JP3786694B2 - 検出装置及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、サンプル中のアナライトの検出のための装置及びサンプル中のアナライトの存在を検出する方法に関する。
診断の分野で用いられている現行の技術では、アナライトの検出に大きく高価な部品が必要である。例えば、免疫検定にはガンマ検出機、分光光度計、レーザー等が必要であり、ＰＣＲ処理の後のＤＮＡ検出には電気泳動と吸収法が必要であり、これら全てが、シグナル増幅に使用される特定のプローブによるものである。単純な単一段階の検定のために設計され、様々な反応と必要な洗浄段階とを実行するために領域分割を利用する多数の装置が、文献に記載されている。例えば、Unipath社の“Clearblue One-Step”等の抗体ベースの試験では、尿を吸収する芯を用い、その後尿はペン状装置を長方向に移動する。ホルモンｈＣＧは、ｍＡｂがカップリングした可動ブルーラテックス粒子を含有する第一層によって捕捉される。尿の流れがラテックス及び結合したｈＣＧを、ホルモン上の第二のエピトープ部位を認識する固定されたｍＡｂを含む第二領域に運搬する。不連続な青色線に示されるように、ラテックスに結合したあらゆるｈＧＣが第二領域の通過をし続けることが阻害される。ｈＧＣが無いことによりラテックスが第３領域へ移動し、固定されたアンチＦｃ抗体に捕捉される。他の廃棄可能な装置では液体操作スウィッチ（M.R. Walker and R.Rapley, John Wiley and sons編、“Molecular and Antibody Probes in Diagnosis”,1993年のA.P.H. Farnsworthによる第１２章の図１２．７に示される）を使用してＥＬＩＳＡタイプの処理における連続的な段階を実行する。ＤＮＡベースの技術ではＰＣＲ技術に要する多数の段階を実行するための製品が頒布されており、単一の廃棄装置における様々な段階を区分することによって、単純になり、またＰＣＲ製品の相互汚染が減少している。
国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８８／００２７３号、ＰＣＴ／ＡＵ８９／００３５２号、ＰＣＴ／ＡＵ９０／０００２５号、ＰＣＴ／ＡＵ９２／００１３２号、ＰＣＴ／ＡＵ９３／００５９０号、ＰＣＴ／ＡＵ９３／００６２０号及びＰＣＴ／ＡＵ９４／００２０２号には、アナライトの検出に用いられるバイオセンサーが開示されている。これらの文献の記載を多面的参照のためここに取り込む。
これらのバイオセンサー及び既存の診断技術を適合させることにより、検出装置及び検出方法の向上が達成されると信じられている。
このように、本発明の第一の態様は、第一及び第二の区域、第一区域へのプローブの添加を可能にする手段、第一区域へのアナライトの含有が疑われるサンプルの添加を可能にする手段及び第一区域から第二区域へのプローブの通過を可能にする手段を備えたアナライト検出装置であり、第一区域にはアナライトに対して反応性の配位子が含まれ、第二区域にはそのインピーダンスがプローブの存在の有無に依存する膜、さらに膜のインピーダンスを測定する手段が含まれるアナライト検出装置である。
第一区域へのプローブ及びサンプルの添加を可能にする手段は同一でも異なってもよい。
本発明の好ましい実施態様においては、プローブにイオノホア、好ましくはグラミシジンが含まれる。
本発明のさらに好ましい実施態様においては、膜に、近接してパックされた両親媒性分子の列の第一及び第二の層、及び第一および第二の半膜スパンモノマーを含む多数のイオノホアが含まれ、第一の半膜スパンモノマーが第一の層中に、第二の半膜スパンモノマーが第二の層中に、第二の半膜スパンモノマーが第一の半膜スパンモノマーに対して独立の第二の層内に側方拡散することができ、第一の半膜スパンモノマーが第一層中で側方拡散することが阻止され、第二の配位子が少なくとも第二の半膜上に配設され、前記第二の配位子はプローブもしくはその一部に対して反応性であり、プローブが第二の配位子に結合していることにより、第一の半膜スパンモノマーと第二の半膜スパンモノマーとの間の関係が変化してイオンがイオノホアを経て膜を通過して流れるか、この流れが阻止され、膜のインピーダンスが測定される。
