanten ³J_H-HC > ⁴J_H-H > ⁵J_H-H. Die Vielzahl an J-gekoppelten Linien erlaubt eine strukturelle Identifizierung des vorliegenden Moleküls.
Befindet sich der ¹³C-Spin an Position 2 oder 3, dann ergibt sich ein ähnliches aus drei Tripletpaaren aufgebautes Kopplungsmuster, wobei aber die J-Kopplungskonstanten alle verschieden von den vorher gezeigten sein können. Ist der ¹³C-Spin an Position 4 lokalisiert, so ergeben sich entsprechend drei Quartettpaare mit ebenfalls unterschiedlichen homo- und heteronuklearen J-Kopplungskonstanten. Das J-Kopplungsmuster in seiner Gesamtheit ist charakteristisch für das n-Butanolmolekül. So wird also im Niederfeld mit der Messung des hetero- und homonuklearen Netzwerks und ohne die Kenntnis der chemischen Verschiebungen ein Fingerabdruck der Struktur des n-Butanolmoleküls erhalten bzw. dieser Fingerabdruck kann erfindungsgemäß gemessen werden. Generell kann man sagen, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren auch auf komplexe Moleküle und ohne komplizierte Hochfrequenzelektronik, supraleitende Magnete, aufwendige Kühltechnologien (SQUIDs) anwenden lässt.
Ist die Bedingung des schwachen Kopplungslimit nicht erfüllt, dann ist das Spektrum komplizierter. Handelt es sich wie z.B. in 5 um eine stark gekoppelte CH₃-Gruppe (ω_H – ω_C ~ J_H-C), dann wird aus dem Quartettpaar ein Oktettpaar und aus dem Triplettpaar ein Paar aus 9 Linien.
Da die homonukleare J-Kopplungskonstante zwischen den X^M und den X^K Kernen sehr klein sein kann (in der Regel < 1 Hz), sollte das verwendete Spektrometer mit der bestmöglichen Frequenzauflösung operieren. Idealerweise sollte das Spektrometer eine vernachlässigbare instrumentelle Linienverbreiterung aufweisen, d.h. die Breiten der Spektrallinien sind nahe an der (kleinst möglichen) natürlichen Linienbreite.
Aus gleichen Gründen sollte darauf geachtet werden, dass das verwendete Niederfeld NMR-Spektrometer sehr sensitiv ist. Das Signal zu Rausch – Verhältnis sollte weit über 1000 für die Hauptlinie betragen, um die wenigen X-Kerne, die heteronuklear an die seltenen Kerne (z.B. ¹³C mit 1 Häufigkeit) gekoppelt sind, zuverlässig beobachtet werden können, Handelt es sich bei den seltenen Kernen z.B. um ¹⁵N (I = 1/2), dann sind die Anforderungen an die Sensitivität des Spektrometers noch höher, da die natürliche Häufigkeit der ¹⁵N-Kerne 0,36% beträgt.
Reicht die Sensitivität des eingesetzten NMR-Spektrometers nicht aus, so kann die zu untersuchende Probe mit Isotopen angereichert werden, also zum Beispiel mit ¹³C. Dann steigert sich die Intensität aller homonuklearen ¹H-¹H gekoppelten Linien um bis zu zwei Größenordnungen. Das bedeutet, dass die Anforderungen an die Sensitivität des Spektrometers nicht mehr so hoch sind. Die Anreicherung ist aber ein sehr teures Verfahren und im mobilen Einsatz (z.B. für die online Analyse der Moleküle des Erdöls) kaum durchführbar.
7 zeigt die verfahrensgemäß ermittelte Struktur des Moleküls Tetramethylsilan (TMS) und die Zuordnung der molekularen Fragmente des TMS zum allgemeinen Schema eines Moleküls X^M-A-B-X^K. Für dieses Beispiel ist X = ¹H, M = 3, K = 9, A = ¹³C und B = (¹²C)₃-Si.
