DE2426519C2

DE2426519C2 - Strahlung aussendende Markierungssubstanz, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie sie enthaltendes markiertes Reagens

Info

Publication number: DE2426519C2
Application number: DE19742426519
Authority: DE
Inventors: Tomas Framingham Mass. Hirschfeld
Original assignee: BLOCK ENGINEERING Inc CAMBRIDGE MASS US
Current assignee: BLOCK ENGINEERING Inc CAMBRIDGE MASS US
Priority date: 1973-07-30
Filing date: 1974-05-31
Publication date: 1985-04-18
Also published as: CA1041422A; CH607022A5; GB1470074A; DE2426519A1; AU6954374A; JPS5045692A; NL7410241A; FR2245948A1

Description

a) die Markierungssubstanz umfaßt eine oligomere oder polymere Kette mit einer gegenüber dem ersten Reaktanten reaktiven Gruppe als Endgruppe;

b) die Kette wird gebildet durch eine Vielzahl sich wiederholender Einheiten, die jeweils eine Seitenbindung aufweisen, die mit einem Rest verbunden ist, der bei geeigneter Aktivierung Strahlung aussenden kann, wobei die Seitenbindungen gegenüber dem ersten Reaktanten nicht reaktiv sind; und

c) die Markierungssubstanz besitzt die gleiche Hydrophilie und Ladungsdichte wie der erste Reaktant.

2. Markierungssubstanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine gefaltete Struktur besitzt.

3. Markierungssubstanz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlung aussen-Jende Rest eine fluoreszierende Gruppe ist.

4. Markierungssubstanz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die sich wiederholenden Einheiten Sigmabindungsabschnitte von ausreichender Länge zur Verhinderung einer sterischen Störung und Erzielung einer Resonanzabschirmung zwischen den fluoreszierenden Gruppen umfassen, wobei die Kette und die fluoreszierenden Gruppen so ausgewählt sind, daß die Kette keine fluoreszierende Strahlung der Gruppen dämpft.

5. Markierungssubstanz nach den Ansprüchen 1 bis 4, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel

NCS-[CH₂-CH₂-N],-CH₃
CH₂
CH₂

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in der D die Strahlung aussendende Gruppe ist und η einen Wert von 4 bis 1000 hat.

6. Verfahren zur Herstellung einer Markierungssubstanz gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, gekennzeichnet durch:

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a) Umsetzung einer oligomeren oder polymeren Kette, die eine gegenüber dem ersten Reaktanten reaktive Endgruppe aufweist und gebildet wird durch eine Vielzahl sich wiederholender Einheiten, die jeweils ein reaktives Zentrum aufweisen, dessen chemische Reaktivität von derjenigen der Endgruppe verschieden ist, mit einer Verbindung, welche die reaktive Endgruppe blockieren kann;

b) Umsetzung des dabei erhaltenen Produkts mit einem Rest, der bei geeigneter Aktivierung Strahlung aussenden kann, wobei die Umsetzung an den reaktiven Zentren der sich wiederholenden Einheiten stattfindet; und

c) Entfernung der Blockierungsgruppen von den reaktiven Endgruppen der oligomeren oder polymeren Verbindung.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Endgruppen der oligomeren oder polymeren Verbindung durch Umsetzung mit Benzaldehyd blockiert und durch Hydrolyse von den Blockierungsgmppen befreit werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6 ode* Λ dadurch gekennzeichnet, daß als polymere Verbindung Polyäthylenimin mit Methylamin am Kettenende verwendet wird.

9. Markiertes Reagens, gekennzeichnet durch eine Markierungssubstanz nach den Ansprüchen 1 bis 5, die an einen ersten Reaktanten gebunden ist.

10. Markiertes Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem ersten Reaktanten um einen Antikörper handelt.

11. Verfahren zur Herstellung des markierten Reagens nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die gemäß Anspruch 6 bis 8 hergestellte Markierungssubstanz nach Entfernung der Blockierungsgruppen von den reaktiven Endgruppen der oligomeren oder polymeren Verbindung zur Herstellung des markierten Reagens mit dem ersten Reaktanten umgesetzt wird.

