-
Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Nachweis eines
Analyten in einer Probe und ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart
eines Analyten in einer Probe.
-
Aktuelle
Technologien, die in der diagnostischen Industrie verwendet werden,
erfordern große, teuere
Ausstattung für
den Nachweis von Analyten. Zum Beispiel erfordern Immunoassays Gamma-Detektoren,
Spektrophotometer, Laser, usw. und DNA-Nachweis nach PCR-Verfahren
erfordert Elektrophorese und Absorptionsmethoden, welche alle von
der spezifischen Sonde abhängen,
die für
die Signalamplifizierung verwendet wurde.
-
Eine
Anzahl an Vorrichtungen wurde in der Literatur beschrieben, welche
für einfache,
einstufige Assays entworfen wurden und von Gebietstrennung Gebrauch
machen, um die erforderlichen, unterschiedlichen Reaktions- und
Waschstufen auszuführen.
Zum Beispiel verwenden auf Antikörper
basierende Tests wie die Schwangerschaftstestvorrichtung „Clearblue
One-Step" von Unipath
einen Docht, um Urin zu absorbieren, welcher sich dann über die Länge einer
stiftähnlichen
Vorrichtung fortbewegt. Das Hormon hCG wird durch die erste Schicht
eingefangen, welche mobile blaue Latexpartikel enthält, an welche
mAb gekoppelt wurde. Der Urinfluss transportiert den Latex, und
gebundenes hCG, in einen zweiten Bereich, der immobilisierten mAb
enthält, welcher
eine zweite Epitopstelle auf dem Hormon erkennt. Jegliches an den
Latex gebundene hCG wird daran gehindert, jenseits des zweiten Bereichs
weiterzulaufen, wie durch eine scharfe blaue Linie nachgewiesen.
In Abwesenheit von hCG bewegt sich der Latex durch zu einem dritten
Bereich und wird durch immobilisierten anti-Fc-Antikörper gefangen. Andere Einmalvorrichtungen
verwenden mit Flüssigkeit
betriebene Schalter (dargestellt in 12.7 Kapitel
12 von A P H. Farnsworth, in "Molecular
and Antibody Probes in Diagnosis" herausgegeben
von M. R. Walker und R. Rapley, John Wiley and sons. 1993), um aufeinander
folgende Stufen in den ELISA-artigen Verfahren auszuführen. In
auf DNA basierenden Technologien wurde ein Produkt zur Ausführung von vielfachen
Stufen, die in der PCR-Technologie
erforderlich sind, herausgebracht, welches durch die Einteilung
der verschiedenen Stufen in Bereiche in einer einzigen Einmalvorrichtung
Einfachheit und Verminderung von Kreuzkontamination der PCR-Produkte bietet.
-
US 5 328 874 betrifft ein
biochemisches Umschaltmodul, das einen Puffer und eine flüssige Membran
enthält.
WO 96/12957 betrifft einen Biosensor, der eine flüssige Bioschicht
und eine Photogelträgerschicht
zum Nachweis der Gegenwart bzw der Abwesenheit von Analyt in einer
Probe umfasst.
-
In
den internationalen Patentanmeldungen Nr. PCT/AU88/00273, PCT/AU89/00352, PCT/AU90/00025,
PCT/AU92/00132, PCT/AU93/00590, PCT/AU93/00620 und PCT/AU94/00202
werden Biosensoren offenbart, die zum Nachweis von Analyten verwendet
werden können.
-
Es
wird angenommen, dass durch Anpassung dieser Biosensoren und existierender
Diagnosetechniken verbesserte Nachweisvorrichtungen und Verfahren
zum Nachweis erreicht werden können.
-
Die
vorliegende Erfindung besteht in einem Verfahren zum Nachweis der
Gegenwart eines Analyten in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: das
in Kontakt bringen der Probe mit einem Träger, der eine Vielzahl von
ersten mit dem Analyten reagierenden Liganden enthält, um eine
Bindung des Analyten an die Trägerliganden
zu ermöglichen,
das in Kontakt bringen des Trägers
mit einer Membran, die eine erste und eine zweite Schicht einer
enggepackten Anordnung von amphiphilen Molekülen und eine Vielzahl von Ionophoren
aufweist, welche erste und zweite die Halbmembran übergreifende
Monomere aufweist, wobei die ersten die Halbmembran übergreifenden
Monomere in der ersten Schicht bereitgestellt sind, und die zweiten
die Halbmembran übergreifenden
Monomere in der zweiten Schicht bereitgestellt sind, wobei die zweiten
die Halbmembran übergreifenden
Monomere in der Lage sind, innerhalb der zweiten Schicht seitlich
zu diffundieren, unabhängig
von den ersten die Halbmembran übergreifenden
Monomeren, wobei die seitliche Diffusion der ersten die Halbmembran übergreifenden
Monomere in der ersten Schicht verhindert wird, und ein zweiter Ligand,
der zumindest auf den zweiten die Halbmembran übergreifenden Monomeren vorgesehen
ist, wobei der zweite Ligand mit dem Analyt oder einem Teil davon
reagieren kann, wobei die Bindung des Analyten an den zweiten Ligand
eine Änderung
der Beziehung zwischen den ersten die Halbmembran übergreifenden
Monomeren und den zweiten die Halbmembran übergreifenden Monomeren verursacht,
so dass der Ionenfluss über
die Membran über
die Ionophore ermöglicht
oder verhindert wird, und Messen der Impedanz der Membran.