さらに別の好ましい実施態様においては、第一区域の配位子が抗体もしくはその結合フラグメントである。
第二の態様においては、本発明はサンプル中のアナライトの検出方法からなり、この方法はアナライトに対して反応性の第一の配位子を多数含む担体と接触させて担体配位子にアナライトを結合させ、担体を、近接してバックされた両親媒性分子の列の第一及び第二の層と第一および第二の半膜スパンモノマーを含む多数のイオノホアとを含む膜と接触させることからなり、第一の半膜スパンモノマーは第一層中に配設され、第二の半膜スパンモノマーは第二層中に配設され、第二の半膜スパンモノマーは第一の半膜スパンモノマーに対して独立の第二の層内に側方拡散することができ、第一の半膜スパンモノマーが第一層中で側方拡散することが阻止され、第二の配位子が少なくとも第二の半膜上に配設され、前記第二の配位子はプローブもしくはその一部に対して反応性であり、プローブが第二の配位子に結合していることにより、第一の半膜スパンモノマーと第二の半膜スパンモノマーとの間の関係に変化が起こり、イオンはイオノホアを経て膜を通過して流れるか、この流れが阻止され、膜のインピーダンスが測定される。
第一層中の第一の半膜スパンモノマーの側方拡散を、数多くの既知の技術の何れを用いて阻止してもよいが、現在ではモノマーと両親媒性分子のそれぞれが、他方の分子の少なくとも一の対応する部分と架橋した少なくとも一の部分を含むか、これによって修飾されていることが好ましい。ＵＶ光線もしくは電離照射線等の適切な刺激の下、架橋可能な部分を重合化させることが可能であり、これによって膜が一つの層内で架橋することになる。
第一の半膜スパンモノマーでもまた、膜の第一層に室温で結晶化する脂質を選択することにより側方拡散が阻止されている。
本発明のさらに好ましい実施態様においては、第一層中の第一半膜スパンモノマーでは第一層と層中のモノマーを固体サポートに固定することによって側方拡散が阻止されている。これは、固体サポートに対して反応性である第一層中及び層中のモノマー上の両親媒性分子上に官能基を与えることによって達成することができる。
本発明の別の好ましい形態では、両親媒性分子の一部が膜スパンアンフィフィル（amphiphile）であり、膜スパンアンフィフィルが古細菌性脂質もしくは末端同士が化学的に結合した二層アンフィフィルである。半膜スパンモノマーがグラミシジンモノマーであることもまた好ましい。
さらに別の好ましい実施態様においては、膜には膜中のアンフィフィル、好ましくは膜スパンアンフィフィルに結合した第三の配位子が多数含まれる。これら第三の配位子の膜中に側方拡散することが、阻止されていることが好ましい。本発明の第一の態様の装置においては、これら第三の配位子はプローブもしくはその一部に対して反応性となる一方で、本発明の第二の態様である方法においては、これらはアナライトに対して反応性となる。
配位子は同一でも異なってもよく、好ましくはポリクローン性もしくは単一クローン性抗体、少なくとも一のＦａｂフラグメント、抗原、レクチン、ハプテン、キレート剤及び染料を含む抗体フラグメントからなる群より選択されることが好ましい。
配位子は、イオノホア及び／またはリンカーを経て膜に結合していることが好ましい。適切なリンカーについては、ＰＣＴ／ＡＵ９０／０００２５号、ＰＣＴ／ＡＵ９２／００１３２号及びＰＣＴ／ＡＵ９３／００５０９号に記述がある。
当業者は認識するであろうが、リザーバーが電極と膜との間となるように膜が電極に結合していることが好ましい。この状態を容易に達成するための分子及び方法についてはＰＣＴ／ＡＵ９３／００５０９号に記述がある。上述したように、これらの文献の記載を多面的参照のために取り込む。
本発明の第三の態様は、
アナライトに対して反応性の配位子を含む膜；
膜のインピーダンスを測定する手段；
配位子に結合したアナライトを移動させ、配位子のアナライトとの結合を切断することなく膜から離間させるための手段；