Die Erfindung betrifft eine Strahlung aussendende Markierungssubstanz, die eine Gruppe aufweist, die mit einem ersten Reaktanten reagieren kann unter Bildung eines markierten Reagens, das einen zweiten Reaktanten markieren kann durch spezifische Bindungsreaktion des markierten Reagens mit dem zweiten Reaktanten, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ein diese enthaltendes markiertes Reagens und ein Verfahren zu dessen Herstellung, die zum Markieren von reaktionsfähigen Molekülen mit zwei oder mehr reaktiven Zentren oder funktionellen Gruppen, inäiesondcre in der klinischen Analyse und für spezifische immunchemische Reaktionen eingesetzt werden können zur Steigerung del Empfindlichkeit von Nachweis- bzw. Analyseverfahren ohne Einführung neuer Fehlerquellen. Sie eignen sich besonders gut fur die Verwendung in Antigen-Antikörper-Reaktionen.

Eine bekannte, im klinischen Labor angewendete Technik besteht darin, einen verdächtigen Virus dadurch aufzuspüren und zu klassifizieren, daß man auf eine die Probe enthaltende Flüssigkeit hintereinander hochspezifische Antikörper einwirken laßt, die mit einer Strahlung aussendenden Markierungssubstanz markiert sind. Wenn die untersuchte Probe das Antigen des eingesetzten Antikörpers enthält, tritt eine Verknüpfung zwischen dem Virus und dem markierten Antikörper auf, als Folge der Antigen-Antikörpcr-Reaktion. Da dabei mehrere markierte Antikörpcrmolekülc mit einem einzelnen Virusmolekül verknüpft werden, ist die von dem entstandenen Aggregat abgcge-

bene Strahlungsenergie eindeutig unterscheidbar von der Strahlungsenergie der markierten Antikörper. Die damit erzielbare Empfindlichkeit und die Möglichkeit, sehr geringe Vimsmengen nachzuweisen, sind bisher jedoch noch ungenügend, insbesondere ist bei einer spezifischen Antikörper-Immunfluoreszenz die Signalstärke von fluorochromen Farbstoffen, die über Antikörper-Zwischenstufen mit Virusteilchen verbunden sind, für den Nachweis der einzelnen Teilchen zu gering. Die bisher durchgeführten Versuche, die Empfindlichkeit durch erhöhte Farbstoffbeladung zu erhöhen, führten bisher aus den nachstehend angegebenen Gründen zu einer geringeren Spezifität:

(1) Da genügend Farbstoffmoleküle mit dem nachzuweisenden Molekül in Verbindung kommen, sind einige nahe genug an dem aktiven Zentrum, um eine partielle sterische Abschirmung mit den damit verbundenen Nachteilen auf die Molekülspezifität zuötwirken;

(2) Veränderungen der Gesarnthydrophiüe und der Ladungsdichte des erhaltenen Moleküls führen zu einer Änderung seiner Reaktionsfähigkeit und Löslichkeit;

(3) Sterische und Hydrophilie-Einwirkungen auf das Molekül sowie mögliche Veränderungen seines Vibrationsverhaltens können zu einer Veränderung der tertiären Proteinstruktur und demzufolge seiner Spezifität führen;

(4) chemische Wechselwirkungen an dem Bindungszentrum kön'3H Veränderungen der Atombindung in einigem Abstand vom Bindungsort bewirken, möglicherweise unter Beteiligung des spezifischen Bindungszeniru<ns.