Für rund 1% aller TMS Moleküle ist ein ¹²C-Kern mit Spin I = 0 durch einen ¹³C-Kern mit Spin I = 1/2 ersetzt. Die A-Gruppe ist demnach hier einfach ein ¹³C Kern, die B-Gruppe besteht aus drei ¹²C-Atomen, die an ein zentrales Si-Atom gebunden sind. In der Natur besteht Silizium zu 95% aus ²⁸Si mit Kernspin I = 0 und zu 4,7% aus Si mit Kernspin I = 1/2. Die zu messenden X-Kerne sind hier Protonen, wobei M = 3 magnetisch äquivalente Protonen an die Gruppe A (= ¹³C) gebunden sind und K = 9 magnetisch äquivalente Protonen an die Gruppe B gebunden sind. Da 4,7% aller Si-Atome ²⁹Si-Atome mit dem Kernspin I = 1/2 sind, erfolgt eine Aufspaltung des ¹H-Spektrums in zwei Linien aufgrund der heteronuklearen Kopplung mit J_H-Si = 6,617 Hz zwischen den 12 Protonen und dem ²⁹Si. Dieses J-gekoppelte Duplet (²⁹Si Kern steht parallel oder antiparallel zum B₀ Feld) wurde schon in 2 veranschaulicht.
Bei einem einzigen von hundert TMS Molekülen sitzt nun ein ¹³C-Kern (1 Häufigkeit) in der A-Gruppe und dieser hebt über die beiden unterschiedlichen heteronuklearen ¹H-¹³C Kopplungen (¹J_H-A ~ 120 Hz und ³J_H-B-A ~ 2 Hz) die magnetische Äquivalenz der 12 Protonen auf. Die K = 9 magnetisch äquivalenten Protonen an der B-Gruppe koppeln nun homonuklear an die M = 3 magnetisch äquivalenten Protonen an der A-Gruppe mit der homonuklearen Kopplungskonstanten ⁴J_H-H << 1 Hz. Da die M = 3 Protonen acht Einstellungsmöglichkeiten haben (alle drei ¹H nach oben oder alle drei ¹H nach unten oder zwei nach oben und einer nach unten bzw. einer nach oben und zwei nach unten mit je einer dreifachen Entartung) werden symmetrisch um die Hauptlinie angeordnet zwei Quartettstrukturen mit dem Frequenzabstand 3./h-b-a ~ 2 Hz gemessen, wie die 8 verdeutlicht. Gezeigt wird die Messung einer homonuklearen ¹H-¹H-J-Kopplung von TMS im Erdmagnetfeld mittels ¹H-NMR. Mit hoher Auflösung wird gleichzeitig die heteronukleare ¹H-²⁹Si (mit J_H-Si = 6,617 Hz), die ¹H-¹³C J-Kopplung (mit ³J_H-B-A = 2,139 Hz) und die homonukleare ¹H-¹H Kopplung mit dem Quartettpaar mit ⁴J_H-H = 0,209 Hz beobachtet. Extrem kleine homonukleare J-Kopplungen (0,209 Hz) können also mit höchster Präzision gemessen werden und damit kleinste strukturelle Unterschiede des Moleküls erfasst werden. Damit ist mit einem einzigen Spektrum die gesamte Molekülstruktur erfasst.
Das Potential der vorgestellten Methode zur Strukturaufklärung ist sogar noch erheblich größer, wenn X = ¹³C als den zu messenden Kern verwendet wird. Im Vergleich zu den Protonenspektren ist die spektrale Auflösung um mehr als den Faktor 10 besser, da die T₂-Relaxationszeiten für die ¹³C-Kerne sehr lang werden können (T₂ ~ 3 s bis 3 min). Wegen eines sehr kleinen Signal-Rauschverhältnisses ist dann aber eine leistungsfähige Vormagnetisierung einzusetzen, wie z.B. dem PHIP (Para Hydrogen Induced Polarizationtransfer), dem SEOP (Spin Exchange Optical Pumping) oder dem SPINOE (Spin Polarized Induced Nuclear Overhauser Effekt) Verfahren [siehe: Bowers, C. R. & Weitekamp, D. P. Transformation of symmetrization order to nuclear-spin magnetization by chemical reaction and nuclear magnetic resonance. Phys. Rev. Lett. 57, 2645-2648 (1986); Goldman, M., Jóhannesson, H., Axelsson, O. & Karlsson, M. Hyperpolarization of ¹³C through order transfer from parahydrogen: A new contrast agent for MRI. Magn. Reson. Imag. 23, 153-157 (2005); Happer, W. Optical Pumping. Rev. Mod. Phys. 44, 169-249 (1972); Appelt, S. et al. Theory of Spin-Exchange Optical Pumping of ³He and ¹²⁹Xe, Phys. Rev. A 58, 1412-1439 (1998); Bouchiat, M. A., Carver, T. R. & Varnum, C. M. Nuclear Polarization in He³ Gas Induced by Optical Pumping and Dipolar Exchange. Phys. Rev. Lett. 5, 373-375 (1960); Colegrove, F. D., Schearer, L. D. & Walters, G. K. Polarization of He³ Gas by Optical Pumping. Phys. Rev. 132, 2561-2572 (1963)].
