DE60218136T2

DE60218136T2 - Langsame Diffusion und Fluss von Molekülen gemessen mit Kernspinresonanz mit gepulsten Feldgradienten unter Verwendung der longitudinalen Magnetisierung von Nicht-Proton Isotopen

Info

Publication number: DE60218136T2
Application number: DE60218136T
Authority: DE
Inventors: Fabien Ferrage; Geoffrey Bodenhausen
Original assignee: Bruker Biospin SAS
Current assignee: Bruker Biospin SAS
Priority date: 2002-05-29
Filing date: 2002-05-29
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2022-05-30
Also published as: EP1367406B1; US20030222646A1; DE60218136D1; US6794866B2; EP1367406A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein NMR (Kernspinresonanz)-Verfahren mit gepulsten Gradienten unter Verwendung von stimulierten Echos zum Bestimmen des translatorischen isotropen oder anisotropen Diffusionskoeffizienten eines Moleküls oder einer Supramolekularanordnung oder der Flussrate und der Flussrichtung von Fluiden, die ein solches Molekül oder eine solche Supramolekularanordnung enthalten.
Ein Gepulster-Feldgradient-NMR-Verfahren, bei dem stimulierte Echos verwendet werden, ist aus A.S. Altieri, D.P. Hinton und R.A. Byrd, J. Am. Chem. Soc. 117 (1995), Seiten 7566-7567 bekannt.
Um den translatorischen Diffusionskoeffizienten oder die Flussrate eines Makromoleküls zu bestimmen, kann Gepulster-Feldgradient-NMR unter Verwendung stimulierter Echos angewandt werden. Mit geeigneten hydrodynamischen Modellen können dann der Radius und die Masse des Makromoleküls geschätzt werden.
Langsame Diffusionskoeffizienten D < 10^–10m²/s oder geringe Flussraten, die normalerweise mit biologischen Makromolekülen oder Supramolekularanordnungen mit Massen von M ≥ 50 kDa verbunden sind, sind jedoch mit diesem Verfahren schwer zu messen.
Der Grund hierfür ist die schnelle longitudinale Relaxation der Protonen bei bekannten Messungen.
Bei Verfahren, bei denen stimulierte Echos (STEs) verwendet werden, wird die Information über die Lokalisierung der Moleküle vorübergehend in Form einer longitudinalen Magnetisierung während eines Diffusionsintervalls (d.h. einer Diffusionszeit) Δ gespeichert. Normalerweise wird die Magnetisierung der Protonen für diese Experimente verwendet, da Protonen ein günstiges gyromagnetisches Verhältnis haben und natürlich Protonen in quasi allen Makromolekülen und biologischen Materialien vorhanden sind.
Wenn jedoch während der Zeit der longitudinalen Relaxation von Protonen T1(H) keine bedeutende Diffusion oder kein bedeutender Fluss stattfindet, kann die translatorische Diffusionskonstante oder die Flussrate nicht bestimmt werden. Dies bedeutet, dass Materialien mit im Vergleich zu den für merkliche translatorische Diffusion oder Fluss erforderlichen Zeiten kurzen T1(H)-Werten von den obengenannten bekannten Messverfahren ausgeschlossen sind.
Das Dokument Biophys. J. 78(2000) 1657-1664 beschreibt homonukleare ³¹P-NMR Diffusions-Spektroskopie mit einer stimulierten Echosequenz. Kapitel 4.1.4.3 von Progr. Nucl. Magn. Res. Spectr. 34 (1999) 203-256 erwähnt eine PFG-Sequenz auf STE-Basis mit INEPT oder DEPT Magnetisierungstransfer von Protonen zu ¹³C nach dem Diffusionsintervall und vor der Detektion.
Aufgabe der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Gepulster-Feldgradient-NMR-Verfahren vorzustellen, das die Bestimmung von translatorischen Diffusionskoeffizienten oder Flussraten von Supramolekularanordnungen oder Molekülen mit kurzen T1(H) Werten erlaubt, insbesondere von Supramolekularanordnungen oder Molekülen mit M ≥ 50kDa.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch ein Verfahren mit gepulsten Feldgradienten gelöst, wie es in Anspruch 1 definiert ist.
Somit wird erfindungsgemäß das Standardisotop der Magnetisierungsspeicherung, d.h. Protonen, ersetzt durch ein anderes Isotop X eines anderen Elements. Obwohl dieses Isotop ein geringeres gyromagnetisches Verhältnis hat und deshalb weniger NMR-Intensität als Protonen liefert, ist es bevorzugt aufgrund einer längeren longitudinalen Relaxationszeit T1(X). Somit kann eine brauchbare Speicherung der Lokalisierungsinformationen während eines Diffusionsintervalls Δ gewährt werden, das länger als T1(H) ist.
Bei einer höchst bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eines der Isotope Stickstoff-15. Stickstoff-15 kann in den meisten Supramolekularanordnungen auf einfache Weise angereichert werden, da Stickstoff ein Element ist, das in Vernetzungsbindungen reichlich vorhanden ist, z.B. in Peptidbindungen oder in Urethan-Kunststoffen.
Alternativ oder zusätzlich dazu ist eine Variante des Verfahrens dadurch gekennzeichnet, dass eines der Isotope Kohlenstoff-13 ist. Kohlenstoff ist in allen makromolekularen Anordnungen oder Molekülen vorhanden und Kohlenstoff-13 kann auf einfache Weise angereichert werden, falls der natürliche Anteil für die vorgesehene Messung nicht ausreicht.
