WO2001094943A2 - Verfahren zur bestimmung der menge von an ziel-molekülen gebundenen liganden - Google Patents

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lit
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Klaus Wanner
Georg HÖFNER
Wolf Bertling
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/5375—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by changing the physical or chemical properties of the medium or immunochemicals, e.g. temperature, density, pH, partitioning
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9486—Analgesics, e.g. opiates, aspirine

Definitions

  • the invention relates to a method for determining the amount of ligands bound to target molecules and a combination of ligands for use in a method according to the invention.
  • US Pat. No. 5,891,742 A describes methods for quickly and easily finding ligands from a mixture of test substances. This mixture is incubated with a target structure. The target structure can be in solution as well as immobilized. After the incubation, the target structures with bound test substances are separated. The bound test substances are directly analyzed and identified by mass spectrometry.
  • the usual methods for determining the amount of ligands bound to target molecules include the following steps:
  • the labeling substance can be, for example, a fluorophore, a radioactive compound or an enzyme.
  • the labeling substances often change the binding properties of the ligands. Then, with the direct quantification described here, it is not possible to exactly determine the amount of native ligands that would bind under the same conditions.
  • the solution in step lit. a additionally native ligands.
  • the ligands provided with a labeling substance have a defined affinity and selectivity for the target molecules.
  • the amount of the bound native ligands is determined indirectly by quantifying the bound ligands provided with a labeling substance. If ligands are used that are clearly identifiable by their mass, bound ligands can be quantified by mass spectrometry. It is not necessary to use labeled ligands.
  • Step lit. b allows the ligands to bind to the target molecules.
  • Ligand-target-molecule complexes are formed. Bound ligands can be separated from unbound ligands, for example by means of filtration or size exclusion chromatography. Target molecules immobilized on a carrier can also be provided. In this case, the ligands separate from the solution during binding. If the carrier, such as microspheres, is in suspension, it can be removed by centrifugation. be changed. After removing the solution, unbound ligands still adhere to the ligand-target-molecule complexes formed. These are removed by washing.
  • the aim of all separation processes, including washing, is to separate unbound ligands as completely as possible from the ligand-target-molecule complexes formed.
  • the amount of ligands present in the separated ligand-target-molecule complexes is determined, in particular by quantifying the labeling substance.
  • the determined amount of bound ligands is equated to the amount of ligands which were originally bound to the target molecules in the binding equilibrium.
  • the amount of unbound ligands still adhering to the ligand-target molecule complexes after incomplete separation would falsify the quantification of bound ligands.
  • the above-mentioned methods for quantifying bound ligands have a system-inherent error: the separation of the bound ligands from the unbound ligands, including washing, leads to a loss of the binding equilibrium. This leads to a reduction in the number of ligand-target-molecule complexes formed. These begin to dissociate as soon as the ligand concentration in the solution surrounding the ligand-target molecule complexes decreases. The step lit. The determined amount of bound ligands is not identical to the amount of ligands originally bound.
  • DE 198 14 775 AI discloses a method for determining the binding constants of dissolved substances and substances on surfaces made of amphiphilic molecules. Layers of amphiphilic molecules are bound to a solid support so that a solid-supported membrane is formed. A defined amount of this solid-supported membrane is brought into contact with a mobile phase. The mobile phase contains a defined amount of substances to be examined for lipid binding. After an incubation, the solid-supported membranes are separated from the mobile phase. The concentrations of the substances in the mobile phase or the solid-supported membrane are determined. The method can be carried out with solid-supported membranes and substances present in different proportions. The binding constant can be calculated from the concentrations determined.
  • the object of the present invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a method is to be provided which makes it possible to determine the amount of ligands bound to target molecules.
  • a method for determining the amount of ligands bound to target molecules is provided with the following steps:
  • the determination or determination of a quantity also means a mere estimate of the quantity. It goes without saying that instead of a quantity, a concentration can also be determined, ascertained or estimated. If only one type of target molecule with uniform binding sites is made available and the number of binding sites is known, the data according to lit. d and lit. e determined quantities, the affinity of the ligands for the binding sites can also be calculated. The method enables the amounts of different ligands bound to target molecules to be determined simultaneously.
  • the term mixed phase encompasses both a pure solution and a suspension.
  • the mixed phase can contain membrane structures such as vesicles.
  • the target molecules can be in solution, in suspension or immobilized.
  • Immobilized target molecules can, for example, be immobilized on a wall of a vessel containing the mixed phase with the ligands or on particles.
  • any method is suitable in which the binding ligand is secreted under binding conditions.
  • the concentration of the unbound ligands does not change in the mixed phase contacting the ligand-target-molecule complexes.
  • the amount of ligand-target-molecule complexes remains constant.
  • a method of this type is, for example, the separation of ligand-target-molecule complexes by means of centrifugation.
  • the ligand concentration and / or amount can then be determined in the mixing phase, which overlays the pellet formed during centrifugation.
  • the secretion of bound ligands also includes that by binding to immobilized target molecules secretion of ligands from the mixed phase taking place.
  • Mass spectrometry for example, is suitable for determining the ligand concentration and / or amount.
  • “Native form” means that the ligands have no modifications necessary for detection, quantification or identification. Such modifications can consist, for example, of marking with a marking substance.
  • a reference is generally understood to mean a previously known substance with known properties, which can provide information about another substance or a specific system.
  • the reference can e.g. Deliver values that serve as reference values for unknown values.
  • known quantifiable ligands serve as a reference. You bind in step lit. b to the target molecules. For example, they can be used to determine the proportion of non-specifically binding ligands.
  • the binding of the ligands serving as reference to the target molecules can also be inhibited by the binding of other ligands contained in the mixed phase to the target molecules. This can e.g. by an allosteric inhibition of the binding or by the reference and the ligands competing for binding to a binding site of the ligands on the target molecules.
  • the amount of ligand bound as a reference can enable the amount of other ligand bound to be determined.
  • a ligand with medium affinity for the target molecules can serve as a reference, from which in step lit. b about half of the amount contained in the mixing phase would bind to the target molecules if there were no other ligands inhibiting its binding in the mixed phase. From the step lit. e determined amount of the bound ligands serving as reference, the amount of other ligands bound to the target molecules can then be determined or at least estimated.
  • the ligands serving as reference are preferably selected so that they are in a step lit. d Have the method selected for determining the quantity demonstrated with high sensitivity.
  • the ligands which serve as reference can have a selective affinity for certain target molecules. In this way, the determination of the amount of other ligands bound to the specific target molecules can be selectively made possible for different target molecules.
  • Another advantage of the method is that non-specific binding of the non-reference ligands has hardly any effect on the amount of bound reference ligands. A quantity of the specifically bound other ligands determined by means of the ligands serving as reference is only insignificantly influenced by the non-specific binding of the other ligands. Essentially, therefore, only the non-specific binding of the ligands serving as a reference must be taken into account.
  • a major advantage of the method is that even with ligands that are difficult to quantify directly in step lit. d only the quantity of unbound ligands serving as reference must be determined. The method is therefore not subject to any restrictions, which are in the nature of the non-reference ligands and cause problems in the quantification. Since the ligands are in native form, it is possible to obtain results which are not falsified by labeling the ligands which influences the binding properties. The effort required by handling marking substances is eliminated. This can be very high, especially with radioactive marking substances. There is also no health hazard associated with the use of radioactive labeling substances.
  • Another advantage of the method is the avoidance of the above-mentioned system-inherent error by the separation under the conditions according to lit. c.
  • the amount of ligands bound to target molecules can be exactly determined.
  • the method according to the invention requires little effort. It is only necessary to separate bound ligands. The isolation of ligand-target molecule complexes is eliminated. A washing step is not necessary in the process according to the invention. The lower number of work steps reduces the risk of introducing errors compared to the prior art.
  • the step lit. a provided mixed phase can contain the ligands in a mixture with various other substances.
  • the method according to the invention is suitable for quickly and easily identifying ligands bound to the target molecules from the mixture.
  • the ligands serving as reference have at least one known affinity for the target molecules. They can serve as a reference for determining an unknown affinity. The determination can also consist of a mere estimate.
  • the ligands serving as reference are preferably different from one another and have graduated affinities for the target molecules. Other ligands in the mixed phase with unknown Affinity then results in a gradual inhibition of binding as a reference; serving ligands.
  • the unknown affinity of the other ligands can be quickly and easily determined, or at least estimated or limited, from the set of ligands used as a reference.
  • the steps lit. are used to determine the affinity of the ligands for the target molecules.
  • a to lit. e carried out with ligands and target molecules in a first ratio and then repeated with ligands and target molecules in at least one further ratio.
  • the incubation is advantageously carried out until the binding equilibrium is reached.
  • the affinity can be determined from the amounts of the ligands bound at the different amount ratios, for example by means of a non-linear regression analysis of the saturation isotherm.
  • the saturation isotherm represents the amount of ligands bound to the target molecules as a function of the concentration of unbound ligands.
  • the target molecules are provided in native, in particular in non-immobilized, form. This makes it possible to obtain results which are not falsified by immobilization which influences the binding properties. It is also possible to use the ligands in the mixed phase after performing step lit. c, in particular by means of a fluorophore. Unbound ligands are marked after binding of ligands to the
  • Target molecules has taken place.
  • the result cannot be falsified by the fact that the labeling causes a change in the binding properties of the ligands.
  • the markie tion enables the amount of unbound ligands to be determined using sensitive detection methods.
  • the sensitivity of the method can be increased by this measure.
  • the mixing phase according to step lit. a contains more than 10, in particular more than 100, different ligands.
  • a separation step can be carried out, in particular using gas chromatography, capillary electrophoresis, liquid chromatography, preferably HPLC, FPLC " , reverse phase chromatography or affinity chromatography.
  • the separation step can, for example, be directly upstream of mass spectrometry. This enables the differentiation between ligands which are direct in themselves after step c), step d is indistinguishable. For example, a distinction can be made between isomers.
  • the ligands can be concentrated in the mixed phase. This increases the sensitivity of the method and enables the use of further, less sensitive detection methods.
  • the ligands are preferably put together in such a way that at least the amount of the ligands which serve as the reference, preferably the amount of all, of the ligands when the step lit. d can be determined in one operation. A previous separation step is not necessary. For example, ligands of different molecular weights are compiled if the detection is to be carried out by mass spectrometry. It is thus possible to determine the affinities or bound amounts of a large number of ligands at the same time. In a preferred embodiment, step lit. a different target molecules are provided. This makes it possible to determine the amount of ligands bound to different target molecules at the same time. The affinities of the ligands for different target molecules can also be determined simultaneously.
  • the target molecules are preferably present in a concentration greater than 1 nM, in particular greater than 100 nM, preferably greater than 1 ⁇ M.
