DE2426519C2 - Strahlung aussendende Markierungssubstanz, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie sie enthaltendes markiertes Reagens - Google Patents
Strahlung aussendende Markierungssubstanz, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie sie enthaltendes markiertes ReagensInfo
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Description
a) die Markierungssubstanz umfaßt eine oligomere oder polymere Kette mit einer gegenüber
dem ersten Reaktanten reaktiven Gruppe als Endgruppe;
b) die Kette wird gebildet durch eine Vielzahl sich wiederholender Einheiten, die jeweils eine Seitenbindung
aufweisen, die mit einem Rest verbunden ist, der bei geeigneter Aktivierung Strahlung aussenden kann, wobei die Seitenbindungen
gegenüber dem ersten Reaktanten nicht reaktiv sind; und
c) die Markierungssubstanz besitzt die gleiche Hydrophilie und Ladungsdichte wie der erste
Reaktant.
2. Markierungssubstanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine gefaltete
Struktur besitzt.
3. Markierungssubstanz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlung aussen-Jende
Rest eine fluoreszierende Gruppe ist.
4. Markierungssubstanz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die sich wiederholenden
Einheiten Sigmabindungsabschnitte von ausreichender Länge zur Verhinderung einer sterischen
Störung und Erzielung einer Resonanzabschirmung zwischen den fluoreszierenden Gruppen umfassen,
wobei die Kette und die fluoreszierenden Gruppen so ausgewählt sind, daß die Kette keine fluoreszierende
Strahlung der Gruppen dämpft.
5. Markierungssubstanz nach den Ansprüchen 1 bis 4, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel
NCS-[CH2-CH2-N],-CH3
CH2
CH2
CH2
CH2
50
55
in der D die Strahlung aussendende Gruppe ist und η
einen Wert von 4 bis 1000 hat.
6. Verfahren zur Herstellung einer Markierungssubstanz gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, gekennzeichnet
durch:
60
a) Umsetzung einer oligomeren oder polymeren Kette, die eine gegenüber dem ersten Reaktanten
reaktive Endgruppe aufweist und gebildet wird durch eine Vielzahl sich wiederholender
Einheiten, die jeweils ein reaktives Zentrum aufweisen, dessen chemische Reaktivität von
derjenigen der Endgruppe verschieden ist, mit einer Verbindung, welche die reaktive Endgruppe
blockieren kann;
b) Umsetzung des dabei erhaltenen Produkts mit einem Rest, der bei geeigneter Aktivierung
Strahlung aussenden kann, wobei die Umsetzung an den reaktiven Zentren der sich wiederholenden
Einheiten stattfindet; und
c) Entfernung der Blockierungsgruppen von den reaktiven Endgruppen der oligomeren oder
polymeren Verbindung.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Endgruppen der oligomeren
oder polymeren Verbindung durch Umsetzung mit Benzaldehyd blockiert und durch Hydrolyse
von den Blockierungsgmppen befreit werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6 ode* Λ dadurch
gekennzeichnet, daß als polymere Verbindung Polyäthylenimin mit Methylamin am Kettenende
verwendet wird.
9. Markiertes Reagens, gekennzeichnet durch eine Markierungssubstanz nach den Ansprüchen 1
bis 5, die an einen ersten Reaktanten gebunden ist.
10. Markiertes Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem ersten
Reaktanten um einen Antikörper handelt.
11. Verfahren zur Herstellung des markierten Reagens nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch
gekennzeichnet, daß die gemäß Anspruch 6 bis 8 hergestellte Markierungssubstanz nach Entfernung
der Blockierungsgruppen von den reaktiven Endgruppen der oligomeren oder polymeren Verbindung
zur Herstellung des markierten Reagens mit dem ersten Reaktanten umgesetzt wird.