Ebenfalls alternativ oder zusätzlich dazu ist bei einer Variante des Verfahrens eines der Isotope Phosphor-31. Phosphor-31 ist das einzige stabile Isotop von Phosphor, und somit kann, wenn Phosphor in der Supramolekularanordnung oder dem Molekül vorhanden ist, dieses einfach für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.
Bei einer bevorzugten Variante des Gepulster-Feldgradient-NMR-Verfahrens gemäß der Erfindung enthält das Molekül oder die Supramolekularanordnung Biomoleküle. Bei Biomolekülen besteht der besondere Bedarf, ihre physikalischen Eigenschaften zu bestimmen, z.B. den translatorischen Diffusionskoeffizienten oder die Flussrate.
Bei einer Weiterentwicklung dieser Variante weist das Molekül oder die Supramolekularanordnung Proteine und/oder Nukleinsäuren auf, die durch Detergens oder amphiphile Mittel gelöst sind. Proteine und Nukleinsäuren enthalten sowohl Stickstoff als auch Kohlenstoff. Somit kann eine Untersuchung des entsprechenden Moleküls oder Supramolekularanordnung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auf einfache Weise realisiert werden.
Eine Variante des NMR-Verfahrens gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass nach der Bestimmung des translatorischen Diffusionskoeffizienten die Masse und Gyrationsradius des Moleküls oder der Supramolekularanordnung auf der Basis eines hydrodynamischen Modells berechnet werden. Somit können weitere physikalische Eigenschaften des Moleküls oder der Supramolekularanordnung bestimmt werden.
Eine weitere Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist gekennzeichnet durch Anwendung einer Sequenz von Hochfrequenz-Impulsen zum Konvertieren der transversalen Magnetisierung senkrecht zum angelegten Magnetfeld der genannten Isotope in Längsmagnetisierung parallel zu dem angelegten Magnetfeld während des Intervalls, in welchem eine translatorische Diffusion oder Fluss überwacht werden. Dadurch wird das Speichern von Informationen über die Lokalisierung des Moleküls oder der Makromolekularanordnung während des Diffusionsintervalls Δ weiter detailliert.
Eine Variante des Verfahrens, bei welcher die folgende Pulssequenz angewandt wird, liegt ebenfalls im Rahmen der Erfindung:

i) 90° Puls, der auf Isotop X wirkt
ii) gepulster Feldgradient zum Dephasieren transversaler Magnetisierung
iii) selektiver 90° Puls in -x-Richtung, der in Resonanz des Isotops H des Lösungsmittels wirkt
iv) 90° Puls in x-Richtung, der auf Isotop H wirkt
v) gepulster Feldgradient zum Codieren der räumlichen Position, Verzögerungszeit τ abwarten
vi) gleichzeitig 180° Puls in x-Richtung, der auf Isotop H wirkt und 180° Puls in x-Richtung, der auf Isotop X wirkt
vii) gepulster Feldgradient zum Codieren der räumlichen Position, Verzögerungszeit τ abwarten
viii) 90° Puls in y-Richtung, der auf Isotop H wirkt
ix) selektiver 90° Puls in -y-Richtung, der in Resonanz des Isotops H des Lösungsmittels wirkt
x) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung
xi) 90° Puls in x-Richtung, der auf Isotop X wirkt
xii) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung, Verzögerungszeit τ abwarten
xiii) gleichzeitig 180° Puls in -x-Richtung, der auf Isotop H wirkt und 180° Puls in x-Richtung, der auf Isotop X wirkt
xiv) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung, Verzögerungszeit τ abwarten
xv) 90° Puls in +x oder –x Richtung, der auf Isotop X wirkt
xvi) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung
xvii) auf Diffusions- oder Flussintervall Δ warten
xviii) 90° Puls in +x oder –x Richtung, der auf Isotop X wirkt
xix) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung, Verzögerungszeit τ abwarten
xx) gleichzeitig 180° Puls in x-Richtung, der auf Isotop H wirkt und 180° Puls in x-Richtung, der auf Isotop X wirkt
xxi) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung, Verzögerungszeit τ abwarten
xxii) selektiver 90° Puls in -x-Richtung, der in Resonanz des Isotops H des Lösungsmittels wirkt
xxiii) gleichzeitig 90° Puls in -x-Richtung, der auf Isotop H wirkt und 90° Puls in -x-Richtung, der auf Isotop X wirkt
xxiv) gepulster Feldgradient zum Decodieren der räumlichen Position
xxv) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung, Verzögerungszeit τ abwarten
xxvi) selektiver 90° Puls in x-Richtung, der in Resonanz des Isotops H des Lösungsmittels wirkt
xxvii) gleichzeitig 180° Puls in -x-Richtung, der auf Isotop H wirkt und 180° Puls in x-Richtung, der auf Isotop X wirkt
xxviii) selektiver 90° Puls in x-Richtung, der in Resonanz des Isotops H des Lösungsmittels wirkt
xxix) gepulster Feldgradient zum Decodieren der räumlichen Position
xxx) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung, Verzögerungszeit τ abwarten
xxxi) H Signal aufnehmen

_HX

^–1

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Weitere Vorteile ergeben sich aus der Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung. Die genannten Ausführungsformen sind nicht als abschließende Aufzählung zu verstehen, sondern haben beispielhaften Charakter zum Beschreiben der Erfindung.
Zeichnungen
Die Erfindung ist in den Zeichnungen gezeigt.
1 zeigt eine Pulssequenz für die Messung von Diffusions- oder Flusskoeffizienten gemäß der Erfindung;
2 zeigt eindimensionale, Stickstoff-15 gefilterte Protonenspektren des Außenmembranproteins A (OmpA), erhalten durch das erfindungsgemäße Verfahren mit unterschiedlichen Amplituden von Feldgradienten;
3 zeigt den Abfall der Signalintensität des OmpA-Detergenskomplexes von 2 als eine Funktion der Amplitude der Feldgradienten.