-
Das
erste die Halbmembran übergreifende Monomer
in der ersten Schicht kann an seitlicher Diffusion gehindert werden
unter Verwendung von jeglicher aus einer Anzahl von bekannten Techniken,
jedoch ist derzeit bevorzugt, dass das Monomer und die amphiphilen
Moleküle
jeweils einschließen
oder dekoriert sind mit mindestens einer Einheit, die mit mindestens
einer entsprechenden Einheit auf einem anderen dieser Moleküle quervernetzt
ist. Unter geeigneter Anregung wie UV-Bestrahlung oder ionisierender
Bestrahlung können
die quervernetzbaren Einheiten zur Polymerisation veranlasst werden,
wodurch es in der Membran zu einer Quervernetzung in einer Schicht
kommt.
-
Die
ersten die Halbmembran übergreifenden Monomere
können
auch an seitlicher Diffusion gehindert werden, indem Lipide für die erste
Schicht der Membran gewählt
werden, die bei Raumtemperatur kristallin sind. Dies eliminiert
eine seitliche Diffusion in der ersten Schicht.
-
In
einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden die ersten die Halbmembran übergreifenden
Monomere in der ersten Schicht an seitlicher Diffusion gehindert,
indem die erste Schicht und die Monomere darin an einem festen Träger fixiert
werden. Dies kann erreicht werden, indem Gruppen auf den amphiphilen
Molekülen
in der ersten Schicht und auf den darin befindlichen Monomeren bereitgestellt
werden, die mit dem festen Träger
oder mit entsprechenden, darauf bereitgestellten Gruppen reagieren
können.
-
In
einer anderen bevorzugten Form der Erfindung sind ein Teil der amphiphilen
Moleküle
Membran übergreifende
Amphiphile, wobei die Membran übergreifenden
Amphiphile archeobakterielle Lipide, oder Schwanz-an-Schwanz-chemisch verbundene Doppelschicht-Amphiphile
sind. Es ist auch bevorzugt, dass die Halbmembran übergreifenden
Monomere Gramicidin-Monomere sind.
-
In
noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Membran
eine Vielzahl von dritten Liganden, die an Amphiphile in der Membran gebunden
sind, vorzugsweise an die Membran übergreifende Amphiphile. Diese
dritten Liganden werden vorzugsweise an seitlicher Diffusion innerhalb
der Membran gehindert. In der Vorrichtung des ersten Aspekts der
vorliegende Erfindung können
diese dritten Liganden mit der Sonde oder einem Teil davon reagieren,
während
sie in dem Verfahren des zweiten Aspekts der vorliegende Erfindung
mit dem Analyten reagieren können.
-
Die
Liganden können
die gleichen oder unterschiedliche sein und werden vorzugsweise
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, Antikörperfragmenten,
einschließlich
mindestens einem Fab-Fragment, Antigenen, Lektinen, Haptenen, chelatbildenden
Mitteln und Farbstoffen.
-
Die
Liganden sind vorzugsweise mit den Ionophoren und/oder Membranen über Linker
verbunden. Geeignete Linker werden in PCT/AU90/00025, PCT/AU92/00132
und PCT/AU93/00509 dargelegt.
-
Wie
von Fachleuten auf diesem Gebiet erkannt werden wird, ist es bevorzugt,
dass die Membran mit einer Elektrode verknüpft ist, so dass ein Reservoir
zwischen der Elektrode und der Membran besteht. Moleküle und Verfahren,
durch welche dies ohne weiteres erreicht werden kann, sind in PCT/AU92/00132
und PCT/AU93/00509 dargelegt.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Membran wie in den Internationalen
Patentanmeldungen Nr. PCT/AU88/00273, PCT/AU89/00352, PCT/AU90/00025,
PCT/AU92/00132, PCT/AU93/00590, PCT/AU93/00620 oder PCT/AU94/00202
beschrieben.
-
Damit
die Natur der vorliegenden Erfindung deutlicher verstanden werden
kann, werden nun bevorzugte Formen von ihr in Bezug auf die folgenden Beispiele
und Figuren beschrieben, in welchen:
-
1a eine
schematische Darstellung einer Ausführungsform einer Analytnachweisvorrichtung zeigt,
die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
-
1b eine
vergrößerte Sicht
des Bereichs B von 1a ist.
-
2 eine
schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform einer Analytnachweisvorrichtung
ist, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
-
3 eine
schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist.
-
4a und 4b schematische
Darstellungen einer Ausführungsform
einer Nachweisvorrichtung sind, die in der vorliegenden Erfindung
verwendet wird.
-
5a und 5b schematische
Darstellungen einer weiteren Ausführungsform einer Nachweisvorrichtung
sind, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
-
6 eine
schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens und
einer Vorrichtung ist, die in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden.