からなるアナライト検出装置からなり、アナライトを膜から離間させる動作によって膜のインピーダンスに変化が生じる。
本発明のこの点について好ましい実施態様では、アナライトは多数の第二の配位子を経て担体に結合している。担体がビーズもしくは荷電したまたは磁性の粒子であることが好ましい。
好ましい実施態様では、アナライトを移動させる手段には電解、磁界もしくは液流を含む。
別の好ましい実施態様においては、膜配位子が膜のアンフィフィルに結合し、アナライトの移動により、配位子及び結合したアンフィフィルが膜から抽出される。
さらに別の好ましい実施態様においては、膜配位子が膜内でイオノホアに結合し、アナライトの移動により、配位子及び結合したアンフィフィルが膜から抽出される。イオノホアがグラミシジンであることが好ましい。
第四の態様においては、本発明はサンプル中のアナライトの存在の有無を決定する方法からなり、この方法は本発明の第一もしくは第三の態様の装置にサンプルを添加し、膜の伝導度及びキャパシタンスの変化を測定することからなる。
本発明の好ましい実施例においては、膜は国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８８／００２７３号、ＰＣＴ／ＡＵ８９／００３５２号、ＰＣＴ／ＡＵ９０／０００２５号、ＰＣＴ／ＡＵ９２／００１３２号、ＰＣＴ／ＡＵ９３／００５９０号、ＰＣＴ／ＡＵ９３／００６２０号もしくはＰＣＴ／ＡＵ９４／００２０２号に記載のものである。
本発明の本質がより明確に理解されるように、その好ましい形態を以下の実施例及び図面を参照してここに記述する。
図１ａは、本発明のアナライト検出装置の実施態様を図示したものである。
図１ｂは、図１ａのＢ部分の拡大図である。
図２は、本発明のアナライト検出装置の別の実施態様を図示したものである。
図３は本発明の方法の実施態様を図示したものである。
図４ａ及び４ｂは、本発明の検出装置の実施態様を図示したものである。
図５ａ及び５ｂは、本発明の検出装置の別の実施態様を図示したものである。
図６は、本発明の方法と装置の別の実施態様を図示したものである。
図７ａ及び７ｂは、ＤＮＡの検出に使用される本発明の実施態様を図示したものである。
図８は、リンカー脂質Ａの構造を示したものである。
図９は、リンカーグラミシジンＢの構造を示したものである。
図１０は、膜スパン脂質Ｄの構造を示したものである。
図１１は、ビオチニル化したグラミシジンＥの構造を示したものであり、ｎ＝５の場合である。
図１２は、実施例４におけるインピーダンス測定である。
図１３は、実施例５におけるインピーダンス測定である。
図１４は、実施例６におけるインピーダンス測定である。
図１ａに示したように、装置１０は二つの区域１２及び１４からなる。区域１２にはアナライト１８に対して反応性の配位子１６が配設されている。プローブ２０はアナライト１８に対して反応性の配位子２２及びマーカー２４からなる。
区域１４には感知膜２６が含まれる。膜２６は両親媒性分子２８及びイオノホア３０及び３２を含む。イオノホア３０にはマーカー２４に対して反応性の配位子３４が含まれる。
操作においては、アナライト１８の含有が疑われるサンプルを区域１２に添加する。プローブ２０もまた区域１２に添加する。図１ａに示される状況では、アナライト１８が配位子１６に結合し、ここに固定されている。プローブ２０の配位子２２もまたアナライト１８と結合し、これによってプローブを固定する。したがって、プローブ２０は、感知膜１６を含む区域１４へ移動することができない。アナライトが存在しない場合、プローブ２０は区域１４及び感知膜２６へ自由に移動することができる。感知膜２６に到達すると、マーカー２４は、膜のインピーダンスの変化を起こす配位子３４に結合する。
図２にはアナライト検出装置の別の実施態様が示されている。アナライト検出装置４０には区域４２及び４４が含まれる。区域４２には担体４６が含まれ、ここにはアナライト５０に対して反応性の配位子４８が結合している。図２に示されるように、区域４２にはまたアナライト５０及びマーカーＳＡ（ストレプタビジン）からなるプローブ５２が含まれる。区域４４には感知膜５４及び電極５５が含まれる。感知膜５４は、アンフィフィル５６、イオノホア５８及び、イオノホア５８とアンフィフィル５６にそれぞれ結合した配位子６０及び６２を具備する。