Zusammenfassung der Erfindung
Zum Schätzen des Radius und somit der Masse von Makromolekularanordnungen, die aus amphiphilen, in Detergentien gelösten Membraneproteinen bestehen, wurden translatorische Diffusionskoeffizienten D mit einem neuen Gepulster-Feldgradient-NMR-Verfahren gemessen. Bei diesem neuen Lösungsweg werden die Informationen über die Lokalisierung von Molekülen vorübergehend in Form von longitudinaler Magnetisierung von Isotopen wie Stickstoff-15 gespeichert, wodurch man die Dauer des Diffusionsintervalls um bis zu zwei Größenordnungen steigern kann aufgrund der langen Spin-Gitter-Relaxationszeiten. Im Gegensatz zu Standard-NMR-Verfahren, bei welchen gepulste Feldgradienten und stimulierte Echos verwendet werden, die nicht zum Messen der Diffusion von biologischen Makromolekülen oder Supramolekularanordnungen geeignet sind, kann das neue Verfahren ausgeweitet werden zum Bestimmen von Diffusionskoeffizienten von weit weniger als D = 10^–10m²s^–1 entsprechend Molekülmassen von mehr als 100kDa. Das Verfahren wird durch Anwendungen bei einer wässrigen Lösung des hydrophoben Transmembranteils des bakteriellen Außenmembranproteins OmpA gezeigt, welches in Oktyl-Polyoxyethylen-Mizellen gelöst ist. Der Diffusionskoeffizient liegt nahe D = 10^–10m²s^–1, was einer effektiven Masse von ca. 50 kDa entspricht, d.h. 19 kDa für das Protein selbst und ca. 30 kDa für das gebundene Detergens.
I. Stand der Technik
Eine der Haupthürden, die vor dem Bestimmen der Strukturen der amphiphilen Membranproteine durch NMR in gelöstem Zustand überwunden werden müssen, ist die Optimierung der Lösung dieser Proteine durch geeignete Lipide, Detergentien oder amphiphile Polymere („Amphipole"). Idealerweise sollte die hydrophobe Oberfläche des Proteins mit der geringst möglichen Schicht eines Lösungsmittels bedeckt sein, so dass die Gesamtmasse der resultierenden Anordnung so klein wie möglich bleibt. Wenn die Gesamtmasse viel größer ist als die des Proteins selbst, wirkt sich dies in einer langsamen Rotationsdiffusion, langen Taumel-Korrelationszeiten τ_c, breiten NMR-Linien und somit einer schlechten Auflösung und Sensitivität aus.
Es gibt mehrere Lösungsansätze zum Bestimmen der Größe einer Supramolekularanordnung mit einem Protein und ihrer zugehörigen Lösungsmittel: Die Kinetik der Sedimentation während des Ultrazentrifugierens, Diffusion durch Membranen mit klar definierten Poren, Chromatographie mit geeigneten Molekularsieben, Neutronendiffraktion und Gepulster-Feldgradient-NMR. Das letztgenannte Verfahren kann eine Messung des translatorischen Diffusionskoeffizienten D bereitstellen. Mit geeigneten hydrodynamischen Modellen ist es dann möglich, den Radius und somit die Masse der Makromolekularanordnungen zu schätzen. Langsame Diffusionskoeffizienten D = 10^–10m²s^–1, die biologischen Makromolekülen oder Supramolekularanordnungen mit Massen M ≥ 50 kDa zugeordnet sind, sind mit normalen NMR-Verfahren (1-5) mit gepulsten Feldgradienten unter Verwendung von stimulierten Echos schwierig zu messen aufgrund der schnellen longitudinalen Relaxation der Kerne (normalerweise Protonen), die die Information über die Lokalisation der Moleküle während des Diffusionsintervalls tragen. Hier wird gezeigt, dass die brauchbare Dauer des Diffusionsintervalls beträchtlich gesteigert werden kann durch Speichern der Information in Form von longitudinaler Magnetisierung von in kleinerer Menge vorhandenen Isotopen wie Stickstoff-15, die normalerweise viel längere Spin-Gitter-Relaxationszeiten als Protonen haben. Dadurch kann man mehr als eine Größenordnung bei der Messung von D gewinnen, so dass Diffusionskoeffizienten von Molekülen mit einer Molekülmasse von mehr als 100 kDa für eine Untersuchung zugänglich sein sollten. Das Verfahren ist gezeigt durch Anwendungen bei einer wässrigen Lösung des Transmembranteils des bakteriellen Außenmembranproteins OmpA, das in Oktyl-Polyoxyethylen-Mizellen gelöst ist. Der Diffusionskoeffizient ist nahe D = 10^–10m²s^–1, was einer effektiven Masse von ca. 50 kDa entspricht, d.h. 19 kDa für das Protein selbst und ca. 30 kDa für das gebundene Detergens.