  • a large amount of bound ligands can be achieved by using the target molecules in high concentration. This increases the sensitivity of the process. It is advantageous to use the target molecules in high concentration even if the mixed phase according to step lit. a contains different ligands with different affinities for the target molecules. Large amounts of bound ligands also cause large differences between the amounts of the different bound ligands. This makes it easier to distinguish between these quantities.
  • the mixed phase can inhibit binding of the
  • ligands Contain ligands to the target molecules.
  • inhibitors can be used which have specificity for one or more of these binding sites.
  • a binding approach without an inhibitor can be compared with a binding approach that contains an inhibitor with a specificity for a target molecule or a binding site. In this way, bonds can be examined selectively.
  • Inhibitors with known affinity for the target molecules can serve as a reference for determining an unknown affinity.
  • the quantity of ligands is advantageously determined by means of a method by which less than 10 ng, in particular less than 100 pg, preferably less than 100 fg, of the ligands can be detected.
  • the amount of ligand can be determined by means of mass spectrometry, capillary electrophoresis or gas or liquid chromatography, preferably HPLC or FPLC, in particular using reverse phase chromatography.
  • the detection after gas or liquid chromatography or capillary electrophoresis can be carried out by means of mass spectrometry, spectrophotometry, in particular by means of UV detection or diode field detection, fluorescence detection, luminescence detection, electrochemical oxidation or reduction or flame ionization detection.
  • a measuring method which, when step lit. d is used to determine the amount of ligands.
  • the measuring method for determining the amount of ligands can be calibrated.
  • the target molecules are dissolved or suspended.
  • the binding properties of the target molecules are not changed by immobilization.
  • the target molecules can be embedded in membrane structures.
  • the membrane structures can be native or artificial.
  • Target molecules are not immobilized. You can be separated by simple processes such as centrifugation.
  • the secretion according to lit. c can be carried out by dialysis, precipitation, adsorption, binding to immobilized molecules with an affinity for the ligand-target-molecule complexes formed, centrifugation or filtration, in particular ultrafiltration.
  • the molecules with an affinity for the ligand-target-molecule complexes formed can be immobilized on, in particular magnetically, particles to be separated.
  • the target molecules are advantageously after the step lit. c regenerates. This enables their reuse. This is particularly useful for valuable target molecules, e.g. in the case of target molecules on cells on which several examinations are to be carried out.
  • the target molecules or ligands can be selected from the following group: peptides, proteins, in particular receptors, low-molecular compounds, prions, enzymes, transport proteins, ion channels or antibodies, hormones, nucleic acids, sugars, polymers and structures on or in cells, cell fragments , Cell homogenates, synaptosomes, liposomes, synaptic plasma membrane vesicles, tissue sections, viruses, their components or fragments of these components, capsids, their components or fragments of these components and
  • the invention further relates to a combination of ligands for use in a method according to the invention, the ligands being compiled in such a way that at least the amount of ligands serving as reference when performing step lit. d can be determined in one operation.
  • the ligands are preferably composed of provided that the amount of all ligands when performing step lit. d can be determined in one operation.
  • the invention further relates to a combination of ligands for use in a method according to the invention, ligands serving as reference being different from one another and having graduated affinities for the target molecules.
  • La, lb, lc is a schematic representation of a binding approach with the ligands LA, LB and LC and the target molecules TA, '
  • 2a, 2b, 2c a schematic representation of a binding approach with the ligands LA, LB and LC, the target molecules TA and TC and
  • 3a, 3b, 3c a schematic representation of a binding approach with the ligands LA, LB and LC, the target molecules TA and TC and the inhibitors IA.
  • Fig. La shows schematically a binding approach with the ligands LA, LB and LC and a single type of target molecules TA.
  • LA to TA has a high affinity
  • LB to TA a low affinity
  • LC to TA a very low one.
  • bound ligands are separated from the mixed phase. This can be done by centrifugation.
  • Fig. Lc shows the situation after the secretion. The amount of LC in the mixed phase is remained unchanged. The amounts of LA and LB in the mixed phase have decreased by the amounts bound to TA.
  • a membrane preparation of transfected CHO-Kl cells which express human ⁇ -opioid receptors as target molecules is used for a binding approach shown schematically in FIGS. 1 a to 1 c.
  • the ⁇ -opioid receptors present in a concentration of 50 nM or an amount of 12.5 pmol are treated with 100 nM, corresponding to 25 pmol morphine, 100 nM, corresponding to 25 pmol codeine, and 100 nM, corresponding to 25 pmol tramadol as ligands and Incubate 5 mM MgCl 2 and 50 mM Tris HC1, pH 7.4 in a total volume of 250 ⁇ l for 150 minutes at 25 ° C. in a 1.5 ml PP reaction vessel. The membrane particles are then centrifuged off at 50000 xg for 20 minutes at 4 ° C. 150 ⁇ l are removed from the supernatant Ül.
  • morphine, codeine and tramadol are separated using HPLC.
  • a LiChrospher 60 RP select B separation column is used. 0.1% formic acid is used as solvent A and methanol is used as solvent B.
  • a gradient is used for chromatography, in which the concentrations of the eluent change from 100% A and 0% B to 0% A and 100% B at a flow rate of 0.8 ml per minute. This is followed by mass spectrometric quantification in MS / MS mode using a Finnigan LCQ Deca mass spectrometer.
  • This mass spectrometer is an ion trap mass spectrometer that uses an API interface with electro-spray ionization.
  • a supernatant Ül * is also produced, which differs from the supernatant Ül in that it is obtained from a membrane preparation without the addition of ligands. It will be one Solution Ll prepared, each containing morphine, codeine and tramadol in a concentration of 100 nM in Ül *. Solution L1 is also analyzed as described for Ül. With the response factors for the ligands determined from Ll, the following amounts of the respective ligands were calculated, which are present in total in unbound form in oil:
  • the K d value can be used as a measure of the affinity of a ligand for the target molecule for the ligands to be examined, such as morphine here, with the aid of at least one reference added to the binding approach with known affinity for the target molecules from the estimate the data obtained well.
  • the K d value can be used as a measure of the affinity of a ligand LA Calculate the target molecule TA as follows:
  • affinity For exact determination of the affinity of ligands for target molecules, data from at least two binding approaches are required.
  • the ligands and the target molecules must be present in different proportions in the binding approaches.
  • the affinity can be determined from the amounts of the ligands bound at the different amount ratios.
  • human ⁇ -opioid receptors are used as target molecules in a concentration of 50 nM, which corresponds to an amount of 12.5 pmol, each with a concentration of codeine in the presence of 5 mM MgCl 2 , 50 mM Tris HCl pH 7.4 in a total volume of 250 ⁇ l for 150 minutes at 25 ° C. in a 1.5 ml PP reaction vessel.
  • the binding approaches have the following codeine concentrations and amounts: Bl - 20 nM - 5 pmol, B2 - 60 nM - 15 pmol, B3 - 200 nM - 50 pmol, B4 - 600 nM - 150 pmol, B5 - 2 ⁇ M - 500 pmol and B6 - 20 ⁇ M - 5000 pmol.
  • the membrane particles are then centrifuged off at 50000 xg for 20 minutes at 4 ° C.
  • 150 ⁇ l of each of the supernatants Ül to Ü6 of the binding approaches B1 to B6 are removed and, as described in exemplary embodiment 1, quantified by means of HPLC and subsequent mass spectrometry.
  • Ül * As described in embodiment 1, a supernatant Ül * is generated.
  • Solutions L1 to L6 are produced in which codeine is present in Ül * in the following concentrations and amounts: Ll - 20 nM - 5 pmol, L2 - 60 nM - 15 pmol, L3 - 200 nM - 50 pmol, L4 - 600 nM - 150 pmol, L5 - 2 ⁇ M - 500 pmol and L6 - 20 ⁇ M - 5000 pmol.
  • the solutions L1 to L6 are analyzed as described for Ül to Ü6.
  • the binding mixture also contains other binding sites to which the ligand binds non-specifically, this must be taken into account for an exact determination of the affinity.
  • concentration ratios in a saturation test as described in this exemplary embodiment, the respective amounts of the non-specifically bound ligand can be determined from the total binding determined in B1 to B6 by non-linear regression analysis using the program Prism 2.01 from GraphPad, Software, Inc., San Diego will be charged. The following amounts of non-specifically bound ligands have been determined in the present exemplary embodiment:
  • the amount of non-specific binding calculated for B1 to B6 depends on the amount of ligand bound in total subtracted, the following specific binding, that is to say only to target molecules, is obtained:
  • Bl B6 the concentrations of the unbound, i.e. free ligands, and to know the ligand-target-molecule complexes.
  • the total concentration of the target molecules as well as the concentration of the unbound, i.e. free target molecules is known.
  • the K d value can be calculated from the corresponding saturation isotherm for B1 to B6 by nonlinear regression analysis using the program Prism 2.01 from GraphPad, Software, Inc., San Diego.
  • the non-specific binding it may also be necessary to carry out a further binding approach in the presence of a specific ligand, which selectively suppresses binding to the target molecules.
  • a specific ligand which selectively suppresses binding to the target molecules.
  • the Kd values for several ligands can be determined simultaneously.
  • the individual ligands can be used side by side in the same concentration in a binding approach.
  • FIG. 2a shows schematically a binding approach with the ligands LA, LB and LC as well as the target molecules TA and TC.
  • LA has an affinity for TA and LC for TC.
  • LB has no affinity for the target molecules present in the mixture.
  • bound ligands are separated from the mixed phase. This can be done by centrifugation.
  • Fig. 2c shows the situation after the secretion.
  • the amount of LB in the mixed phase has remained unchanged.
  • the amounts of LA and LC in the mixed phase have decreased by the amounts bound to TA and TC.
  • Ligands are to be identified which have affinity for TA but not for TC.
  • FIG. 3a shows the binding approach schematically.
  • the inhibitor specifically binds to TA and prevents the binding of LA to TA.
  • 3b shows the state at the end of the incubation.
  • 3c shows the situation after the release of bound ligands including the bound inhibitor IA.
  • the amount of LC in the mixed phase has decreased.
  • a comparison of the compositions of the mixed phases shown in FIG. 2c and the one shown in FIG. 3c shows which ligands have an affinity for the target molecule TA.
  • a preparation of synaptic plasma membrane vesicles is used in the binding approach shown schematically in FIGS. 2a to 2c.
  • the spm vesicles are obtained from the hippocampus of pigs (G. Höfner and K. Th. Wanner, Eur. J. Pharmacol. 394, 211-219, 2000) and then 4 x in 5 mM Tris-HCl pH 7.4 washed (G. H ⁇ fner and K. Th. Wanner, J. Recept. Signal Transduct. Res. 16, 297-313, 1996).
  • this spm vesicle preparation contains N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, which contain binding sites for glycine in addition to other binding sites.