-
7a und 7b schematische
Darstellungen einer Ausführungsform
einer Nachweisvorrichtung der vorliegenden Erfindung sind, die zum Nachweis
von DNA verwendet wird.
-
8 die
Struktur des Linkerlipids A zeigt.
-
9 die
Struktur des Linkers Gramicidin B zeigt.
-
10 die
Struktur des Membran übergreifenden
Lipids D zeigt.
-
11 die
Struktur von biotinyliertem Gramicidin E zeigt, wobei n = 5.
-
12 Impedanzmessungen
in Beispiel 4 zeigt.
-
13 Impedanzmessungen
in Beispiel 5 zeigt.
-
14 Impedanzmessungen
in Beispiel 6 zeigt.
-
Wie
in 1a gezeigt, besteht die Vorrichtung 10 aus
zwei Zonen 12 und 14. Zone 12 ist mit
Liganden 16 versehen, die mit Analyt 18 reagieren
können.
Die Sonde 20 besteht aus einem Liganden 22, der
mit Analyt 18 reagieren kann, und einem Marker 24.
-
Zone 14 umfasst
eine Sensormembran 26. Die Membran 26 umfasst
amphiphile Moleküle 28 und
Ionophore 30 und 32. Ionophore 30 umfassen
Ligand 34, der mit dem Marker 24 reagieren kann.
-
Im
Betrieb wird eine Probe, von der vermutet wird, dass sie Analyt 18 enthält, zur
Zone 12 gegeben. Sonde 20 wird ebenfalls zur Zone 12 gegeben. In
der in 1a gezeigten Situation bindet
der Analyt 18 an Liganden 16 und wird dadurch
immobilisiert. Ligand 22 von Sonde 20 bindet dann
ebenfalls an Analyt 18 und immobilisiert dadurch die Sonde.
Die Sonde 20 kann sich daher nicht in die Zone 14 fortbewegen,
welche die Sensormembran 16 umfasst. Wenn kein Analyt anwesend
ist, dann ist die Sonde 20 frei, sich in die Zone 14 und
zur Sensormembran 26 fortzubewegen. Sobald die Sensormembran 26 erreicht wird,
bindet der Marker 24 an Ligand 34, was eine Veränderung
der Impedanz der Membran verursacht.
-
2 zeigt
eine weitere Ausführungsform
einer Analytnachweisvorrichtung. Die Analytnachweisvorrichtung 40 umfasst
Zonen 42 und 44. Zone 42 schließt Träger 46 ein,
an welche Liganden 48 gebunden sind, die mit Analyt 50 reagieren
können.
Wie in 2 gezeigt, umfasst Zone 42 auch Sonde 52, welche
Analyt 50 und Marker SA (Streptavidin) enthält. Zone 44 umfasst
eine Sensormembran 54 und Elektrode 55. Die Sensormembran 54 besteht
aus Amphiphilen 56, Ionophoren 58 und Liganden 60 und 62,
welche mit den Ionophoren 58 bzw. den Amphiphilen 56 verknüpft sind.
-
Im
Betrieb wird Analyt 50 zur Zone 42 gegeben. Der
Analyt 50 konkurriert mit dem Analytbestandteil 50 der
Sonde 52 um die Bindung an Ligand 48. Wie in 2 gezeigt,
hat dies die Freisetzung von Sonde 52 zur Folge, welche
Streptavidin umfasst. Die Sonde 52 gelangt dann in Zone 44 und
zur Sensormembran 54. Das Streptavidin bindet dann mit
Liganden 60 und 62, was eine Veränderung
der Impedanz der Sensormembran 54 verursacht. Offensichtlich
würde Sonde 52,
wenn die zugefügte
Probe Analyt 50 nicht enthielte, nicht freigesetzt werden
und das Streptavidin würde
die Sensormembran 54 nicht erreichen.
-
3 zeigt
eine Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Das Verfahren beinhaltet die Verwendung einer Sensormembran 70,
umfassend Amphiphile 72 und Ionophore 74 und 76 und Elektrode 71.
Die Liganden 78 und 80, die mit dem Analyten 82 reagieren
können,
sind an Ionophore 76 bzw. Amphiphile 72 gebunden.
Eine Trägerperle 86, die
mit einer Vielzahl an Liganden 84 versehen ist, die mit
Analyt 82 reagieren können,
wird ebenfalls bereitgestellt. Die Bindung an den Analyten 82,
der an die Trägerperle 86 über Liganden 84 an
Liganden 78 und 80 gebunden ist, verursacht eine
Veränderung
der Impedanz der Membran 70.
-
4 zeigt schematisch den Betrieb einer Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Wie in 4a gezeigt, wird ein Analyt 92 an
einen Träger 90 über Liganden 91 gebunden.
Eine Sensormembran 94, umfassend Amphiphile 95 und Ionophore 96 und
Elektrode 99, wird ebenfalls bereitgestellt. Der Analyt 92 ist
an die Sensormembran 94 über Liganden 93 gebunden.
In 4b wurde der Träger 90, und dadurch
Analyt 92, von der Sensormembran 94 weg bewegt.