II. Gepulster-Feldgradient-NMR
Der Erfolg des ursprünglichen Spin-Echo-NMR-Verfahrens mit gepulsten Feldgradienten von Stejskal und Tanner (1) hat zu der Entwicklung von vielen Varianten geführt, insbesondere Verfahren, bei welchen sogenannte stimulierte Echos (STEs) verwendet werden, bei welchen Informationen über die Lokalisierung der Moleküle vorübergehend in Form von longitudinaler Magnetisierung gespeichert wird (2). Solche Experimente werden normalerweise unter Verwendung der Magnetisierung von Protonen ausgeführt, aufgrund des günstigen gyromagnetischen Verhältnisses, das ein „Codieren" der anfänglichen räumlichen Position mit guter Genauigkeit erlaubt, ohne auf sehr starke Gradienten zurückzugreifen. Byrd und seine Mitarbeiter (6) haben ein Verfahren (5) mit einem zusätzlichen Intervall entwickelt, bei welchem die Information in Form von longitudinaler Protonenmagnetisierung gespeichert wird, damit Wirbelströme abklingen können. Jüngere Experimente erlauben es, unerwünschte Wirkungen der Wirbelströme durch Verwendung sogenannter „bipolarer Gradienten" (3) zu umgehen. Es hat sich auch jüngst gezeigt, dass Diffusion von einem Fluss oder einer Konvektion unterschieden werden kann (4). Die Entwicklung von neuen experimentellen Verfahren wurde begleitet von beträchtlichen Bemühungen, zuverlässige Informationen aus der Abschwächung der Signale als eine Funktion der Amplitude der Gradienten zu gewinnen, welche Idealerweise einer Gauss-Funktion folgen sollte. Die Raten dieses Abklingens können durch verschiedene Lösungswege mittels umgekehrter Laplace-Transformationen geschätzt werden. Dies führte zu sogenannten DOSY (Diffusion Ordered Spectroscopy) Darstellungen (5), d.h. zweidimensionalen Darstellungen, in welchen die Diffusionskoeffizienten entlang der Ordinaten auftreten, während die chemischen Verschiebungen für die Dispersion entlang den Abszissen verantwortlich sind.
Das Speichern der Informationen in Form von longitudinaler Protonenmagnetisierung unterliegt natürlich der Spin-Gitter-Relaxation T₁(¹H). Bei Makromolekülen, wie Proteinen und Nukleinsäuren, begrenzt dies normalerweise die brauchbare Dauer des Diffusionsintervalls Δ. Bei Proben wie der vorliegenden, mit Massen im Bereich von 50kDa, haben wir normalerweise T₁(¹H) = 30ms, so dass wir das Diffusionsintervall auf ca. Δ = 30ms beschränken müssen (wenn Δ = T₁(¹H), beträgt der Verlust der Signalintensität exp {–Δ/T₁(¹H)} = e^–1 = 0,37). Diese Beschränkung bedeutet, dass sehr kleine translatorische Diffusionskonstanten D schwer zu messen sind. In der Praxis fanden wir es schwierig, genaue Schätzungen zu erhalten, wenn D ≤ 10^–10m²s^–1 ist bei Verwendung von herkömmlichen stimulierten Echo (STE) Verfahren (6), die nur Protonenmagnetisierung mit einem 600MHz Spektrometer beinhalten, der mit normalen Gradienten in 3 Achsen ausgerüstet ist. Der Diffusionskoeffizient einer wässrigen Lösung des Proteins Ubiquitin (D = 2,4 10^–10m²s^–1 bei 30°C für eine Masse von M = 8kDa) kann z.B. einfach bestimmt werden durch das zuvor beschriebene Verfahren (nicht veröffentlichte Ergebnisse). Das konventionelle stimulierte Echo-Verfahren STE (6) wurde auch für Supramolekularanordnungen von hohem Molekülgewicht verwendet (7), wo es möglich ist, den Diffusionskoeffizienten einer höchst mobilen Polyhistidin-Markierung zu messen, die an das Protein angefügt wurde und relativ schmale Linien und eine langsame Proton-Spin-Gitter-Relaxation hat. Die Konstruktion eines solchen Fusionsproteins ist jedoch zeitaufwändig. Wir fanden heraus, dass das herkömmliche STE-Verfahren ungeeignet ist, um den Diffusionskoeffizienten des Aggregats des Proteins OmpA mit Detergens (D = 10^–10m²s^–1 für eine Masse von M = 50kDa) in der Abwesenheit einer Polyhistidin-Markierung zu bestimmen.
Da eine Stickstoff-15-Anreicherung eine Voraussetzung für die meisten modernen biomolekularen NMR-Verfahren ist, nehmen wir an, dass Löslichmachungs-Studien mit isotopisch angereicherten Proteinen oder Nukleinsäuren ausgeführt werden können. Es ist deshalb möglich, eine Magnetisierung zwischen Amidprotonen ¹H^N und ¹⁵N Kernen durch die skalaren Kopplungen ¹J(¹H^N, ¹⁵N) ≈ –95Hz zu übertragen. Die meisten heteronuklearen Korrelationsverfahren nutzen die Vorteile der günstigen Dispersion der ¹⁵N chemischen Verschiebungen bei so genannten HSQC Darstellungen. Bei dem vorliegenden Dokument verwenden wir jedoch nicht die ¹⁵N chemischen Verschiebungen, sondern wir nutzen ein anderes günstiges Merkmal der ¹⁵N Spins in Biomolekülen aus: Die Tatsache, dass ihre longitudinalen Relaxationszeiten T₁(¹⁵N) normalerweise viel länger sind als die T₁(¹H) der Protonen. Normalerweise ist bei den Lösungen des OmpA-Proteins mit Detergentien, wie unten erörtert, T₁(¹⁵N) ≈ 1s, wohingegen T₁(¹H) ≈ 30ms. Dadurch wird das Speichern von Information in Form von longitudinaler Stickstoffmagnetisierung N_z attraktiv. Wir bezeichnen das neue Verfahren mit „X-STE" für „durch longitudinale homonukleare Magnetisierung stimulierte Echos".
