CN113552160A - 一种基于液体核磁共振技术检测蛋白质扩散运动的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于液体核磁共振技术检测蛋白质扩散运动的方法，涉及生物大分子动态运动性质检测领域，将PEP灵敏度增强的脉冲序列应用于蛋白质扩散系数的测定中，编写新的可以用于测定蛋白质扩散系数的三维{¹H}，¹⁵N‑DOSY‑HSQC实验的脉冲序列，该脉冲序列引入了杂核¹⁵N维和PEP灵敏度增强脉冲序列，用来测定¹⁵N原子的扩散系数，可以有效的提高了分辨率和灵敏度，同时测定的数据结果更能够反映蛋白质主链与整体的平动运动性质。

Description

一种基于液体核磁共振技术检测蛋白质扩散运动的方法

技术领域

本发明涉及生物大分子动态运动性质检测领域，尤其涉及一种基于液体核磁共振技术灵敏度增强的检测蛋白质动态扩散运动性质的方法。

背景技术

除了结构之外，蛋白质动力学在其功能中也起着重要的作用。与其它技术相比，溶液核磁共振是唯一一种能同时测定多个位点并以原子分辨率获得定量信息的技术。目前已有许多核磁共振实验被开发用于研究不同时间尺度上的蛋白质动态性质的研究(Farrowet al.1994，Loria et al.1999，Korzhnev et al.2002，Vallurupalli et al.2012，Johnson 1999，Pages et al.2017)，其中分子在溶液中的平动更加直观易懂。蛋白质的平动运动性质与蛋白质的结构和功能相关，可以用扩散系数(D)来表征。通过蛋白质扩散系数的测定可以研究蛋白质的聚集(Altieri et al.1995，Buevich and Baum 2002，Dehnerand Kessler 2005，Dingley et al.1995，Price et al.1997)和蛋白质-配体或蛋白质-蛋白质相互作用(Serdyuk et al.2007，Didenko et al.2011，Wahlstrom et al.2012，Kusova et al.2019)。

DOSY也被称为脉冲场梯度(PFG)核磁共振波谱，可以高精度地测量平动扩散系数(Johnson 1999，Pages et al.2017)。典型的DOSY谱包含一个扩散维和一个或两个频率维。对于蛋白质来说，较大的分子量导致核磁共振信号弱且重叠严重，因此增加核磁谱图的灵敏度和检测频率维至关重要。PEP脉冲序列的使用可以使核磁共振信号强度最大增加一倍，灵敏度增加41.4％(Palmer et al.1991，Kay et al.1992)，但是该序列尚未应用于测定扩散系数的DOSY实验中。另外，通常蛋白质的¹H，{¹⁵N}-HSQC谱具有较好的分辨率和灵敏度，增加¹⁵N维的检测能够提高分辨率。目前已有文献报道了3D ¹H，{¹⁵N}-DOSY-HSQC，¹H{¹⁵N}-DOSY-TROSY和{¹H}，¹⁵N-DOSY-HSQC实验(Brand et al.2007，Didenko et al.2011，Lee etal.2020，Choy et al.2002，Ferrage et al.2003，Orekhov et al.1999)，前两个实验分别被设计用于蛋白质的主链残基NH交换率和蛋白质复合物的构象变化的研究。两个实验均测定主链酰胺基¹H原子的扩散系数，主链酰胺基中的¹H具有活性，易于与溶剂交换，从而导致测定结果与实际偏差，蛋白质主链酰胺基¹⁵N原子的平移运动更接近于蛋白质主链的真实运动性质。而{¹H}，¹⁵N-DOSY-HSQC实验虽然测定的是主链酰胺基¹H原子的扩散系数，但实验中并未使用任何灵敏度增强的脉冲序列，实验的灵敏度仍有可能进一步提高。