Die Erfindung betrifft eine Strahlung aussendende Markierungssubstanz, die eine Gruppe aufweist, die mit
einem ersten Reaktanten reagieren kann unter Bildung eines markierten Reagens, das einen zweiten Reaktanten
markieren kann durch spezifische Bindungsreaktion des markierten Reagens mit dem zweiten Reaktanten,
ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ein diese enthaltendes markiertes Reagens und ein Verfahren zu
dessen Herstellung, die zum Markieren von reaktionsfähigen Molekülen mit zwei oder mehr reaktiven Zentren
oder funktionellen Gruppen, inäiesondcre in der
klinischen Analyse und für spezifische immunchemische Reaktionen eingesetzt werden können zur
Steigerung del Empfindlichkeit von Nachweis- bzw. Analyseverfahren ohne Einführung neuer Fehlerquellen.
Sie eignen sich besonders gut fur die Verwendung in Antigen-Antikörper-Reaktionen.
Eine bekannte, im klinischen Labor angewendete Technik besteht darin, einen verdächtigen Virus
dadurch aufzuspüren und zu klassifizieren, daß man auf eine die Probe enthaltende Flüssigkeit hintereinander
hochspezifische Antikörper einwirken laßt, die mit einer Strahlung aussendenden Markierungssubstanz
markiert sind. Wenn die untersuchte Probe das Antigen des eingesetzten Antikörpers enthält, tritt eine Verknüpfung
zwischen dem Virus und dem markierten Antikörper auf, als Folge der Antigen-Antikörpcr-Reaktion.
Da dabei mehrere markierte Antikörpcrmolekülc mit einem einzelnen Virusmolekül verknüpft
werden, ist die von dem entstandenen Aggregat abgcge-
bene Strahlungsenergie eindeutig unterscheidbar von der Strahlungsenergie der markierten Antikörper. Die
damit erzielbare Empfindlichkeit und die Möglichkeit, sehr geringe Vimsmengen nachzuweisen, sind bisher
jedoch noch ungenügend, insbesondere ist bei einer spezifischen Antikörper-Immunfluoreszenz die Signalstärke
von fluorochromen Farbstoffen, die über Antikörper-Zwischenstufen mit Virusteilchen verbunden
sind, für den Nachweis der einzelnen Teilchen zu gering. Die bisher durchgeführten Versuche, die Empfindlichkeit
durch erhöhte Farbstoffbeladung zu erhöhen, führten bisher aus den nachstehend angegebenen
Gründen zu einer geringeren Spezifität:
(1) Da genügend Farbstoffmoleküle mit dem nachzuweisenden
Molekül in Verbindung kommen, sind einige nahe genug an dem aktiven Zentrum, um eine partielle sterische Abschirmung mit den
damit verbundenen Nachteilen auf die Molekülspezifität zuötwirken;
(2) Veränderungen der Gesarnthydrophiüe und der
Ladungsdichte des erhaltenen Moleküls führen zu einer Änderung seiner Reaktionsfähigkeit und
Löslichkeit;
(3) Sterische und Hydrophilie-Einwirkungen auf das Molekül sowie mögliche Veränderungen seines
Vibrationsverhaltens können zu einer Veränderung der tertiären Proteinstruktur und demzufolge
seiner Spezifität führen;
(4) chemische Wechselwirkungen an dem Bindungszentrum kön'3H Veränderungen der Atombindung
in einigem Abstand vom Bindungsort bewirken, möglicherweise unter Beteiligung des
spezifischen Bindungszeniru<ns.
Aus »Ärztliches Laboratorium«, 18. Jahrgang, 1972, Seiten 133 bis 142, ist zwar bereits eine Strahlung aussendende
Markierungssubstanz für die Markierung von Proteinmolekülen für immunchemische Zwecke bekannt,
die eine Molekülstruktur mit einer gegenüber den zu markierenden Molekülen reaktiven Gruppe aufweist,
aber auch in diesem Falle ist die erzielbare Empfindlichkeit noch unzureichend bzw. geht auf Kosten
der Spezifität.