操作として、アナライト５０を区域４２に添加する。アナライト５０は、プローブ５２のアナライト５０成分と競争して配位子４８と結合する。図２に示されるように、この結果としてストレプタビジンを含むプローブ５２が放出される。プローブ５２は区域４４及び感知膜５４に達する。ストレプタビジンは、感知膜５４のインピーダンスに変化を起こす配位子６０及び６２に結合する。添加したサンプルにアナライト５０が含まれていなければ、プローブ５２が放出されたり、ストレプタビジンが感知膜５４に達することがないのは明らかである。
図３には本発明の方法の実施態様が示されている。この方法では、アンフィフィル７２及びイオノホア７４と７６及び電極７１を具備する感知膜７０が使用される。アナライト８２に対して反応性である配位子７８及び８０が、それぞれイオノホア７６及びアンフィフィル７２に結合している。アナライト８２に対して反応性である配位子８４を多数備えた担体ビーズ８６もまた配設されている。担体ビーズ８６に結合したアナライト８２の、配位子８４を経た配位子７８及び８０との結合によって膜７０のインピーダンスに変化が生じる。
図４には本発明の装置の実施態様の操作が図式的に示されている。図４ａに示されるように、アナライト９２は配位子９１を経て担体９０に結合している。アンフィフィル９５及びイオノホア９６及び電極９９を具備する感知膜９４もまた配設されている。アナライト９２は、配位子９３を経て感知膜９４に結合している。図４ｂにおいては、担体９０、及びアナライト９２が移動して感知膜９４から離間する。これは電界、磁界もしくは液流による力の適用によって達成することができる。粒子９０の動作によって、感知膜９５のセグメント９７の抽出が起きる。これによってイオンの膜を通過する能力が向上し、結果として感知膜９４のインピーダンスに変化を生じる。
図５には、図４に示されるものに代わる実施態様が示されている。この配置では、担体９０が移動して膜から離間することにより、イオノホア９８が膜から抽出される。これらイオノホアの除去によりイオンが膜を通過する能力は低下し、これによって膜のインピーダンスに変化が生じる。
図６には、図３に示されるものに代わる実施態様が示されている。この実施態様では、アンフィフィル１２２、イオノホア１２４及びアナライト１３０に対して反応性である配位子１２６を具備する感知膜１２０が与えられている。電極１２１もまた配設されている。アナライト１３０に対して反応性の多数の配位子１３２及び多数のイオノホア１３４を備えた担体ビーズ１２８もまた配設されている。アナライト１３０の配位子１２６及び１３２との結合により、イオノホア１３４が膜内に挿入され、これによって膜１２０のインピーダンスに変化が起きる。
図７は、ＤＮＡ検出を図式的に表示したものである。図７ａには、アンフィフィル１０２及びイオノホア１０４及び１０６及び電極１０１から構成される感知膜１００が示されている。ストレプタビジン（ＳＡ）は、アンフィフィル１０２及びイオノホア１０６に、それぞれリンカー１０８及び１１０を経て結合している。図７ｂに示されるように、ＤＮＡ１１２上のビオチン１１４はストレプタビジンに結合しており、これが膜のゲート開閉（gating）を引き起こし、その結果膜１００のインピーダンスの変化をもたらす。
図７の表示は、認識されるごとく、ビオチン標識したＤＮＡ官能基をプローブとする本発明の装置の第二区域の実施態様である。
当業者には認識されるであろうが、本発明は一般的に、例えば下記に適用される。
１．一般的な均質キャピラリ／カラムセンサー
-Ａｂ-Ａｇ-Ａｂサンドウィッチとともに用いる
ａ） 直接検定：検定装置にサンプルを加える。キャピラリ動作によってサンプルをプローブで標識されたＡｂと接触させる。さらに移動させることによってＡｇ-Ａｂ錯体が、Ａｇ-Ａｂ錯体を捕捉するキャピラリ壁上に固定された第二のＡｂに結合可能となる。アナライトがない場合、プローブで標識された第二のＡｂがバイオセンサー膜に拡散し、ここで膜のインピーダンスに変化が起こる（図１）。