Bisher wurde nur der eindimensionale Fall der NMR Spektroskopie für Felder < 10^–4 T behandelt. Bei den NMR Spektren mit den verschiedenen Multiplettpaaren kann man eindeutig auf die Zahl der gemessenen Kerne (z.B. ¹H, ¹³C, ...) schließen, die an die A- bzw. B-Gruppe gebunden sind. Obwohl alle heteronuklearen J-Kopplungskonstanten aus dem Spektrum bestimmt werden können, kann man nicht unbedingt schließen, mit welchem Kern die gemessenen Kerne koppeln. Dieses Problem wird dadurch gelöst, indem man im Spektrum eine zweite Dimension im Frequenzraum einführt. Ähnlich wie bei der 2-dimensionalen NMR [siehe: Ernst, R. R., Bodenhausen, G. & Wokaun, A. Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions (Clarendon Press, Oxford, UK, 1987)] kann man z.B. während der Messung des Spektrums kontinuierlich mit einer Radiofrequenz mit geringer Intensität einstrahlen. Die eingestrahlte Frequenz sollte weit genug von der Larmorfrequenz der gemessenen Kerne, entfernt sein, damit sie die Messung des Signals der gemessenen Kerne nicht stört. Wenn die Radiofrequenz in Resonanz mit dem unbekannten Kern ist, der mit den gemessenen Kernen eine heteronukleare Kopplung eingeht, dann mittelt sich die heteronukleare J-Kopplung heraus und das entsprechende Multiplettpaar verschwindet im Spektrum. Da man die Frequenz der Einstrahlung kennt, kann man eindeutig zurückschließen, um welchen Typ von Kern es sich handelt. Wiederholt man das eindimensionale Experiment mit dem gemessenen Kern bei vielen verschiedenen Radiofrequenzen, so erhält man ein zweidimensionales NMR Spektrum, wobei im Frequenzraum in der ersten Dimension alle heteronuklearen und homonuklearen J-Kopplungen der gemessenen Kerne aufgespannt werden und im Frequenzraum in der zweiten Dimension alle Typen von Kernen (außer den Protonen) aufspannt, die heteronuklear mit den gemessenen Kernen gekoppelt sind.
Im Fall des TMS Moleküls im Erdmagnetfeld (4,698-10^–5 T) mit der entsprechenden Larmorfrequenz der Protonen (γ_H = 4,257 kHz/G) bei 2000 Hz.
Die Larmorfrequenz von ¹³C ist dann 503 Hz (γ_13C = 1,0708 kHz/G) und die von ²⁹Si liegt bei 397,7 Hz (γ_29Si = –0,8465 kHz/G). Wenn man jetzt z.B. genau bei 503 Hz mit der Feldstärke B₁ einstrahlt, dann oszilliert die ¹³C-Magnetisierung mit der Rabifrequenz ν_R = γ_13C·B₁ und mittelt die heteronukleare ¹H-¹³C J-Kopplung zu Null heraus. Im eindimensionalen ¹H TMS Spektrum verschwindet dann das in 8 gezeigte Quartettpaar, da die Voraussetzung für das Erscheinen des Quartettpaares die Existenz der heteronuklearen ¹H-¹³C J-Kopplung ist. In gleicher Weise mittelt sich die heteronukleare ¹H-²⁹Si J-Kopplung heraus, wenn man mit 397,7 Hz einstrahlt. Insgesamt erscheinen also auf dem Proton 2D Spektrum Einbrüche der Multiplettstrukturen genau dort, wo die Heterokerne in Resonanz sind. Dies wird in 9 verdeutlicht, wo ein simuliertes ¹H 2D Spektrum im Erdfeld für das TMS-Molekül dargestellt ist. Da man jetzt aus dem 2D Spektrum außer allen J-Kopplungskonstanten auch alle beteiligten Kernsorten einschließlich ihrer zugeordneten J-Kopplungen kennt, ist eine gegenüber dem 1D Spektrum noch bessere Entschlüsselung der Molekülstruktur möglich.