对于蛋白质来说，较大的分子量使得蛋白质横向弛豫时间变短，导致核磁共振信号的强度变弱，提高信号检测的灵敏度对于蛋白质检测来说至关重要。PEP脉冲序列是比较成熟的方法，理论上可以最高增加一倍的核磁共振信号强度和41.4％的核磁信号灵敏度。目前蛋白质扩散系数三维实验方法仍处于开发阶段，虽有文献报道，但只能看到结果，无法获得脉冲过程，更没有商业化的方法可以使用，并且已发表的文献中的方法并没有使用信号增强的脉冲序列。

发明内容

本发明的目的是提出一种基于液体核磁共振技术检测蛋白质扩散运动的方法，将PEP灵敏度增强的脉冲序列应用于蛋白质扩散系数的测定中，编写新的可以用于测定蛋白质扩散系数的三维{¹H}，¹⁵N-DOSY-HSQC实验的脉冲序列，该脉冲序列引入了杂核¹⁵N维和PEP灵敏度增强脉冲序列，用来测定¹⁵N原子的扩散系数，可以有效的提高了分辨率和灵敏度，同时测定的数据结果更能够反映蛋白质主链与整体的平动运动性质。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于液体核磁共振技术检测蛋白质扩散运动的方法，包括如下步骤：

1)制备待测蛋白质样品，该蛋白质样品至少进行¹⁵N同位素标记；

2)对{¹H}，¹⁵N-DOSY-HSQC的脉冲序列参数进行设定，使用双INEPT序列将¹⁵N的磁矩转至横向，然后通过在¹⁵N维使用双脉冲对自旋回拨序列(BPPSTE)在不同梯度场强度下实现磁矩的扩散，同时对¹H维使用WALTZ65组合脉冲去耦(CPD)序列进行去耦；

3)参数设定好后，在液体核磁共振仪上对蛋白质样品进行检测，利用¹⁵N进行化学位移标记，并使用PEP脉冲序列传递磁矩和增强信号强度，在¹H维和¹⁵N维进行多次的数据采集；

4)将采集的数据处理成不同梯度场强度的二维谱图，提取二维谱图中不同梯度场强度的每一个代表主链氨基酸信号强度的数据，再对提取的氨基酸信号强度数据进行拟合，得到蛋白质扩散序数。

进一步地，蛋白质样品的浓度大于0.5mM，纯度大于90％。

进一步地，INEPT传递时间根据样品¹H、¹⁵N化学键的耦合常数J计算所得，计算公式为1/4J，典型值是2.5ms。

进一步地，对自旋回拨序列(BPPSTE)实现磁矩的扩散，扩散时间设为300ms；梯度场强度设为仪器最大梯度场的5％，15％，25％，35％，45％，55％(*2)，65％，75％，85％，95％。

进一步地，梯度场时间根据最弱和最强梯度强度的强度比值确定，优选强度比为20:1时的梯度场时间，该梯度场时间为1～7ms。

进一步地，二维谱图数量与梯度场强度数量相同，且其中两张二维谱图用于计算误差。

进一步地，¹H维和¹⁵N维的数据采集的点数分别不少于1024和128。

进一步地，数据采集的累计次数不小于128次。

进一步地，根据公式

对提取的每一个氨基酸信号强度进行最小二乘法拟合，得到蛋白质扩散序数，其中S为氨基酸信号强度，S₀为常数，D为扩散系数，γ为旋磁比，g为梯度场强度，δ为2倍的梯度场时间，Δ为扩散时间。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

目前并没有商业化的测定蛋白质扩散运动的三维异核的脉冲方法，已有的文献的方法并未使用信号增强的脉冲序列。本发明针对蛋白质样品信号弱的特点，将PEP信号增强的序列方法应用于蛋白质扩散运动测定中，发明了测定蛋白质扩散运动的灵敏度增强的三维异核脉冲序列{¹H}，¹⁵N-DOSY-HSQC，最高可提高一倍的信号强度和41.4％的信号灵敏度，具有更高的应用价值。

附图说明

图1是{¹H}，¹⁵N-DOSY-HSQC实验脉冲序列示意图。

图2A是CD147主链¹⁵N扩散系数图。

图2B是CD147主链扩散运动性质的结构表示图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明做进一步说明，所举实施例并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