検出プローブは、二層膜への混入もしくは増加の際に、インピーダンスの変化（シグナルの増加であるか減少であるかに関わらず）を示すものならばいかなるものであってもよい。検出プローブの実施例には、ストレプタビジン、グラミシジン、グラミシジン／洗剤（例えば、ＳＤＳ、オクチルグリコシド）、アグリゲート、グラミシジン／小胞、グラミシジン／ポリスチレンビーズ等が含まれる。プローブがストレプタビジンである場合、膜はビオチニル化グラミシジンを含み、プローブがグラミシジンを含む場合、膜は最初、グラミシジンを全く含まない。プローブが抗体である場合、膜にはグラミシジン-ハプテンもしくはグラミシジン-抗原の共役体が含まれる。
ｂ）比較検定：サンドウィッチがＡｂ-ＡｇもしくはＡｇ類似-Ａｂの間で行われること以外はａ）に記載の通り。サンプルを導入された際、サンプル中のアナライトが標識された第二のＡｂよりも速く、バイオセンサー膜にインピーダンスの変化を生じる。
２．ストレプタビジンセンサー
例えばＡｂにカップリングしたポリエステルビーズ等を入れたビーズカラム。アナライトもしくはアナライト類似物とストレプタビジンとが共有結合的に結合した共役体が、Ａｂに結合している。アナライトを含有するサンプルが導入された際、アナライトがＳＡ／アナライト共役物よりも速く、ＳＡを放出させる。ＳＡはバイオセンサー膜中でビオチニル化グラミシジンと結合し、インピーダンスシグナルを変化させる（図２）。１で既述のキャピラリー法にもまた使用可能である。当業者によれば、こうした配列をＳＡ以外の標識（プローブ）と用いることも容易に認識される。例えばＳＡは、ハプテンと置き換えることができ、膜中のグラミシジンはビオチニル化されずハプテンの受容体に結合する。
３．Ａｂビーズ共役体を備えたＡｂ-Ａｇ-Ａｂサンドウィッチの検出方法
ａ） 側方偏析；
Ａｂ被覆したビーズがサンプルアナライトを捕捉する。サンドウィッチ錯体はグラミシジンに結合したＡｂ及び膜スパン脂質で完全化され、チャンネルの側方偏析を引き起こし、これによってインピーダンスに変化が生じる（図３参照）。
ｂ） 流れの漏出を誘発する大きな粒子；
Ａｂ-被覆した大きなビーズがサンプルアナライトを捕捉する。サンドウィッチ錯体はそれ自体ドメインに架橋した膜成分に結合したＡｂで完全化される（膜にはチャンネルが含まれなくてもよい）。液流を高速で適用することによって、バイオセンサー膜の一部がドメインを経て除去され、電気漏出が生じる。図４参照。
ｃ） イオンチャンネルを除去する大きな粒子；
Ａｂ-被覆した大きなビーズがサンプルアナライトを捕捉する。サンドウィッチ錯体はバイオセンサー膜中のグラミシジンに結合したＡｂで完全化される。液流を高速で適用することによって、バイオセンサー膜からグラミシジンが除去され、電気シグナルが“消える”。図５参照。
ｄ） 流れの漏出を誘発する磁性の粒子；
Ａｂ-被覆した荷電した磁性ビーズがサンプルアナライトを捕捉する。サンドウィッチ錯体はそれ自体ドメインに架橋した膜成分に結合したＡｂで完全化される（チャンネルが含まれない）。電界もしくは磁界の適用によって、バイオセンサー膜の一部がドメインを経て除去され、電気漏出が生じる。図４参照。
ｅ） イオンチャンネルを除去する磁性粒子；
Ａｂ-被覆した荷電した磁性ビーズがサンプルアナライトを捕捉する。サンドウィッチ錯体はバイオセンサー膜中のグラミシジンに結合したＡｂで完全化される。電界もしくは磁界の適用によって、バイオセンサー膜からグラミシジンが除去され、電気シグナルが“消える”。図５参照。
ｆ） 膜内にイオンの流れを挿入するビーズ；
グラミシジンチャンネルで被覆したＡｂ-被覆したビーズがサンプルアナライトを捕捉する。サンドウィッチ錯体は膜中の成分に結合したＡｂで完全化される（イオンチャンネルを含まない）。ビーズが表面に近接していることにより、ビーズ上のグラミシジンチャンネルの膜への挿入が可能であり、膜を通る伝導を生じる。図６参照。
４．ＰＣＲ生成物の検出方法