  • NMDA N-methyl-D-aspartate
  • a first binding approach B1 the spm vesicles in a protein concentration of 15 mg / ml, corresponding to a concentration or amount of the glycine binding sites of 50 nM or 12.5 pmol, with 100 nM, corresponding to 25 pmol aminocyclopropanecarboxylic acid, 100 nM, correspondingly 25 pmol L-methionine and 100 nM, corresponding to 25 pmol L-phenylalanine and 10 mM MgCl 2 and 5 mM Tris-HCl buffer at pH 7.4 in a total volume of 250 ul 180 minutes at 4 ° C in a 1.5 ml of PP reaction tube incubated.
  • the spm vesicles are then centrif
  • B2 differs from the first binding approach B1 only in that it additionally contains 10 ⁇ M MDL 105.515, a selective ligand for a glycine binding site on the NMDA receptor.
  • a supernatant Ü2 is obtained from B2, which is analyzed like Ül.
  • a supernatant Ül * is also produced, which differs from the supernatant Ül in that it is obtained from a spm vesicle preparation without the addition of ligands.
  • a solution L1 is prepared which contains 100 nM aminocyclopropanecarboxylic acid, 100 nM L-methionine and 100 nM L-phenylalanine in oil *. This solution Ll is analyzed as well as Ül. The following amounts of unbound ligands result:
  • K d value as a measure of the affinity of a ligand, in this exemplary embodiment of aminocyclopropanecarboxylic acid, for Carefully estimate the target molecule for the ligands to be examined from the data obtained with the aid of at least one reference added to the binding approach with known affinity for the target molecules.
  • the Kd value as a measure of the affinity of a ligand, in this application example for aminocyclopropanecarboxylic acid, to the target molecule can also be according to the formula
  • Human ⁇ -opioid receptors served as target molecules in all binding approaches.
  • the target molecules were provided by means of a membrane preparation of transfected human ⁇ -opioid receptors expressing CHO-Kl cells from NEN, Brussels, Belgium.
  • BO contained 8.0 nM ⁇ -opioid receptors, 5 mM MgCl 2 , 7.5% sucrose and 50 mM Tris HCl, pH 7.4 in a total volume of 400 ⁇ l. B0 was incubated for 150 minutes at 25 ° C. in a 1.5 ml PP reaction vessel. The membrane particles were then centrifuged off at 50000 ⁇ g for 20 minutes at 4 ° C. The resulting supernatant was Ü0 350 ⁇ l removed. The following attachment approaches were treated like BO:
  • a binding approach Bl composed like BO, which additionally contained 10 nM nalbuphine as reference ligands and as further ligands 10 nM naloxone and 10 nM dihydrocodeine.
  • the supernatant Ül was obtained from B1.
  • a binding approach B3 composed like B0, which additionally contained 10 nM nalbuphine as reference ligand and as further ligand 10 nM dihydrocodeine and 10 nM (+) -normetazocin.
  • the supernatant Ü3 was obtained from B3.
  • a binding approach B4 composed like B0, which additionally contained 10 nM nalbuphine as reference ligands.
  • the supernatant Ü4 was obtained from B4.
  • Sample volume 20 ⁇ l (injected using an autosampler) Nalbuphin, naloxone and dihydrocodeine in the supernatants Ül to Ü4 were measured by mass spectrometry and quantified using an external standard. 2 nM, 5 nM, .8 nM and 10 nM nalbuphine, naloxone and dihydrocodeine were used as external standards in Ü0. All samples were measured twice.
  • the specific binding of the ligands in B1 to the target molecules results from the difference between the concentrations determined in Ül and Ü2. In the concentration used, dihydrocodeine shows no clearly measurable specific binding to the target molecules. Naloxone shows a specific binding in the order of magnitude of the reference nalbuphin. The reference allows the estimate that naloxone has a similar affinity for the target molecules as nalbuphine.
  • Ü3 only the substances nalbuphine and dihydrocodeine, but not (+) -normetazocin, were quantified under the chosen chromatographic or mass spectrometric conditions.
  • dihydrocodeine shows on no measurable specific binding to the target molecules.
  • the comparison of Ü3 with Ü4 shows that the binding of the reference nalbuphin to the target molecules is not inhibited by (+) -ormetazocin.
  • Normetazocin apparently shows no recognizable specific binding to the target molecules in the concentration used.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge von an Ziel-Molekülen gebundenen Liganden mit folgenden Schritten: a) Bereitstellen der Ziel-Moleküle und einer die Liganden in nativer Form in einer vorgegebenen Menge enthaltenden Mischphase, b) Inkontaktbringen und Inkubieren der Mischphase mit den Ziel-Molekülen, c) Absondern gebundener Liganden von der Mischphase unter Bedingungen, unter denen die Menge ungebundener Liganden konstant bleibt, d) Ermitteln der Menge ungebundener Liganden in der Mischphase und e) Ermitteln der Menge gebundener Liganden durch Differenzbildung zwischen der Menge der Liganden gemäss lit. a und der gemäss lit. d ermittelten Menge der Liganden, wobei die Mischphase gemäss Schritt lit. a verschiedene Liganden enthält, die teilweise als Referenz dienen.

Description

Verfahren zur Bestimmung der Menge von an Ziel-Molekülen gebundenen Liganden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge von an Ziel-Molekülen gebundenen Liganden sowie eine Kombination von Liganden zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren.
In der US 5,891,742 A werden Verfahren zum schnellen und ein- fachen Auffinden von Liganden aus einer Mischung von Testsubstanzen beschrieben. Dabei wird diese Mischung mit einer Zielstruktur inkubiert. Die Zielstruktur kann sowohl in Lösung als auch immobilisiert vorliegen. Nach der Inkubation werden die Zielstrukturen mit gebundenen Testsubstanzen abge- trennt. Die gebundenen Testsubstanzen werden direkt massen- spektrometrisch analysiert und identifiziert.
Die üblichen Verfahren zur Bestimmung der Menge von an Ziel- Molekülen gebundenen Liganden umfassen folgende Schritte:
a) Bereitstellen von Ziel-Molekülen und einer Losung von mit einer Markierungssubstanz versehenen Liganden,
b) Inkontaktbringen und Inkubieren der Lösung mit den Ziel- Molekülen,
c) Trennen der an Ziel-Moleküle gebundenen von nicht gebunden Liganden,
d) ggf- Waschen der abgetrennten an Ziel-Moleküle gebundenen Liganden und e) Quantifizieren gebundener Liganden durch Messen der Menge der Markierungssubstanz der gebundenen Liganden.
Die Markierungssubstanz kann beispielsweise ein Fluorophor, eine radioaktive Verbindung oder ein Enzym sein. Die Markierungssubstanzen verändern häufig die Bindungseigenschaften der Liganden. Dann ist es bei der hier beschriebenen direkten Quantifizierung nicht möglich, exakt die Menge nativer Liganden zu bestimmen, welche unter den gleichen Bedingungen bin- den würden.
Bei einer indirekten Quantifizierung enthält die Lösung beim Schritt lit. a zusätzlich native Liganden. Die mit einer Markierungssubstanz versehenen Liganden weisen eine definierte Affinität und Selektivität zu den Ziel-Molekülen auf. Beim Schritt lit. b konkurrieren sie mit den nativen Liganden um die Bindung an den Ziel-Molekülen. Die Menge der gebundenen nativen Liganden wird durch Quantifizieren der gebundenen mit einer Markierungssubstanz versehenen Liganden indirekt ermit- telt. Werden Liganden eingesetzt, die durch ihre Masse eindeutig identifizierbar sind, können gebundene Liganden mas- senspektrometrisch quantifiziert werden. Es ist nicht erforderlich markierte Liganden einzusetzen.
Schritt lit. b erlaubt das Binden der Liganden an die Ziel- Moleküle. Dabei bilden sich Liganden-Ziel-Molekül-Komplexe. Das Trennen gebundener von nicht gebundenen Liganden kann beispielsweise mittels Filtration oder Größenausschlußchroma- tographie erfolgen. Es können auch an einem Träger immobili- sierte Ziel-Moleküle bereitgestellt werden. In diesem Fall sondern sich die Liganden beim Binden von der Lösung ab. Falls der Träger, wie beispielsweise Mikrokügelchen, in Suspension vorliegt, kann dieser durch Zentrifugation abgeson- dert werden. Nach dem Entfernen der Lösung haften an den gebildeten Liganden-Ziel-Molekül-Komplexen noch ungebundene Liganden. Diese werden durch Waschen entfernt.
Sämtliche Trennverfahren einschließlich des Waschens haben das Ziel, ungebundene Liganden möglichst vollständig von gebildeten Liganden-Ziel-Molekül-Komplexen zu trennen. Die Menge der in den abgetrennten Liganden-Ziel-Molekül-Komplexen vorhandenen Liganden wird, insbesondere durch Quantifizieren der Markierungssubstanz, ermittelt. Die ermittelte Menge gebundener Liganden wird der Liganden-Menge gleichgesetzt, welche ursprünglich im Bindungsgleichgewicht an die Ziel- Moleküle gebunden war. Die Menge der nach einer unvollständigen Trennung an den Liganden-Ziel-Molekül-Komplexen noch an- haftenden ungebundenen Liganden würde die Quantifizierung gebundener Liganden verfälschen.
Die genannten Verfahren zur Quantifizierung gebundener Liganden weisen einen systemimmanenten Fehler auf : Die Abtrennung der gebundenen von den nicht gebundenen Liganden einschließlich des Waschens führt zu einer Aufhebung des Bindungs- gleichgewichts . Das bewirkt eine Verringerung der Anzahl gebildeter Liganden-Ziel-Molekül-Komplexe. Diese beginnen zu dissoziieren, sobald sich die Liganden-Konzentration in der die Liganden-Ziel-Molekül-Komplexe umgebenden Lösung verringert. Die beim Schritt lit. e ermittelte Menge gebundener Liganden ist nicht identisch mit der Menge der ursprünglich gebundenen Liganden.
Die DE 198 14 775 AI offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der Bindungskonstanten gelöster Stoffe und Substanzen an Oberflächen aus amphiphilen Molekülen. Dabei werden Schichten amphiphiler Moleküle an einen festen Träger gebunden, so daß sich eine festkörperunterstützte Membran ausbildet. Eine definierte Menge dieser festkörperunterstützten Membran wird mit einer mobilen Phase in Kontakt gebracht . Die mobile Phase enthält eine definierte Menge von auf Lipidbindung zu unter- suchenden Substanzen. Nach einer Inkubation werden die festkörperunterstützten Membranen von der mobilen Phase abgetrennt. Die Konzentrationen der Substanzen in der mobilen Phase oder der festkörperunterstützten Membran werden ermittelt. Das Verfahren kann mit in unterschiedlichen Mengenver- haltnissen vorliegenden festkörperunterstützten Membranen und Substanzen durchgeführt werden. Aus den dabei ermittelten Konzentrationen kann die Bindungskonstante berechnet werden.