Aufgabe der Erfindung war es daher, eine Strahlung aussendende Markierungssubstanz zu entwickeln, mit
deren Hilfe es möglich ist, die Empfindlichkeit des Nachweises von reaktionsfähigen chemischen Molekülen
deutlich zu erhöhen, ohne die Spezifität des Nachweises zu beeinträchtigen.
Gegenstand der Erfindung, mit dem die vorgenannte Aufgabe gelöst werden kann, ist eine Strahlung aussendende
Markierungssubstanz, die eine Gruppe aufweist, die mit einem ersten Reaktanten reagieren kann unter
Bildung eines markierten Reagens, das einen zweiten Reaktanten markieren kann durch spezifische Bindungsreaktion
des markierten Reagens mit dem zweiten Reaktanten, die durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet
ist:
senden kann, wobei die Seitenbindungen gegenüber dem ersten Reaktanten nicht reaktiv sind;
c) die Markierangssubstanz besitzt die gleiche Hydrophiüe und Ladungsdichte wie der erste
ReaktanL
Damit ist es möglich, die Empfindlichkeit des Nachweises
von reaktionsfähigen Molekülen, insbesondere bei immunchemischen Reaktionen, um mindestens
ίο zwei Größenordnungeu (Potenz 10 der Bestimmung in
Teilchen pro μΐ Lösung) gegenüber bekannten Nachweisverfahren
zu erhöhen. Damit ist es insbesondere möglich, einzelne chemische Moleküle oder Viiusteil·
chfin mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen, ihre Grö3e zu bestimmen bzw. sie zu klassieren, ohne daß
dies auf Kosten ihrer Spezifität geht.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung hat die Markierungssubstanz eine gefaltete Struktur
und der Strahlung aussendende Rest ist vorzugsweise eine fluoreszierende Gruppe.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfassen die sich wiederholenden Einheiten
Sigmabindungsabschnitte von ausreichender Länge zur Verhinderung einer sterischen Störung und
Erzielung einer Resonanzabschirmung zwischen den fluoreszierenden Gruppen, wobei die Kette und die
fluoreszierenden Gruppen so ausgewählt sind, daß die Kette keine fluoreszierende Strahlung der Gruppen
dämpft. Vorzugsweise handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Markierungssubstanz um eine solche
der allgemeinen Formel
NCS-[CH2-CH2-N]n-CH3
35
CH2
CH2
in der D die Strahlung aussendende Gruppe darstellt und η einen Wert von 4 bis 1000 hat.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend beschriebenen neuen
Markierungssubstanz, das gekennzeichnet ist durch:
a) die Markicrungssubstanz umfaßt eine oligomere oder polymere Kette mit einer gegenüber dem
ersten Reaktanten reaktiven Gruppe als Endgruppe:
b) die Kette wird gebildet durch eine Vielzahl sich wiederholender Einheiten, die jeweils eine Seitenbindung
aufweisen, die mit einem Rest verbunden ist, der bei geeigneter Aktivierung Strahlung aus-
(a) Umsetzung einer oligomeren oder polymeren Kette, die eine gegenüber dem ersten Reaktanten
reaktive Endgruppe aufweist und gebildet wird durch eine Vielzahl sich wiederholender Einheiten,
die jeweils ein reaktives Zentrum aufweisen, dessen chemische Reaktivität von derjenigen der
Endgruppen verschieden ist, mit einer Verbindung, welche die reaktive Endgruppe blockieren
kann;
(b) Umsetzung des dabei erhaltenen Produkts mit einem Rest, der bei geeigneter Aktivierung Strahlung
aussenden kann, wobei die Umsetzung an den reaktiven Zentren der sich wiederholenden Einheiten