实施例1

1、蛋白质样品的制备：

本实施例以人源细胞表面受体CD147对脉冲序列进行测试。野生型CD147是一个单次跨膜蛋白，由269个氨基酸组成，可分为信号肽(1-21)，胞外区(22-206)、跨膜区(207-230)和胞内区(231-269)四个部分。本实施例使用¹⁵N同位素标记的胞外区部分，包含N端IgC2型结构域(残基22-101)和C端IgI型结构域(残基107-205)组成，其结构如图2B图所示，具有较大氨基酸残基用红色标出，具有较小扩散系数的氨基酸残基在结构上用蓝色标出，未进行化学位移归属的氨基酸残基用黑色标出，其它氨基酸残基用青色标出。其中具有扩散系数低的E118-T121和I171-D179的无结构区也在图中标出。具体的克隆、表达和纯化过程参考文献(Jin et al.2018)。纯化出来的0.4mM ¹⁵N同位素标记的样品溶解在20mM MOPS，50mM NaCl，pH 7.0，1％EDTA，90％H₂O/10％D₂O的缓冲体系中，浓度大于0.5mM，体积500μL，纯度大于90％。

2、脉冲序列参数设置：

对{¹H}，¹⁵N-DOSY-HSQC的脉冲序列参数进行设定，如图1所示，图中窄的和宽的的矩形表示¹H和¹⁵N的90°和180°脉冲，箭头形表示整形脉冲和梯度场脉冲，空的矮矩形表示CPD去耦脉冲。相位循环分别为φ1＝4(x),4(-x)；φ2＝x,-x；φ3＝2(x),2(-x)；φ4＝2(-y),2(y)；receiver＝x,2(-x),x,-x,2(x),-x.d₁表示磁矩恢复时间，d₂表示INEPT传递时间，t₁表示¹⁵N化学位移标记时间。使用双INEPT序列将¹⁵N的磁矩转至横向，然后通过在¹⁵N维使用双脉冲对自旋回拨序列BPPSTE在不同梯度场强度下实现磁矩的扩散，同时对¹H维使用WALTZ65组合脉冲去耦(CPD)序列进行去耦。CD147扩散系数检测参数如下：INEPT传递时间设为2.5ms；扩散时间设为300ms；梯度场强度设为2.65,7.95,13.25,18.55,23.85,29.15(×2),34.45,39.75,45.05,50.35G/cm；根据最弱和最强梯度强度的对比，梯度场时间设为5.1ms；直接维¹H维和间接维¹⁵N维的采集点数分别为1024和128，，以保证谱图具有足够的分辨率，频率激发中心分别为4.706ppm和121.0ppm。实验的累积扫描次数为128次，实验的累计采集次数与浓度相关，一般不小于128以保证具有足够的灵敏度进行数据拟合。

3、实验数据处理与结果分析：

将得到的CD147的谱图处理成11个二维谱，并提取图中每一个氨基酸信号的强度，得到因使用不同梯度场强度而具有不同氨基酸信号强度的数据集。随后按照公式

对每一个氨基酸信号进行最小二乘法拟合，得到相应的扩散序数。拟合公式中Δ是扩散时间300ms，δ是2倍的梯度场时间10.2ms，γ是旋磁比4257.7Hz/G，此三项为常数项。g是梯度场强度，11个实验中共有10值，见步骤2，两个相同的值用于计算误差，是函数自变量。S是氨基酸信号强度，来自各个谱图提取出来的数据集，是函数因变量。在数据拟合中，对CD147的187个氨基酸残基中的155个氨基酸残基进行了拟合分析，没有拟合的氨基酸残基主要是N端残基、8个无信号的Pro氨基酸残基和19个没能进行化学位移归属的氨基酸残基。最终拟合得到扩散系数D的结果如图2A所示，横坐标是氨基酸残基数，纵坐标分别是主链氨基¹⁵N的扩散系数，实验在700MHz核磁共振仪器上采集，实验温度是298K。