Bei den im Stand der Technik bekannten Verfahren ist es er- forderlich, entweder die gebundenen oder nicht gebundenen Liganden direkt oder indirekt zu quantifizieren. Beim direkten Quantifizieren kann das je nach Ligand mit einem erheblichen Aufwand verbunden sein. Zur Quantifizierung muß das jeweils verwendete Detektionssystem für jeden zu quantifizierenden Liganden kalibriert werden. Das ist auch für Liganden erforderlich, von denen nicht bekannt ist, ob sie eine Affinität zu den Ziel-Molekülen aufweisen. Auch das indirekte Quantifizieren mittels markierter Liganden ist aufwendig. Es ist zunächst erforderlich, die Liganden mit einer Markierungssub- stanz so zu markieren, daß die markierten Liganden noch eine ausreichende Affinität zu den Ziel-Molekülen aufweisen. Häufig müssen dazu verschiedene Markierungsmethoden mit verschiedenen Markierungssubstanzen erprobt werden. Oftmals erweisen sich nur radioaktive Markierungssubstanzen als geeig- net. Das Handhaben dieser Markierungssubstanzen und der damit markierten Liganden ist gefährlich und wegen der erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen aufwendig. Weiterhin ist nicht jeder Ligand dazu geeignet, mit einer bestimmten gewünschten Methode markiert zu werden. Dadurch kann eine Suche nach geeigneten Liganden erforderlich sein.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile des Stands der Technik zu beseitigen. Insbesondere soll ein Verfahren bereitgestellt werden, das es ermöglicht, die Menge von an Ziel -Molekülen gebundenen Liganden zu ermitteln.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 23 und 25 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 - 22 und 24.
Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Bestimmung der Menge von an Ziel-Molekülen gebundenen Liganden mit folgenden Schritten vorgesehen:
a) Bereitstellen der Ziel-Moleküle und einer die Liganden in nativer Form in einer vorgegebenen Menge enthaltenden Mischphase,
b) Inkontaktbringen und Inkubieren der Mischphase mit den Ziel-Molekülen,
c) Absondern gebundener Liganden von der Mischphase unter Be- dingungen, unter denen die Menge ungebundener Liganden konstant bleibt,
d) Ermitteln der Menge ungebundener Liganden in der Mischphase und
e) Ermitteln der Menge gebundener Liganden durch Differenzbildung zwischen der Menge der Liganden gemäß lit. a und der gemäß lit. d ermittelten Menge der Liganden, wobei die Mischphase gemäß Schritt lit. a verschiedene Liganden enthält, die teilweise als Referenz dienen.
Unter der Bestimmung bzw. dem Ermitteln einer Menge wird auch eine bloße Abschätzung der Menge verstanden. Es versteht sich, daß statt einer Menge auch eine Konzentration bestimmt bzw. ermittelt bzw. abgeschätzt werden kann. Wird nur eine Art von Ziel-Molekülen mit einheitlichen Bindungsstellen bereitgestellt und ist die Zahl der Bindungsstellen bekannt, kann aus den gemäß lit. d und lit. e ermittelten Mengen auch die Affinität der Liganden zu den Bindungsstellen errechnet werden. Das Verfahren ermöglicht es, die Mengen verschiedener an Ziel-Moleküle gebundener Liganden gleichzeitig zu bestimmen. Der Begriff Mischphase umfaßt sowohl eine reine Lösung als auch eine Suspension. Die Mischphase kann Membranstrukturen, wie z.B. Vesikel, enthalten. Die Ziel-Moleküle können in Lösung, in Suspension oder immobilisiert vorliegen. Immobilisierte Ziel-Moleküle können z.B. an einer Wand eines die Mischphase mit den Liganden enthaltenden Gefäßes oder an Par- tikeln immobilisiert sein. Zur Durchführung des Schritts lit. c ist jedes beliebige Verfahren geeignet, bei dem das Absondern gebundener Liganden unter Bindungsbedingungen erfolgt . Dabei ändert sich die Konzentration der ungebundenen Liganden in der die Liganden-Ziel-Molekül-Komplexe kontaktierenden Mischphase nicht. Die Menge der gebildeten Liganden-Ziel- Molekül-Komplexe bleibt konstant. Als ein solches Verfahren kommt z.B. ein Absondern gebildeter Liganden-Ziel-Molekül- Komplexe mittels Zentrifugieren in Betracht. Danach kann die Liganden-Konzentration und/oder -Menge in der Mischphase er- mittelt werden, welche das beim Zentrifugieren gebildete Pellet überschichtet . Das Absondern gebundener Liganden umfaßt auch das durch das Binden an immobilisierte Ziel-Moleküle stattfindende Absondern von Liganden aus der Mischphase. Zum Ermitteln der Liganden-Konzentration und/oder -Menge ist beispielsweise die Massenspektrometrie geeignet.
"Native Form" bedeutet, daß die Liganden keine für den Nachweis, die Quantifizierung oder die Identifizierung erforderlichen Modifikationen aufweisen. Solche Modifikationen können bspw. in einer Markierung mit einem Markierungsstoff bestehen.
Unter einer Referenz wird allgemein eine vorbekannte Substanz mit bekannten Eigenschaften verstanden, die Informationen über eine andere Substanz oder ein bestimmtes System bereitstellen kann. Die Referenz kann z.B. Werte liefern, welche als Bezugsgrößen für unbekannte Werte dienen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dienen vorbekannte quantifizierbare Liganden als Referenz. Sie binden beim Schritt lit. b an die Ziel-Moleküle. Sie können bspw. dazu dienen, den Anteil unspezifisch bindender Liganden zu bestimmen. Die Bindung der als Referenz dienenden Liganden an die Ziel- Moleküle kann aber auch durch die Bindung anderer in der Mischphase enthaltener Liganden an die Ziel-Moleküle inhibiert werden. Das kann z.B. durch eine allosterische Inhibi- tion der Bindung oder dadurch erfolgen, daß die Referenz und die Liganden um die Bindung an eine Bindungsstelle der Liganden an den Ziel-Molekülen konkurrieren. Die Menge der gebundenen als Referenz dienenden Liganden kann das Ermitteln der Menge der anderen gebundenen Liganden ermöglichen.
Beispielsweise kann ein Ligand mit mittlerer Affinität zu den Ziel-Molekülen als Referenz dienen, von welchem beim Schritt lit. b etwa die Hälfte der in der Mischphase enthaltenen Men- ge an die Ziel-Moleküle binden würde, wenn sonst keine dessen Bindung inhibierenden Liganden in der Mischphase enthalten wären. Aus der beim Schritt lit. e ermittelten Menge der als Referenz dienenden gebundenen Liganden kann dann die Menge der an die Ziel-Moleküle gebundenen anderen Liganden bestimmt oder zumindest abgeschätzt werden. Die als Referenz dienenden Liganden sind bevorzugt so ausgewählt, daß sie sich bei einem beim Schritt lit. d zum Ermitteln der Menge gewählten Verfahren mit hoher Empfindlichkeit nachweisen lassen.
Weiterhin können die als Referenz dienenden Liganden eine selektive Affinität zu bestimmten Ziel-Molekülen aufweisen. Dadurch kann bei verschiedenen Ziel-Molekülen das Ermitteln der Menge von an die bestimmten Ziel-Moleküle gebundenen anderen Liganden selektiv ermöglicht werden. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß sich eine unspezifische Bindung der nicht als Referenz dienenden anderen Liganden kaum auf die Menge der gebundenen als Referenz dienenden Liganden auswirkt. Eine mittels der als Referenz dienenden Liganden er- mittelte Menge der spezifisch gebundenen anderen Liganden wird nur unwesentlich durch die unspezifische Bindung der anderen Liganden beeinflußt. Im wesentlichen muß daher nur die unspezifische Bindung der als Referenz dienenden Liganden berücksichtigt werden.
Ein wesentlicher Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß auch bei Liganden, welche schwierig direkt zu quantifizieren sind, beim Schritt lit. d nur die Menge der als Referenz dienenden ungebundenen Liganden ermittelt werden muß. Das Ver- fahren unterliegt somit keinen Beschränkungen, die in der Natur der nicht als Referenz dienenden Liganden liegen und Probleme bei der Quantifizierung bereiten. Da die Liganden in nativer Form vorliegen ist es möglich, Ergebnisse zu erhal- ten, die nicht durch ein die Bindungseigenschaften beeinflussendes Markieren der Liganden verfälscht sind. Ein durch die Handhabung von Markierungssubstanzen erforderlicher Aufwand entfällt. Dieser kann insbesondere bei radioaktiven Markie- rungssubstanzen sehr hoch sein. Auch eine mit der Verwendung radioaktiver Markierungssubstanzen verbundene gesundheitliche Gefährdung findet nicht statt .
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht in der Vermeidung des oben genannten systemimmanenten Fehlers durch das Absondern unter den Bedingungen gemäß lit. c. Die Menge von an Ziel-Molekülen gebunden Liganden ist exakt bestimmbar. Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert einen geringen Aufwand. Es ist lediglich das Absondern gebundener Liganden erforder- lieh. Die Isolation gebildeter Liganden-Ziel -Molekül-Komplexe entfällt. Ein Waschschritt ist beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht erforderlich. Durch die geringere Zahl der Arbeitsschritte verringert sich gegenüber dem Stand der Technik das Risiko, Fehler einzuschleppen. Die beim Schritt lit. a be- reitgestellte Mischphase kann die Liganden in einer Mischung mit verschiedenen anderen Substanzen enthalten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet, schnell und einfach an die Ziel-Moleküle gebundene Liganden aus der Mischung zu identifizieren.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung weisen die als Referenz dienenden Liganden mindestens eine bekannte Affinität zu den Ziel-Molekülen auf. Sie können als Referenz zur Bestimmung einer unbekannten Affinität dienen. Dabei kann die Bestimmung auch in einer bloßen Abschätzung bestehen. Vorzugsweise sind die als Referenz dienenden Liganden voneinander verschieden und weisen abgestufte Affinitäten zu den Ziel-Molekülen auf. Weitere in der Mischphase enthaltene Liganden mit unbekannter Affinität bewirken dann eine abgestufte Inhibition der Bindung der als Referenz; dienenden Liganden. Aus der Menge der jeweils gebundenen als Referenz dienenden Liganden kann schnell und einfach die unbekannte Affinität der weiteren Li- ganden bestimmt oder zumindest abgeschätzt oder eingegrenzt werden.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung werden zur Bestimmung der Affinität der Liganden zu den Ziel-Molekülen die Schritte lit. a bis lit. e mit Liganden und Ziel-Molekülen in einem ersten Mengen-Verhältnis durchgeführt und dann mit Liganden und Ziel-Molekülen in mindestens einem weiteren Mengenverhältnis wiederholt. Vorteilhafterweise erfolgt dabei das Inkubieren bis zum Erreichen des Bindungsgleichgewichts. Aus den Mengen der bei den unterschiedlichen Mengen-Verhältnissen gebundenen Liganden kann, beispielsweise mittels einer nicht linearen Regressionsanalyse der Sättigungsisotherme, die Affinität ermittelt werden. Die Sättigungsisotherme stellt die Menge der an die Ziel-Moleküle gebundenen Liganden in Abhän- gigkeit von der Konzentration ungebundener Liganden dar.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn beim erfindungsgemäßen Verfahren die Ziel-Moleküle in nativer, insbesondere in nicht immobilisierter, Form bereitgestellt werden. Dadurch ist es möglich, Ergebnisse zu erhalten, die nicht durch ein die Bindungseigenschaften beeinflussendes Immobilisieren verfälscht sind. Es ist auch möglich, die Liganden in der Mischphase nach Durchführung des Schritts lit. c, insbesondere mittels eines Fluorophors, zu markieren. Dabei werden ungebundene Li- ganden markiert, nachdem eine Bindung von Liganden an die
Ziel-Moleküle stattgefunden hat. Das Ergebnis kann nicht dadurch verfälscht werden, daß das Markieren eine Veränderung der Bindungseigenschaften der Liganden bewirkt. Die Markie- rung ermöglicht das Ermitteln der Menge ungebundener Liganden mittels empfindlicher Nachweismethoden. Die Empfindlichkeit des Verfahrens kann durch diese Maßnahme gesteigert werden.
Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die Mischphase gemäß Schritt lit. a mehr als 10, insbesondere mehr als 100, verschiedene Liganden enthält.
Nach Durchführung des Schritts lit. c und vor Durchführung des Schritts lit. d kann ein Trennschritt, insbesondere unter Verwendung von Gaschromatographie, Kapillarelektrophorese, Flüssigkeitschromatographie, vorzugsweise HPLC, FPLC", Umkehrphasenchromatographie oder Affinitätschromatographie, erfolgen. Der Trennschritt kann beispielsweise einer Massen- spektrometrie direkt vorgeschaltet sein. Das ermöglicht das Differenzieren zwischen Liganden, die bei sich direkt an den Schritt lit. c anschließender Durchführung des Schritts lit. d nicht unterscheidbar sind. Beispielsweise kann zwischen Isomeren unterschieden werden. Nach Durchführung des Schritts lit. c und vor Durchführung des Schritts lit. d können die Liganden in der Mischphase konzentriert werden. Das erhöht die Empfindlichkeit des Verfahrens und ermöglicht den Einsatz von weiteren, weniger sensitiven Nachweismethoden.
Bevorzugt sind die Liganden derart zusammengestellt, daß zumindest die Menge der als Referenz dienenden, vorzugsweise die Menge aller, Liganden bei Durchführung des Schritts lit. d in einem Arbeitsgang ermittelt werden kann. Ein vorhergehender Trennschritt ist dabei nicht erforderlich. Beispiels- weise werden Liganden unterschiedlicher Molmasse zusammengestellt, wenn die Detektion massenspektrometrisch erfolgen soll. So ist es möglich, die Affinitäten oder gebundenen Mengen einer großen Zahl von Liganden gleichzeitig zu ermitteln. Bei einer bevorzugten Ausgestaltung werden beim Schritt lit. a verschiedene Ziel-Moleküle bereitgestellt. Dadurch ist es möglich, die Menge von an verschiedenen Ziel-Molekülen gebundenen Liganden gleichzeitig zu bestimmen. Auch die Affinitä- ten der Liganden zu verschiedenen Ziel-Molekülen können gleichzeitig bestimmt werden. Vorzugsweise liegen die Ziel- Moleküle in einer Konzentration größer als 1 nM, insbesondere größer als 100 nM, vorzugsweise größer als 1 μM, vor. Durch den Einsatz der Ziel-Moleküle in hoher Konzentration kann ei- ne große Menge gebundener Liganden erreicht werden. Das erhöht die Empfindlichkeit des Verfahrens. Vorteilhaft ist der Einsatz der Ziel-Moleküle in hoher Konzentration auch dann, wenn die Mischphase gemäß Schritt lit. a verschiedene Liganden mit unterschiedlichen Affinitäten zu den Ziel-Molekülen enthält. Große Mengen gebundener Liganden bewirken auch große Unterschiede zwischen den Mengen der verschiedenen gebundenen Liganden. Dadurch kann besser zwischen diesen Mengen unterschieden werden.
Zusätzlich kann die Mischphase Inhibitoren einer Bindung der
Liganden an die Ziel-Moleküle enthalten. Bei Ziel-Molekülen mit verschiedenen Bindungsstellen können Inhibitoren eingesetzt werden, die eine Spezifität für eine oder mehrere dieser Bindungsstellen aufweisen. Beim Bereitstellen von ver- schiedenen Ziel-Molekülen und/oder Ziel-Molekülen mit verschiedenen Bindungsstellen kann ein Bindungsansatz ohne einen Inhibitor mit jeweils einem Bindungsansatz verglichen werden, der einen Inhibitor mit einer Spezifität für ein Ziel-Molekül oder eine Bindungsstelle enthält. So können Bindungen selek- tiv untersucht werden. Inhibitoren mit bekannter Affinität zu den Ziel-Molekülen können als Referenz zur Bestimmung einer unbekannten Affinität dienen. Vorteilhafterweise erfolgt das Ermitteln der Menge der Liganden mittels eines Verfahrens, mit dem weniger als 10 ng, insbesondere weniger als 100 pg, vorzugsweise weniger als 100 fg, der Liganden detektierbar sind. Die Menge der Liganden kann mittels Massenspektrometrie, Kapillarelektrophorese oder Gas- oder Flüssigkeitschromatographie, vorzugsweise HPLC oder FPLC , insbesondere unter Verwendung von Umkehrphasenchromatographie, ermittelt werden. Die Detektion nach der Gas- oder Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese kann mittels Massenspektrometrie, Spektralphotometrie, insbesondere mittels UV-Detektion oder Diodenfeld-Detektion, Fluores- zenzdetektion, Lumineszenzdetektion, elektrochemischer Oxida- tion oder Reduktion oder Flammenionisationsdetektion erfolgen.
Vorzugsweise wird die Menge der Liganden in der Mischphase vor Durchführung des Schritts lit. c, insbesondere vor Durchführung des Schritts lit. b, mit einem Messverfahren gemessen, welches bei Durchführung des Schritts lit. d zum Ermit- teln der Menge der Liganden eingesetzt wird. Das ermöglicht eine bessere Vergleichbarkeit der eingesetzten mit der beim Schritt lit. d ermittelten Menge der Liganden. Ferner kann dadurch das Messverfahren für das Ermitteln der Menge der Liganden geeicht werden.
Bei einem Ausführungsbeispiel liegen die Ziel-Moleküle gelöst oder suspendiert vor. Die Bindungseigenschaften der Ziel- Moleküle sind nicht durch Immobilisieren verändert. Die Ziel- Moleküle können in Membranstrukturen eingebettet vorliegen. Die Membranstrukturen können nativ oder künstlich sein. Die
Ziel-Moleküle sind dabei nicht immobilisiert. Sie können durch einfache Verfahren, wie Zentrifugation, abgesondert werden.
Das Absondern gemäß lit. c kann durch Dialyse, Präzipitation, Adsorption, Bindung an immobilisierte Moleküle mit einer Affinität zu gebildeten Ligand-Ziel-Molekül-Komplexen, Zentrifugation oder Filtration, insbesondere Ultrafiltration, erfolgen. Die Moleküle mit einer Affinität zu gebildeten Ligand-Ziel-Molekül-Komplexen können an, insbesondere magne- tisch, abzusondernden Partikeln immobilisiert sein. Vorteilhafterweise werden die Ziel-Moleküle nach Durchführung des Schritts lit. c regeneriert. Dies ermöglicht deren Wiederverwendung. Das ist besonders bei kostbaren Ziel-Molekülen sinnvoll, z.B. bei Ziel-Molekülen auf Zellen, an denen mehrere Untersuchungen durchgeführt werden sollen.
Die Ziel-Moleküle oder Liganden können aus folgender Gruppe ausgewählt sein: Peptide, Proteine, insbesondere Rezeptoren, niedermolekulare Verbindungen, Prionen, Enzyme, Transportpro- teine, Ionenkanäle oder Antikörper, Hormone, Nukleinsäuren, Zucker, Polymere und Strukturen auf oder in Zellen, Zellfragmenten, Zellhomogenaten, Synaptosomen, Liposomen, synapti- schen Plasmamembran-Vesikeln, Gewebeschnitten, Viren, deren Bestandteilen oder Fragmenten dieser Bestandteile, Kapsiden, deren Bestandteilen oder Fragmenten dieser Bestandteile und
Naturstoffgemischen.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus eine Kombination von Liganden zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Liganden derart zusammengestellt sind, daß zumindest die Menge von als Referenz dienenden Liganden bei Durchführung des Schritts lit. d in einem Arbeitsgang ermittelt werden kann. Vorzugsweise sind die Liganden dabei so zusam- mengestellt, daß die Menge aller Liganden bei Durchführung des Schritts lit. d in einem Arbeitsgang ermittelt werden kann. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Kombination von Liganden zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei als Referenz dienende Liganden voneinander verschieden sind und abgestufte Affinitäten zu den Ziel-Molekülen aufweisen.
Nachfolgend wird die Erfindung durch die Zeichnung und anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. la, lb, lc eine schematische Darstellung eines Bindungsansatzes mit den Liganden LA, LB und LC sowie den Ziel-Molekülen TA, '
Fig. 2a, 2b, 2c eine schematische Darstellung eines Bindungsansatzes mit den Liganden LA, LB und LC, den Ziel-Molekülen TA und TC und
Fig. 3a, 3b, 3c eine schematische Darstellung eines Bindungsansatzes mit den Liganden LA, LB und LC, den Ziel-Molekülen TA und TC sowie den Inhibitoren IA.
Ausführungsbeispiel 1 :
Fig. la zeigt schematisch einen Bindungsansatz mit den Liganden LA, LB und LC sowie einer einzigen Sorte von Ziel- Molekülen TA. Dabei weist LA zu TA eine hohe, LB zu TA eine geringe und LC zu TA eine sehr geringe Affinität auf. Im An- Schluß an die in Fig. lb dargestellte Inkubation erfolgt das Absondern gebundener Liganden von der Mischphase. Das kann durch Zentrifugation erfolgen. Fig. lc zeigt die Situation nach dem Absondern. Die Menge von LC in der Mischphase ist unverändert geblieben. Die Mengen von LA und LB in der Mischphase haben sich um die an TA gebundenen Mengen verringert.