stattfindet; und
(c) Entfernung der Blockierungsgruppen von den reaktiven Endgruppen der oligomeren oder polymeren
Verbindung.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden die reaktiven Endgruppen der oligomeren oder
polymeren Verbindung durch Umsetzung mit Benz-
aldehyd blockiert und durch Hydrolyse von den Blockierungsgruppen befreit. Als polymere Verbindung
verwendet man vorzugsweise Polyäthylenimin mit Methylamin am Ksttenende.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein markiertes Reagens, das gekennzeichnet ist durch eine wie vorstehend
beschriebene Markierungssubstanz, die an einen ersten Reaktanten gebunden ist, bei dem es sich vorzugsweise
um einen Antikörper handelt
Dieses markierte Reagens wird nach einem einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildenden Verfahren
hergestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
die in vorstehender Weise hergestellte Markierungssubstanz nach Entfernung der Blockierungsgruppen
von den reaktiven Endgruppen der oligomeren oder polymeren Verbindung mit dem ersten Reaktanten
umgesetzt wird, wobei man ein Strahlung aussendendes markiertes Reagens erhält
Die erfindungsgemäße, Strahlung aussendende Markierungssubstanz wird vorzugsweise zum Nachv/eis und
zur Größenbestimmung bzw. Klassierung einzelner Virusteilchen oder anderer Spezies im Rahmen immunchemischer
Reaktionen verwendet. Zu diesem Zweck wird
a) ein geeigneter Farbstoff (fluoreszierend oder phosporeszierend) ausgewählt, dessen Hydrophilie
praktisch die gleiche ist wie diejenige des Antikörpers bei dem in der Nachweisreaktion angewendeten
Arbeits-pH-Wert.
b) Als Trägerpolymerisat wird eine oligomere oder polymere Kette aus einer Vielzahl sich wiederholender
Einheiten ausgewählt, die in Längsrichtung der Kette verteilte reaktive Zentren und am Ende
der Kette ein reaktives Zentrum mit einer unterschiedlichen chemischen Reaktionsfähigkeit aufweist.
Dieses Trägerpolymerisat ist vorzugsweise entrjder steif oder faltet sich leicht zu einer GIobularkonfiguration
in Wasser, so daß durch Entfaltung oder Verdrehung verursachte sterische oder Resonanzhinderungen verhindert werden. Seine
Ladungsdichte ist im wesentlichen die gleiche wie diejenige des Antikörpers bei dem in dem NachweTsverfahren
angewendeten Arbeits-pH-Wert. Außerdem besitzen die reaktiven Zentren des
Trägerpolymerisats vorzugsweise eine geringere Affinität gegenüber dem Protein selbst und sie sind
nicht in der Lage, fluoreszenzdämpfend zu wirken.
Die Hydrophilie des Trägerpolymerisats ist im wesentlichen die gleiche wie diejenige des Antikörpers.
Die Hauptkette des Trägerpolymerisats weist vorzugsweise genügend breite Sigmabindungsabscfinitte
zwischen den Bindungszentren auf, um eine Veränderung der erwünschten spektralen
Farbstoffeigenschaften als Folge der erhöhten Elektronen-Delokalisierung zu verhindern.
(c) Der Farbstoff ist an das Trägerpoiymerisat gebunden,
während sein reaktives Zentrum am Ende der Kette chemisch blockiert ist. Eine gleichmäßige
Beladungsdichte, die hinsichtlich der quantitativen Behandlung erwünscht ist, wird am besten
durch vollständige Absättigung eines Polymerisats mit einer normalen stöchiometrischen Konzentration
aktiver Zentren und einem engen Molekumrgewichtsbereic'.; erreicht.