Die Pulssequenz ist in 1 gezeigt. Schmale und breite Pulse stellen 90° bzw. 180° Pulse dar. Sofern nichts anders angegeben ist, werden alle Pulse entlang der X-Achsen des zweifach rotierenden Rahmens angelegt. Die sinusförmigen grauen Pulse sind Wasser-Flip-Back-Pulse (8), normalerweise 90° Gauss-Pulse von einer Dauer von 1,2 ms. Solche Pulse werden auch zwischen den Punkten e und f verwendet, um das Lösungsmittelsignal mit dem „Watergate"-Verfahren (9) zu unterdrücken. Die senkrechten Gradienten G_x oder G_y werden verwendet, um unerwünschte Magnetisierungskomponenten zu eliminieren. Diese Gradienten können auch entlang der z-Achse angelegt werden, vorausgesetzt, dass geeignete Vorkehrungen getroffen werden, um ein unbeabsichtigtes Refokusieren zu verhindern. Der anfängliche 90° Stickstoff-15-Puls bei Punkt a und der nachfolgende Gradient G₁ dienen zum Sättigen der Gleichgewichts-Stickstoff-Magnetisierung. Die Gradienten G_z von einer Dauer δ = 1,3 ms und variabler Amplitude G_encode und G_decode werden für „bipolare Codierung" in den ersten zwei τ-Verzögerungen und für ein „bipolares Decodieren" in den letzten zwei τ-Verzögerungen verwendet. Ihre Auswirkung kann durch den Faktor κ = γ_ISG_maxδ zusammengefasst werden, wobei γ_I das gyromagnetische Verhältnis (von Protonen) ist, s die Oberfläche der (normalerweise nicht rechteckigen) Form der Gradientenpulse G_encode bzw. G_decode, G_max ihre Spitzengradientenamplitude und δ ihre Dauer. Die Phase, die sich durch die Magnetisierung während jedem Gradientenpaar gebildet hat, ist proportional zu der räumlichen Position des Moleküls entlang der vertikalen z-Achse der Probe, ϕ = 2ΚZ. Die Spitzenamplituden G_max wurden inkrementiert von 5,6 auf 52,9 G.cm^–1 zum Dephasieren (und späteren Rephasieren) der transversalen Protonen-Magnetisierung während der τ-Intervalle. Bei Punkt b nach einer INEPT-artigen Sequenz mit τ = (4J_HN)^–1 = 2,72 ms (J_HN = –92Hz) wird die longitudinale zwei-Spin-Ordnung 2H_zN_zcos(2ΚZ) räumlich entlang der z-Achse des Probenrohrs moduliert aufgrund der zwei bipolaren Gradientenpulse, leicht gedämpft durch den Faktor exp {-DΚ²τ'} aufgrund des Beginns der Diffusion zwischen dem Codieren und Punkt b (aus Gründen der Einfachheit nehmen wir an, dass die zwei Codiergradienten nahe beieinander sind und dass beide durch ein Intervall τ von Punkt b entfernt sind). Die Sequenz zwischen den Punkten b und c mit τ = (4J_HN)^–1 konvertiert die longitudinale Zwei-Spin-Ordnung 2N_zN_zcos(2ΚZ) in eine Stickstoff-15 Zeeman-Ordnung N_zcos(2ΚZ), nun gedämpft durch einen Diffusionsfaktor exp {–DΚ² (τ' + 2τ)} bei Punkt c. Die Rückwandlung von N_z in beobachtbare Protonen-Magnetisierung H_y bei Punkt f folgt einem grob symmetrischen Pfad. Wir nehmen wiederum an, dass die zwei Decodiergradienten nahe beieinander sind und durch ein Intervall τ von Punkt e entfernt sind, wird das resultierende Signal durch die translatorische Diffusion während 6 kurzen τ Intervallen und während des viel längeren Δ Intervalls (in unserem Fall betrug die gesamte Dauer 200 ms) gedämpft. Ein Phasenzyklus mit vier Stufen (Φ₁ = y, –y, y, –y, Φ₂ = y, y, –y, –y, Empfängerphase Φ_rec = x, –x, –x, x) wird verwendet, um Signale von Protonen zu eliminieren, die nicht mit ¹⁵N gekoppelt sind (isotope Filtration), und um sicherzustellen, dass longitudinale Relaxation bewirkt, dass die Signale asymptotisch zu Null und nicht zu ihrem Gleichgewichtswert konvergieren.
Das Verhältnis zwischen dem Signal S, das durch Diffusion gedämpft wurde (aufgezeichnet mit G_encode = G_decode ≠ 0) und dem Referenzsignal So (aufgenommen mit sehr schwachen Gradientenamplituden) gehorcht der folgenden Gleichung S/S0 = exp {–Dκ2(Δ + 2τ' + 4τ)} (1)
Sowohl das Referenzsignal S₀ als auch das gedämpfte Signal S werden durch transversale Proton- und Stickstoffrelaxation und durch longitudinale Stickstoff-15 Relaxation gedämpft, was durch einen gemeinsamen Faktor ausgedrückt werden kann f = exp{–4τ/T2(1H)} exp{–4τ/T2(15N)} exp{–Δ/T1(15N)} (2)
Dies kann verglichen werden mit einem ähnlichen Dämpfungsfaktor bei dem weitverbreiteten homonuklearen stimulierten Spin-Echo (STE) Verfahren, wie von Byrd und Mitarbeitern verwendet (6): f' = exp{–4δ/T2(1H)} exp{–Δ/T1(1H)} (3)
Es sollte jedoch hervorgehoben werden, dass in Gleichung (2) die Verzögerung τ beschränkt ist auf τ = (4J_HN)^–1, (etwa 2,7 ms) während in Gleichung (3) δ gleich der Dauer der bipolaren Gradienten ist (etwa 1 bis 10 ms). In den Gleichungen (2) und (3) sind die effektiven transversalen Relaxationsraten Durchschnittswerte der Relaxationsraten der phasengleichen und gegenphasigen Kohärenzen: 1/T2(1H) = {1/T2(Ix) + 1/T2(2IxSz)}/2 (4) 1/T2(15N) = {1/T2(Sx) + 1/T2(2IzSx)}/2 (5)
Wenn wir der Einfachheit halber die Auswirkungen der transversalen Relaxation in den τ Intervallen vernachlässigen, liegt der Hauptunterschied zwischen den Gleichungen (2) und (3) bei den Faktoren exp {–Δ/T_I(¹⁵N)} und exp {–Δ/T_I(¹H)}. Wenn wir annehmen, dass wir einen Verlust der Signalintensität exp {–1} = 0,35 in beiden Experimenten akzeptieren können, kann die Verzögerung Δ von ca. 30 ms bei dem STE-Verfahren auf etwa 1s in dem neuen N_z-STE-Verfahren verlängert werden, wodurch viel langsamere Diffusionskonstanten untersucht werden können.