Dies kann durch die Anwendung von Kraft aufgrund eines elektrischen Felds,
magnetischen Felds oder Flüssigkeitsströmung erreicht
werden. Die Bewegung des Partikels 90 verursacht die Extraktion
eines Segments 97 der Sensormembran 95. Dies hat
eine erhöhte
Fähigkeit der
Ionen zur Folge, durch die Membran zu gelangen, was eine Veränderung
der Impedanz der Sensormembran 94 zur Folge hat.
-
5 zeigt eine alternative Ausführungsform
zu der in 4 gezeigten. In dieser Anordnung führt die
Bewegung des Trägers 90 von
der Membran weg zur Extraktion von Ionophoren 98 von der
Membran. Die Entfernung dieser Ionophore wird eine Abnahme der Fähigkeit
von Ionen zur Folge haben, durch die Membran zu gelangen, und daher
zu einer Veränderung
der Impedanz der Membran führen.
-
6 zeigt
eine alternative Ausführungsform
zu der in 3 gezeigten. In dieser Ausführungsform
wird eine Sensormembran 120, umfassend Amphiphile 122,
Ionophore 124 und Liganden 126, die mit Analyt 130 reagieren
können,
bereitgestellt. Es wird auch eine Elektrode 121 bereitgestellt. Eine
Trägerperle 128,
die mit einer Vielzahl an Liganden 132, die mit Analyt 130 reagieren
können,
und einer Vielzahl an Ionophoren 134 versehen ist, wird ebenfalls
bereitgestellt. Die Bindung am Analyten 130 an Liganden 126 und 132 führt zur
Insertion von Ionophoren 134 in die Membran 120,
wodurch eine Veränderung
der Impedanz der Membran 120 verursacht wird.
-
7 zeigt eine schematische Darstellung des
Nachweises von DNA. 7a zeigt die Sensormembran 100,
umfassend Amphiphile 102 und Ionophore 104 und 106 und
Elektrode 101. Streptavidin (SA) ist an die Amphiphilen 102 und
Ionophoren 106 über
Linker 108 bzw. 110 gebunden. Wie in 7b gezeigt,
bindet Biotin 114 auf DNA 112 an das Streptavidin,
was ein Gating der Membran 100 verursacht und zu einer
Veränderung
der Impedanz der Membran 100 führt.
-
Man
wird zu dem Schluss gelangen, dass die Darstellungen in 7 eine Ausführungsform der zweiten Zone
einer in der vorliegenden Erfindung verwendeten Vorrichtung sind,
in welcher die mit Biotin markierte DNA als Sonde fungiert.
-
Wie
Fachleute auf dem Gebiet erkennen werden, hat die vorliegende Erfindung
allgemeine Anwendbarkeit, zum Beispiel:
-
1. Generischer homogener
Kapillar/Säulen-Sensor – Verwendung
mit Ab-Ag-Ab-Sandwich
-
- a) DIREKTER ASSAY: Probe wird zur Assayvorrichtung
gegeben. Kapillarwirkung treibt die Probe in den Kontakt mit Ab,
der mit Sonde markiert ist. Weitere Fortbewegung ermöglicht dem Ag-Ab-Komplex,
eine Bindung an einen zweiten Ab einzugehen, der auf der Kapillarwand
immobilisiert ist, welche den Ag-Ab-Komplex einfängt. In der Abwesenheit von
Analyt diffundiert der zweite, mit Sonde markierte Ab zu der Biosensormembran,
wo er eine Veränderung
der Impedanz hervorruft (1). Die Nachweissonde
kann irgend etwas sein, dass bei Einbau in oder Ansammeln auf der
zweischichtigen Membran eine Impedanzveränderung hervorruft (egal ob
Ansteigen oder Absinken des Signals). Beispiele von Nachweissonden
umfassen Streptavidin, Gramicidin, Gramicidin/Detergens-(z. B. SDS,
Octylglukosid)-Aggregat, Gramicidin/Vesikel, Gramicidin/Polystyrolperlen,
usw. Wo die Sonde Streptavidin ist, würde die Membran biotinyliertes
Gramicidin enthalten: wenn die Sonde Gramicidin enthält, würde die Membran
anfänglich
kein Gramicidin enthalten. Wo die Sonde ein Antikörper ist,
würde die
Membran ein Gramicidin-Hapten oder Gramicidin-Antigen-Konjugat enthalten.
- b) KOMPETITIVER ASSAY: wie für
a) beschrieben, außer
dass das Sandwich zwischen Ab-Ag oder Ag-Analog-Ab ausgeführt wird.
Wenn die Probe eingeführt
wird, verdrängt
der Analyt in der Probe den markierten, zweiten Ab und ruft so eine Impedanzveränderung
an der Biosensormembran hervor.