Aus »Ärztliches Laboratorium«, 18. Jahrgang, 1972, Seiten 133 bis 142, ist zwar bereits eine Strahlung aussendende Markierungssubstanz für die Markierung von Proteinmolekülen für immunchemische Zwecke bekannt, die eine Molekülstruktur mit einer gegenüber den zu markierenden Molekülen reaktiven Gruppe aufweist, aber auch in diesem Falle ist die erzielbare Empfindlichkeit noch unzureichend bzw. geht auf Kosten der Spezifität.

Aufgabe der Erfindung war es daher, eine Strahlung aussendende Markierungssubstanz zu entwickeln, mit deren Hilfe es möglich ist, die Empfindlichkeit des Nachweises von reaktionsfähigen chemischen Molekülen deutlich zu erhöhen, ohne die Spezifität des Nachweises zu beeinträchtigen.

Gegenstand der Erfindung, mit dem die vorgenannte Aufgabe gelöst werden kann, ist eine Strahlung aussendende Markierungssubstanz, die eine Gruppe aufweist, die mit einem ersten Reaktanten reagieren kann unter Bildung eines markierten Reagens, das einen zweiten Reaktanten markieren kann durch spezifische Bindungsreaktion des markierten Reagens mit dem zweiten Reaktanten, die durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:

senden kann, wobei die Seitenbindungen gegenüber dem ersten Reaktanten nicht reaktiv sind; c) die Markierangssubstanz besitzt die gleiche Hydrophiüe und Ladungsdichte wie der erste ReaktanL

Damit ist es möglich, die Empfindlichkeit des Nachweises von reaktionsfähigen Molekülen, insbesondere bei immunchemischen Reaktionen, um mindestens

ίο zwei Größenordnungeu (Potenz 10 der Bestimmung in Teilchen pro μΐ Lösung) gegenüber bekannten Nachweisverfahren zu erhöhen. Damit ist es insbesondere möglich, einzelne chemische Moleküle oder Viiusteil· chfin mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen, ihre Grö3e zu bestimmen bzw. sie zu klassieren, ohne daß dies auf Kosten ihrer Spezifität geht.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung hat die Markierungssubstanz eine gefaltete Struktur und der Strahlung aussendende Rest ist vorzugsweise eine fluoreszierende Gruppe.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfassen die sich wiederholenden Einheiten Sigmabindungsabschnitte von ausreichender Länge zur Verhinderung einer sterischen Störung und Erzielung einer Resonanzabschirmung zwischen den fluoreszierenden Gruppen, wobei die Kette und die fluoreszierenden Gruppen so ausgewählt sind, daß die Kette keine fluoreszierende Strahlung der Gruppen dämpft. Vorzugsweise handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Markierungssubstanz um eine solche der allgemeinen Formel

NCS-[CH₂-CH₂-N]_n-CH₃

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CH₂

in der D die Strahlung aussendende Gruppe darstellt und η einen Wert von 4 bis 1000 hat.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend beschriebenen neuen Markierungssubstanz, das gekennzeichnet ist durch:

a) die Markicrungssubstanz umfaßt eine oligomere oder polymere Kette mit einer gegenüber dem ersten Reaktanten reaktiven Gruppe als Endgruppe:

b) die Kette wird gebildet durch eine Vielzahl sich wiederholender Einheiten, die jeweils eine Seitenbindung aufweisen, die mit einem Rest verbunden ist, der bei geeigneter Aktivierung Strahlung aus-

(a) Umsetzung einer oligomeren oder polymeren Kette, die eine gegenüber dem ersten Reaktanten reaktive Endgruppe aufweist und gebildet wird durch eine Vielzahl sich wiederholender Einheiten, die jeweils ein reaktives Zentrum aufweisen, dessen chemische Reaktivität von derjenigen der Endgruppen verschieden ist, mit einer Verbindung, welche die reaktive Endgruppe blockieren kann;

(b) Umsetzung des dabei erhaltenen Produkts mit einem Rest, der bei geeigneter Aktivierung Strahlung aussenden kann, wobei die Umsetzung an den reaktiven Zentren der sich wiederholenden Einheiten stattfindet; und