III. Anwendungen
Das N_z-STE-Verfahren wurde bei einer Lösung eines Transmembransegments des Außenmembranproteins A (OmpA) angewandt, das mit dem Detergens Oktyl-Polyoxyethylen löslich gemacht wurde. Das Protein wurde in einem E.Coli-Stamm mittels eines Plasmids geklont. Die Bakterienkultur wurde in einem minimalen, mit Stickstoff-15 angereicherten M9 Medium gezüchtet, gereinigt und renaturiert. Die NMR Probe war eine Lösung von 1mM Protein in einem Tris-Puffer mit H₂O:D„O = 9:1 bei pH = 8,0 mit 80mg/ml Oktyl-Polyoxyethylen (C₈-POE). Die CH₃(CH2)₇-Oktylkette hatte eine klar definierte Länge, die (CH₂O)_n Polyoxyethylenkette jedoch hatte eine variable Länge mit <n> = 5. Das Detergens hatte eine durchschnittliche Molekülmasse von 360 Da. Die molare Konzentration des freien Detergens betrug 240mM. Es wurde aufgrund der Neutronenbeugungs-Nachweisen geschätzt, dass die Aggregate 30kDa Detergens für jedes Protein von 19kDa aufweisen.
Es ist nicht überraschend, dass die Protonenspektren dieser Lösung von OmpA mit Detergens eine ziemlich schlechte Auflösung haben. Die Dispersion von sowohl ¹H als auch ¹⁵N Spektren (HSQC ist nicht gezeigt) zeigt an, dass das Protein weitgehend gefaltet ist, die Resonanzen jedoch breit sind und eine schlechte Auflösung haben, wahrscheinlich aufgrund einer gewissen Heterogenität der Probe. Trotzdem kann das Experiment von 1 erfolgreich angewandt werden, was in 2 gezeigt ist. Es ist zu beachten, dass die Signale von der Protonenmagnetisierung stammen, die auf die Stickstoff-15 Kerne hin und her übertragen wurde und dass die gesamte Pulssequenz ca. 300 ms dauerte.
3 zeigt den Gauss-Abfall der Signalintensität des OmpA Detergenskomplexes bei 30°C als eine Funktion der Amplituden der Codier- und Decodiergradienten: G_encode = G_decoder welche in 16 Schritten von 5,6 auf 52,9 G.cm^–1 inkrementiert wurden. Der Diffusionskoeffizient, der durch Anpassen dieses Abfalls an Gleichung (1) bestimmt wurde, ist D = (9,84 ± 0,12).10^–11m².s^–1. Als Vergleich berichtet Tanford von einem Diffusionskoeffizienten D = 10.10^–11m².s^–1 für Ovalbumin (45kDa). Beide sind um ca. einen Faktor 20 langsamer als der Diffusionskoeffizient von Wasser, da D(H₂O) = 2.3.10^–9m².s^–1 bei 30°C ist. Die Diffusion des OmpA-Detergenskomplexes ist um einen Faktor 2,4 langsamer als die des Proteins Ubiquitin (M = 8kDA) in einem wässrigen Puffer bei pH = 5,5, wofür wir D = 2.4.10^–10m².s^–1 bei 30°C gemessen haben. Wenn wir annehmen, dass die Diffusion des OmpA-Detergenskomplexes nicht durch die Anwesenheit von Mizellen behindert wird, die durch überschüssiges Detergens gebildet werden (die kritische Mizellenkonzentration des Detergens beträgt 8,4mM bei pH 6,5 und T = 30°C), entspricht dieser Diffusionskoeffizient einer Masse von ca. 50kDa pro Komplex, was sich aus der Zuordnung von 19kDa für jedes Protein und ca. 30kDa Detergens entsprechend ca. 80 Waschmittel-Molekülen für jedes Protein ergeben muss.
Wie in der Studie von Sanders und Mitarbeitern (7) erlaubte es uns die von Byrd und seinen Mitarbeitern (6) vorgeschlagene Sequenz, die Polyhistidin-Markierung von OmpA zu beobachten. Die intensiven Signale des Detergens jedoch führten zu dramatischen Variationen der Basislinie, welche das Verarbeiten der Daten erschwerte. Darüber hinaus ermöglicht dieses Experiment nur die Beobachtung der Polyhistidin-Markierung, welche dem Lösungsmittel ausgesetzt ist. Ein Austausch oder Kreuz-Relaxation mit Wasserprotonen kann somit zu einer Überschätzung der Diffusionskonstanten des Protein-Detergens-Komplexes führen. Dieser Effekt kann teilweise verhindert werden durch Vorsättigen der Wasserresonanz, was jedoch einen Signalverlust zur Folge hat (8). Schließlich kann eine Kreuz-Relaxation zwischen der Protonen- und Stickstoffmagnetisierung für lange Diffusionsintervalle Δ stattfinden. Dies kann weitgehend unterdrückt werden durch Anlegen (zusammengesetzter) π Pulse an die Stickstoffmagnetisierung bei Δ/4 und 3Δ/4 in den Diffusionsintervallen.