-
2. Streptavidin-Sensor
-
Perlensäule, umfassend
z. B. Polystyrolperlen, die an Ab gekoppelt sind. Ein kovalent verknüpftes Konjugat
aus Analyt oder Analytanalogon und Streptavidin wird an den Ab gebunden
Wenn die den Analyt enthaltende Probe eingeführt wird, verdrängt der
Analyt das SA/Analyt-Konjugat und setzt so SA frei. SA bindet an
biotinyliertes Gramicidin in der Biosensormembran und verändert so
das Impedanzsignal (2). Kann auch im Kapillarmodus
verwendet werden, wie oben in 1. beschrieben. Fachleute auf diesem
Gebiet werden ohne weiteres auch erkennen, dass eine derartige Anordnung
mit anderen Markern (Sonden) als SA verwendet werden kann. Zum Beispiel
könnte
SA durch ein Hapten ersetzt werden und das Gramicidin in der Membran
würde, anstatt
dass es biotinyliert wird, einen Rezeptor für das Hapten an sich gebunden
haben.
-
3. Verfahren zum Nachweis
von Ab-Ag-Ab-Sandwich, umfassend Ab-Perlenkonjugate
-
- a) LATERALE TRENNUNG; Ab-beschichtete Perlen
fangen Probenanalyt. Der Sandwich-Komplex wird mit Ab vervollständigt, der
an Gramicidin und Membran übergreifendem
Lipid geknüpft
ist, was laterale Trennung von Kanälen verursacht, welche zu Impedanzveränderungen
führt (siehe 3).
- b) GROSSE PARTIKEL, DIE KRIECHSTRÖME INDUZIEREN: Ab-beschichtete,
große
Perlen fangen Probenanalyt. Der Sandwich-Komplex wird mit Abs vervollständigt, die
mit Membranbestandteilen verknüpft
sind, die ihrerseits zu Domänen
quervernetzt sind (Membran muss keine Kanäle enthalten). Die Anwendung
von Flüssigkeitsströmung bei
hoher Geschwindigkeit beseitigt einen Teil der Biosensormembran über die
Domänen,
was zu einem elektrischen Kriechverlust führt. Siehe 4.
- c) GROSSE PARTIKEL, DIE IONENKANÄLE BESEITIGEN: Ab-beschichtete,
große
Perlen fangen Probenanalyt. Der Sandwich-Komplex wird mit Ab vervollständigt, der
in der Biosensormembran mit Gramicidin verknüpft ist. Die Anwendung von Flüssigkeitsströmung bei
hoher Geschwindigkeit beseitigt das Gramicidin von der Biosensormembran,
was zu einem „Ab"-schalten des elektrischen
Signals führt.
Siehe 5.
- d) MAGNETISCHE PARTIKEL, DIE KRIECHSTRÖME INDUZIEREN: Ab-beschichtete, geladene,
magnetische Perlen fangen Probenanalyt. Der Sandwich-Komplex wird mit
Abs vervollständigt,
die mit Membranbestandteilen verknüpft sind, die ihrerseits zu
Domänen
quervernetzt sind (enthalten keine Kanäle). Die Anwendung von elektrischem
Feld oder magnetischem Feld beseitigt einen Teil der Biosensormembran über die
Domänen,
was zu einem elektrischen Kriechverlust führt. Siehe 4.
- e) MAGNETISCHE PARTIKEL, DIE IONENKANÄLE BESEITIGEN: Ab-beschichtete, geladene, magnetische
Perlen fangen Probenanalyt. Der Sandwich-Komplex wird mit Ab vervollständigt, der
in der Biosensormembran mit Gramicidin verknüpft ist. Die Anwendung von
elektrischem Feld oder Magnetfeld beseitigt das Gramicidin von der Biosensormembran,
was zu einem „Ab"-schalten des elektrischen
Signals führt.
Siehe 5.
- f) PERLEN, DIE IONENKANÄLE
IN DIE MEMBRAN EINFÜGEN:
Ab-beschichtete Perlen, die mit Gramicidinkanälen beschichtet sind, fangen
Probenanalyt. Der Sandwich-Komplex wird mit Abs vervollständigt, die
mit Membranbestandteilen verknüpft
sind (enthalten keine Kanäle).
Die Nähe der
Perlen zur Oberfläche
ermöglicht
die Insertion von Gramicidinkanälen
auf den Perlen in die Membran, was zur einer Leitung durch die Membran
führt.
Siehe 6.
-
4. Verfahren
zum Nachweis von PCR-Produkten
-
Proben-DNA
wird unter Verwendung der bekannten PCR-Technik amplifiziert, um
biotinylierte DNA zu erzeugen. Biotinylierte DNA wird zu einer Biosensormembran
durchgeleitet, die SA enthält,
das entweder mit Gramicidin allein oder mit Gramicidin und Membran übergreifenden
Lipiden verknüpft
ist, um direkt oder unter Verwendung von lateraler Trennung, jeweils
die Membran „auszuschalten". Siehe 7.
-
Beispiel 1: Herstellung
einer Sensormembran
-
Die
Struktur des Linkerlipids A ist in 8 dargestellt,
die Struktur des Linkers Gramicidin B ist in 9 dargestellt;
die Struktur des Membran übergreifenden
Lipids D ist in 10 dargestellt; die Struktur
des verwendeten, biotinylierten Gramicidin E, wobei n = 5, ist in 11 dargestellt.