Das vorgeschlagene 2D Niederfeld NMR Verfahren lässt sich noch weiter verbessern, wenn man statt dem Erdfeld in einer Ausführungsform der Erfindung ein höheres Magnetfeld im mT-Bereich wählt. Bei 1 mT (= 10^–3 T) beträgt die Larmorfrequenz der ¹³C-Kerne ca. 10 kHz. Da der Bereich der ¹³C chemischen Verschiebungen ca. 100 ppm beträgt, liegen die Unterschiede der ¹³C Resonanzfrequenzen aufgrund verschiedener chemischer Umgebungen bei ca. 1 Hz. Vorausgesetzt das Magnetfeld B₀ = 1 mT ist sehr homogen (ΔB₀/B₀ ~ 10^–6) und zeitlich stabil, dann kann man im ¹H 2D Spektrum (~ 42 kHz Larmorfrequenz) durch Variation der eingestrahlten ¹³C Radiofrequenz (zum Beispiel in 10 mHz Schritten) zwischen den verschiedenen ¹³C chemischen Verschiebungen unterscheiden. Dies erlaubt im 2D Spektrum eine Zuordnung zwischen jeder gemessenen ¹³C chemischen Verschiebung und dem zugehörigen J-Multiplettpaar und erlaubt somit eine ultimative Aufklärung der molekularen Struktur.
Mit den bisher beschriebenen Verfahren ist beispielsweise die mobile Strukturaufklärung von Erdölmolekülen möglich. Bei der Ölexploration vor Ort (noch am oder im Bohrloch) kann aufgrund der homo- und heteronuklearen J-Kopplungen z.B. zwischen Heptan, Oktan, Benzol und anderen Ölbestandteilen unterschieden und somit die Qualität des Erdöls genauestens klassifiziert werden.
Chemische Reaktionen, die z.B. in einem verfahrenstechnischen Prozess unter schwierigen Bedingungen ablaufen (z.B. in großen Reaktionskammern), könnten in ihren chemischen Reaktionsablauf mithilfe der verfahrensgemäßen (mobilen) NMR charakterisiert werden. Dies ist z.B. wichtig für die online-Charakterisierung von Polymerisationsreaktionen bei der Herstellung von Kunststoffen.
Die Qualitätssicherung von flüssigen Nahrungsmittelprodukten (z.B. alkoholische Getränke, Ethanol, Wasser, Aromatengehalt etc..) ist ein weiterer Anwendungsbereich des Verfahrens.
Schließlich sind in der Pharmaindustrie mobile NMR-Geräte, welche die Struktur von kleinen bis mittelgroßen Proteinen bzw. Biomolekülen entschlüsseln von großen Interesse. Das vorgeschlagene Verfahren ermöglicht den Einsatz von mobilen NMR-Geräten, die wesentlich flexibler und billiger sind im Vergleich zur Durchführung von Strukturanalysen mit supraleitenden Magneten.
Nachfolgend wird eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens für mobile hochauflösende NMR beschrieben.
Die zentrale Einheit des in 10 gezeigte Vorrichtung besteht aus zwei Helmholtzspulen (4), die ein möglichst homogenes Magnetfeld (5) (B₀ = 0,2 – 200 G) erzeugt. Die Homogenität ΔB/B₀ muss dabei mindestens 1 ppm sein. Um eine hinreichende zeitliche Stabilität des B₀-Feldes zu erreichen, muss der Stromkonstanter (6) eine zeitliche Stabilität von besser als 1 ppm über 1h besitzen. Gegebenfalls muss die Homogenität durch zusätzliche Shim-Spulen erreicht werden. Die Abschirmung (10) dient dazu, Veränderungen oder Verzerrungen des Magnetfeldes durch die Umgebung am Messort zu vermeiden.
Die gewünschte Polarisation der zu messenden Probe (1) wird entweder durch eine Vormagnetisierung in einem Halbachmagneten (2) oder durch andere Hyperpolarisations-technologien (11) (SEOP, PHIP, SEOP+SPINOE) mit anschließendem Transport (5) der Probe in die Messspule (7) erreicht. Bei Proben mit kurzen longitudinalen Relaxationszeiten (T₁ < 1s) kann der Transport von dem Halbach-Magneten (2) zur Messspule (7) durch Pressluft in ca. 100 ms erfolgen.
Die Probe wird durch die Sendespule (8) mit einem DC oder AC Puls, der von der NMR-Elektronik (9) erzeugt wird, angeregt. Anschließend wird der "Freie Induktionszerfall" (FID) mit der Empfangspule (7) und der NMR-Elektronik (9) gemessen und mit einem Datenerfassungs-system aufgezeichnet und anschließend ausgewertet.