ビオチニル化-ＤＮＡを生成させるための既知のＰＣＲ技術を用いてサンプルＤＮＡを増幅する。ビオチニル化-ＤＮＡをグラミシジンのみか、グラミシジン及び膜スパン脂質のいずれかに結合したＳＡを含有するバイオセンサー膜に通し、直接か側方偏析をそれぞれ用いて膜を“消す”。図７参照。
実施例１：感知膜の調製
リンカー脂質Ａの構造を図８に、リンカーグラミシジンＢの構造を図９に、膜スパン脂質Ｄの構造を図１０に、使用されるグラミシジンＥで、ｎ＝５のものの構造を図１１に示した。
このように、ガラスのスライドもしくはプラスチックのサポートを蒸発により５０オングストロームクロム付着層で、続いて金の２０００オングストローム層で被覆した。金被覆した基質を、リンカー脂質Ａ（１０mMのエタノール溶液３００ul）、２，２’-エタノール=ジスルフィド（１０mMのエタノール溶液２００ul）、リンカーグラミシジンＢ（０．０１mg/mlのエタノール溶液１００ul）、膜スパン脂質Ｄ（１mMのエタノール溶液２２５ul）及びエタノール（５０ml）を含有するエタノール溶液中においた。金被覆した基質が、この溶液中におかれるのは、準備のための５分以内であることが好ましい。
金被覆した基質を、この溶液中に６０分間おき、エタノールで濯いだ。金被覆したスライドを電極ホルダーに入れ、この実施例については電極の面積が約１６mm²となるように電極を決定した。エタノール中の全脂質濃度が１４mMである、１，２-ジ（３ＲＳ，７Ｒ，１１Ｒ-フィタニル）-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホコリンと、１，２-ジ（３ＲＳ，７Ｒ，１１Ｒ-フィタニル）グリセリンとの比が７：３である溶液５ulを、金電極の表面に添加し、リン酸塩で緩衝した食塩水（ＰＢＳ）５００ulで二度洗浄することで濯ぎ、ＰＢＳ１００ulを電極表面上に残した。電極の上に残されたＰＢＳの量は、１００ul以下であることが好ましい。典型的には銀である反対電極を、ＰＢＳ溶液に浸し、反対電極と感知電極とをインピーダンスブリッジに結合した。ＡＣ測定の間、感知電極にＤＣオフセット３００mVを適用した。電極部品は３５℃に保った。このことにより、プローブが使用される場合の感知膜が形成され、膜の伝導は増大する。
実施例２：プローブ溶液の調製
バス音波処理器で、リンカーグラミシジンＢの溶液（１uM）及びドデシル硫酸ナトリウム（１０uM）をＰＢＳ中、２０分間音波処理した。この溶液は、４℃にて少なくとも１２ヶ月貯蔵することができる。グラミシジンとドデシル硫酸ナトリウムとは水性溶液中で安定であるが、グラミシジンは感知膜中に容易に混入し、伝導イオンチャンネルを生成する。伝導性のこうした変化は、インピーダンス分光を使用して監視することができる。
実施例３：アビジン被覆固体サポートの調製
ＥＬＩＳＡ試験で使用されると同様に、ＰＢＳ中、アビジン（１mg/ml）の溶液でポリスチレンウェルを６０分間処理し、ＰＢＳで３度濯ぎ、液を捨て、ＰＢＳ２００ulを満たした。こうしてポリスチレンウェルはアビジンで被覆された。
実施例４：小さいアナライト、すなわちビオチンの感知
アビジンで被覆したポリスチレンウェル二つ-ウェルＡ及びウェルＢ-を実施例３に記載した通り調製した。ウェルＡにアナライトビオチンを含む試験溶液５ul（ＰＢＳ中１mM）を添加し、３分間混合した。ウェルＢにはビオチンを含まない試験溶液５ulを添加し、３分間混合した。ＡとＢ双方のウェルに実施例２で調製したプローブ溶液２．５ulを添加し、５分間混合した。アナライト（すなわちビオチン）が存在する場合、ビオチンは固体サポートに結合した受容体と錯化しており、したがってビオチニル化したグラミシジンＥの固体サポート上、すなわちＰＢＳ溶液中に残るビオチニル化したグラミシジンＥプローブ上でのアビジンと錯化が阻止されていることが見出された。アナライト（すなわちビオチン）が溶液中に存在しない場合、アビジンの受容体部分は錯化されずにビオチニル化したグラミシジンＥプローブが固体サポートと錯化し、すなわちビオチニル化したグラミシジンＥが溶液から除去される。次に、ウェルＡからとウェルＢからの溶液１００ulを二つの別の感知膜に添加し、インピーダンス分光を用いて膜の伝導を監視した。