Für einen schematisch in den Figuren la bis lc dargestellten Bindungsansatz wird eine Membranpräparation transfizierter CHO-Kl Zellen, die als Ziel-Moleküle humane μ-opioid Rezeptoren exprimieren (Biotrend GmbH, Köln, Deutschland) , verwendet. Die in einer Konzentration von 50 nM bzw. einer Menge von 12,5 pmol vorliegenden μ-opioid Rezeptoren werden mit 100 nM, entsprechend 25 pmol Morphin, 100 nM, entsprechend 25 pmol Codein, und 100 nM, entsprechend 25 pmol Tramadol als Liganden sowie 5 mM MgCl2 und 50 mM Tris HC1, pH 7,4 in einem Gesamtvolumen von 250 μl 150 Minuten bei 25° C in einem 1,5 ml PP-Reaktionsgefäß inkubiert. Anschließend werden die Mem- branpartikel bei 50000 x g 20 Minuten bei 4° C abzentrifu- giert . Vom Überstand Ül werden 150 μl abgenommen.
In Ül werden Morphin, Codein und Tramadol mittels HPLC getrennt. Dabei wird eine LiChrospher 60 RP select B-Trennsäule verwendet. Als Laufmittel A wird 0,1 % Ameisensäure und als Laufmittel B Methanol verwendet. Zur Chromatographie wird ein Gradient eingesetzt, bei dem sich die Konzentrationen der Laufmittel von 100 % A und 0 % B zu 0 % A und 100 % B bei einer Flußrate von 0,8 ml pro Minute ändern. Anschließend er- folgt eine massenspektrometrische Quantifizierung im MS/MS- Modus mittels eines Finnigan LCQ Deca-Massenspektrometers . Dieses Massenspektrometer ist ein Ion-Trap-Massenspektro- meter, das ein API-Interface mit Elektro-Spray-Ionisation nutzt .
Ebenso wird ein Überstand Ül* hergestellt, der sich vom Überstand Ül dadurch unterscheidet, daß er aus einer Membranpräparation ohne Zusatz von Liganden gewonnen wird. Es wird eine Lösung Ll hergestellt, die Morphin, Codein und Tramadol jeweils in einer Konzentration von 100 nM in Ül* enthält. Die Lösung Ll wird ebenso analysiert, wie für Ül beschrieben. Mit den aus Ll ermittelten Ansprechfaktoren für die Liganden sind die folgenden Mengen der jeweiligen Liganden berechnet worden, die insgesamt in ungebundener Form in Ül vorhanden sind:
Morphin 13,2 pmol, Codein 24,1 pmol und Tramadol 24,3 pmol.
Aus der jeweiligen Differenz der eingesetzten und in Ll bestimmten Menge an Ligand und der für Ül ermittelten Menge an nicht gebundenem Ligand sind die folgenden Mengen gebundener Liganden ermittelt worden:
Morphin 11,8 pmol, Codein 0 , 9 pmol und Tramadol 0 , 7 pmol .
Je größer der Anteil des an Ziel -Moleküle gebundenen Liganden ist, desto größer ist die Affinität des Liganden zum Ziel- Molekül . Für die relativen Affinitäten der untersuchten Liganden zu den Ziel-Molekülen ergibt sich somit, daß Morphin eine deutlich höhere Affinität zu den Ziel-Molekülen aufweist als Codein und Tramadol. Gegebenenfalls läßt sich der Kd-Wert als Maß für die Affinität eines Liganden zum Ziel-Molekül für die zu untersuchenden Liganden, wie hier z.B. Morphin, mit Hilfe mindestens einer dem Bindungsansatz zugesetzten Refe- renz mit bekannter Affinität zu den Ziel-Molekülen aus den gewonnenen Daten gut abschätzen. Wenn nur eine Art von Ziel-Molekülen vorliegt, die Liganden in einem geeigneten Konzentrationsbereich vorliegen und ein Binden der Liganden an andere Bindungsstellen als die Zielmoleküle weitgehend ausgeschlossen werden kann, läßt sich der Kd-Wert als Maß für die Affinität eines Liganden LA zu einem Ziel-Molekül TA wie folgt berechnen:
Kd = [TA-frei]x [LA-frei] / [LA-gebunden]
Dabei ist
[TA-frei] die Konzentration der freien Ziel-Moleküle TA,
[LA-frei] die Konzentration der freien Liganden LA und
[LA-gebunden] die Konzentration der an die Ziel-Moleküle TA spezifisch gebundenen Liganden LA
im Bindungsansatz nach der Inkubation.
Ausführungsbeispiel 2 :
Zur exakten Ermittlung der Affinität von Liganden zu Ziel- Molekülen sind Daten aus mindestens zwei Bindungsansätzen erforderlich. In den Bindungsansätzen müssen die Liganden und die Ziel-Moleküle in unterschiedlichen Mengen-Verhältnissen vorliegen. Aus den Mengen der bei den unterschiedlichen Mengen-Verhältnissen gebundenen Liganden kann die Affinität ermittelt werden.
In den Bindungsansätzen Bl bis B6 werden humane μ-opioid Rezeptoren als Ziel-Moleküle in einer Konzentration von 50 nM, die einer Menge von 12,5 pmol entspricht, mit jeweils einer Konzentration Codein in Gegenwart von 5 mM MgCl2, 50 mM Tris HCl pH 7,4 in einem Gesamtvolumen von 250 μl 150 Minuten bei 25° C in einem 1,5 ml PP-Reaktionsgefäß inkubiert. Die Bindungsansätze weisen dabei die folgenden Codein- Konzentrationen und -Mengen auf: Bl - 20 nM - 5 pmol, B2 - 60 nM - 15 pmol, B3 - 200 nM - 50 pmol, B4 - 600 nM - 150 pmol, B5 - 2 μM - 500 pmol und B6 - 20 μM - 5000 pmol. Anschließend werden die Membranpartikel bei 50000 x g 20 Minuten bei 4° C abzentrifugiert . Von den Überständen Ül bis Ü6 der Bindungsansätze Bl bis B6 werden jeweils 150 μl abgenommen und wie in Ausfuhrungsbeispiel 1 beschrieben mittels HPLC und anschließender Massenspektrometrie quantifiziert.
Wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, wird ein Überstand Ül* erzeugt. Es werden Lösungen Ll bis L6 hergestellt, in de- nen Codein in Ül* in den folgenden Konzentration und Mengen vorliegt: Ll - 20 nM - 5 pmol, L2 - 60 nM - 15 pmol, L3 - 200 nM - 50 pmol, L4 - 600 nM - 150 pmol, L5 - 2 μM - 500 pmol und L6 - 20 μM - 5000 pmol. Die Lösungen Ll bis L6 werden analysiert wie es für Ül bis Ü6 beschrieben worden ist.
Mit dem aus Ll bis L6 ermittelten Ansprechfaktor für den Liganden sind die folgenden Mengen der insgesamt in ungebundener Form in Ül bis Ü6 vorliegenden Liganden berechnet worden:
Ul 4 , 0 pmol ,
Ü2 10,9 pmol,
Ü3 41,7 pmol ,
Ü4 134,5 pmol,
Ü5 463 , 1 pmol und
Ü6 4737 pmol.
Aus der jeweiligen Differenz der in Ll bis L6 eingesetzten Menge an Ligand und der in Ül bis Ü6 ermittelten Menge an nicht gebundenem Ligand sind für Bl bis B6 die folgenden Mengen insgesamt gebundener Liganden ermittelt worden:
Bl 1,0 pmol ,
B2 4,1 pmol ,
B3 8,3 pmol,
B4 15,5 pmol,
B5 36,9 pmol und
B6 263 pmol .
Falls in dem Bindungsansatz zusätzlich zu den Ziel-Molekülen auch noch andere Bindungsstellen enthalten sind, an welche der Ligand unspezifisch bindet, muß dies für eine exakte Ermittlung der Affinität berücksichtigt werden. Durch Wahl ge- eigneter Konzentrationsverhältnisse in einem Sättigungsversuch, wie in diesem Ausführungsbeispiel beschrieben, können die jeweiligen Mengen des unspezifisch gebundenen Liganden aus der in Bl bis B6 ermittelten Gesamtbindung durch nicht lineare Regressionsanalyse mittels des Programms Prism 2.01 der Firma GraphPad, Software, Inc., San Diego berechnet werden. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel sind die folgenden Mengen unspezifisch gebundener Liganden ermittelt worden:
Bl 0,25 pmol,
B2 0,75 pmol,
B3 2 , 5 pmol ,
B4 7 , 5 pmol ,
B5 25 pmol und
B6 250 pmol.
Wird die für Bl bis B6 berechnete Menge unspezifischer Bindung jeweils von der Menge des insgesamt gebundenen Liganden subtrahiert, wird die folgende spezifische, d.h. ausschließlich an Ziel-Moleküle erfolgte, Bindung erhalten:
Bl 0,75 pmol,
B2 3,3 pmol,
B3 5,8 pmol ,
B4 8,0 pmol,
B5 11,9 pmol und
B6 13,0 pmol .
Es ist bis zum Erreichen eines Bindungsgleichgewichts inkubiert worden. Zur Berechnung der Affinität eines Liganden zu den Ziel -Molekülen ist es erforderlich, für Bl bis B6 die Konzentrationen des nicht gebundenen, d.h. freien Liganden, und der gebildeten Liganden-Ziel-Moleküle-Komplexe zu kennen. Die Konzentration der Ziel-Moleküle insgesamt sowie die Konzentration der nicht gebundenen, d.h. freien Ziel-Moleküle, ist bekannt.
Aus der entsprechenden Sättigungsisotherme für Bl bis B6 läßt sich durch nicht lineare Regressionsanalyse mittels des Programms Prism 2.01 der Firma GraphPad, Software, Inc., San Diego der Kd-Wert berechnen.
Aus den in Bl bis B6 erhaltenen Daten ergibt sich für Codein ein Kd-Wert von 2,2 x 10"7 mol/1 bei einer Gesamtkonzentration der Ziel-Moleküle von 5,2 x 10"8 mol/1.
Gegebenenfalls kann zur Bestimmung der nicht spezifischen Bindung auch die Durchführung eines weiteren Bindungsansatzes in Gegenwart eines spezifischen Liganden, welche eine Bindung an die Ziel-Moleküle selektiv unterdrückt, erforderlich sein. Es wird auf Ausführungsbeispiel 3 verwiesen. Analog können auch die Kd-Werte für mehrere Liganden gleichzeitig bestimmt werden. Dafür können die einzelnen Liganden nebeneinander in jeweils gleicher Konzentration in einem Bindungsansatz eingesetzt werden.