Mit der in 10 gezeigten Anordnung ist es möglich, mobil ultrahochauflösende NMR-Spektroskopie zu betreiben. Besonderheiten sind eine magnetische Doppelabschirmung mit einem Abschirmfaktor von mindestens 5000 sowie eine hochsensitive NMR-Elektronik, die ein Signal-Rausch-Verhältnis von mehreren Tausend bezogen auf die ungekoppelten Protonen aufweist.

Claims

Verfahren zur Untersuchung einer Probe mittels Kernspinresonanzspektroskopie, dadurch gekennzeichnet, dass homonukleare J-Kopplungen in einem kleinen Magnetfeld gemessen werden und die gemessenen homonuklearen J-Kopplungen für die Charakterisierung der Probe verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Volumen der Probe 0,1 bis 4 cm³, vorzugsweise 1 bis 2 cm³ beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Probe in einem Magnetfeld mit einer Stärke von wenigstens 0,1 Tesla, vorzugsweise von wenigstens 1 Tesla vormagnetisiert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem als Probe organische Moleküle verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Probe Moleküle mit der Struktur X^M-A-B-X^K untersucht werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ¹H-¹H J-Kopplungen der Probe gemessen und für die Charakterisierung verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Probe so bereitgestellt oder ausgewählt wird, dass wenigstens zwei unterschiedliche heteronukleare J-Kopplungen in der Probe vorhanden sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Magnetfeld kleiner als 10^–3 Tesla, vorzugsweise kleiner als 10^–4 Tesla, vorzugsweise das Erdmagnetfeld ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem zusätzlich heteronukleare J-Kopplungen der Probe gemessen und für die Charakterisierung eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Probe vormagnetisiert wird und zwar insbesondere durch Hyperpolarisation der Kernspins der Probe.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der während einer Messung eines Protonenspektrums kontinuierlich mit einer Radiofrequenz eingestrahlt wird, wobei die eingestrahlte Frequenz vorzugsweisedeutlich verschieden von der ¹H-Lamorfrequenz ist.
Verfahren zur Untersuchung einer Probe mittels Kernspinresonanzspektroskopie, dadurch gekennzeichnet, dass in einem kleinen Magnetfeld (< 5·10^–3 T) homo- und heteronukleare J-Kopplungen gemessen werden und aus dem zughörigen Multiplettspektrum die Struktur der Moleküle in der der Probe bestimmt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das NMR-Spektrometer einschließlich des B₀-Feldes eine instrumentelle Linienverbreiterung verursacht, die viel kleiner als die natürliche Linienbreite des gemessenen Kerns ist.
Verfahren nach Anspruch 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass das NMR-Spektrometer so sensitiv ist, dass es mit ausreichendem Signal/Rausch-Verhältnis die geringen Intensitäten der Multiplettstrukturen messen kann.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 12 bis 14, bei dem das Volumen der Probe 0,1 bis 4 cm³, vorzugsweise 1 bis 2 cm³ ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 12 bis 15, bei dem die Probe in einem Magnetfeld mit einer Stärke von wenigstens 0,1 Tesla vormagnetisiert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 12 bis 16, bei dem Moleküle verwendet werden, die mindestens zwei unterschiedliche heteronukleare J-Kopplungen besitzen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass als Probe Moleküle mit der Struktur X^M-A-B-X^K verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Magnetfeld kleiner als 10^–3 Tesla, vorzugsweise kleiner als 10^–4 T, vorzugsweise das Erdmagnetfeld ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 12 bis 19, bei dem durch eine Hyperpolarisationstechnologie (z.B. Spin-Austausch-Optisches-Pumpen, PHIP, DNP) die zu messenden Kernspins polarisiert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 12 bis 20, bei dem zur Bestimmung der Kernsorte, mit der die J-Kopplung erfolgt, während der Messung eines NMR-Spektrums der Kernsorte X ¹H, ¹³C, ¹⁹F ...) kontinuierlich eine Radiofrequenz eingestrahlt wird, wobei die eingestrahlte Frequenz in Resonanz mit dem gekoppelten heteronuklearen Kern in der Gruppe A oder B ist und soweit von der Frequenz des X Kerns entfernt ist, dass keine Störung der Messung auftritt.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit Mitteln zur Durchführung einer Polarisation der Probe, mit einer Sendespule (8) zur Anregung der Probe, mit Mitteln zur Erzeugung eines homogenen Magnetfeldes mit einer Homogenität von wenigstens 1 ppm über 1 cm³ und vorzugsweise während einer Stunde, mit einer magnetischen Abschirmung mit einem Abschirmfaktor von wenigstens 5000.