Bei dem hier gezeigten OmpA-Detergenskomplex, welcher eine gesamte Masse von ca. 50 kDa und eine Rotationsdiffusion haben soll, die gekennzeichnet ist durch eine Korrelationszeit τ_c von ca. 20ns, ist der theoretische Vorteil ungefähr n ≈ 30, da T_I(¹⁵N) ≈ 1s und T_I(¹H) ≈ 39ms. Je größer der Komplex ist, umso langsamer ist die Diffusionskonstante, und umso günstiger ist der Faktor n solange die Stickstoff-15 Kern-Relaxation von CSA und der dipolaren Wechselwirkung mit dessen gebundenem Proton dominiert wird. Man sollte auch die Verluste aufgrund transversaler Proton- und Stickstoff-Relaxation während der festen τ Intervalle in der Sequenz von 1 berücksichtigen.
Schlussfolgerungen
Es hat sich gezeigt, dass langsame translatorische Diffusionskonstanten für Stickstoff-15 angereicherte Biomoleküle oder Aggregate exakt bestimmt werden können durch Anwendung einer Variante von Gepulster-Feldgradient-NMR mit stimuliertem Echo, wobei die Information in Form von longitudinaler Zeeman-Magnetisierung der Stickstoff-15 Kerne gespeichert wird. Dieses Verfahren sollte die Optimierung von Detergentien und amphiphilen Mitteln für die Löslichmachung von Membranproteinen beachtlich vereinfachen.
Mögliche Anwendungen der Erfindung
Mögliche Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhalten:

– Messung der räumlichen Anisotropie von translatorischer Diffusion oder der Richtung des Stroms durch Verwenden von Codier- und Decodiergradienten in drei orthogonalen Richtungen;
– Messung der isotropen oder anisotropen translatorischen Diffusion von Molekülen in viskosen Fluiden, Elektrolytlösungen und flüssigen kristallinen Phasen, einschließlich Mizellar- und Bizellar-Phasen;
– Messung der isotropen oder anisotropen Diffusion oder des Flusses von Molekülen durch poröse Feststoffe wie Zeolite, Öl enthaltende Steine, Aerogels und andere poröse Materialien;
– Messung der isotropen oder anisotropen Diffusion oder des Flusses von Molekülen in Fluiden durch Vorrichtungen, die makroskopische oder mikroskopische Kanäle und/oder Reaktoren enthalten;
– Messung der isotropen oder anisotropen Diffusion oder des Flusses von in Fluiden, insbesondere Blut, enthaltenen Molekülen durch Gefäße wie Arterien und Venen bei lebenden Organismen; und
– Messung der isotropen oder anisotropen Diffusion von in Fluiden, insbesondere Blut, enthaltenen Molekülen durch Organe, wie Muskeln, Gehirn, Leber etc. sowohl in-vivo als auch in-vitro.

Referenzen

(1) E. O. Stejskal und J. E. Tanner, J. Chem. Phys. 42, 288-292 (1965).
(2) J. E. Tanner, J. Chem. Phys. 52, 2523 (1970).
(3) G. Wider, V. Dotsch und K. Wüthrich, J. Magn. Reson. A 108, 255 (1994).
(4) A. Jerschow und N. Müller, J. Magn. Reson. 125, 372-375 (1997).
(5) C. S. Johnson, Prog. NMR Spec. 34, 203-256 (1999).
(6) A. S. Altieri, D. P. Hinton und R. A. Byrd, J. Am. Chem. Soc. 117, 7566-7567 (1985).
(7) O. Vinogradova, F. Sönnischen und C. R. Sanders II, J. Biomol. NMR 4, 381-386 (1998).
(8) S. Grzesiek und A. Bax, J. Am. Chem. Soc. 115, 12593-12594 (1993).
(9) M. Piotto, V. Saudek und V. Sklenar, J. Biomol. NMR 2, 661-665 (1992).
(10) H. Barjat, G. A. Morris und A. S Swanson, J. Magn. Reson. 131, 131 (1998).

Erklärung der Bildunterschriften
1 Pulssequenz, ausgebildet für die Messung von Diffusionskoeffizienten mittels Speicherung von longitudinaler Stickstoff-15 Magnetisierung mit stimulierten Echos (N_z-STE) wie im Text erklärt.
2 Eindimensionale Stickstoff-15 gefilterte Protonenspektren, erhalten mit der N_z-STE Sequenz von 1, vom einer Probe des Transmembransegments des Außenmembranproteins A (OmpA), angereichert in Stickstoff-15 und gelöst in Oktyl-Polyoxyethylen-Mizellen in H₂O:D₂O = 9:1 bei pH = 8,0 und T = 30°C. Das gesamte Diffusionsintervall betrug Δ + 6τ = 300ms. Die Amplituden der Gradienten G_encode = G_decode wurden von 5,6 auf 52,9 G.cm^–1 inkrementiert. Jedes Experiment wurde mit 512 Transienten erhalten, während die Relaxationsverzögerung zwischen aufeinander folgenden Experimenten 1 s betrug. Die Pfeile deuten die Grenzen des Bereichs zwischen 7,55 und 9,45 ppm an, über den das Signal integriert wurde.