Ausfuhrungsbeispiel 3 :
Fig. 2a zeigt schematisch einen Bindungsansatz mit den Liganden LA, LB und LC sowie den Ziel-Molekülen TA und TC. Dabei weist LA zu TA und LC zu TC eine Affinität auf. LB besitzt keine Affinität zu den im Ansatz vorhandenen Ziel-Molekülen. Im Anschluß an die in Fig. 2b dargestellte Inkubation erfolgt das Absondern gebundener Liganden von der Mischphase. Das kann durch Zentrifugation geschehen. Fig. 2c zeigt die Situation nach dem Absondern. Die Menge von LB in der Mischphase ist unverändert geblieben. Die Mengen von LA und LC in der Mischphase haben sich um die an TA und TC gebundenen Mengen verringert. Es sollen Liganden identifiziert werden, die Affinität zu TA, nicht aber zu TC besitzen. Dazu wird zu einem zweiten Bindungsansatz, wie er in Fig. 3a dargestellt ist, ein spezifischer Inhibitor IA im Überschuß gegenüber TA zugesetzt. Fig. 3a zeigt den Bindungsansatz schematisch. Der Inhibitor bindet spezifisch an TA und verhindert die Bindung von LA an TA. In Fig. 3b ist der Zustand am Ende der Inkubation dargestellt. Fig. 3c zeigt die Situation nach dem Abson- dern gebundener Liganden einschließlich des gebundenen Inhibitors IA. Es befinden sich unveränderte Mengen von LB und LA in der Mischphase. Die Menge an LC in der Mischphase hat sich verringert. Aus dem Vergleich der Zusammensetzungen der in Fig. 2c und der in Fig. 3c dargestellten Mischphasen ergibt sich, welche Liganden eine Affinität zu dem Ziel-Molekül TA aufweisen. In dem schematisch in den Figuren 2a bis 2c dargestellten Bindungsansatz wird eine Präparation synaptischer Plasmamem- bran-Vesikel (spm-Vesikel) verwendet. Die spm-Vesikel sind aus dem Hippocampus von Schweinen gewonnen (G. Höfner und K. Th. Wanner, Eur. J. Pharmacol . 394, 211-219, 2000) und anschließend 4 x in 5 mM Tris-HCl pH 7,4 gewaschen worden (G. Hδfner und K. Th. Wanner, J. Recept . Signal Transduct . Res . 16, 297-313, 1996). Neben vielen anderen Ziel-Molekülen enthält diese spm-Vesikel-Präparation N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) Rezeptoren, die neben anderen Bindungsstellen Bindungsstellen für Glycin enthalten. In einem ersten Bindungsansatz Bl werden die spm-Vesikel in einer Proteinkonzentration von 15 mg/ml, entsprechend einer Konzentration bzw. Menge der Gylcinbindungsstellen von 50 nM bzw. 12,5 pmol, mit 100 nM, entsprechend 25 pmol Aminocyclopropancarbonsäure, 100 nM, entsprechend 25 pmol L-Methionin und 100 nM, entsprechend 25 pmol L-Phenylalanin sowie 10 mM MgCl2 und 5 mM Tris-HCl- Puffer bei pH 7,4 in einem Gesamtvolumen von 250 μl 180 Minuten bei 4° C in einem 1,5 ml PP-Reaktionsgefäß inkubiert. An- schließend werden die spm-Vesikel bei 50000 x g 20 Minuten bei 4° C abzentrifugiert . Vom Überstand Ül werden 100 μl abgenommen.
In Ül werden Aminocyclopropancarbonsäure, L-Methionin und L- Phenylalanin mittels HPLC, wie in ChromCircle Version 1.3, 1997, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland beschrieben, getrennt. Dazu sind die folgenden Laufmittel verwendet worden: Laufmittel A: Wasser, Lauf ittel B: Acetonitril und Lauf it- tel C: Ammoniumformiatpuffer pH 4,4. Zur Chromatographie wird ein Gradient eingesetzt, bei dem sich die Konzentrationen der Laufmittel von 100 % A, 0 % B und 0 % C zu 0 % A, 50 % B und 50 % C bei einer Flußrate von 0,8 ml pro Minute ändern. Die Quantifizierung erfolgt wie im Ausführungsbeispiel 1 be- schrieben mittels eines Finnigan LCQ Deca-Massenspektrometers im MS/MS-Modus.
Parallel dazu wird _eine zweite Bindung in einem Bindungsansatz B2 durchgeführt. B2 unterscheidet sich vom ersten Bindungsansatz Bl nur dadurch, daß zusätzlich 10 μM MDL 105,515, ein selektiver Ligand für eine Glycinbindungsstelle am NMDA Rezeptor, enthalten sind. Aus B2 wird ein Überstand Ü2 gewonnen, der wie Ül analysiert wird.
Ebenso wird ein Überstand Ül* hergestellt, der sich vom Überstand Ül dadurch unterscheidet, daß er aus einer spm-Vesikel - Päparation ohne Zusatz von Liganden gewonnen wird. Es wird eine Lösung Ll hergestellt, die 100 nM Aminocyclopropancar- bonsäure, 100 nM L-Methionin und 100 nM L-Phenylalanin in Ül* enthält. Diese Lösung Ll wird ebenso analysiert wie Ül . Es ergeben sich die folgenden Mengen ungebundener Liganden:
Ul:
Aminocyclopropancarbonsäure 17,5 pmol L-Methionin 22,3 pmol
L-Phenylalanin 22,2 pmol
U2
Aminocyclopropancarbonsäure 22,0 pmol L-Methionin 22,3 pmol
L-Phenylalanin 22,1 pmol
Aus der Differenz der jeweils eingesetzten und in Ll bestimmten Menge an Liganden und der für Ül bzw. Ü2 jeweils ermit- telten Menge nicht gebundener Liganden, sind die folgenden Mengen gebundener Liganden ermittelt worden:
Ül:
Aminocyclopropancarbonsäure 7 , 5 pmol
L-Methionin 2 , 7 pmol
L-Phenylalanin 2,8 pmol
U2:
Aminocyclopropancarbonsäure 3,0 pmol L-Methionin 2,7 pmol
L-Phenylalanin 2,9 pmol
Aus der Differenz der jeweiligen Menge an Liganden in Ül und Ü2 wird die Menge spezifisch an Ziel-Moleküle gebundener Liganden in Bl wie folgt berechnet :
Aminocyclopropancarbonsäure 4,5 pmol L-Methionin 0 pmol
L-Phenylalanin ~0 pmol
Je größer der Anteil der an Ziel-Moleküle gebundenen Liganden ist, desto größer ist die Affinität des Liganden zum Ziel- Molekül. Für die relativen Affinitäten der drei untersuchten Liganden zu den Ziel-Molekülen ergibt sich somit, daß Aminocyclopropancarbonsäure eine deutlich höhere Affinität zum Ziel-Molekül besitzt als L-Methionin und L-Phenylalanin. Die Affinitäten von L-Methionin und L-Phenylalanin sind unter diesen Bedingungen nicht meßbar. Gegebenenfalls läßt sich der
Kd-Wert als Maß für die Affinität eines Liganden, in diesem Ausführungsbeispiel von Aminocyclopropancarbonsäure, zum Ziel-Molekül für die zu untersuchenden Liganden mit Hilfe mindestens einer dem Bindungsansatz zugesetzten Referenz mit bekannter Affinität zu den Ziel-Molekülen aus den gewonnenen Daten gut abschätzen.
Der Kd-Wert als Maß für die Affinität eines Liganden, in diesem Anwendungsbeispiel für Aminocyclopropancarbonsäure, zum Ziel-Molekül läßt sich außerdem gemäß der Formel
Kd = [TA-frei] x [LA-frei] / [LA-gebunden]
berechnen.
Aus den ermittelten Ergebnissen ergibt sich für Aminocyclo- propancarbonsäure ein K^-Wert von 1,5 x 10"7 mol/1.
Ausfuhrungsbeispiel 4 :
Screening von Substanzbibliotheken in Gegenwart eines als Re- ferenz dienenden Liganden
4.1. Bindungsansätze
In allen Bindungsansätzen dienten humane μ-opioid Rezeptoren als Ziel-Moleküle. Die Ziel-Moleküle wurden mittels einer Membranpräparation transfizierter humane μ-opioid Rezeptoren exprimierender CHO-Kl Zellen der Fa. NEN, Brüssel, Belgien bereitgestellt .
Ein Ansatz BO enthielt 8,0 nM μ-opioid Rezeptoren, 5 mM MgCl2, 7,5 % Sucrose und 50 mM Tris HCl , pH 7,4 in einem Gesamtvolumen von 400 μl . Der Ansatz B0 wurde 150 Minuten bei 25 °C in einem 1,5 ml PP-Reaktionsgefäß inkubiert. Anschließend wurden die Membranpartikel bei 50000 x g 20 Minuten bei 4 °C abzentrifugiert . Vom resultierenden Überstand Ü0 wurden 350 μl abgenommen. Folgende Bindungsansätze wurden wie BO behandelt :
- Ein wie BO zusammengesetzter Bindungsansatz Bl, der zu- sätzlich 10 nM Nalbuphin als als Referenz dienende Liganden und als weitere Liganden 10 nM Naloxon und 10 nM Dihy- drocodein enthielt . Aus Bl wurde der Überstand Ül gewonnen.
- Ein wie Bl zusammengesetzter Bindungsansatz B2 , der zusätzlich (±) -Methadon in einer Konzentration von 50 μM enthielt. Aus B2 wurde der Überstand Ü2 gewonnen.
Ein wie B0 zusammengesetzter Bindungsansatz B3 , der zu- sätzlich 10 nM Nalbuphin als als Referenz dienende Liganden und als weitere Liganden 10 nM Dihydrocodein und 10 nM (+) -Normetazocin enthielt. Aus B3 wurde der Überstand Ü3 gewonnen.
- Ein wie B0 zusammengesetzter Bindungsansatz B4, der zusätzlich 10 nM Nalbuphin als als Referenz dienende Liganden enthielt. Aus B4 wurde der Überstand Ü4 gewonnen.
4.2. Quantifizierung der Liganden Die massenspektrometrische Bestimmung wurde an einem Applied Biosystems API 2000 mit TurboIonSpray-Quelle im MRM-Modus, an das ein Hewlett Packard HPllOO LC-System gekoppelt war, unter folgenden Bedingungen durchgeführt :
Säule: Superspher 60 RP select B 4 μm 125 x 2 mm
Laufmittel: 0,1 % HCOOH in Wasser / Acetonitril (70/30)
Fluß: 0,4 ml/min (isokratisch)
Probenvolumen: 20 μl (injiziert mittels Autosampier) Nalbuphin, Naloxon und Dihydrocodein wurden in den Überständen Ül bis Ü4 massenspektrometrisch vermessen und mittels einem externen Standard quantifiziert. Als externer Standard wurden jeweils 2 nM, 5 nM, .8 nM und 10 nM Nalbuphin, Naloxon und Dihydrocodein in Ü0 eingesetzt. Alle Proben wurden zweimal vermessen.
