JP2005233977A - 検出装置及び方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、アナライト検出装置を与える。該装置は、第一及び第二の区域、第一区域にプローブの添加をすることのできる手段、アナライトの含有が疑われるサンプルを添加することのできる手段及び第一区域から第二区域へプローブを通過させることのできる手段を備える。第一区域はアナライトに対して反応性の配位子を含み、第二区域はそのインピーダンスがプローブの存在の有無に依存する膜と膜のインビーダンスを測定するための手段を含む。プローブがイオノホア、好ましくはグラミシジンを含むことが好ましい。本発明はまた、アナライトの存在の検出方法にも関する。
【選択図】 なし
Description
アナライトに対して反応性の配位子を含む膜;
膜のインピーダンスを測定する手段;
配位子に結合したアナライトを移動させ、配位子のアナライトとの結合を切断することなく膜から離間させるための手段;
からなるアナライト検出装置からなり、アナライトを膜から離間させる動作によって膜のインピーダンスに変化が生じる。
-Ab-Ag-Abサンドウィッチとともに用いる
a) 直接検定:検定装置にサンプルを加える。キャピラリ動作によってサンプルをプローブで標識されたAbと接触させる。さらに移動させることによってAg-Ab錯体が、Ag-Ab錯体を捕捉するキャピラリ壁上に固定された第二のAbに結合可能となる。アナライトがない場合、プローブで標識された第二のAbがバイオセンサー膜に拡散し、ここで膜のインピーダンスに変化が起こる(図1 )。
例えばAbにカップリングしたポリエステルビーズ等を入れたビーズカラム。アナライトもしくはアナライト類似物とストレプタビジンとが共有結合的に結合した共役体が、Abに結合している。アナライトを含有するサンプルが導入された際、アナライトがSA/アナライト共役物よりも速く、SAを放出させる。SAはバイオセンサー膜中でビオチニル化グラミシジンと結合し、インピーダンスシグナルを変化させる(図2)。1で既述のキャピラリー法にもまた使用可能である。当業者によれば、こうした配列をSA以外の標識(プローブ)と用いることも容易に認識される。例えばSAは、ハプテンと置き換えることができ、膜中のグラミシジンはビオチニル化されずハプテンの受容体に結合する。
a) 側方偏析;
Ab被覆したビーズがサンプルアナライトを捕捉する。サンドウィッチ錯体はグラミシジンに結合したAb及び膜スパン脂質で完全化され、チャンネルの側方偏析を引き起こし、これによってインピーダンスに変化が生じる(図3参照)。
ビオチニル化-DNAを生成させるための既知のPCR技術を用いてサンプルDNAを増幅する。ビオチニル化-DNAをグラミシジンのみか、グラミシジン及び膜スパン脂質のいずれかに結合したSAを含有するバイオセンサー膜に通し、直接か側方偏析をそれぞれ用いて膜を“消す”。図7参照。
リンカー脂質Aの構造を図8に、リンカーグラミシジンBの構造を図9に、膜スパン脂質Dの構造を図10に、使用されるグラミシジンEで、n=5のものの構造を図11に示した。
アビジンで被覆したポリスチレンウェル二つ-ウェルA及びウェルB-を実施例3に記載した通り調製した。ウェルAにアナライトビオチンを含む試験溶液5ul (PBS中1mM)を添加し、3分間混合した。ウェルBにはビオチンを含まない試験溶液5ulを添加し、3分間混合した。AとB双方のウェルに実施例2で調製したプローブ溶液2.5ulを添加し、5分間混合した。アナライト(すなわちビオチン)が存在する場合、ビオチンは固体サポートに結合した受容体と錯化しており、したがってビオチニル化したグラミシジンEの固体サボート上、すなわちPBS溶液中に残るビオチニル化したグラミシジンEプローブ上でのアビジンと錯化が阻止されていることが見出された。アナライト(すなわちビオチン)が溶液中に存在しない場合、アビジンの受容体部分は錯化されずにビオチニル化したグラミシジンEプローブが固体サポートと錯化し、すなわちビオチニル化したグラミシジンEが溶液から除去される。次に、ウェルAからとウェルBからの溶液100ulを二つの別の感知膜に添加し、インピーダンス分光を用いて膜の伝導を監視した。図12には、ウェルAからの溶液の添加によって起こるインピーダンスの低下は、ウェルBからの溶液の添加によって起こるインピーダンスの低下よりも大幅で速いことが示されている。したがって、ビオチンアナライトの存在の有無を検出することができる。試験溶液中のビオチンの量により、固体サポート上の受容体においてビオチンが占める結合部分の数が明らかに決定され、逆に溶液中に残るプローブ分子の数も決定される。したがって、膜のインピーダンス特性のプロープによる変化の率は、アナライト濃度に比例する。あるいはまた、プローブ分子の数が限定されている場合、膜に影響するプローブ分子の厳密な数を用いてアナライト濃度を決定することができる。当業者には、黒膜中の単一のグラミシジンイオンチャンネルの伝導度が測定可能であることが既知である。当業者には、固体サポートに結合した受容体は、アナライトに特定の抗体等の受容体であってよく、グラミシジンにアナライトの類似体が固定され、グラミシジンが、結固定されたアナライト類似体を経て固定された受容体に結合するとよいことが認識されるであろう。