(d) Das reaktive Zentrum am Kettenende wird aktiviert und das fluoreszierende Polymerisat wird
an das Protein u 'bunden. Durch Reinigung mittels Zv.'eistufen-Affinitäts-Chromatographie (keine
Bindung durch die Gewebeprobe, Bindung durch Antigen) werden dann diese Moleküle entfernt.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens der Erfindung wird Polyäthylenimin mit Methylamin
am Kettenende der nachstehend angegebenen allgemeinen Formel (I)
NH2-[CH2CH2NH]n—CH3
worin η vorzugsweise einwertig ist und mindestens 4
bedeutet mit Benzaldehyd der allgemeinen Forme! (II)
-CHO
in einem wäßrigen Medium umgesetzt unter Bildung eines Produkts der Formel (III)
-CH=N-[CH2CH2NHJ-CH3
Dieses Reaktionsprodukt (III) wird in einem aprotischen Lösungsmittel mit Lithium behandelt, wobei das
Reaktionsprodukt der Formel (IV) entsteht
Li+
= N-[CH2CH2N-Jn-CH3
= N-[CH2CH2N-Jn-CH3
Anschließend wird an das Reaktionsprodukt (IV) ein fluorochromer Farbstoff gebunden durch Entmetallisierung
an einer /7-BromäthyIseitenkette am Farbstoff,
wobei das Reaktionsprodukt der Formel (V) entsteht
CH = N-[CH2CH2N]n-CH3
CH2
CH2
CH2
das bei der Hydrolyse das Rp.aktionsprodukt der Formel (VI) ergibt
NH2-[CH2CH2N]n-CH3
CH2 (VI)
CH2
Letzteres k?nn mit Thiophosgen behandelt werden,
wobei das Thiocyanat der Formel (VIl) entsteht
NCS-[CH2CH2N]n-CH3
CH2 (VD)
CH2
das wiiederum unter Anwendung von Standardver-
fahren mil dem Proteinmolekül verknüpft werden kann.
Anstelle des Polyiithylenimins können auch andere Trägerpolymerisate, z. B. Polyäthylenoxid, Polyamide,
niedermolekulare polymere Carbon- und Aminosäuren (mit einem Molekulargewicht von 100 bis 10000) einschließlich
der Polypeptide verwendet werden. Diese Verbindungen haben die allgemeine Formel
R1—[R2—R5I,-R!
R4
R4
worin bedeuten:
R1 cine Endgruppe, wie CNS, CN, COOH oder NH2.
die gegenüber dem Immunglobinprotein reaktiv ist;
R'' eine hydrophile Gruppe, wie OH, NH, N oder SH, die im wesentlichen sowohl gegenüber dem
Immunglobinprotein als auch gegenüber der zu bestimmenden Substanz oder ihren Symbiosen
nicht-reaktiv ist;
R: und R4 Sigmabindungs-Zwischcncinheiten. wie
(CH2)^, wobei m mindestens 2 bedeutet;
D den Farbstoffrest, der entweder R4 oder eine endständige
Bindung zu R4 enthält;
R~ eine weitere Endgruppe, wie -CHj, die im gegebenen
Zusammenha v: im wesentlichen inert ist; und η eine Zahl von 4 bis 1000.
Bei den obengenannten Polymerisaten kann es sich auch um Copolymerisate mit alternierenden Strukturen
handeln.
Zur Beibehaltung der Hydrophilie und Ladungsilichlc muß das Hauptkette/Farbstoff-Aggrega! ?ine
polare Gruppe, wie z. B. -OH, -NH oder -SH pro Molekulargewichts-Einheitsabschnitt in einem Verhältnis
enthalten, das den hydrophilen Gruppen pro Hinheitsvolumen des zu markierenden Antikörpers entspricht.
Inder Regel beträgt dieses Verhältnis 1 : 130 für Antikörper, die in Antigen-Antikörper-Reaktionen für
Virusbestimmungen verwendet werden. Die Hauptkette kann alle der genannten polaren Gruppen zur Verfügung
stellen, in der Praxis kann aber auch der Farbstoffeinige der polaren Gruppen zur Vergügung stellen.