-
Auf
diese Weise wird ein Glasobjektträger oder Kunststoffträger durch
Verdampfen mit einer 50 Ångström Chrom-Adhäsionsschicht
beschichtet, gefolgt von einer 200 nm (2.000 Ångström) Schicht aus Gold. Das mit
Gold beschichtete Substrat wird in eine ethanolische Lösung gegeben,
enthaltend Linkerlipid A (300 μl
einer 10 mM Lösung
in Ethanol), 2,2'-Ethanoldisulfid
(200 μl
einer 10 mM Lösung
in Ethanol), Linker Gramicidin B (100 μl einer 0,01 mg/ml Lösung in
Ethanol), Membran übergreifendes
Lipid D (225 μl einer
1 mM Lösung
in Ethanol) und Ethanol (50 ml). Das mit Gold beschichtete Substrat
sollte vorzugsweise innerhalb von fünf Minuten nach Herstellung
in diese Lösung
gegeben werden. Das mit Gold beschichtete Substrat wird 60 Minuten
in dieser Lösung gelassen
und dann mit Ethanol abgespült.
Der mit Gold beschichtete Objektträger wird dann in einem Elektrodenhalter
eingebaut, so dass eine Elektrode definiert wird, die für die derzeitigen
Beispiele einen Bereich von etwa 16 mm2 umfasst.
Dann werden 5 μl einer
Lösung
aus 1,2-Di-(3RS,7R,11R-phytanyl)-sn-glycero-3-phosphocholin und 1,2-Di-(3RS,7R,11R-phytanyl)glycerin
in einem Verhältnis
von 7 : 3, 14 mM Gesamtlipidkonzentration in Ethanol zu der Oberfläche der
Goldelektrode gegeben und dann mit zwei Waschgängen aus 500 μl Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung
(PBS) abgespült,
wobei 100 μl
PBS über
der Elektrodenoberfläche
zurückgelassen
werden. Die Menge an PBS, die über
der Elektrode zurückgelassen
wurde, beträgt vorzugsweise
weniger als oder ist gleich 100 μl.
Eine Gegenelektrode, typischerweise Silber, wird in die PBS-Lösung getaucht
und die Gegenelektrode und die Sensorelektrode werden mit einer
Impedanzbrücke
verbunden. Ein Gleichstrom-Offset von –300 mV wird während der
Wechselstrommessung an die Sensorelektrode angelegt. Die Elektrodenbaugruppe wird
auf 35°C
abgeglichen. Dies bildet die Sensormembran in dem Fall, wenn eine
Sonde verwendet wird, welche den elektrischen Leitwert der Membran erhöht.
-
Beispiel 2: Herstellung
einer Sondenlösung
-
Eine
Lösung
aus biotinyliertem Gramicidin E (1 μM) und Natriumdodecylsulfat
(10 μM)
in PBS wird in einem Ultraschallgerät mit Bad 20 Minuten mit Ultraschall
behandelt. Diese Lösung
kann für
mindestens 12 Monate bei 4°C
gelagert werden. Obwohl das Gramicidin mit Natriumdodecylsulfat
in wässriger
Lösung
stabil ist, wird das Gramicidin ohne weiteres in die Sensormembranen
eingebaut und erzeugt leitende Ionenkanäle. Diese Veränderung
der Leitfähigkeit kann
unter Verwendung der Impedanzspektroskopie überwacht werden.
-
Beispiel 3: Herstellung
eines mit Avidin beschichteten festen Trägers
-
Polystyrol-Wells,
wie sie bei der Herstellung von ELISA-Tests verwendet werden, werden
mit einer Lösung
aus Avidin (1 mg/ml) in PBS für
60 Minuten behandelt, und dann mit PBS dreimal gespült; man
lässt ablaufen
und füllt
dann mit 200 μl
PBS. Die Polystyrol-Wells sind nun mit Avidin beschichtet.
-
Beispiel 4: Detektion
von kleinem Analyt – d.
h. Biotin
-
Zwei
mit Avidin beschichtete Polystyrol-Wells werden wie in Beispiel
3 beschrieben hergestellt – Well
A und Well B. Zu Well A werden 5 μl einer Testlösung gegeben,
die den Analyten Biotin (1 mM in PBS) enthält, und 3 Minuten lang gemischt.
Zu Well B werden 5 μl
einer Testlösung
gegeben, die kein Biotin enthält,
und 3 Minuten lang gemischt. Zu beiden Wells A und B werden 2,5 μl der Sondenlösung, hergestellt
in Beispiel 2, gegeben und 5 Minuten lang gemischt. Es wurde gefunden,
dass in der Gegenwart von Analyt (d. h. Biotin) das Biotin mit dem
Rezeptor, der an den festen Träger,
in diesem Falle Avidin, gebunden ist, einen Komplex bildet und daher
das biotinylierte Gramicidin E daran hindert, einen Komplex mit
dem Avidin auf dem festen Träger zu
bilden, d. h. die biotinylierte Gramicidin E-Sonde verbleibt in
der PBS-Lösung.