図１２には、ウェルＡからの溶液の添加によって起こるインピーダンスの低下は、ウェルＢからの溶液の添加によって起こるインピーダンスの低下よりも大幅で速いことが示されている。したがって、ビオチンアナライトの存在の有無を検出することができる。試験溶液中のビオチンの量により、固体サポート上の受容体においてビオチンが占める結合部分の数が明らかに決定され、逆に溶液中に残るプローブ分子の数も決定される。したがって、膜のインピーダンス特性のプローブによる変化の率は、アナライト濃度に比例する。あるいはまた、プローブ分子の数が限定されている場合、膜に影響するプローブ分子の厳密な数を用いてアナライト濃度を決定することができる。当業者には、黒膜中の単一のグラミシジンイオンチャンネルの伝導度が測定可能であることが既知である。当業者には、固体サポートに結合した受容体は、アナライトに特定の抗体等の受容体であってよく、グラミシジンにアナライトの類似体が固定され、グラミシジンが、結固定されたアナライト類似体を経て固定された受容体に結合するとよいことが認識されるであろう。
実施例５：大きなアナライト-すなわちビオチニル化したＢＳＡの感知
アビジンで被覆したポリスチレンウェル二つ-ウェルＣ及びウェルＤ-を実施例３に記載した通り調製した。ウェルＣにアナライトビオチニル化したウシの血漿アルブミン（ＢＳＡ）を含む試験溶液５ul（ＰＢＳ中１．３mg/ml）を添加し、１０分間混合した。ウェルＤにはビオチニル化したＢＳＡを含まない試験溶液５ulを添加し、１０分間混合した。ＣとＤ双方のウェルに実施例２で調製したプローブ溶液２．５ulを添加し、１０分間混合した。アナライト（すなわちビオチニル化ＢＳＡ）が存在する場合、ビオチニル化ＢＳＡは固体サポートに結合した受容体と錯化しており、したがってビオチニル化したグラミシジンＥの固体サポート上、すなわちＰＢＳ溶液中に残るビオチニル化したグラミシジンＥプローブ上でのアビジンとの錯化が阻止されていることが予期される。アナライト（すなわちビオチニル化ＢＳＡ）が溶液中に存在しない場合、アビジンの受容体部分は錯化されずにビオチニル化したグラミシジンＥプローブが固体サポートと錯化し、すなわちビオチニル化したグラミシジンＥが溶液から除去される。次に、ウェルＣからとウェルＤからの溶液１００ulを二つの別の感知膜に添加し、インピーダンス分光を用いて膜の伝導度を監視した。図１３には、ウェルＣからの溶液の添加によって起こるインピーダンスの低下は、ウェルＤからの溶液の添加によって起こるインピーダンスの低下よりも大幅で速いことが示されている。こうして、ビオチニル化ＢＳＡアナライトの存在の有無を検出することができた。
実施例６：大きなアナライト−フェリチンの感知
フェリチンとして市販のＥＬＩＳＡキット（Bioclone Australia Pty, Ltd., Marrickville NSW 2204, Elegance Amplified Elisa System, Cat. No. FEA-96）由来の抗フェリチン抗体で被覆したポリスチレンウェルを使用した。一方のウェル（ウェルＥ）には５００nMフェリチン２００ulを添加し、他方のウェル（ウェルＦ）にはフェリチンアナライトを添加していないＰＢＳ２００ulを添加した。双方のウェルを６分間混合し、ＰＢＳ４００ulで３度洗浄した。ＥＬＩＳＡキット由来のビオチニル化抗フェリチン抗体溶液２００ulを各ウェルに添加し、３分間混合した。ウェルをＰＢＳ４００ulで３度濯ぎ、ＰＢＳ中のアビジン０．０２５mg/mlを２００ulを双方のウェルに添加し、５分間混合した。ウェルをＰＢＳ４００ulで３度濯ぎ、ＰＢＳ２００ulを双方のウェルに残した。双方のウェルに、実施例２で調製したビオチニル化したグラミシジンＥ／ドデシル硫酸ナトリウムのプローブ溶液２．５ulを添加し、５分間混合した。次に、ウェルＥからとウェルＦからの溶液１００ulを実施例１で準備したように二つの感知膜に添加した。インピーダンス分光を用いてプローブ溶液の添加によるインピーダンスの変化を監視した。図１４には、試験溶液由来のフェリチンが存在しない場合のプローブ溶液によるインピーダンスの低下は、試験溶液中にフェリチンが存在する場合よりも大幅で速いことが明らかに示されている。容易に認識されるとおり、変化率及び範囲を用いてアナライトサンプル中のフェリチン濃度を決定することが可能である。