Die Struktur des farbstoffmarkierten Antikörpers
kann durch die folgende allgemeine Formel dargestellt werden
D DD
BC
D D
in der A, 11 und C die grundlegende. Y-tormigc Molckülstruktur
des Immunglobins darstellen, wobei C der stabile Teil ist und A und B reaktive Gruppen davon
enthalten, die an spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktionen teilnehmen. D stellt Farbstoffmoleküle dar,
die mit den gefalteten Hauptketten-Trägermolekülen BC verknüft sind, von denen eines oder mehrere am
Ende mit dem Ende oder einer oder mehreren Seitenbindungen des immunglobulins verknüft sein können.
Einige der auf diese Weise markierten Immunglobuline (VIII) können mildem ursprünglichen Antigenmolekül in der
Antigen-Anükörper-Reaktion verbunden werden, wobei die genaue Anzahl von der Anzahl der reaktiven
Zentren und der Größe des Antigens abhängt.
Die Messung der abgegebenen Strahlungsenergie (ζ. B. bei der photometrischen Analyse unter Verwendung
herkömmlicher Vorrichtungen) kann dazu verwendet werden, zu bestimmen, ob die Test-Antigen-A"tikcrpcr
Rs::klicri stattgefunden hat, d. h. ob des
verdächtige Antigen in der untersuchten Probe enthalten war, indem man den markierten Antikörper damit
vermischt und behandelt, um die gewünschte Reaktion einzuleiten. Der nicht umgesetzte Antikörper liegt nach
Beendigung der Reaktion in einer niedrigeren lokalen Konzentration vor oder er kann durch Waschen entfernt
werden.
Zusätzlicn können einzelne molekulare Antigen-Antikörper-'^aktionsprodukte
durch ein Kapillarrohr geschickt und einzeln auf die abgegebene Strahlungs-
JO energie untersucht werden. Die dabei festgestellte Emission kann zur Bestimmung der Anzahl der mit
dem Antikörper verbundenen Farbsioffmoleküle verwendet werden. Wenn die verwendeten Hauptketten-Trägermoleküle
hinsichtlich der Anzahl der wiederkehrenden Einheiten der aktiven Zentren für die Farbstoffverknüpfung
im wesentlichen einwertig sind, kann die Anzahl dieser Zentren multipliziert werden mit der
Anzahl der Zentren auf dem Antikörper für die Verknüpfung mit dem Hauptkettenmolekül, und von Probe
zu Probe auftretende Unterschiede in den abgelesenen Emissionswerten lassen sich auf Unterschiede in der
Anzahl der Antikörper zurückfuhren, die mit dem Virusteilchen oder einem anderen festgestellten Antigen
verbunden sind, was wiederum zur Größe der Virusteilchen in Beziehung gesetzt werden kann.
Der hier verwendete Ausdruck »Strahlung« bzw. »Strahlungsenergie« umfaßt radioaktive, Röntgen- oder
Mikrowellenstrahlung ebenso wie fluoreszierende Energiestrahlung, wobei der letztgenannte Ausdruck
auch phosphoreszierende Energiestrahlung einschließt. Der hier verwendete Ausdruck »Polymerisat« umfhüt
sowohl Dimere als auch Trimere und große Monomere mit wiederkehrenden Einheiten sowie polymerisierte
Monomere.
Einzelheiten bezüglich der herkömmlichen Vorrichtungen zur Messung der Strahlungsenergie und der
emittierten Stoffe sind dem Fachmann bekannt und brauchen daher hier nicht näher erörtert zu werden.
Beispiele Tür geeignete Vorrichtungen, Materialien und Verfahren sind in den US-PS 3497690 und 3586859
beschrieben.
BC
D D
T\
D D
Claims (1)
1. Strahlung aussendende Markierungssubstanz, die eine Gruppe aufweist, die mit einem ersten
Reaktanten reagieren kann unter Bildung eines markierten Reagens, das einen zweiten Reaktanten
markieren kann durch spezifische Bindungsreaktion des markierten Reagens mit dem zweiten Reaktanten,
gekennzeichnet durch folgende Merkmale:
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