结果表明，绝大多数的氨基酸残基的扩散系数位于3到5×10^-12m²/s，平均值是(3.90±0.37)×10^-12m²/s，该数值反映了CD147整体扩散运动的性质。有21个氨基酸残基的扩散系数大于5×10^-12m²/s，表明这些氨基酸残基具有更高的运动性；有13个氨基酸残基的扩散系数小于3×10^-12m²/s，表明这些氨基酸残基具有较低的运动性。将测得的扩散系数值与结构匹配得到图2B。21个具有较高运动性的氨基酸残基主要位于无结构区，无结构区本身具有比其它结构更高的运动性，检测结果与事实相符。CD147由两个结构域构成，所有具有较低扩散系数的氨基酸残基均位于C端结构域，C端结构域整体的扩散系数低于N端结构域，表明C端结构域具有更低的运动性，这与文献中CD147通过C端结构域聚集的结果一致。并且，C端的E118-T121和I171-D179两个无结构区没有像其它无结构区一样具有较高的运动性，已有的关于锌离子诱导CD147聚集的研究表明，CD147进行自聚集的界面包含了上述两个无结构区域，因此这两个无结构区域因位于自聚集界面而被稳定了。位于锌离子诱导的聚集界面H115-L124和H170-D179氨基酸残基平均扩散系数分别为3.64×10^-12m²/s和3.95×10^-12m²/s，前者有一半的氨基酸残基是无结构区，运动性反而明显低于CD147的整体运动性，后者基本都是无结构区域，但运动性和CD147整体运动性相近。这些结构均表明，即使没有锌离子存在，CD147也存在自聚集作用，且作用界面与锌离子有诱导聚集的界面一致。本发明的方法可以用来研究蛋白质自聚集，蛋白质相互作用，拓展了液体核磁共振技术的应用。

Claims (9)

1.一种基于液体核磁共振技术检测蛋白质扩散运动的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备待测蛋白质样品，该蛋白质样品至少进行¹⁵N同位素标记；

2)对{¹H}，¹⁵N-DOSY-HSQC的脉冲序列参数进行设定，使用双INEPT序列将¹⁵N的磁矩转至横向，然后通过在¹⁵N维使用双脉冲对自旋回拨序列在不同梯度场强度下实现磁矩的扩散，同时对¹H维使用WALTZ65组合脉冲去耦序列进行去耦；

3)参数设定好后，在液体核磁共振仪上对蛋白质样品进行检测，利用¹⁵N进行化学位移标记，并使用PEP脉冲序列传递磁矩和增强信号强度，在¹H维和¹⁵N维进行多次的数据采集；

4)将采集的数据处理成不同梯度场强度的二维谱图，提取二维谱图中不同梯度场强度的每一个代表主链氨基酸信号强度的数据，再对提取的氨基酸信号强度数据进行拟合，得到蛋白质扩散序数。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白质样品的浓度大于0.5mM，纯度大于90％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，INEPT传递时间根据样品¹H、¹⁵N化学键的耦合常数J计算所得，计算公式为1/4J，典型值是2.5ms。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对自旋回拨序列实现磁矩的扩散，扩散时间设为300ms；梯度场强度设为仪器最大梯度场的5％，15％，25％，35％，45％，55％(*2)，65％，75％，85％，95％。

5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，梯度场时间根据最弱和最强梯度强度的强度比值确定，优选强度比为20:1时的梯度场时间，该梯度场时间为1～7ms。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，二维谱图数量与梯度场强度数量相同，且其中两张二维谱图用于计算误差。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，¹H维和¹⁵N维的数据采集的点数分别不少于1024和128。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，数据采集的累计次数不小于128次。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，根据公式

对提取的每一个氨基酸信号强度进行最小二乘法拟合，得到蛋白质扩散序数，其中S为氨基酸信号强度，S₀为常数，D为扩散系数，γ为旋磁比，g为梯度场强度，δ为2倍的梯度场时间，Δ为扩散时间。

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