上記の記載から明らかなように、本発明は抗体もしくはＤＮＡベースの技術ための現行の検出方法に取り込むことが可能な装置及び方法について開示するものである。本発明では検出物質として様々な特許（例えば、ＰＣＴ／ＡＵ８８／００２７３号、ＰＣＴ／ＡＵ８９／００３５２号、ＰＣＴ／ＡＵ９０／０００２５号、ＰＣＴ／ＡＵ９２／００１３２号、ＰＣＴ／ＡＵ９３／００５９０号、ＰＣＴ／ＡＵ９３／００６２０号もしくはＰＣＴ／ＡＵ９４／００２０２号）に記載された感知膜物質を使用する。感知膜は、最終生成物の検出のために現在使用されている酵素、化学ルミネセンス、蛍光、もしくは放射線標識したプローブに代えて、一段階装置に取り込むか、従来の多段階処理に用いることができる。抗体もしくはＤＮＡベースの技術の最終段階で使用される分子に結合可能なプローブのタイプには、膜を通る伝導性に変化をきたすことのできるあらゆる種類が含まれる。
例えば、イオンチャンネル等のプローブを膜に挿入し、イオン流を絶縁膜に通すことができる。他のプローブが、膜上の部位に特定的に結合することによって、絶縁膜を通る漏出路を生じ、相分離か分子の凝集のいずれかを誘発するか、膜を可溶化するか、または膜の部位を除去することが可能である。
他のプローブは、膜中に既に存在するイオンチャンネルと相互作用することにより、チャンネルを通るイオン流を減少させることができる。例えば、ストレプタビジンもしくはアビジンをビオチニル化したグラミシジンを含有する膜との相互作用のためのプローブとして用いることにより、膜を通るイオン流が減少する。
膜への効果は、イオン流を減少させるためもしくは膜を通るイオン流を収容するイオンチャンネルを多くするために多数のストレプタビジンが結合したラテックスもしくはポリスチレンビーズマルチプローブを使用することによって増幅することができる。
抗体もしくはＤＮＡ-ベースの技術における検出機構としての感知膜の利点は、読みとりの速さと単純さである。イオン流の変化は様々な頻度もしくは単一の頻度でのインピーダンス変化によって測定することができる。例えばグラミシジンの単一チャンネル測定は、黒膜を用いて規定通り行われ、非常に高感度で測定できる可能性のあるものである。インピーダンス測定には、携帯用の大きさにサイズを縮小させることのできる単純なコンピュータ部品が必要である。試薬は単純化され、検出に際して色変化もしくは光発散に依存しない。
当業者であれば、特定の実施態様に示される通り、広範に記載された本発明の精神もしくは範囲からの要旨から外れることなく多数の種類及び／または変形を製造できることが認識されるであろう。これら実施態様は、したがって、あらゆる点で詳説のためであり、限定的ではないとみなすこととする。

Claims (5)

1. アンフィフィル、第一のイオノホア、及びアナライトに対して反応性である第一の配位子を具備する感知膜を含む電極と、アナライトに対して反応性の少なくとも一つの第二の配位子及び少なくとも一つの第二のイオノホアを具備するプローブとを含むアナライト検出装置であって、
   アナライトの前記第一及び第二の配位子との結合により、前記第二のイオノホアが膜内に挿入され、これによって膜のインピーダンスに変化が起きるアナライト検出装置。
2. プローブが担体ビーズである請求項１に記載のアナライト検出装置。
3. 第一及び第二のイオノホアがグラミシジンである請求項１または２に記載のアナライト検出装置。
4. 第一及び第二の配位子が抗体である請求項１から３のいずれか一項に記載のアナライト検出装置。
5. 請求項１から４のいずれか一項に記載のアナライト検出装置にサンプルを添加し、膜のインピーダンスを測定することからなるサンプル中のアナライトの存在の検出方法。

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