4.3. Auswertung
In Ül bis Ü4 wurden folgende Konzentrationen der ungebundenen Liganden ermittelt:
Ul U2 U3 U4
Nalbuphin 6,99 nM 9,69 nM 6,32 nM 6,21 nM
Naloxon 5,92 nM 8,66 nM * *
Dihydrocodein 8,32 nM 8,60 nM 8,43 nM *
(+) -Normetazocin * * nicht * bestimmt
*nicht im jeweiligen Bindungsansatz enthalten
Die spezifische Bindung der Liganden in Bl an die Ziel- Moleküle ergibt sich aus der Differenz der in Ül bzw. Ü2 ermittelten Konzentrationen. Dihydrocodein zeigt in der einge- setzten Konzentration keine deutlich meßbare spezifische Bindung an die Ziel-Moleküle. Naloxon zeigt eine spezifische Bindung in der Größenordnung der Referenz Nalbuphin. Die Referenz erlaubt die Abschätzung, daß Naloxon eine ähnliche Affinität zu den Ziel-Molekülen aufweist wie Nalbuphin.
In Ü3 wurden unter den gewählten chromatographischen bzw. massenspektrometrischen Bedingungen nur die Substanzen Nalbuphin und Dihydrocodein, nicht aber (+) -Normetazocin, quantifiziert. Dihydrocodein zeigt in der eingesetzten Konzentrati- on keine meßbare spezifische Bindung an die Ziel-Moleküle . Der Vergleich von Ü3 mit Ü4 zeigt, daß durch (+) -Normetazocin die Bindung der Referenz Nalbuphin an die Ziel-Moleküle nicht inhibiert wird. Normetazocin zeigt in der eingesetzten Konzentration offensichtlich keine erkennbare spezifische Bindung an die Ziel-Moleküle .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung der Menge von an Ziel-Molekülen gebundenen Liganden mit folgenden Schritten:
a) Bereitstellen der Ziel-Moleküle und einer die Liganden in nativer Form in einer vorgegebenen Menge enthaltenden Mischphase,
b) Inkontaktbringen und Inkubieren der Mischphase mit den Ziel-Molekülen,
c) Absondern gebundener Liganden von der Mischphase unter Bedingungen, unter denen die Menge ungebundener Liganden konstant bleibt,
d) Ermitteln der Menge ungebundener Liganden in der Mischphase und
e) Ermitteln der Menge gebundener Liganden durch Differenzbildung zwischen der Menge der Liganden gemäß lit. a und- der gemäß lit. d ermittelten Menge der Liganden,
wobei die Mischphase gemäß Schritt lit. a verschiedene Ligan- den enthält, die teilweise als Referenz dienen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die als Referenz dienenden Liganden mindestens eine bekannte Affinität zu den Ziel-Molekülen aufweisen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die als Referenz dienenden Liganden voneinander verschieden sind und abgestufte Affinitäten zu den Ziel-Molekülen aufweisen.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Bestimmung der Affinität der Liganden zu den Ziel- Molekülen die Schritte lit. a bis lit. e mit Liganden und Ziel-Molekülen in einem ersten Mengen-Verhältnis durchgeführt und dann mit Liganden und Ziel-Molekülen in mindestens einem weiteren Mengen-Verhältnis wiederholt werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ziel-Moleküle in nativer Form bereitgestellt werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Liganden in der Mischphase nach Durchführung des Schritts lit. c, insbesondere mittels eines Fluorophors, markiert werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mischphase gemäß Schritt lit. a mehr als 10, insbesondere mehr als 100, verschiedene Liganden enthält.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei nach Durchführung des Schritts lit. c und vor Durchführung des Schritts lit. d ein Trennschritt, insbesondere unter Verwendung von Gaschromatographie, Kapillarelektrophorese, Flüssigkeitschromatographie, vorzugsweise HPLC, FPLC , Umkehrphasenchromatographie oder Affinitätschromatographie, erfolgt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Liganden in der Mischphase nach Durchführung des Schritts lit. c und vor Durchführung des Schritts lit. d konzentriert werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Liganden derart zusammengestellt sind, daß zumindest die Menge der als Referenz dienenden, vorzugsweise die Menge aller, Liganden bei Durchführung des Schritts lit. d in einem Arbeitsgang ermittelt werden kann.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei beim Schritt lit. a verschiedene Ziel-Moleküle bereitgestellt werden.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ziel-Moleküle in einer Konzentration größer als 1 nM, insbesondere größer als 100 nM, vorzugsweise größer als 1 μM, vorliegen.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mischphase zusätzlich Inhibitoren einer Bindung der Liganden an die Ziel-Moleküle enthält.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ermitteln der Menge der Liganden mittels eines Verfahrens erfolgt, mit dem weniger als 10 ng, insbesondere weniger als 100 pg, vorzugsweise weniger als 100 fg, der Liganden detek- tierbar sind.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ermitteln der Menge der Liganden mittels Massenspektrometrie, Kapillarelektrophorese oder Gas- oder Flüssigkeitschromatographie, vorzugsweise HPLC oder FPLC , insbesondere unter Verwendung von Umkehrphasenchromatographie, erfolgt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Detektion nach der Gas- oder Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese mittels Massenspektrometrie, Spektralphotometrie, insbesondere mittels UV-Detektion oder Diodenfeld-Detektion, Fluoreszenzdetektion, Lumineszenzdetektion, elektrochemischer Oxidation oder Reduktion oder Flammenionisationsdetektion erfolgt.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Menge der Liganden in der Mischphase vor Durchführung des
Schritts lit. c, insbesondere vor Durchführung des Schritts lit. b, mit einem Messverfahren gemessen wird, welches bei Durchführung des Schritts lit. d zum Ermitteln der Menge der Liganden eingesetzt wird.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ziel-Moleküle gelöst oder suspendiert vorliegen.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ziel -Moleküle in Membranstrukturen eingebettet vorliegen.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Absondern gemäß lit. c durch Dialyse, Präzipitation, Adsorption, Bindung an immobilisierte Moleküle mit einer Affi- nität zu gebildeten Ligand-Ziel -Molekül -Komplexen, Zentrifu- gation oder Filtration, insbesondere Ultrafiltration, erfolgt.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ziel -Moleküle nach Durchführung des Schritts lit. c regeneriert werden.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ziel-Moleküle oder Liganden aus folgender Gruppe ausgewählt sind: Peptide, Proteine, insbesondere Rezeptoren, niedermolekulare Verbindungen, Prionen, Enzyme, Transportprotei- ne, Ionenkanäle oder Antikörper, Hormone, Nukleinsäuren, Zuk- ker, Polymere und Strukturen auf oder in Zellen, Zellfragmenten, Zellhomogenaten, Synaptosomen, Liposomen, synaptischen Plasmamembran-Vesikeln, Gewebeschnitten, Viren, deren Bestandteilen oder Fragmenten dieser Bestandteile, Kapsiden, deren Bestandteilen oder Fragmenten dieser Bestandteile und Naturstoffgemischen.
23. Kombination von Liganden zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 22, wobei die Liganden der- art zusammengestellt sind, daß zumindest die Menge von als Referenz dienenden Liganden bei Durchführung des Schritts lit. d in einem Arbeitsgang ermittelt werden kann.
24. Kombination von Liganden nach Anspruch 23, wobei die Li- ganden derart zusammengestellt sind, daß die Menge aller Liganden bei Durchführung des Schritts lit. d in einem Arbeitsgang ermittelt werden kann.
25. Kombination von Liganden zur Verwendung in einem Verfah- ren nach einem der Ansprüche 1 - 22, wobei als Referenz dienende Liganden voneinander verschieden sind und abgestufte Affinitäten zu den Ziel-Molekülen aufweisen.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1151301A1 (de) * 1999-02-12 2001-11-07 Cetek Corporation Grössenausschliessendes hochdurchsatzverfahren zum screenen von komplexen biologischen materialien nach affinitätsliganden
WO2002095403A2 (de) * 2001-05-23 2002-11-28 november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin Verfahren zur bestimmung des bindeverhaltens von an ziel-molekülen spezifisch bindenden liganden
WO2003076654A2 (de) * 2002-03-08 2003-09-18 november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin Verfahren zum nachweisen, quantifizieren und/oder charakterisieren eines analyten

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1983003306A1 (en) * 1982-03-19 1983-09-29 Roger Philip Ekins Method and composition for free ligand assays
US5891742A (en) * 1995-01-19 1999-04-06 Chiron Corporation Affinity selection of ligands by mass spectroscopy
DE19814775A1 (de) * 1998-04-02 1999-10-14 Nimbus Biotechnologie Gmbh Verfahren zur Bestimmung der Bindungskonstanten gelöster Stoffe und Substanzen an Oberflächen aus amphiphilen Molekülen
EP1026504A1 (de) * 1999-01-25 2000-08-09 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Verfahren zur Bestimmung von Rezeptorbindungseigenschaften und Reagenz zum Assay

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1983003306A1 (en) * 1982-03-19 1983-09-29 Roger Philip Ekins Method and composition for free ligand assays
US5891742A (en) * 1995-01-19 1999-04-06 Chiron Corporation Affinity selection of ligands by mass spectroscopy
DE19814775A1 (de) * 1998-04-02 1999-10-14 Nimbus Biotechnologie Gmbh Verfahren zur Bestimmung der Bindungskonstanten gelöster Stoffe und Substanzen an Oberflächen aus amphiphilen Molekülen
EP1026504A1 (de) * 1999-01-25 2000-08-09 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Verfahren zur Bestimmung von Rezeptorbindungseigenschaften und Reagenz zum Assay

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1151301A1 (de) * 1999-02-12 2001-11-07 Cetek Corporation Grössenausschliessendes hochdurchsatzverfahren zum screenen von komplexen biologischen materialien nach affinitätsliganden
EP1151301A4 (de) * 1999-02-12 2004-07-14 Cetek Corp Grössenausschliessendes hochdurchsatzverfahren zum screenen von komplexen biologischen materialien nach affinitätsliganden
US7179592B2 (en) 1999-02-12 2007-02-20 Cetek Corporation Size-exclusion-based extraction of affinity ligands and active compounds from natural samples
WO2002095403A2 (de) * 2001-05-23 2002-11-28 november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin Verfahren zur bestimmung des bindeverhaltens von an ziel-molekülen spezifisch bindenden liganden
WO2002095403A3 (de) * 2001-05-23 2003-02-13 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zur bestimmung des bindeverhaltens von an ziel-molekülen spezifisch bindenden liganden
US7074334B2 (en) 2001-05-23 2006-07-11 Klaus Wanner Method for determining the binding behavior of ligands which specifically bind to target molecules
WO2003076654A2 (de) * 2002-03-08 2003-09-18 november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin Verfahren zum nachweisen, quantifizieren und/oder charakterisieren eines analyten
WO2003076654A3 (de) * 2002-03-08 2004-03-11 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zum nachweisen, quantifizieren und/oder charakterisieren eines analyten

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