アビジンで被覆したポリスチレンウェル二つ-ウェルC及びウェルD-を実施例3に記載した通り調製した。ウェルCにアナライトビオチニル化したウシの血漿アルブミン(BSA)を含む試験溶液5ul(PBS中1.3mg/ml)を添加し、10分間混合した。ウェルDにはビオチニル化したBSAを含まない試験溶液5 ulを添加し、10分間混合した。CとD双方のウェルに実施例2で調製したプローブ溶液2.5ulを添加し、10分間混合した。アナライト(すなわちピオチニル化BSA)が存在する場合、ビオチニル化BSAは固体サポートに結合した受容体と錯化しており、したがってビオチニル化したグラミシジンEの固体サポート上、すなわちPBS溶液中に残るビオチニル化したグラミシジンEプローブ上でのアビジンとの錯化が阻止されていることが予期される。アナライト(すなわちビオチニル化BSA)が溶液中に存在しない場合、アビジンの受容体部分は錯化されずにビオチニル化したグラミシジンEプローブが固体サポートと錯化し、すなわちビオチニル化したグラミシジンEが溶液から除去される。次に、ウェルCからとウェルDからの溶液100ulを二つの別の感知膜に添加し、インピーダンス分光を用いて膜の伝導度を監視した。図13には、ウェルCからの溶掖の添加によって起こるインピーダンスの低下は、ウェルDからの溶液の添加によって起こるインピーダンスの低下よりも大幅で速いことが示されている。こうして、ビオチニル化BSAアナライトの存在の有無を検出することができた。
フェリチンとして市販のELISAキット(Bioclone Australia Pty,Ltd., Marrickville NSW 2204,Elegance Amplified Elisa System,Cat.No.FEA-96 )由来の抗フェリチン抗体で被覆したポリスチレンウェルを使用した。一方のウェル(ウェルE)には500nMフェリチン200ulを添加し、他方のウェル(ウェルF)にはフェリチンアナライトを添加していないPBS200ulを添加した。双方のウェルを6分間混合し、PBS400ulで3度洗浄した。ELISAキット由来のビオチニル化抗フェリチン抗体溶液200ulを各ウェルに添加し、3分間混合した。ウェルをPBS400ulで3度濯ぎ、PBS中のアビジン0.025mg/mlを200ulを双方のウェルに添加し、5分間混合した。ウェルをPBS400ulで3度濯ぎ、PBS200ulを双方のウェルに残した。双方のウェルに、実施例2で調製したビオチニル化したグラミシジンE/ドデシル硫酸ナトリウムのプローブ溶液2.5ulを添加し、5分間混合した。次に、ウェルEからとウェルFからの溶液100ulを実施例1で準備したように二つの感知膜に添加した。インピーダンス分光を用いてプローブ溶液の添加によるインピーダンスの変化を監視した。図14には、試験溶液由来のフェリチンが存在しない場合のプローブ溶液によるインピーダンスの低下は、試験溶液中にフェリチンが存在する場合よりも大幅で速いことが明らかに示されている。容易に認識されるとおり、変化率及び範囲を用いてアナライトサンプル中のフェリチン濃度を決定することが可能である。
Claims (8)
- アナライトに対して反応性である配位子を含む膜;
膜のインピーダンスを測定する手段;及び
配位子に結合したアナライトを移動させ、配位子とアナライトとの結合を切断することなく膜から離間させる手段;
からなり、アナライトが移動し膜から離間することによって膜のインピーダンスに変化が生じるアナライト検出装置。 - アナライトが、多数の第二の配位子を経て担体に結合している請求項1に記載のアナライト検出装置。
- 担体がビーズ、もしくは荷電したまたは磁性の粒子である請求項2に記載のアナライト検出装置。
- アナライトを移動させる手段が、電界、磁界もしくは液流からなる請求項1から3のいずれか一項に記載のアナライト検出装置。
- 膜配位子が膜のアンフィフィルに結合し、アナライトの移動によって膜から配位子及び結合したアンフィフィルが抽出される配位子請求項1から4のいずれか一項に記載のアナライト検出装置。
- 膜配位子が膜内でイオノホアに結合し、アナライトの移動によって膜から配位子及び結合したアンフィフィルが抽出される配位子請求項1から4のいずれか一項に記載のアナライト検出装置。
- イオノホアがグラミシジンである請求項6に記載のアナライト検出装置。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の検出装置にサンプルを添加し、膜のインピーダンスを測定することからなるサンプル中のアナライトの存在の検出方法。
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