(c) Entfernung der Blockierungsgruppen von den reaktiven Endgruppen der oligomeren oder polymeren Verbindung.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden die reaktiven Endgruppen der oligomeren oder polymeren Verbindung durch Umsetzung mit Benz-

aldehyd blockiert und durch Hydrolyse von den Blockierungsgruppen befreit. Als polymere Verbindung verwendet man vorzugsweise Polyäthylenimin mit Methylamin am Ksttenende.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein markiertes Reagens, das gekennzeichnet ist durch eine wie vorstehend beschriebene Markierungssubstanz, die an einen ersten Reaktanten gebunden ist, bei dem es sich vorzugsweise um einen Antikörper handelt

Dieses markierte Reagens wird nach einem einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildenden Verfahren hergestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die in vorstehender Weise hergestellte Markierungssubstanz nach Entfernung der Blockierungsgruppen von den reaktiven Endgruppen der oligomeren oder polymeren Verbindung mit dem ersten Reaktanten umgesetzt wird, wobei man ein Strahlung aussendendes markiertes Reagens erhält

Die erfindungsgemäße, Strahlung aussendende Markierungssubstanz wird vorzugsweise zum Nachv/eis und zur Größenbestimmung bzw. Klassierung einzelner Virusteilchen oder anderer Spezies im Rahmen immunchemischer Reaktionen verwendet. Zu diesem Zweck wird

a) ein geeigneter Farbstoff (fluoreszierend oder phosporeszierend) ausgewählt, dessen Hydrophilie praktisch die gleiche ist wie diejenige des Antikörpers bei dem in der Nachweisreaktion angewendeten Arbeits-pH-Wert.

b) Als Trägerpolymerisat wird eine oligomere oder polymere Kette aus einer Vielzahl sich wiederholender Einheiten ausgewählt, die in Längsrichtung der Kette verteilte reaktive Zentren und am Ende der Kette ein reaktives Zentrum mit einer unterschiedlichen chemischen Reaktionsfähigkeit aufweist. Dieses Trägerpolymerisat ist vorzugsweise entrjder steif oder faltet sich leicht zu einer GIobularkonfiguration in Wasser, so daß durch Entfaltung oder Verdrehung verursachte sterische oder Resonanzhinderungen verhindert werden. Seine Ladungsdichte ist im wesentlichen die gleiche wie diejenige des Antikörpers bei dem in dem NachweTsverfahren angewendeten Arbeits-pH-Wert. Außerdem besitzen die reaktiven Zentren des Trägerpolymerisats vorzugsweise eine geringere Affinität gegenüber dem Protein selbst und sie sind nicht in der Lage, fluoreszenzdämpfend zu wirken.

Die Hydrophilie des Trägerpolymerisats ist im wesentlichen die gleiche wie diejenige des Antikörpers. Die Hauptkette des Trägerpolymerisats weist vorzugsweise genügend breite Sigmabindungsabscfinitte zwischen den Bindungszentren auf, um eine Veränderung der erwünschten spektralen Farbstoffeigenschaften als Folge der erhöhten Elektronen-Delokalisierung zu verhindern.

(c) Der Farbstoff ist an das Trägerpoiymerisat gebunden, während sein reaktives Zentrum am Ende der Kette chemisch blockiert ist. Eine gleichmäßige Beladungsdichte, die hinsichtlich der quantitativen Behandlung erwünscht ist, wird am besten durch vollständige Absättigung eines Polymerisats mit einer normalen stöchiometrischen Konzentration aktiver Zentren und einem engen Molekumrgewichtsbereic'.; erreicht.