In dem Fall, in dem kein Analyt (d. h. Biotin) in der Lösung anwesend
ist, bleiben die Rezeptorstellen des Avidins unkomplexiert und die
biotinylierte Gramicidin E-Sonde bildet einen Komplex an dem festen
Träger,
d. h. das biotinylierte Gramicidin E wird aus der Lösung entfernt.
Als nächstes
werden 100 μl
der Lösungen
aus Well A und aus Well B zu zwei getrennten Sensormembranen gegeben
und die Leitfähigkeit
der Membran wird unter Verwendung von Impedanzspektroskopie überwacht. 12 zeigt,
dass das Absinken der Impedanz, das durch die Zugabe der Lösung aus
Well A verursacht wird, größer und
schneller ist als das Absinken der Impedanz, das durch die Zugabe
der Lösung
aus Well B verursacht wird. So kann die Gegenwart oder Abwesenheit
des Biotinanalyts nachgewiesen werden. Die Menge an Biotin in der
Testlösung wird
offensichtlich die Anzahl der Bindungsstellen bestimmen, die das
Biotin auf dem Rezeptor auf dem festen Träger besetzt, was wiederum die
Anzahl an Sondenmoleküle
bestimmen wird, die in der Lösung verbleiben.
Die Geschwindigkeit der Veränderung der
Impedanzeigenschaften der Membran aufgrund der Sonde wird daher
proportional zur Analytkonzentration sein. Alternativ kann, wenn
die Anzahl an Sondenmolekülen
begrenzt ist, die absolute Anzahl an Sondenmolekülen, welche sich auf die Membran auswirken,
verwendet werden, um die Konzentration des Analyten zu bestimmen.
Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass es möglich ist, den elektrischen Leitwert
eines einzelnen Gramicidin-Ionenkanals in schwarzen Lipidmembranen
zu messen. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass der an
den festen Träger
gebundene Rezeptor ein Rezeptor wie ein Antiköper sein kann, der gegenüber einem
Analyten spezifisch ist, und dass das Gramicidin ein Analogon des
Analyten gebunden aufweisen kann, so dass das Gramicidin an den
verknüpften
Rezeptor über
das verknüpfte
Analytanalogon binden kann.
-
Beispiel 5: Detektion
von großem
Analyt – d.
h. biotinyliertem BSA
-
Zwei
mit Avidin beschichtete Polystyrol-Wells werden wie in Beispiel
3 beschrieben hergestellt – Well
C und Well D. Zu Well C werden 5 μl einer
Testlösung
gegeben, die den Analyten biotinyliertes Rinderserumalbumin (BSA)
(1,3 mg/ml in PBS) enthält,
und 10 Minuten lang gemischt. Zu Well D werden 5 μl einer Testlösung gegeben,
die kein biotinyliertes BSA enthält,
und 10 Minuten lang gemischt. Zu beiden Wells C und D werden 2,5 μl der Sondenlösung, hergestellt
in Beispiel 2, gegeben und 10 Minuten lang gemischt. Es wird erwartet,
dass in Gegenwart des Analyten, d. h. biotinyliertem BSA, das biotinylierte
BSA mit dem Rezeptor, der an den festen Träger, in diesem Falle Avidin,
gebunden ist, einen Komplex bildet und daher das biotinylierte Gramicidin
E daran hindert, einen Komplex mit dem Avidin auf dem festen Träger zu bilden,
d. h. die biotinylierte Gramicidin E-Sonde verbleibt in der PBS-Lösung. In
dem Fall, in dem kein Analyt (d. h. biotinyliertes BSA) in der Lösung anwesend
ist, bleiben die Rezeptorstellen des Avidins unkomplexiert und die
biotinylierte Gramicidin E-Sonde bildet einen Komplex an dem festen
Träger,
d. h. das biotinylierte Gramicidin E wird aus der Lösung entfernt.
Als nächstes
werden 100 μl
der Lösungen
aus Well C und aus Well D zu zwei getrennten Sensormembranen gegeben
und die Leitfähigkeit
der Membran wird unter Verwendung von Impedanzspektroskopie überwacht. 13 zeigt,
dass das Absinken der Impedanz, das durch die Zugabe der Lösung aus
Well C verursacht wird, größer und
schneller ist als das Absinken der Impedanz, das durch die Zugabe
der Lösung
aus Well D verursacht wird. So kann die Gegenwart oder Abwesenheit
des biotinylierten BSA-Analyten nachgewiesen werden.