3 Abfall der Signalintensität des OmpA-Detergenskomplexes von 2 als eine Funktion der Amplituden der Codier- und Decodiergradienten G_encode =G_decode, welche in 16 Schritten von 5,6 auf 52,9 G.cm^–1 inkrementiert wurden. Die Protonensignale wurden über den Amidbereich integriert (siehe 2). Der Diffusionskoeffizient, bestimmt durch die Anpassung an Gleichung (1) ist D = (9,84 ± 0,12).10^–11m².s-¹.

Claims

Gepulster Feldgradient NMR (Kernspinresonanz) Verfahren unter Verwendung von stimulierten Echos zum Bestimmen des translatorischen isotropen oder anisotropen Diffusionskoeffizienten eines Moleküls oder einer Supramolekularanordnung oder der Flussrate und der Flussrichtung von Fluiden, die ein solches Molekül oder eine solche Supramolekularanordnung enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül oder die Supramolekularanordnung Protonen (H) und eines oder mehrere, von Protonen verschiedene Isotope (X) mit einem Kernspin von nicht Null enthält mit longitudinalen Relaxationszeiten T1(X), die länger sind als die longitudinalen Relaxationszeiten T1(H) der Protonen, dass die Informationen über die Lokalisierung des Moleküls oder der Supramolekularanordnung, welche durch Anwenden eines gepulsten Feldgradienten codiert sind, während des Diffusions- oder Flussintervalls (Δ) in Form einer longitudinalen Magnetisierung des Isotops oder der Isotope vorübergehend gespeichert werden, und dass eine Sequenz von Hochfrequenzimpulsen angewandt wird, um die Magnetisierung von Protonen an das genannte Isotop oder die genannten Isotope vor der besagten vorübergehenden Speicherung der Informationen in Form von longitudinaler Magnetisierung des Isotops oder der Isotope zu übertragen und danach wieder zurück zu übertragen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, das eines der Isotope Stickstoff-15 ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eines der Isotope Kohlenstoff-13 ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eines der Isotope Phosphor-31 ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül oder die Supramolekularanordnung Biomoleküle enthält.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül oder die Supramolekularanordnung Proteine und/oder Nukleinsäuren aufweist, die durch Reinigungsmittel oder amphiphile Mittel gelöst sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Bestimmung des translatorischen Diffusionskoeffizienten die Masse und der Gyrationsradius des Moleküls oder der Supramolekularanordnung auf der Basis eines hydrodynamischen Modells berechnet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Anwendung einer Folge von Hochfrequenzimpulsen zum Konvertieren der transversalen Magnetisierung senkrecht zum angelegten Magnetfeld der genannten Isotope in longitudinale Magnetisierung parallel zu dem angelegten Magnetfeld während des Intervalls, in dem eine translatorische Diffusion oder Fluss überwacht wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die folgende Impulssequenz angewandt wird: i) 90° Puls, der auf Isotop X wirkt ii) gepulster Feldgradient zum Dephasieren transversaler Magnetisierung iii) selektiver 90° Puls in -x-Richtung, der in Resonanz des Isotops H des Lösungsmittels wirkt iv) 90° Puls in x-Richtung, der auf Isotop H wirkt v) gepulster Feldgradient zum Codieren der räumlichen Position, Verzögerungszeit τ abwarten vi) gleichzeitig 180° Puls in x-Richtung, der auf Isotop H wirkt und 180° Puls in x-Richtung, der auf Isotop X wirkt vii) gepulster Feldgradient zum Codieren der räumlichen Position, Verzögerungszeit τ abwarten viii) 90° Puls in y-Richtung, der auf Isotop H wirkt ix) selektiver 90° Puls in -y-Richtung, der in Resonanz des Isotops H des Lösungsmittels wirkt x) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung xi) 90° Puls in x-Richtung, der auf Isotop X wirkt xii) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung, Verzögerungszeit τ abwarten xiii) gleichzeitig 180° Puls in -x-Richtung, der auf Isotop H wirkt und 180° Puls in x-Richtung, der auf Isotop X wirkt xiv) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung, Verzögerungszeit τ abwarten xv) 90° Puls in +x oder –x Richtung, der auf Isotop X wirkt xvi) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung xvii) auf Diffusions- oder Flussintervall Δ warten xviii) 90° Puls in +x oder –x Richtung, der auf Isotop X wirkt xix) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung, Verzögerungszeit τ abwarten xx) gleichzeitig 180° Puls in x-Richtung, der auf Isotop H wirkt und 180° Puls in x-Richtung, der auf Isotop X wirkt xxi) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung, Verzögerungszeit τ abwarten xxii) selektiver 90° Puls in -x-Richtung, der in Resonanz des Isotops H des Lösungsmittels wirkt xxiii) gleichzeitig 90° Puls in -x-Richtung, der auf Isotop H wirkt und 90° Puls in -x-Richtung, der auf Isotop X wirkt xxiv) gepulster Feldgradient zum Decodieren der räumlichen Position xxv) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung, Verzögerungszeit τ abwarten xxvi) selektiver 90° Puls in x-Richtung, der in Resonanz des Isotops H des Lösungsmittels wirkt xxvii) gleichzeitig 180° Puls in -x-Richtung, der auf Isotop H wirkt und 180° Puls in x-Richtung, der auf Isotop X wirkt xxviii) selektiver 90° Puls in x-Richtung, der in Resonanz des Isotops H des Lösungsmittels wirkt xxix) gepulster Feldgradient zum Decodieren der räumlichen Position xxx) gepulster Feldgradient zum Dephasieren der transversalen Magnetisierung, Verzögerungszeit τ abwarten xxxi) H Signal aufnehmen mit τ = (4J_HX)^–1, wobei J_HX die skalare Kopplungskonstante der Isotope H und X ist, und Δ ein wählbarer Zeitparameter ist, wobei Δ > > τ.