(d) Das reaktive Zentrum am Kettenende wird aktiviert und das fluoreszierende Polymerisat wird an das Protein u 'bunden. Durch Reinigung mittels Zv.'eistufen-Affinitäts-Chromatographie (keine Bindung durch die Gewebeprobe, Bindung durch Antigen) werden dann diese Moleküle entfernt.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens der Erfindung wird Polyäthylenimin mit Methylamin am Kettenende der nachstehend angegebenen allgemeinen Formel (I)

NH₂-[CH₂CH₂NH]_n—CH₃

worin η vorzugsweise einwertig ist und mindestens 4 bedeutet mit Benzaldehyd der allgemeinen Forme! (II)

-CHO

in einem wäßrigen Medium umgesetzt unter Bildung eines Produkts der Formel (III)

-CH=N-[CH₂CH₂NHJ-CH₃

Dieses Reaktionsprodukt (III) wird in einem aprotischen Lösungsmittel mit Lithium behandelt, wobei das Reaktionsprodukt der Formel (IV) entsteht

Li⁺
= N-[CH₂CH₂N-J_n-CH₃

Anschließend wird an das Reaktionsprodukt (IV) ein fluorochromer Farbstoff gebunden durch Entmetallisierung an einer /7-BromäthyIseitenkette am Farbstoff, wobei das Reaktionsprodukt der Formel (V) entsteht

CH = N-[CH₂CH₂N]_n-CH₃
CH₂

CH₂

das bei der Hydrolyse das Rp.aktionsprodukt der Formel (VI) ergibt

NH₂-[CH₂CH₂N]_n-CH₃

CH₂ (VI)

CH₂

Letzteres k?nn mit Thiophosgen behandelt werden, wobei das Thiocyanat der Formel (VIl) entsteht

NCS-[CH₂CH₂N]_n-CH₃

CH₂ (VD)

CH₂

das wiiederum unter Anwendung von Standardver-

fahren mil dem Proteinmolekül verknüpft werden kann. Anstelle des Polyiithylenimins können auch andere Trägerpolymerisate, z. B. Polyäthylenoxid, Polyamide, niedermolekulare polymere Carbon- und Aminosäuren (mit einem Molekulargewicht von 100 bis 10000) einschließlich der Polypeptide verwendet werden. Diese Verbindungen haben die allgemeine Formel

R¹—[R²—R⁵I,-R^!
R⁴

worin bedeuten:

R¹ cine Endgruppe, wie CNS, CN, COOH oder NH₂. die gegenüber dem Immunglobinprotein reaktiv ist;

R'' eine hydrophile Gruppe, wie OH, NH, N oder SH, die im wesentlichen sowohl gegenüber dem Immunglobinprotein als auch gegenüber der zu bestimmenden Substanz oder ihren Symbiosen nicht-reaktiv ist;

R^: und R⁴ Sigmabindungs-Zwischcncinheiten. wie (CH₂)^, wobei m mindestens 2 bedeutet;

D den Farbstoffrest, der entweder R⁴ oder eine endständige Bindung zu R⁴ enthält;

R~ eine weitere Endgruppe, wie -CHj, die im gegebenen Zusammenha v: im wesentlichen inert ist; und η eine Zahl von 4 bis 1000.

Bei den obengenannten Polymerisaten kann es sich auch um Copolymerisate mit alternierenden Strukturen handeln.

Zur Beibehaltung der Hydrophilie und Ladungsilichlc muß das Hauptkette/Farbstoff-Aggrega! ?ine polare Gruppe, wie z. B. -OH, -NH oder -SH pro Molekulargewichts-Einheitsabschnitt in einem Verhältnis enthalten, das den hydrophilen Gruppen pro Hinheitsvolumen des zu markierenden Antikörpers entspricht. Inder Regel beträgt dieses Verhältnis 1 : 130 für Antikörper, die in Antigen-Antikörper-Reaktionen für Virusbestimmungen verwendet werden. Die Hauptkette kann alle der genannten polaren Gruppen zur Verfügung stellen, in der Praxis kann aber auch der Farbstoffeinige der polaren Gruppen zur Vergügung stellen.