-
Beispiel 6: Detektion
von großem
Analyt – d.
h. Ferritin
-
Es
wurden die Polystyrol-Wells verwendet, die mit einem Anti-Ferritin-Antikörper aus
einem kommerziell erhältlichen
ELISA-Kit für
Ferritin (Bioclone Australia Pty. Ltd., Marrickville NSW 2204 Elegance Amplified
Elisa System, Cat. No. FEA-96) beschichtet waren. Zu einem Well
(Well E) wurden 200 μl
500 nM Ferritin gegeben, zu dem anderen Well (Well F) wurden 200 μl PBS ohne
den Ferritin-Analyten gegeben. Beide Wells wurden sechs Minuten
gemischt und dann dreimal mit 400 μl PBS gewaschen. Anschließend wurden
200 μl biotinylierte
Anti- Ferritin-Antikörperlösung aus
dem ELISA-Kit zu jedem Well gegeben und für 3 Minuten gemischt. Die Wells wurden
dreimal mit 400 μl
PBS gespült
und 200 μl
einer Lösung
von 0,025 mg/ml Avidin in PBS wurden zu beiden Wells gegeben und
für 5 Minuten
gemischt. Die Wells wurden dreimal mit 400 μl PBS gespült und 200 μl PBS wurden in beiden Wells
zurückgelassen. Zu
beiden Wells wurden 2,5 μl
der Sondenlösung
aus biotinyliertem Gramicidin E/Natriumdodecylsulfat, hergestellt
in Beispiel 2, gegeben und 5 Minuten lang gemischt. Als nächstes wurden
100 μl der
Lösungen aus
Well E und aus Well F zu zwei getrennten Sensormembranen gegeben,
hergestellt wie in Beispiel 1. Die Veränderung der Impedanz aufgrund
der Zugabe der Sondenlösung
wurde mittels Impedanzspektroskopie überwacht. 14 zeigt
deutlich, dass es ein größeres und
schnelleres Absinken der Impedanz aufgrund der Sondenlösung in
Abwesenheit von Ferritin aus der Testlösung gibt als in Gegenwart von
Ferritin in der Testlösung.
Wie ohne weiteres erkannt wird, kann die Geschwindigkeit der Veränderung
und die Amplitude verwendet werden, um die Konzentration von Ferritin
in einer Analytprobe zu bestimmen.
-
Wie
aus der oben stehenden Beschreibung offensichtlich wird, beschreibt
die vorliegende Erfindung Vorrichtungen und Verfahren, welche in
aktuelle Nachweisverfahren für
auf Antikörper
oder DNA basierende Techniken eingebaut werden können. Die Erfindung verwendet
die in verschiedenen Patenten (z. B. PCT/AU88/00273, PCT/AU89/00352, PCT/AU90/00025,
PCT/AU92/00132, PCT/AU93/00590, PCT/AU93/00620 oder PCT/AU94/00202)
beschriebenen Sensormembranmaterialien als Nachweismaterial. Die
Sensormembran kann in einstufige Vorrichtungen eingebaut werden
oder in herkömmlichen,
vielstufigen Prozessen verwendet werden, um die Enzym-, chemilumineszenten,
fluoreszenten oder radioaktiv markierten Sonden, die aktuell für den Nachweis
von Endprodukt verwendet werden, zu ersetzen. Die Arten der Sonden,
welche an Moleküle
geknüpft
werden können,
die in der letzten Stufe von auf Antikörpern oder DNA basierenden
Techniken verwendet werden, umfassen jegliche Spezies, die eine
Veränderung
der Leitfähigkeit
durch die Membran verursachen können.
-
Zum
Beispiel können
Sonden wie Ionenkanäle
sich selbst in die Membran einfügen
und einen Ionenfluss durch eine isolierende Membran ermöglichen. Andere
Sonden können
Kriechstrecken durch isolierende Membranen verursachen, indem sie
spezifisch an Stellen auf der Membran binden und entweder eine Phasentrennung
oder eine Aggregation von Molekülen,
die Auflösung
der Membran oder die Entfernung eines Teils der Membran induzieren.
-
Andere
Sonden können
den Ionenfluss durch den Kanal durch Wechselwirkung mit bereits
in der Membran vorhandenen Ionenkanälen vermindern. Zum Beispiel
wird die Verwendung von Streptavidin oder Avidin als Sonde für die Wechselwirkung mit
Membranen, die biotinyliertes Gramicidin enthalten, den Ionenfluss
durch die Membran vermindern.
-
Die
Wirkung auf die Membran kann verstärkt werden durch die Verwendung
von Multisonden wie Latex- oder Polystyrolperlen mit einer großen Anzahl an
Streptavidinen, die an sie gebunden sind, um den Ionenfluss zu vermindern,
oder an Ionenkanäle
gebunden, um den Ionenfluss durch die Membran einzuschließen.
-
Die
Vorteile der Sensormembran als Nachweismechanismus in auf Antikörpern oder
DNA basierenden Techniken sind die Geschwindigkeit und die Einfachheit
der Ablesungen. Ionenflussveränderungen
können
durch Impedanzveränderungen
bei einer Vielzahl von Frequenzen oder bei einer einzelnen Frequenz
gemessen werden. Einzelkanal-Messungen von Gramicidin, zum Beispiel,
werden routinemäßig unter
Verwendung von schwarzen Lipidmembranen ausgeführt und bieten das Potenzial
für äußerst empfindliche
Messungen. Impedanzmessungen erfordern eine einfache Computerausstattung,
welche auch bezüglich
der Größe auf tragbare Abmessungen
reduziert werden kann. Reagenzien sind vereinfacht und sind nicht
auf Farbveränderungen
oder lichtemittierende Spezies für
den Nachweis angewiesen.