Die Struktur des farbstoffmarkierten Antikörpers kann durch die folgende allgemeine Formel dargestellt werden

D DD

BC

D D

in der A, 11 und C die grundlegende. Y-tormigc Molckülstruktur des Immunglobins darstellen, wobei C der stabile Teil ist und A und B reaktive Gruppen davon enthalten, die an spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktionen teilnehmen. D stellt Farbstoffmoleküle dar, die mit den gefalteten Hauptketten-Trägermolekülen BC verknüft sind, von denen eines oder mehrere am Ende mit dem Ende oder einer oder mehreren Seitenbindungen des immunglobulins verknüft sein können.

Einige der auf diese Weise markierten Immunglobuline (VIII) können mildem ursprünglichen Antigenmolekül in der Antigen-Anükörper-Reaktion verbunden werden, wobei die genaue Anzahl von der Anzahl der reaktiven Zentren und der Größe des Antigens abhängt.

Die Messung der abgegebenen Strahlungsenergie (ζ. B. bei der photometrischen Analyse unter Verwendung herkömmlicher Vorrichtungen) kann dazu verwendet werden, zu bestimmen, ob die Test-Antigen-A"tikcrpcr Rs::klicri stattgefunden hat, d. h. ob des verdächtige Antigen in der untersuchten Probe enthalten war, indem man den markierten Antikörper damit vermischt und behandelt, um die gewünschte Reaktion einzuleiten. Der nicht umgesetzte Antikörper liegt nach Beendigung der Reaktion in einer niedrigeren lokalen Konzentration vor oder er kann durch Waschen entfernt werden.

Zusätzlicn können einzelne molekulare Antigen-Antikörper-'^aktionsprodukte durch ein Kapillarrohr geschickt und einzeln auf die abgegebene Strahlungs-

JO energie untersucht werden. Die dabei festgestellte Emission kann zur Bestimmung der Anzahl der mit dem Antikörper verbundenen Farbsioffmoleküle verwendet werden. Wenn die verwendeten Hauptketten-Trägermoleküle hinsichtlich der Anzahl der wiederkehrenden Einheiten der aktiven Zentren für die Farbstoffverknüpfung im wesentlichen einwertig sind, kann die Anzahl dieser Zentren multipliziert werden mit der Anzahl der Zentren auf dem Antikörper für die Verknüpfung mit dem Hauptkettenmolekül, und von Probe zu Probe auftretende Unterschiede in den abgelesenen Emissionswerten lassen sich auf Unterschiede in der Anzahl der Antikörper zurückfuhren, die mit dem Virusteilchen oder einem anderen festgestellten Antigen verbunden sind, was wiederum zur Größe der Virusteilchen in Beziehung gesetzt werden kann.

Der hier verwendete Ausdruck »Strahlung« bzw. »Strahlungsenergie« umfaßt radioaktive, Röntgen- oder Mikrowellenstrahlung ebenso wie fluoreszierende Energiestrahlung, wobei der letztgenannte Ausdruck auch phosphoreszierende Energiestrahlung einschließt. Der hier verwendete Ausdruck »Polymerisat« umfhüt sowohl Dimere als auch Trimere und große Monomere mit wiederkehrenden Einheiten sowie polymerisierte Monomere.

Einzelheiten bezüglich der herkömmlichen Vorrichtungen zur Messung der Strahlungsenergie und der emittierten Stoffe sind dem Fachmann bekannt und brauchen daher hier nicht näher erörtert zu werden. Beispiele Tür geeignete Vorrichtungen, Materialien und Verfahren sind in den US-PS 3497690 und 3586859 beschrieben.

BC

D D

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D D

Claims

Patentansprüche:

1. Strahlung aussendende Markierungssubstanz, die eine Gruppe aufweist, die mit einem ersten Reaktanten reagieren kann unter Bildung eines markierten Reagens, das einen zweiten Reaktanten markieren kann durch spezifische Bindungsreaktion des markierten Reagens mit dem zweiten Reaktanten, gekennzeichnet durch folgende Merkmale: